Method Article

Monitoring van conformationele dynamica van enkelvoudige ongemodificeerde eiwitten met behulp van plasmonische nanopincetten

DOI:

10.3791/68093

⸱

March 21st, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Advanced Optics and Photonics Laboratory, Department of Engineering, School of Science and Technology, Nottingham Trent University, 2School of Physics and Astronomy, University of Nottingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmonische nanopincetten gebruiken gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie in gouden nanostructuren om afzonderlijke nanodeeltjes, waaronder eiwitten, op te vangen in een optisch veld op nanometerschaal. Veranderingen in het verstrooide signaal onthullen de aanwezigheid van eiwitten en de conformationele dynamiek, waardoor monitoring mogelijk is zonder fluorofoormodificaties of oppervlaktetethering.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige technieken met één molecuul om eiwitten te karakteriseren vereisen doorgaans labels, tethers of het gebruik van niet-inheemse oplossingsvoorwaarden. Dergelijke veranderingen kunnen de biofysica van eiwitten veranderen en het nut van de verkregen gegevens verminderen. Plasmonische nanopincetten is een techniek die gebruik maakt van gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie (LSPR) op gouden nanostructuren om het elektrische veld binnen een beperkt hotspotgebied te versterken. Deze veldverbetering maakt het gebruik van lage laservermogens mogelijk om afzonderlijke nanodeeltjes te vangen die veel kleiner zijn dan conventionele optische pincetten, tot slechts een paar nanometer in diameter, zoals afzonderlijke eiwitten. Het vangen van afzonderlijke eiwitmoleculen in het hotspotgebied veroorzaakt een verschuiving in de lokale brekingsindex (neiwit >n water), waardoor de lichtverstrooiing verandert als een product van de polariseerbaarheid van het molecuul, die wordt beïnvloed door zijn volume, vormanisotropie en brekingsindex. Een lawinefotodiode (APD) verzamelt de daaropvolgende veranderingen in lichtverstrooiing. Deze veranderingen kunnen vervolgens worden geanalyseerd om veranderingen in het gevangen molecuul te bepalen, waaronder de grootte, globale conformatie en dynamiek van conformatieverandering in de loop van de tijd. De integratie van microfluïdica in het systeem maakt gecontroleerde veranderingen in de omgeving mogelijk en real-time monitoring van hun daaropvolgende effecten op het molecuul. In dit protocol demonstreren we de stappen om afzonderlijke eiwitmoleculen te vangen, hun omgevingsoplossingsomstandigheden te veranderen en hun overeenkomstige conformatieveranderingen te monitoren met behulp van een plasmonisch nanopincetsysteem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige technieken met één molecuul voor het ondervragen van de conformationele dynamiek van eiwitten omvatten op etikettering gebaseerde methoden zoals fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET)1,2, op tethering gebaseerde benaderingen zoals optische pincetten 3,4 en atoomkrachtmicroscopie (AFM)5, op interferentie gebaseerde technieken zoals interferentieverstrooiingsmicroscopie (iSCAT)6, of op nanofluïdica gebaseerde technieken zoals nanoporiën7,8,9. Hoewel deze methoden veel voordelen hebben; Een paar belangrijke beperkingen voorkomen dat ze gegevens verstrekken over de conformationele dynamiek van ongemodificeerde eiwitten. FRET en optische pincetten vereisen fluorofoor-etikettering of binding aan een oppervlak, wat de biofysische eigenschappen van de eiwitten kan beïnvloeden 10,11,12. iSCAT, hoewel technisch labelvrij, vereist ook interactie tussen het eiwit en een oppervlak om interferentie tussen de twee te observeren die mogelijk de eigenschappen van de eiwitten beïnvloedt. Bovendien kan iSCAT, beperkt door zijn signaal-ruisverhouding, alleen eiwitten detecteren >40 kDa als gevolg van apparatuurruis en spikkelachtige achtergrondfluctuaties13. Hoewel deze groottelimiet kan worden verlicht door middel van machine learning, zijn buffercomponenten beperkt omdat ze de optische eigenschappen kunnen beïnvloeden, wat resulteert in ruisende gegevens 13,14. Nanoporiën vertonen snelle translocatietijden van eiwitten door de porie (meestal binnen 5 μs), waardoor ze geen langzamere conformationele dynamiek kunnen detecteren 15,16, hoewel onderzoek naar het verlichten van deze beperkingen, zoals het gebruik van DNA-origami in een elektro-osmotische val met nanoporiën17 of opname van plasmonics 18,19,20,21. Bovendien kunnen hoge zoutconcentraties, meestal rond de 1 M, de toepasbaarheid van de gegevens voor in vivo werk verminderen15,22. De ideale techniek met één molecuul voor eiwitkarakterisering zou eiwitten in realtime moeten monitoren en conformationele dynamiek over langere duur (d.w.z. milliseconden) moeten vastleggen zonder dat er aanpassingen aan het eiwit of niet-inheemse oplossingscondities nodig zijn.

Plasmonische nanopincetten zijn vergelijkbaar met conventionele optische pincetten, in die zin dat ze licht gebruiken om materie op te vangen. Plasmonische nanopincetten maken echter gebruik van gelokaliseerde oppervlakteplasmonische resonantie (LSPR) om het elektrische veld met verschillende ordes van grootte te verbeteren om een gradiëntkracht te genereren die sterk genoeg is om afzonderlijke nanodeeltjes23 te vangen. Bovendien speelt het gevangen deeltje een actieve rol bij het vergroten van de sterkte van de val, bekend als self-induced back-action (SIBA) trapping voor nanoaperture-structuren24. Deze SIBA-vangst zorgt voor lage laservermogens (d.w.z. milliwatt) om kleine deeltjes met een diameter van slechts enkele nanometers op te vangen, zoals eiwitten 25,26,27. Het vangen van afzonderlijke eiwitmoleculen in het hotspotgebied veroorzaakt een verschuiving in de lokale brekingsindex (neiwit >n water), waardoor de lichtverstrooiing verandert op basis van de polariseerbaarheid van het molecuul, die wordt beïnvloed door het volume, de vormanisotropie en de brekingsindex van het eiwit28. Een lawinefotodiode (APD) detecteert deze informatie vervolgens om latere veranderingen in de lichtverstrooiing te volgen. Bovendien maken plasmonische nanopincetten het mogelijk om de gevangen eiwitten in realtime te monitoren zonder labeling, tethers en agressieve oplossingsomstandigheden gedurende lange perioden (d.w.z. minuten tot uren)29, waarmee wordt voldaan aan de criteria voor een ideale single-molecule-techniek voor eiwitten. Met behulp van een dubbele nanogatstructuur (DNH) hebben plasmonische nanopincetten aangetoond dat ze in staat zijn om verschillende eiwitten te vangen en er belangrijke informatie uit te halen, waaronder conformationele overgangen29, demontagekinetiek30, energielandschappen31, diffusietracking32 en ligandbinding33,34. Naast DNH-structuren zijn alternatieve structuurgeometrieën aangetoond om deeltjes met kleine deeltjesgroottes op te vangen35,36. In dit protocol worden de fundamentele stappen voor het opzetten en uitvoeren van een plasmonische nanopincet met een geïntegreerd microfluïdice-systeem gepresenteerd. We hopen dat dit protocol zal helpen om de toegankelijkheid en het begrip van plasmonische nanopincetten voor onderzoekers te vergroten, met name die op het gebied van structurele biologie en biofysica.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LET OP: Lees alle relevante veiligheidsinformatiebladen (SDS) voor alle gebruikte chemicaliën en houd u aan alle toepasselijke veiligheidspraktijken en draag indien nodig persoonlijke beschermingsmiddelen (laserveiligheidsbril, laboratoriumjassen, handschoenen).

1. Het bouwen van de plasmonische nanopincet opstelling

OPMERKING: De optische opstelling is gebaseerd op de Modular Optical Pincets System (OTKB)-kit die gebruik maakt van een andere laser en APD (zie materiaaltabel). Gebruik optische apparatuur alleen op een geschikte optische tafel om de impact van externe trillingen op het systeem te verminderen. De laser in de kit was 976 nm, maar aangezien de piekresonantiegolflengte voor de wigresonantie van de DNH-structuren ongeveer 740-760 nm33 is. We kozen voor een NIR-laser (852 nm) omdat deze dicht bij de resonantiepiek ligt, LSPR induceert en ook een beter detectierendement heeft door de op silicium gebaseerde APD. Lasers met langere20 of kortere18 golflengten zijn gebruikt om biomoleculen te vangen.

  1. Stel de laser in de fotodiode-laserhouder in en voer deze in een collimator in, wat leidt tot een gecollimeerde laserstraal met een breedte van 1,7 mm voor onze opstelling.
  2. Voeg een halvegolfplaat toe aan het lichtpad om de polarisatie aan te passen. Pas aan met behulp van een Glan-Taylor-polarisator om ervoor te zorgen dat de verticale polarisatie (S-polarisatie) de hoogste lichtintensiteit heeft.
    NOTITIE: Het gebruik van de juiste polarisatie is van vitaal belang om een maximale versterking van het elektrische veld van de DNH-structuren te garanderen, aangezien deze afhankelijk zijn van polarisatie.
  3. Richt het licht door een bundelexpanderopstelling bestaande uit een plano-concave lens (f = -50 mm) gevolgd door een plano-convexe lens (f = 150 mm) om de bundelbreedte te vergroten tot ongeveer 5 mm om de volledige achteropening van het onderste objectief te vullen.
  4. Gebruik een dichroïsche spiegel (805 nm short pass) om de laser naar de gewenste locatie te reflecteren. Plaats de camera (CCD) erachter.
  5. Richt het licht op het onderste objectief (100x/1.25 NA) en plaats het bovenste objectief (4x/0.1 NA) op de confocale afstand om het doorgelaten licht op te vangen.
  6. Voeg nog een dichroïsche spiegel toe (805 nm korte doorlaat) om het laserlicht naar de APD te reflecteren door een plano-convexe lens die op de brandpuntsafstand is geplaatst om het licht in de APD te focussen. Voeg de witte lichtbron (WLS) toe achter de dichroïsche spiegel, zodat deze terug kan gaan door de opstelling om de camera te bereiken. Figuur 1 toont een schema van de volledig geassembleerde opstelling van het plasmonische nanopincet.

figure-protocol-1
Figuur 1: Opstelling van plasmonische nanopincetten. Het schema toont de volledige optische route van de opstelling van het plasmonische nanopincet. Een laserstraal van 852 nm (rood) gaat door een collimator en een halfgolfplaat en wordt vervolgens door de bundelexpander (BE) uitgebreid tot ~5,1 mm. Het wordt vervolgens gericht op de steekproef met behulp van een 100x-objectief. Het doorgelaten laserlicht wordt opgevangen door een 4x objectief en geregistreerd door een APD met een bemonsteringsfrequentie van 1 MHz. Wit licht van WLS (geel) passeert het 4x objectief, monster en 100x objectief voordat het de CCD bereikt, die een helder veldbeeld van het monster geeft. Gebieden waar beide lichtpaden elkaar kruisen, zijn in oranje weergegeven. SEM-beeld van DNH genomen bij een kanteling van 20°. Afkortingen: BE = Beam expander, CCD = Charge-coupled device, DM = Dichroic mirror, HWP = Half-wave plaat, M = Silver mirror en WLS = White light source. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Fabricage van de DNH-structuren

  1. Zet 5 nm Ti af, gevolgd door 100 nm Au op een 550 μm dikke gesmolten silicawafel met behulp van e-beam-verdamping zoals eerder beschreven29,33. Snijd de wafel in blokjes tot monsters van 1 cm x 1 cm, klaar voor gebruik.
    OPMERKING: Er is gekozen voor E-straalverdamping omdat het een goudlaag produceert met een lage oppervlakteruwheid, waardoor hoogwaardige DNH-structuren worden geproduceerd met een hoge vangefficiëntie37.
  2. Neem het lege goudfilmmonster en monteer het in een scanning-elektronenmicroscoop-gefocusseerde ionenbundel (SEM-FIB) die bij kamertemperatuur is opgesteld met behulp van een galliumionbron.
  3. Zorg ervoor dat FIB-nanoapertures zijn uitgelijnd met SEM om DNH op nauwkeurige posities te produceren.
  4. Maak een markeringsvak met behulp van een ionenbundel met hoge stroomsterkte (bijv. 100 pA). Deze markering zal dienen als referentiegids om de positie van de DNH-structuren onder de optische opstelling te lokaliseren.
  5. Om de DNH-structuur te creëren, worden twee cirkels met een hart-op-hart afstand van 200 nm en een diameter van 160 nm overbrugd door een rechthoek (3 nm x 40 nm). Voor een spleetgrootte van ongeveer 20-30 nm, etst u cirkels met een dosisfactor van 0,09, terwijl de rechthoekige dosis tussen 0,300 en 0,350 ligt met behulp van een sonde-energie van 30 kV en een bundelstroom van 1 pA.
    OPMERKING: De gebruikte SEM-FIB heeft een resolutie van 3 nm bij deze sonde-energie, waardoor een betrouwbare fabricage van DNH met spleetgroottes tussen 20-30 nm mogelijk is. We zouden geen lagere resolutie gebruiken, omdat dit grotere openingen zal produceren, waardoor de insluitingsefficiëntie van DNH wordt verminderd. Als een FIB niet haalbaar is, is een alternatieve methode voor het produceren van DNH-structuren het gebruik van polystyreen nanosfeerlithografie38. Vanwege de hoge precisie die nodig is om DNH-structuren te fabriceren, is het mogelijk dat hetzelfde recept niet dezelfde opening produceert tussen SEM-FIB-toepassingen. Verander de dosis en hoogte van de rechthoek (dosis 0,280 tot 0,350 en 2 tot 4 nm hoogte) en meet de opening

3. Coating van DNH-monsters

  1. Gebruik een oplosmiddelbestendige container, zoals een kristalliserende schaal gemaakt van borosilicaatglas 3.3, en voeg 20 ml ethanol toe.
    LET OP: Ethanol is licht ontvlambaar en irriterend. Alleen gebruiken in een zuurkast. Bewaar op een koele, goed geventileerde plaats. Hanteren met handschoenen en een laboratoriumjas.
  2. Weeg 32 mg poly(ethyleenglycol) methyletherthiol (PEG-thiol; gemiddeld molecuulgewicht 800 g/mol) af en meng dit door de ethanol, zorg ervoor dat alle PEG-thiol is opgelost om een oplossing te produceren met een concentratie van ongeveer 2 mM om de dichtheid van de monolaagte maximaliseren 39.
    LET OP: PEG-thiol is irriterend; behandel het met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
  3. Voeg de monsterchips met de nanostructuren toe aan het mengsel met een recht pincet, dek af en incubeer een nacht (~16 uur) bij kamertemperatuur zodat de PEG-thiol een zelfgeassembleerde monolaag op het goudoppervlak vormt.
  4. Spoel de monsters na de incubatie af door ze met een recht pincet boven een geschikte container in de zuurkast te houden. Gebruik een spuitfles om ethanol aan elke kant grondig te spuiten. Droog volledig met een luchtpistool voordat u het opbergt of in het plasmonische nanopincet monteert.
    OPMERKING: Monsters kunnen bij 4 °C worden bewaard om de levensduur te verlengen, omdat ze na verloop van tijd kunnen verslechteren.

4. Montage van het PEG-gecoate monster in een flowcel

  1. Plaats het gecoate monster in de 3D-geprinte flowcel (geprint door een Form 2-printer met Clear V4-hars) met behulp van een recht pincet met de goudlaag naar boven gericht (zie aanvullende afbeelding 1 voor de belangrijkste parameters en waarden in ons ontwerp van de flowcel).
  2. Pel een kant van de doorzichtige dubbelzijdige tapeafdekking van PET-plastic af met een recht pincet en plaats deze op het monster en de stroomcel, zodat de nanostructuren en inlaat-/afvoergaten in de stroomcel onbedekt blijven. Druk voorzichtig met een afgerond pincet langs de randen van de tape om er zeker van te zijn dat deze goed aan de flowcel en het monster is gehecht.
  3. Trek de andere kant van de tape eraf en plaats voorzichtig een glazen dekglaasje (dikte 0,17 mm) over het monster met behulp van een afgerond pincet. Druk voorzichtig met het afgeronde pincet langs de randen van het dekglaasje om er zeker van te zijn dat het goed vastzit. Hierdoor ontstaat een vloeistofkanaal (hoogte = 50 μm, volume = 3,5 μL) in de flowcel.
    OPMERKING: Druk niet op het dekglaasje op of in de buurt van waar de nanostructuren zich bevinden, omdat deze beschadigd kunnen raken. Als het dekglaasje vuil is, was het dan met ethanol en droog het af met een luchtpistool voordat u het monteert.
  4. Meng gelijke delen A en B van de duplicerende siliconenoplossingen in een verhouding van 1:1 (of volgens de instructies van de fabrikant) op een microscoopglaasje met behulp van een kleine pipetpunt.
  5. Vul de openingen tussen het dekglaasje en de flowcel op met de gemengde duplicaatsiliconen en duw het voorzichtig onder het dekglaasje. Houd de flowcel ondersteboven en plaats voorzichtig duplicaatsiliconen rond de binnenwand van het gat voordat u de pipetpunt gebruikt om deze voorzichtig naar de zichtbare randen van de gesmolten silica-onderkant van het monster te verplaatsen (zie aanvullende afbeelding 2).
  6. Laat drogen met de goudlaag naar boven tot de dupliceersiliconen volledig zijn uitgehard, volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat siliconen geen nanostructuren bedekken wanneer ze aan de onderkant van het monster worden aangebracht. Zorg ervoor dat de duplicerende siliconen niet onder het dekglaasje worden geforceerd, omdat deze in de inlaat-/uitvoergaten van de flowcel of de nanostructuren kunnen komen, die moeilijk schoon te maken kunnen zijn (aanvullende afbeelding 3).

5. Aansluiten van het microfluïdica systeem

NOTITIE: Zorg voor het gebruik van schone slangen voor het systeem. Hier worden kleine ID PTFE-slangen: 0,18 mm ID en grote ID PTFE-slangen: 0,8 mm gebruikt, maar andere ID-waarden werken.

  1. Stel de spuitpomp in en sluit deze aan op het 3/2-weg magneetventiel met behulp van de grote PTFE-slang. Sluit de ene poort van de klep aan op de buffercontainer en de andere op een vasthoudspiraal, ongeveer 1 ml in volume, gemaakt van de grote ID-slang om terugstroming in de spuit te voorkomen.
    OPMERKING: De 3/2 klep kan worden bediend via een klepcontroller, die bepaalt of de oplossing wordt toegediend/onttrokken uit de buffercontainer of uit de houdspoel.
  2. Sluit de vasthoudspoel aan op de middenklep van de 12/1 roterende bidirectionele microfluïdische klep. Sluit containers aan voor oplossingen met behulp van kleine ID-slangen voor schaarse of waardevolle monsters en grote ID-slangen voor de rest. Gebruik één klep alleen voor infusie in een afvalcontainer en een andere alleen voor infusie in de flowcel; gebruik een kleine ID-slang voor de infuusklep van de flowcel.
  3. Sluit grote ID-slangen van de uitgang van de stroomcel aan op de afvalcontainer. Figuur 2 toont een schema van het volledig aangesloten microfluïdische systeem.
    OPMERKING: Kleine ID PTFE-slangen hebben de voorkeur voor de inname van de flowcel en voor kleppen die zullen worden gebruikt voor eiwitinfusie vanwege het kleinere volume waarbij het monster in de slang zal blijven. Grote ID PTFE-slangen hebben de voorkeur voor goedkopere of meer overvloedige materialen zoals buffers. Probeer minimale slangen te gebruiken om dit dode volume verder te verminderen.

figure-protocol-2
Figuur 2: Microfluïdisch systeem. Schema illustreert het microfluïdische systeem. De spuitpomp infusert of zuigt oplossingen af via één poort van de 3/2-wegklep, ofwel de schoonwatercontainer of de houdspoel. Oplossingen die zijn aangesloten op de 12/1-klep gaan altijd door de houdspoel wanneer deze wordt ingetrokken en kunnen vervolgens via het gewenste kanaal worden toegediend. Door infusie in het inlaatkanaal dat op de flowcel is aangesloten, wordt de oplossing uit de flowcel in de afvalcontainer geduwd. Dikke en dunne buizen vertegenwoordigen grote en kleine ID-slangen uit het protocol. Zwarte doppen op de 12/1 klep vertegenwoordigen afgesloten kanalen. Stroomrichtingen zijn gemarkeerd met zwarte pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Voorbereiding van het microfluïdische systeem

  1. Laad de gebruikersinterface van het microfluïdische systeem op de pc en controleer of de componenten correct zijn aangesloten. Selecteer het afspeelpictogram naast de draad en verdeler om de bijbehorende gebruikersinterface te openen. Om de 3/2-wegklep te omzeilen, draait u poort 1 op de draad.
  2. Zorg ervoor dat de kleppen die in het systeem worden gebruikt, worden gereinigd door isopropanol (IPA) toe te dienen en vervolgens de slang meerdere keren te wassen met buffer(s) naar keuze of gedestilleerd water om lucht en IPA in het systeem te verwijderen. Infusie kan worden gedaan door de gewenste klep op de gebruikersinterface van de verdeler te selecteren en de spuitpomp te laten draaien, infuseren/terugtrekken te selecteren en het gewenste volume en debiet te kiezen (bijv. volume van 0.5 ml en debiet van 0.2 ml/min).
    OPMERKING: Breng geen IPA toe aan flowcellen, omdat dit de cel en de lijm aantast, wat kan leiden tot lekken.

7. Montage van de flowcel in een plasmonisch nanopincet en controleren op lekken

  1. Bevestig de inlaat- en uitlaatbuizen aan het juiste deel van de flowcel voordat u ze op schoon weefsel plaatst met een gouden laag naar boven gericht.
  2. Breng buffer toe aan de flowcel met een hoog debiet (~0,3 ml/min) en controleer of de vloeistof over het monster in de flowcel beweegt en of er geen vloeistof zichtbaar is aan de buiten- of onderkant van de flowcel. Hogere debieten kunnen worden gebruikt, op voorwaarde dat er geen lekkage optreedt. Als het monster lekt, demonteren en opnieuw monteren.
  3. Voeg 1-2 druppels immersieolie toe aan het 100x-objectief voordat u de stroomcel in de plasmonische nanopincetfase plaatst met de goudlaag naar beneden gericht. Plaats metalen clips over de magneten van de flowcel en vergrendel de tafel om deze op zijn plaats te houden.
    LET OP: Objectieve olie is irriterend, gevaarlijk voor de gezondheid en giftig voor in het water levende organismen, alleen met handschoenen hanteren.

8. Lokaliseren van nanostructuren op monster

  1. Zet de witte lichtbron aan. Open de camerasoftware en verhoog de versterkings- en belichtingstijd totdat de nanostructuren zichtbaar zijn. Zet de laser met relatief veel laservermogen aan en stel de z-as handmatig in totdat de laservlek zichtbaar is. Geef prioriteit aan het vergroten van de belichtingstijd en -winst boven het vergroten van het laservermogen om de laserspot te vinden.
    LET OP: Lasers vormen een ernstig potentieel risico voor gebruikers. Zorg ervoor dat geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen zoals een laserveiligheidsbril met voldoende optische dichtheid binnen het vereiste golflengtebereik worden gebruikt.
  2. Schakel de piëzo-elektrische controller in en selecteer de juiste instellingen voor de COM-poort en de maximale spanning. Stel de waarden voor de x-, y- en z-as in op de helft van de maximale spanning om een goed bereik mogelijk te maken om de tafel in alle richtingen uit te lijnen.
    OPMERKING: De COM-poort van de piëzo-elektrische controller kan worden gevonden en gewijzigd in de apparaatbeheerder onder het tabblad poorten.
  3. Verplaats de laserspot naar een overlay met een van de DNH-assen met behulp van de bedieningsknoppen van de x-, y- en z-as van de hoofdtrap. Zorg ervoor dat de APD is ingeschakeld en sluit vervolgens voorzichtig de behuizing voor het plasmonische nanopincet.
    OPMERKING: Het gebruik van een markeergereedschap in de camerasoftware, indien beschikbaar, zal helpen om de laservlek over een nanostructuur te verplaatsen. Zet de markering op het midden van de laservlek en zet de laser uit, maar laat de witte lichtbron aan om de uitlijning met een nanostructuur te vergemakkelijken. De APD kan oververzadigd en beschadigd raken als er te veel laserlicht op valt. Zorg ervoor dat het monster het laserpad in de weg zit en verhoog geleidelijk het laservermogen om ervoor te zorgen dat de verzadiging niet wordt bereikt. Filters met neutrale dichtheid (ND) kunnen indien nodig vóór de APD worden geplaatst om het licht dat de APD bereikt te verminderen.

9. Optimaal uitlijnen van de laser met de gewenste nanostructuur

  1. Open de software die is gekoppeld aan de APD-opname, zoals een zelfgemaakte Labview-gebruikersinterface, en stel de afsnijfrequentie in op 1 kHz. Geef het gewenste bestandspad en de naamgevingsindeling van de bestanden die worden opgeslagen een naam en stel deze in.
  2. Schakel de witte lichtbron uit en zet de laser weer aan. Stel in op een geschikt laservermogen (bijv. ~20 mW) en gebruik de piëzo-elektrische bedieningselementen om de x-, y- en z-assen aan te passen totdat het APD-signaal zo hoog mogelijk is, waarbij APD-verzadiging wordt vermeden en met minimale standaarddeviatie (SD) van het spoor.
    OPMERKING: De APD heeft waarschijnlijk een optimaal gevoeligheidsbereik voor transmissie (zie producthandleiding), wat ideaal is om in de buurt te blijven, bijv. 1000-2000 mV. ND-filters kunnen worden gebruikt om de transmissie rond dit bereik te houden. De belangrijkste overweging is dat de transmissie niet in de buurt van het APD-verzadigingspunt ligt, aangezien overvulling de transmissie kan verhogen tot de verzadigingslimiet, wat leidt tot gegevensverlies.

10. Eiwitten in de flowcel infuseren

  1. Schakel de laser uit om de levensduur van de nanostructuren te behouden en laat de besturingseenheid van de spuitpomp en de gebruikersinterface van de verdeler draaien om de klep in te stellen en de gewenste hoeveelheid eiwit op te zuigen (bijv. 30 μL). Voor het aftappen met behulp van de kleine ID-slang helpt een lager debiet ervoor te zorgen dat alle oplossingen worden afgezogen (~0,01 - 0,1 ml/min). Hogere debieten kunnen desgewenst worden gebruikt om de wachttijd te verkorten.
    OPMERKING: De optimale hoeveelheid eiwit die moet worden gebruikt, hangt af van hoe waardevol het eiwit is en wat het experiment hoopt te bereiken. De typische eiwitconcentratie die we gebruiken is 1 μM en een aliquoot volume van 100 μL. Als het eiwitmonster overvloedig is, kunnen hogere concentraties worden gebruikt om de gemiddelde vangtijd te verkorten. Als de concentraties echter te hoog zijn, neemt het risico toe dat twee van dezelfde eiwitten in de nanostructuur worden opgesloten. Als het experiment een infusie van een ander ligand/eiwit vereist na het vangen van het oorspronkelijke eiwit, kan de voorkeur worden gegeven aan een lager aliquoot volume om verspilling te minimaliseren en de tijd die nodig is om de volgende oplossing te infuseren. Zorg ervoor dat de slang ondergedompeld blijft in de oplossing om te voorkomen dat er lucht in het systeem komt. Speciale aandacht moet worden besteed aan eiwitaliquots als de slang de bodem van de container niet bereikt of als de oplossing te veel is opgezogen.
  2. Gebruik de microfluïdica UI om de eiwitoplossing te infuseren met een stroomsnelheid die vergelijkbaar is met de opnamesnelheid (~0,01 - 0,1 ml/min). Laat met deze snelheid trekken totdat de eiwitoplossing de stroomcel bereikt en verlaag vervolgens de stroomsnelheid tot ≤0,001 ml/min. Controleer het volume en de tijd op de spuitpomp om er zeker van te zijn dat ze overeenkomen met het verwachte volume (bijv. 1 minuut voor 1 ml volume bij 1 ml/min).
    OPMERKING: Het benodigde volume hiervoor kan worden berekend op basis van het volume van de slang van het microfluïdische systeem naar de flowcel. Als de lengte en ID van de slang bekend zijn, kan een online calculator voor het volume van een cilinder worden gebruikt. De infusiesnelheid kan naar wens worden aangepast, bijvoorbeeld >0,001 ml/min voor eiwitinfusie om de gemiddelde wachttijd voor een val te verkorten. Voorzichtigheid is echter geboden, want als het debiet te hoog is, kan dit voorkomen dat eiwitten de nanostructuur binnendringen.

11. Verzamelen van gegevens

  1. Terwijl de eiwitoplossing in de stroomcel wordt toegediend, begint u met het registreren van de gegevens van het APD-signaal. Pas de x-, y- en z-assen indien nodig aan met behulp van de gebruikersinterface van de piëzo-elektrische controller, aangezien het systeem na verloop van tijd waarschijnlijk zal afdrijven. Ideale vangsporen hebben een consistent algemeen patroon dat overeenkomt met dat van het spoor in figuur 3.
  2. Bij het waarnemen van een grote verandering in transmissie en S.D. vergelijkbaar met het voorbeeldige vangspoor, noteer dan de tijd dat dit gebeurt voor toekomstige gegevenssortering (zie bijvoorbeeld figuur 4B ).
    OPMERKING: Driften in het systeem kan leiden tot veranderingen in de transmissie en een toename van SD, soms vrij plotseling, wat kan worden aangezien voor een eiwitval. Zorg ervoor dat de signaalsprong hetzelfde patroon vertoont als de voorbeeldval en dat er geen externe interferentie aanwezig was toen de sprong plaatsvond, zoals uitlijndrift of harde geluiden die door het systeem worden opgepikt.
  3. Als het eiwit moet worden vrijgegeven als onderdeel van het experiment, zet u de laser ~5 s uit en weer aan. Het spoor zou een grote verandering in transmissie en een significant lagere SD moeten hebben, wat wijst op een terugkeer naar de basislijntoestand.
    OPMERKING: Als er geen grote verandering in transmissie en/of SD wordt waargenomen, of als er een soortgelijk spoor als het gevangen eiwit wordt waargenomen, zit het eiwit waarschijnlijk vast aan het monsteroppervlak (zie bijvoorbeeld figuur 5B).

12. Het monster ontkoppelen

  1. Schakel na het uitvoeren van het gewenste experiment de laser uit, haal de flowcel uit de 3-assige trap en koppel de slang van het microfluïdische systeem los.
  2. Plaats de flowcel op een schoon weefsel met de goudlaag van het monster naar boven. Snijd met een scalpel voorzichtig de lijm onder het glazen dekglaasje en til deze voorzichtig op met een afgerond pincet. Gooi het weg in de daarvoor bestemde bak voor gebroken glas.
    LET OP: Gebroken glas en het gebruik van scherpe voorwerpen kunnen letsel veroorzaken. Zorg ervoor dat u een veiligheidsbril, handschoenen en een laboratoriumjas draagt.
  3. Houd de flowcel schuin met de goudlaag nog steeds naar boven gericht en gebruik een afgerond pincet om de lijm aan de onderkant van de flowcel voorzichtig te verwijderen om het monster vrij te maken. Het dupliceren van siliconen zorgt voor gemakkelijke verwijdering zonder de DNH-structuren te beschadigen.
  4. Gebruik een recht pincet, pak het monster op en spoel grondig af met IPA en vervolgens water voordat u het droogt met een luchtpistool. Indien herbruikbaar, bewaar het monster dan in een geschikte container met de goudlaag naar boven.
    OPMERKING: Monsters hebben doorgaans een bruikbare spanwijdte van ongeveer 1-2 weken als ze op de juiste manier worden behandeld, hoewel de grootte van nanostructuren in de loop van de tijd verandert. Als het te beschadigd is, schakel dan over op een nieuw monster voor het volgende experiment. Schade kan de vorm hebben van krassen op het goudoppervlak in de buurt van de nanostructuren of van slechte experimentele prestaties, wat wijst op degradatie van de nanostructuren29.

13. Het systeem klaarmaken voor toekomstig gebruik

  1. Gebruik gevouwen lensdoekje om de olie in één richting van het objectief te vegen, til het op en herhaal het met een ander schoon deel van het doekje.
    OPMERKING: Objectieven zijn gevoelig voor vlekken en krassen, wat de prestaties aanzienlijk kan verminderen. Draag altijd handschoenen tijdens het schoonmaken en vermijd het aanraken van organisch materiaal. Gebruik alleen nieuw lensreinigingsdoekje om vervuiling te voorkomen en reinig in één richting met één beweging. Wrijf niet over de lens en maak het doekje niet heen en weer om schade te minimaliseren. Als chemisch reinigen onvoldoende is, breng dan een kleine hoeveelheid ethanol aan op het tissue, veeg de olie weg zoals eerder vermeld en eindig met een droog tissue.
  2. Als vervolgens dezelfde eiwit-/bufferoplossingen worden gebruikt, hoeft de slang mogelijk niet te worden vervangen. Als er andere oplossingen worden gebruikt, vervang dan de slang om het risico op besmetting door eerdere oplossingen te verminderen.
    NOTITIE: Gebruik dezelfde slang niet langer dan 1 week, zelfs niet als u experimenten uitvoert met dezelfde oplossingen, omdat deze na verloop van tijd vuil wordt.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na gegevensverzameling kan gegevensanalyse worden uitgevoerd op de onbewerkte gegevens met behulp van MATLAB-code om sporen te genereren van de onbewerkte gegevens die door de APD zijn verzameld. Figuur 3 toont een voorbeeld van een vangspoor, inclusief de basislijn vóór het vangen, de vanggebeurtenis waarbij een grote verandering in transmissie (ΔT/T0) en standaarddeviatie wordt waargenomen voordat de laser ongeveer 5 seconden wordt uitgeschakeld voordat hij weer wordt ingeschakeld. Een significante vermindering van de standaarddeviatie en terugkeer van de transmissie naar vergelijkbare niveaus als de basislijn geeft de afgifte van eiwit aan. Lineaire drift wordt uit het spoor verwijderd met behulp van de MATLAB-functie detrend.m, en vervolgens wordt de gemiddelde waarde van de gegevens weer toegevoegd aan het gedetrendeerde spoor. Af en toe moeten we het spoor detrenderen omdat de opstelling in de loop van de tijd afdrijft, waardoor een lineaire afname van de transmissie ontstaat (zie het grijze spoor in figuur 3). Kleine veranderingen in de basislijnsporen voor en na het vangen zijn het gevolg van faseaanpassing om de basislijn te optimaliseren met minimale standaarddeviatie, zoals aangetoond in figuur 4A. Soms zijn eiwitmoleculen zichtbaar in het spoor zonder te worden opgesloten, de zogenaamde voorbijgaande eiwitten. Eiwitten die langskomen, verschijnen als een scherpe verandering in transmissie, vergelijkbaar met een typische val (Figuur 4B), maar met een aanzienlijk kortere duur, zoals weergegeven in Figuur 4A. Spectrale dichtheid van het vermogen (PSD) presenteert een andere analyse om eiwitvangst te bevestigen door signaalsterkte op verschillende frequenties te leveren. Eiwitconformationele bewegingen worden doorgaans gezien in het bereik van >1 μs door spectroscopiemethoden met één molecuul40. Figuur 4C laat zien dat in vergelijking met de basislijn, het vangen van een eiwit leidt tot een hogere signaalsterkte, ten minste binnen het bereik van 10 kHz (> 100 μs). Het benadrukt ook het belang van het afstemmen van de trap op een geoptimaliseerde basislijn, aangezien een slechte basislijn de ruis kan verhogen bij frequenties tussen 50-500 Hz, een frequentiebereik bedekt met eiwitconformatiebewegingen.

figure-results-1
Figuur 3: Volledig vangspoor voor een enkel eiwit. Representatief spoor voor een volledige val, inclusief de basislijn, het vangen van een eiwit en het vrijkomen van het eiwit. Sprongen in het spoor voor en na het vangen zijn te wijten aan uitlijning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 4: Veel voorkomende sporen. (A) Voorbeelden van een uitlijning van een slechte naar een goede basislijn en een eiwit dat dicht bij de hotspot passeert. (B) Trapping trace die het proces weergeeft vanaf de basislijn wanneer de DNH-hotspot leeg is tot wanneer het eiwit wordt opgesloten. (C) Grafiek van de spectrale dichtheid van het vermogen (PSD) tussen de goede en slechte basislijnen weergegeven in (A) en het eiwit gevangen in (B). Hogere PSD-waarden duiden op meer ruis bij bepaalde frequenties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De meeste vanggebeurtenissen volgen hetzelfde algemene patroon als het spoor in figuur 3, hoewel er zich af en toe problemen kunnen voordoen tijdens experimenten. Voor de meeste experimenten moet het eiwit handmatig worden vrijgegeven door de laser uit te schakelen zodra het gewenste experiment is voltooid. In sommige gevallen kan het eiwit echter zonder tussenkomst de val verlaten, zoals weergegeven in figuur 5A. Omgekeerd kunnen eiwitten soms op de vangplaats achterblijven, zelfs nadat de laser is uitgeschakeld, waarschijnlijk omdat het eiwit aan het monster blijft plakken. Dit plakken resulteert in een ruw spoor na het uit- en inschakelen van de laser (zie afbeelding 5B). De kans dat dit gebeurt, hangt af van het eiwit, aangezien sommige eiwitten vatbaarder zijn voor oppervlakteadsorptie41,42. Het gebruik van een coating zoals PEG-thiol kan de kans op aanhechting van eiwitten verkleinen39,43. Tenzij gewenst, zoals het bestuderen van eiwit-eiwitinteracties, is een ander probleem dubbele vangst, waarbij een tweede eiwit na de eerste val wordt gevangen. Dit wordt gekenmerkt door een nieuwe sterke toename van de transmissie, vergelijkbaar met de eerste val, en een verandering in de standaarddeviatie (zie figuur 5C).

figure-results-3
Figuur 5: Voorbeelden van ongewenste vang events. (A) Onbedoelde afgifte van een eiwit uit de DNH-hotspot. (B) Voorbeeld van eiwit dat vast komt te zitten op het monsteroppervlak in de DNH-hotspot. (C) Trace jump treedt op wanneer een tweede eiwit wordt gevangen terwijl het eerste zich nog in de DNH-hotspot bevindt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een representatief experiment uitgevoerd op in situ ijzerbelasting van een apo-ferritinemolecuul demonstreert het gebruik van plasmonische nanopincetten als een instrument om de conformatiedynamiek van eiwitten te onderzoeken29. Ferritine is een ijzerdragereiwit dat in twee toestanden voorkomt: apo-ferritine, dat geen ijzer bevat, en holo-ferritine, dat gevuld is met ijzer44,45. IJzerijzer komt het eiwit binnen via 3-voudige kanalen waar het wordt geoxideerd tot ijzerijzer en wordt opgeslagen in de eiwitkern46. Figuur 6A toont een typisch vangspoor van apo-ferritine met een ijzerhoudende oplossing die gedurende meer dan 20 minuten wordt toegediend terwijl het eiwit wordt opgesloten. De 20 s-sporen die langs het hele spoor op de punten b-e zijn genomen, geven inzicht in de veranderingen die zich in de loop van de tijd aan het eiwit voordoen. In figuur 6B zit apo-ferritine gevangen in een standaard PBS-buffer en worden er geen significante veranderingen in het spoor waargenomen. Figuur 6C, D tonen fluctuaties in de S.D van de sporen, die worden veroorzaakt door ijzerbelasting in het eiwit via zijn 3-voudige kanalen, wat resulteert in een meer dynamische toestand (apo-) waar de kanalen open zijn, en een compactere toestand (holo-) met de kanalen gesloten. Toen het ferritinemolecuul met ijzer werd gevuld, ging het over naar zijn holovorm, wat resulteerde in een stabiel vangspoor, zoals weergegeven in figuur 6E. Kansdichtheidsfuncties (PDF) in figuren 6B-E tonen verder de veranderingen die het eiwit ondergaat bij blootstelling aan verschillende oplossingsomstandigheden in de loop van de tijd.

figure-results-4
Figuur 6: In situ ijzer dat in een ingesloten apoferritine wordt geladen. (A) Volledig transmissiespoor van een DNH met een apoferritinemolecuul ingesloten, gevolgd door het injecteren van een ijzeroplossing op de vangplaats om de conformatieveranderingen van ferritine in verband met ijzerbelasting te observeren. (B) 20-s vangspoor van een apoferritine dat is opgesloten voordat de ijzerhoudende oplossing de hotspot bereikte. (C, D) 20-s vangsporen nadat het apoferritinemolecuul was blootgesteld aan de ijzeroplossing. Blauwe en paarse segmenten markeren de hogere en onderste S.D van het spoor, wat respectievelijk flexibele en stijve conformaties van ferritine aangeeft. (E) 20-s vangspoor nadat apoferritine gedurende >20 minuten aan de ijzerhoudende oplossing was blootgesteld. De grafieken van de kansdichtheidsfunctie (PDF) aan de rechterkant geven de verdeling van de transmissie weer en hebben een kleurcode voor de blauwe en paarse segmenten. Dit cijfer is gewijzigd van29. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Gouden DNH-monster gemonteerd op de 3D-geprinte flowcel. Het monster wordt in een speciale gleuf geplaatst en met dubbelzijdig PET-plakband op de flowcel geplakt. De belangrijkste parameters en bijbehorende metingen voor ons flowcelontwerp zijn gelabeld. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Achterkant van de flowcel met gouden DNH-monster gemonteerd en binnenwand gelabeld. Het monster wordt in de flowcel verzegeld met behulp van duplicaatsiliconen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Diagram van de stroomcel met gouden DNH gemonteerd met inlaat- en uitlaatgaten gelabeld. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een cruciale stap in het protocol is ervoor te zorgen dat de flowcel niet lekt voordat deze in de trap wordt geplaatst, die vooraf buiten de houder met een hoge stroomsnelheid moet worden getest. Lekkage nadat het monster is gemonteerd, kan optische componenten beschadigen, met name het onderste objectief.

De uitlijning kan in de loop van de tijd tijdens een experiment van zijn optimale positie afwijken, waardoor signaalvariatie ontstaat als gevolg van de gevoeligheid van het plasmonische nanopincet. Wanneer dit gebeurt, lijnt u opnieuw uit met behulp van de piëzo-elektrische bedieningselementen tot maximale transmissie en minimale standaarddeviatie van de basislijn, aangezien een ruisende basislijn de kwaliteit van de gegevens vermindert. Er moet voor worden gezorgd dat nauwgezette aantekeningen worden gemaakt van wanneer uitlijningen worden gemaakt om het risico van verwarring door de gebruiker voor een overvulgebeurtenis weg te nemen. Als er een grote drift optreedt, lijn dan de tafel voorzichtig uit om het risico op het vrijkomen van het eiwit te minimaliseren en noteer de aanpassingstijd.

Wijzigingen en wijzigingen in de gepresenteerde techniek kunnen worden aangebracht op basis van specifieke experimentele behoeften. Een temperatuurgeregelde fase kan bijvoorbeeld helpen het monster naar wens af te koelen/verwarmen in plaats van laserverwarming te gebruiken om de temperatuur te verhogen31,33. Andere technieken, bijvoorbeeld interferometrische verstrooiingsmicroscopie (iSCAT), kunnen interferentie van het eiwit binnen het verstrooiingsveld van de DNH veroorzaken, waardoor een extra signaal wordt verkregen dat evenredig is met de polariseerbaarheid van het eiwit, wat geassocieerd is met deeltjesgrootte47,48.

Plasmonische nanopincetten zijn puur een temporele detectietechniek, aangezien gegevens worden geregistreerd door de APD (een single-pixel detector). Deze techniek geeft geen directe informatie over de structurele veranderingen van een eiwit, zoals welke regio's van het eiwit betrokken zijn bij een conformatieverandering of waar een ligand of een ander eiwit aan het eiwit kan binden. Bovendien is de techniek beperkt tot een tijdsbereik van >1 μs vanwege de bemonsteringsfrequentie van de data-acquisitiekaart (1 MHz). Gezien de Nyquist-frequentie, waarbij het hoogst mogelijke bereik de helft van de acquisitiesnelheid is, in dit geval 2 μs onder perfecte omstandigheden.

In dit protocol hebben we het proces beschreven van het opzetten van een plasmonisch nanopincet-experiment om een enkel eiwit te vangen en veranderingen in de conformatiedynamiek in de loop van de tijd te volgen. De techniek kan worden ontwikkeld op elke zelfgebouwde of commerciële microscoop. In tegenstelling tot fluorescentie- of tethering-gebaseerde benaderingen, zoals smFRET en optische pincetten, kan de techniek eiwitten vangen zonder labels of tethers en toch een gevoeligheid van één molecuul bereiken. De omstandigheden van de oplossing kunnen worden gewijzigd terwijl het eiwit wordt opgesloten met behulp van een microfluïdisch systeem, waardoor het effect van verschillende oplossingen op het eiwit in realtime kan worden gevolgd. Deze eigenschappen maken plasmonische nanopincetten tot een veelbelovend hulpmiddel binnen de biofysica en biosensing, met name voor eiwitten die conventionele technieken moeilijk kunnen ondervragen in hun oorspronkelijke staat. Toekomstige toepassingen zullen zich richten op het decoderen van de conformationele dynamica van meer dynamische eiwitten zoals intrinsiek ongeordende eiwitten en eiwitten die intrinsiek ongeordende regio's bevatten, en membraaneiwitten, waarvan de dynamiek en zelfs de structuur aan de huidige technieken ontsnappen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.Z. erkent de steun van het Biotechnology and Biological Sciences Research Council Doctoral Training Partnership (BBSRC DTP) (BB/T0083690/1). De auteurs erkennen de financiering van het UK-India Education and Research Initiative (UKIERI). M.R. waardeert de steun van de Royal Society en de Wolfson Foundation.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x Objective (NA = 1.25)OlympusPLN100XOClean oil only with lens cleaning tissue in one motion
12-1 rotary bidirectional microfluidic valveElveflow
3/2 way solenoid valveElveflow
4x Objective (NA = 0.1)OlympusPLN4XP
AirgunRS Components666-6772
Avalanche photodiode (APD)ThorlabsAPD120A/MDo not oversaturate, 50 MHz bandwidth, static sensitive
Butterfly laser diodeThorlabsFPL852S
Charge-coupled device (camera)HikrobotMV-CE200-10UC
Crystallising dishVWR216-0065
Data acquisition card National instrumentsUSB-63612 MHz sampling rate
Double-sided tapeAdhesive Research IncARcare92712Cut appropriate shape for flow cell with a laser cutter
EthanolFume hood only, use gloves
Fibreport collimatorThorlabsPAF2-A7B
Glass microscope coverslips (thickness 0.17 mm)
Half wave plateThorlabsAHWP10M-980
Ideal-tek 120 mm, stainless steel, straight tweezersRS Components282-7472For holding sample and peeling double sided tape
Isopropanol (IPA)Fume hood only, use gloves
Lens cleaning tissueThorlabsMC-5
Metrosil rapid duplicating silicone parts A and BMetrodentMSILR/1 
Microscope slides (75 mm x 26 mm)
Modular Optical Tweezers SystemThorlabsOTKB/M-CUSTOM
Objective oilOlympusUse gloves, store between 2oC-8oC
Photodiode laser mountThorlabsCLD1015
Piezoelectric controllerThorlabsMDT693B
Piezoelectric stageThorlabsNanomax 300
Planoconcave lens (f = -50 mm)ThorlabsLC1715-B
Planoconvex lens (f = 150 mm)ThorlabsLA1433-B
Planoconvex lens (f = 60 mm)ThorlabsLA1134-B
Poly(ethylene glycol) methyl ether thiol (PEG-thiol) 800 MWSigma Aldrich729108Store between 2oC-8oC
PTFE tubing (ID: 0.18 mm)Vici JourJR-T-6805-M25
PTFE tubing (ID: 0.8 mm)Cole-ParmerWZ-21942-72
SEM-FIBZeissCrossbeam 550Gallium ion source
Shortpass dichroic mirror 805 nmThorlabsDMSP805
Silver mirrorThorlabsPF-10-03-P01
Syringe pumpHarvard Apparatus70-4511
Weller Erem 120 mm stainless steel, flat, rounded tweezersRS Components176-1150For holding glass coverslip and peeling glue from flow cell

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sizing up single-molecule enzymatic conformational dynamics. Chem Soc Rev. 43 (4), 1118-1143 (2014).">Peter Lu, H. P. Sizing up single-molecule enzymatic conformational dynamics. Chem Soc Rev. 43 (4), 1118-1143 (2014).
  2. Single-molecule FRET methods to study the dynamics of proteins at work. Curr Opin Biomed Eng. 12, 8-17 (2019).">Mazal, H., Haran, G. Single-molecule FRET methods to study the dynamics of proteins at work. Curr Opin Biomed Eng. 12, 8-17 (2019).
  3. Probing the structural dynamics of proteins and nucleic acids with optical tweezers. Curr Opin Str Biol. 34, 43-51 (2015).">Ritchie, D. B., Woodside, M. T. Probing the structural dynamics of proteins and nucleic acids with optical tweezers. Curr Opin Str Biol. 34, 43-51 (2015).
  4. Diverse metastable structures formed by small oligomers of α-Synuclein probed by force spectroscopy. PLoS One. 9 (1), e86495(2014).">Neupane, K., Solanki, A., Sosova, I., Belov, M., Woodside, M. T. Diverse metastable structures formed by small oligomers of α-Synuclein probed by force spectroscopy. PLoS One. 9 (1), e86495(2014).
  5. The physics of pulling polyproteins: a review of single molecule force spectroscopy using the AFM to study protein unfolding. Rep Prog Phys. 79 (7), 076601-076601 (2016).">Hughes, M. L., Dougan, L. The physics of pulling polyproteins: a review of single molecule force spectroscopy using the AFM to study protein unfolding. Rep Prog Phys. 79 (7), 076601-076601 (2016).
  6. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).">Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  7. Nanopores: a versatile tool to study protein dynamics. Essays Biochem. 65 (1), 93-107 (2021).">Schmid, S., Dekker, C. Nanopores: a versatile tool to study protein dynamics. Essays Biochem. 65 (1), 93-107 (2021).
  8. Real-time conformational changes and controlled orientation of native proteins inside a protein nanoreactor. J Am Chem Soc. 139 (51), 18640-18646 (2017).">Van Meervelt, V., et al. Real-time conformational changes and controlled orientation of native proteins inside a protein nanoreactor. J Am Chem Soc. 139 (51), 18640-18646 (2017).
  9. Simultaneous determination of the size and shape of single α-Synuclein oligomers in solution. ACS Nano. 17 (13), 12325-12335 (2023).">Awasthi, S., Ying, C., Li, J., Mayer, M. Simultaneous determination of the size and shape of single α-Synuclein oligomers in solution. ACS Nano. 17 (13), 12325-12335 (2023).
  10. Effects of fluorophore attachment on protein conformation and dynamics studied by spFRET and NMR spectroscopy. Chemistry. 23 (57), 14267-14277 (2017).">Sµnchez-Rico, C., Von Vithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of fluorophore attachment on protein conformation and dynamics studied by spFRET and NMR spectroscopy. Chemistry. 23 (57), 14267-14277 (2017).
  11. How does fluorescent labeling affect the binding kinetics of proteins with intact cells. Biosens Bioelectr. 66, 412-416 (2015).">Yin, L., et al. How does fluorescent labeling affect the binding kinetics of proteins with intact cells. Biosens Bioelectr. 66, 412-416 (2015).
  12. Rate limit of protein elastic response is tether dependent. Proc Natl Acad Sci. 109 (36), 14416-14421 (2012).">Berkovich, R., et al. Rate limit of protein elastic response is tether dependent. Proc Natl Acad Sci. 109 (36), 14416-14421 (2012).
  13. Self-supervised machine learning pushes the sensitivity limit in label-free detection of single proteins below 10 kDa. Nat Meth. 20 (3), 442-447 (2023).">Dahmardeh, M., Mirzaalian Dastjerdi, H., Mazal, H., Köstler, H., Sandoghdar, V. Self-supervised machine learning pushes the sensitivity limit in label-free detection of single proteins below 10 kDa. Nat Meth. 20 (3), 442-447 (2023).
  14. A quantitative description for optical mass measurement of single biomolecules. ACS Photon. 10 (8), 2699-2710 (2023).">Becker, J., et al. A quantitative description for optical mass measurement of single biomolecules. ACS Photon. 10 (8), 2699-2710 (2023).
  15. Estimation of shape, volume, and dipole moment of individual proteins freely transiting a synthetic nanopore. ACS Nano. 13 (5), 5231-5242 (2019).">Houghtaling, J., et al. Estimation of shape, volume, and dipole moment of individual proteins freely transiting a synthetic nanopore. ACS Nano. 13 (5), 5231-5242 (2019).
  16. Fast translocation of proteins through solid state nanopores. Nano Lett. 13 (2), 658-663 (2013).">Plesa, C., et al. Fast translocation of proteins through solid state nanopores. Nano Lett. 13 (2), 658-663 (2013).
  17. Nanopore electro-osmotic trap for the label-free study of single proteins and their conformations. Nat Nanotechnol. 16 (11), 1244-1250 (2021).">Schmid, S., Stömmer, P., Dietz, H., Dekker, C. Nanopore electro-osmotic trap for the label-free study of single proteins and their conformations. Nat Nanotechnol. 16 (11), 1244-1250 (2021).
  18. Active delivery of single DNA molecules into a plasmonic nanopore for label-free optical sensing. Nano Lett. 18 (12), 8003-8010 (2018).">Shi, X., Verschueren, D. V., Dekker, C. Active delivery of single DNA molecules into a plasmonic nanopore for label-free optical sensing. Nano Lett. 18 (12), 8003-8010 (2018).
  19. Label-free optical detection of DNA translocations through plasmonic nanopores. ACS Nano. 13 (1), 61-70 (2019).">Verschueren, D. V., et al. Label-free optical detection of DNA translocations through plasmonic nanopores. ACS Nano. 13 (1), 61-70 (2019).
  20. Nano-optical tweezing of single proteins in plasmonic nanopores. Small Meth. 3 (5), 1800465(2019).">Verschueren, D., Shi, X., Dekker, C. Nano-optical tweezing of single proteins in plasmonic nanopores. Small Meth. 3 (5), 1800465(2019).
  21. Quantification of low affinity binding interactions between natural killer cell inhibitory receptors and targeting ligands with a self-induced back-action actuated nanopore electrophoresis (SANE) sensor. Nanotechnology. 32 (4), 045501(2020).">Peri, S. S. S., et al. Quantification of low affinity binding interactions between natural killer cell inhibitory receptors and targeting ligands with a self-induced back-action actuated nanopore electrophoresis (SANE) sensor. Nanotechnology. 32 (4), 045501(2020).
  22. Salt gradient control of translocation dynamics in a solid-state nanopore. Anal Chem. 93 (49), 16700-16708 (2021).">Leong, I. W., Tsutsui, M., Yokota, K., Taniguchi, M. Salt gradient control of translocation dynamics in a solid-state nanopore. Anal Chem. 93 (49), 16700-16708 (2021).
  23. Plasmon nano-optical tweezers. Nat Photon. 5 (6), 349-356 (2011).">Juan, M. L., Righini, M., Quidant, R. Plasmon nano-optical tweezers. Nat Photon. 5 (6), 349-356 (2011).
  24. Self-induced back-action optical trapping of dielectric nanoparticles. Nat Phys. 5 (12), 915-919 (2009).">Juan, M. L., Gordon, R., Pang, Y., Eftekhari, F., Quidant, R. Self-induced back-action optical trapping of dielectric nanoparticles. Nat Phys. 5 (12), 915-919 (2009).
  25. Optical trapping of 12 nm dielectric spheres using double-nanoholes in a gold film. Nano Lett. 11 (9), 3763-3767 (2011).">Pang, Y., Gordon, R. Optical trapping of 12 nm dielectric spheres using double-nanoholes in a gold film. Nano Lett. 11 (9), 3763-3767 (2011).
  26. Optical trapping of a single protein. Nano Lett. 12 (1), 402-406 (2012).">Pang, Y., Gordon, R. Optical trapping of a single protein. Nano Lett. 12 (1), 402-406 (2012).
  27. Quantification of high-efficiency trapping of nanoparticles in a double nanohole optical tweezer. Nano Lett. 14 (2), 853-856 (2014).">Kotnala, A., Gordon, R. Quantification of high-efficiency trapping of nanoparticles in a double nanohole optical tweezer. Nano Lett. 14 (2), 853-856 (2014).
  28. Modelling of the dynamic polarizability of macromolecules for single-molecule optical biosensing. Sci Rep. 12 (1), 1995(2022).">Booth, L. S., et al. Modelling of the dynamic polarizability of macromolecules for single-molecule optical biosensing. Sci Rep. 12 (1), 1995(2022).
  29. Optical monitoring of in situ Iron loading into single, native ferritin proteins. Nano Lett. 23 (8), 3251-3258 (2023).">Yousefi, A., et al. Optical monitoring of in situ Iron loading into single, native ferritin proteins. Nano Lett. 23 (8), 3251-3258 (2023).
  30. Structural Flexibility and Disassembly Kinetics of Single Ferritin Molecules Using Optical Nanotweezers. ACS Nano. 18 (24), 15617-15626 (2024).">Yousefi, A., et al. Structural Flexibility and Disassembly Kinetics of Single Ferritin Molecules Using Optical Nanotweezers. ACS Nano. 18 (24), 15617-15626 (2024).
  31. Energy landscape of conformational changes for a single unmodified protein. NPJ Biosens. 1 (1), 14-14 (2024).">Peters, M., et al. Energy landscape of conformational changes for a single unmodified protein. NPJ Biosens. 1 (1), 14-14 (2024).
  32. Label-free tracking of proteins through plasmon-enhanced interference. ACS Nanosci Au. 4 (1), 69-75 (2024).">Peters, M., McIntosh, D., Branzan Albu, A., Ying, C., Gordon, R. Label-free tracking of proteins through plasmon-enhanced interference. ACS Nanosci Au. 4 (1), 69-75 (2024).
  33. arXiv. , (2021).">Ying, C., et al. Watching single unmodified enzymes at work. arXiv. , (2021).
  34. Direct observation of small molecule activator binding to single PR65 protein. NPJ Biosensing. 2 (1), 1-10 (2025).">Yang-Schulz, A., et al. Direct observation of small molecule activator binding to single PR65 protein. NPJ Biosensing. 2 (1), 1-10 (2025).
  35. FIB-milled plasmonic nanoapertures allow for long trapping times of individual proteins. iScience. 24 (11), 103237(2021).">Yang, W., van Dijk, M., Primavera, C., Dekker, C. FIB-milled plasmonic nanoapertures allow for long trapping times of individual proteins. iScience. 24 (11), 103237(2021).
  36. Novel plasmonic nanocavities for optical trapping-assisted biosensing applications. Adv Optical Mater. 8 (7), 1901481(2020).">Koya, A. N., et al. Novel plasmonic nanocavities for optical trapping-assisted biosensing applications. Adv Optical Mater. 8 (7), 1901481(2020).
  37. Development of a microstructured surface using the FIB. J Micromanufact. 1 (1), 53-61 (2018).">Goswami, A., Umashankar, R., Gupta, A. K., Aravindan, S., Rao, P. V. Development of a microstructured surface using the FIB. J Micromanufact. 1 (1), 53-61 (2018).
  38. Optical field enhancement at cusps between adjacent nanoapertures. Nano Lett. 7 (3), 557-564 (2007).">Onuta, T. D., Waegele, M., DuFort, C. C., Schaich, W. L., Dragnea, B. Optical field enhancement at cusps between adjacent nanoapertures. Nano Lett. 7 (3), 557-564 (2007).
  39. The influence of PEG-thiol derivatives on controlling cellular and bacterial interactions with gold surfaces. Appl Surf Sci. 462, 980-990 (2018).">Al-Ani, A., et al. The influence of PEG-thiol derivatives on controlling cellular and bacterial interactions with gold surfaces. Appl Surf Sci. 462, 980-990 (2018).
  40. Single-molecule spectroscopy of protein folding dynamics-expanding scope and timescales. Curr Opin Str Biol. 23 (1), 36-47 (2013).">Schuler, B., Hofmann, H. Single-molecule spectroscopy of protein folding dynamics-expanding scope and timescales. Curr Opin Str Biol. 23 (1), 36-47 (2013).
  41. Protein corona, understanding the nanoparticle-protein interactions and future perspectives: A critical review. Int J Biol Macromol. 169, 290-301 (2021).">Kopac, T. Protein corona, understanding the nanoparticle-protein interactions and future perspectives: A critical review. Int J Biol Macromol. 169, 290-301 (2021).
  42. The interaction mechanism between gold nanoparticles and proteins: Lysozyme, trypsin, pepsin, γ-globulin, and hemoglobin. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 272, 120983(2022).">Li, X., Guo, W., Xu, R., Song, Z., Ni, T. The interaction mechanism between gold nanoparticles and proteins: Lysozyme, trypsin, pepsin, γ-globulin, and hemoglobin. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 272, 120983(2022).
  43. Strongly stretched protein resistant poly(ethylene glycol) brushes prepared by grafting-To. ACS Appl Mater Inter. 7 (14), 7505-7515 (2015).">Emilsson, G., et al. Strongly stretched protein resistant poly(ethylene glycol) brushes prepared by grafting-To. ACS Appl Mater Inter. 7 (14), 7505-7515 (2015).
  44. Gated pores in the ferritin protein nanocage. Inorg Chim Acta. 361 (4), 868-874 (2008).">Theil, E. C., Liu, X. S., Tosha, T. Gated pores in the ferritin protein nanocage. Inorg Chim Acta. 361 (4), 868-874 (2008).
  45. The ferritin iron entry and exit problem. Inorg Chim Acta. 297 (1), 242-251 (2000).">Theil, E. C., et al. The ferritin iron entry and exit problem. Inorg Chim Acta. 297 (1), 242-251 (2000).
  46. Functional properties of threefold and fourfold channels in Ferritin D=deduced from electrostatic calculations. Biophys J. 84 (4), 2256-2263 (2003).">Takahashi, T., Kuyucak, S. Functional properties of threefold and fourfold channels in Ferritin D=deduced from electrostatic calculations. Biophys J. 84 (4), 2256-2263 (2003).
  47. Label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iSCAT microscopy. J Vis Exp. (141), e58486(2018).">Gemeinhardt, A., et al. Label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iSCAT microscopy. J Vis Exp. (141), e58486(2018).
  48. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nat Comm. 5 (1), 4495(2014).">Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nat Comm. 5 (1), 4495(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasmonic NanotweezersSingle Molecule ProteinsConformational DynamicsLabel Free Protein AnalysisLocalized Surface PlasmonProtein TrappingMicrofluidic SystemAvalanche PhotodiodeProtein Structural ChangesGold Nanostructures

Related Articles