Het afstemmen van de contractiliteit en vervormingsmodi van actieve op actine gebaseerde assemblages in vitro: van tweedimensionale actieve netwerken tot druppels van vloeibare kristallen

Summary

Hier presenteren we methoden voor het bereiden van quasi-tweedimensionale (2D) verstrengelde, verknoopte en vloeibare kristalactine-assemblages van gezuiverde eiwitten.

Abstract

Materialen op basis van actine-cytoskeletten worden op grote schaal onderzocht als modelcellulaire materialen om fysische mechanismen van celmechanica op te helderen, zoals vormregulatie en krachtproductie, evenals intrigerende zachte polymere materialen. In deze methode beschrijven we het in vitro maken van op actine gebaseerde assemblages met behulp van gezuiverd eiwit voor fluorescentiemicroscopiestudies. We polymeriseren lange actinefilamenten in een monsterkamer en gebruiken een polymeerverarmend middel om filamenten in een tweedimensionaal (2D)-verstrengeld netwerk te proppen tegen een oppervlak dat is gepassiveerd met een oppervlakteactieve laag. Het toevoegen van myosine II-filamenten van de skeletspier in aanwezigheid van adenosinetrifosfaat (ATP) induceert samentrekking van het actinenetwerk. Door actinefilamenten te bundelen met een crosslinker, stemmen we de contractiliteit van de assemblage af, waarbij we overgaan van een materiaal dat knikt naar een materiaal dat op microschaal glijdt. Door de lengte van de actinefilamenten te verkleinen door actine te copolymeriseren in aanwezigheid van afdekkend eiwit, stemmen we het materiaal af van een 2D-netwerk naar een vloeibaar kristal. Verknoping van gedispergeerde korte actinefilamenten resulteert in de vorming van driedimensionale (3D) vloeibare kristaldruppels.

Introduction

Actieve biologische materialen liggen ten grondslag aan mechanische processen in een verscheidenheid aan fysiologische processen, waaronder intracellulair transport, celmigratie, celvormregulatie en biologische krachtgeneratie ^1,2,3. In vitro assemblages van cytoskeletale systemen, opgebouwd uit gezuiverde en gemanipuleerde eiwitcomponenten die zelf in buffer zijn geassembleerd, zijn een gevestigd hulpmiddel voor het karakteriseren van fundamentele biofysische en biochemische processen 4,5,6,7. Deze vereenvoudigde modelsystemen maken het mogelijk om eiwitten te bestuderen zonder de complexiteit van cellulaire omgevingen, waardoor de rollen van individuele componenten kunnen worden geïdentificeerd. Naast het ondersteunen van fundamentele biologische studies, worden in vitro cytoskeletale assemblages ook op grote schaal ontwikkeld als experimentele systemen om vloeibare kristallijne en actieve of uit evenwicht zijnde materialen te onderzoeken 8,9,10,11,12,13,14,15.

Actine is een belangrijk biopolymeer in cytoskeletale assemblages die de celmechanica en -dynamiek reguleren door middel van motorische en polymerisatie-aangedreven krachten ^3,16. Fluorescentiemicroscopie-experimenten maken visualisatie mogelijk van structurele veranderingen in het actinenetwerk tijdens processen zoals motorgestuurde contractie en actinebundeling door verknopingseiwitten. Het afbeelden van driedimensionale actinenetwerken terwijl ze worden gemodelleerd door ingebedde motoreiwitten heeft de rol van actinecrosslinkers voor netwerkcontractie en patroonvorming belicht 12,17,18,19. Quasi-tweedimensionale actinenetwerken overwinnen echter uitdagingen in beeldvorming met voldoende spatiotemporele resolutie om structurele veranderingen in het netwerk vast te leggen. Bovendien zijn quasi-tweedimensionale actinestructuren met een hoge dichtheid een nauwere nabootsing van cellulaire assemblages zoals de dichte actinecortex van een cel²⁰. Strategieën om quasi-tweedimensionale actinestructuren te produceren, omvatten de hechting van actinenucleerende eiwitten aan een dekglaasje ^21,22, koppeling van actine aan een oppervlak via linkermoleculen^10,23,24, vorming van dichte actinebundels bevestigd aan kralen op een dekglaasoppervlak^25,26, en concentratie van actinefilamenten op een dekglaasoppervlak met moleculaire crowding-middelen^10,27.

Hier beschrijven we een methode voor het maken van reproduceerbare modelassemblages op basis van actine en hoe deze kunnen worden aangepast om variaties van actieve netwerken tot quasi-2D vloeibare kristallen en nematische druppeltjes voor te bereiden. We hebben eerder vergelijkbare methoden gebruikt om de vorming van fasegescheiden vloeibare kristallijne druppeltjes van korte actinefilamenten met crosslinkertoevoeging¹¹, veranderingen in myosine II-gegenereerde actinenetwerkvervormingsmodi (bijv. filamentknik of relatieve verschuifing) met filamentverknoping en connectiviteit²⁸, verschillen in myosine II-gegenereerde krachten op actinebundels met variërende afstand en compliantie²⁹, en myosine II transport³⁰. Het gebruik van verknopingseiwitten en actine-afdekkende eiwitten maakt een systematische variatie van de lengte en assemblagearchitectuur van actinefilamenten mogelijk.

Protocol

OPMERKING: Eiwitten en etikettering: Voor de toepassing van dit protocol wordt aangenomen dat de onderzoeker begint met voorraden gezuiverde eiwitten, die fluorescerend worden geëtiketteerd wanneer dat nodig is voor fluorescentiemicroscopieonderzoek. Deze eiwitten kunnen worden gekocht of gezuiverd en fluorescerend worden geëtiketteerd in lab 31,32,33,34,35,36,37. In dit protocol is gebruik gemaakt van voorraden eiwitten die zijn ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 °C. De eiwitten kunnen meestal op vergelijkbare manieren worden geëtiketteerd. Het eiwit kan worden geëtiketteerd als een zuiveringsstap of uit een bevroren bouillon. Ontdooi bevroren eiwitvoorraden op ijs voordat u verder gaat met het etiketteren. Het volgende is een methode voor het fluorescerend labelen van skeletspiermyosine II (myosine) met een maleimide-gefunctionaliseerde fluorofoor (aangepast van³⁸).

1. Bereid fluorescerend gelabelde myosine voor

1. Begin met ~2 ml myosine in een concentratie van 5-10 mg/ml.
   OPMERKING: In dit protocol werd skeletspiermyosine II gezuiverd uit kippenspier met behulp van gepubliceerde methoden³⁵ gebruikt. De myosine wordt opgeslagen in Myosine opslagbuffer (25 mM KPO₄, 0,6 M KCl, 10 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1 mM dithiothreitol (DTT), pH 6,6), hetzij direct na zuivering, hetzij uit bevroren voorraad. Het is belangrijk om de myosine te allen tijde koud te houden om verlies van motorische activiteit te voorkomen.
2. Voeg DTT toe aan de ontdooide myosineoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 10 mM. Gebruik een 1 M DTT-voorraadoplossing om het volume te beperken.
   OPMERKING: De DTT vermindert de thiolgroep op cysteïnen in het myosine-eiwit, waardoor ze worden voorbereid om te reageren met de maleimide voor etikettering.
3. Om interferentie met de etiketteringsreactie te voorkomen, verwijdert u de DTT door 's nachts te dialyseren in 50 mM HEPES, 500 mM KCl, 1 mM EDTA, pH 7,6, bij 4 °C.
4. Centrifugeer de myosineoplossing na dialyse gedurende 15 minuten bij 100.000 x g bij 4 °C om eventuele aggregaten te pelleteren. Verzamel de supernatant.
5. Bepaal de concentratie myosine in het bovenstaande met behulp van een spectrofotometer. Schat de myosineconcentratie met behulp van een extinctiecoëfficiënt bij 280 nm van ~148.000 ^{M-1 cm-1} voor^{skeletspiermyosine 38}. Deze extinctiecoëfficiënt gaat ervan uit dat een "monomeer" bestaat uit een zware keten, een essentiële lichte keten en een regulerende lichte keten.
6. Bereid fluorofoor voor op de etiketteringsreactie door fluorofoor in poedervorm te resuspenderen in droog dimethylsulfoxide (DMSO) tot een concentratie van 5 mM fluorofoor.
   OPMERKING: Elke fluorofoor met een maleimide-reactieve groep zou moeten werken. Alexa 647 maleimide werd gebruikt. DMSO is hygroscopisch en verzamelt water. "Droog" DMSO verwijst naar DMSO die in een omgeving is opgeslagen om waterophoping te voorkomen. Om ervoor te zorgen dat het oplosmiddel droge DMSO is, werd voor deze stap een vers geopende ampul DMSO gebruikt. Leg DMSO-oplossingen niet op ijs. DMSO heeft een smeltpunt van 19 °C, dus het moet op kamertemperatuur (of iets warmer) zijn om³⁹ te pipetten.
   LET OP: DMSO kan door handschoenen heen dringen, dus het is een goede gewoonte om dubbele nitrilhandschoenen te dragen en ervoor te zorgen dat morsen wordt voorkomen.
7. Om de myosine voor te bereiden op het toevoegen van fluorofoor, haalt u de myosineoplossing kort van het ijs en laat u deze opwarmen tot kamertemperatuur (RT).
   OPMERKING: Laat myosine niet langer dan nodig op RT staan. Voer deze stap uit nadat de fluorofoor in DMSO is gesuspendeerd.
8. Zodra de myosine-oplossing in de buurt van RT is, voeg je de fluorofooroplossing toe aan de myosine en meng je snel zodat er een molaire verhouding van 5:1 is van fluorofoor: myosine. Doe de myosine-oplossing op ijs zodra deze is gemengd met de fluorofoor.
9. Incubeer gedurende 1 uur op ijs, beschermd tegen licht, en stop dan de reactie door DTT toe te voegen tot een concentratie van 1 mM. Gebruik een DTT-voorraad van 1 M om het toegevoegde volume te minimaliseren.
10. Verwijder niet-gereageerde fluoroforen. Gebruik een van de twee methoden die hieronder worden beschreven:
    1. Optie 1:
       1. Polymeriseer myosine door het langzaam te verdunnen tot een F-buffer (10 mM Imidazool, 50 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 4 mM ATP, pH 7,5). Dit is ongeveer een verdunning van 10x, afhankelijk van het verfvolume dat in stap 1.8 is toegevoegd.
       2. Incubeer 20 minuten op ijs. Centrifugeer op 8.000 x g in een gekoelde centrifuge bij 4 °C gedurende 10 minuten tot pellets.
       3. Gooi het bovenstaande met vrije kleurstof weg en suspendeer/depolymeriseer myosine met myosineopslagbuffer (vanaf stap 1). Om eventuele resterende kleurstof te verwijderen, dialyseert u in 5 mM 2-[4-(2-sulfoethyl)piperazin-1-yl]ethaansulfonzuur (PIPES), 0,45 M KCl, pH 7,0 (>100-voudig volumeovermaat) driemaal gedurende 15 minuten elk met behulp van een dialysecup met 10 kD cutoff.
    2. Optie 2:
       1. Gebruik een ontziltingskolom voor bufferuitwisseling in 5 mM PIPES, 0,45 M KCl, pH 7,0, met het standaardprotocol van de kolomfabrikant.
11. Schat de fluorofoor-eiwitverhouding door de concentratie van myosine en fluorofoor te meten met een spectrofotometer, met behulp van extinctiecoëfficiënten voor myosine bij 280 nm en voor de fluorofoor zoals gerapporteerd door de fabrikant. Een verhouding van 2-4 is typisch.
    OPMERKING: De gelabelde myosine is nu klaar voor het snel invriezen van aliquots in vloeibare stikstof. Aliquots worden opgeslagen bij -80 °C voor langdurige opslag.

2. Optioneel: Procedure om inactieve myosine te verwijderen

OPMERKING: Myosine kan in experimenten rechtstreeks uit een ontdooid aliquot worden gebruikt, maar een deel van de myosine zal inactief zijn. De volgende procedure beschrijft hoe inactieve myosine kan worden verwijderd. Dit is een optionele stap, maar het kan cruciaal zijn voor de reproduceerbaarheid. Myosine-aliquots worden ongeveer 3 dagen na ontdooiing gebruikt, bewaard bij 4 °C of op ijs.

1. Polymeriseer niet-gelabelde, phalloïdine-gestabiliseerde actine:
   1. Meng 10 μl 10x F-buffer, 1 μl 100 mM ATP en ddH₂O zodanig dat het uiteindelijke volume (inclusief actine in stap 2.1.2) 100 μl is in een microcentrifugebuis.
   2. Voeg actinemonomeer toe tot een eindconcentratie van 20 μM en pipetteermeng.
   3. Om actinefilamenten te stabiliseren, voegt u falloïdine toe tot een eindconcentratie van 6,7 μM met behulp van een voorraad van 100 μM falloïdine in methanol en pipettenmengsel.
      LET OP: Phalloidin is een toxine⁴⁰. Vermijd morsen en vervuiling.
   4. Incubeer gedurende 20 minuten op ijs om actine te laten polymeriseren. Bewaar de actine na polymerisatie bij 4 °C voor toekomstige spin-downs.
2. Pipetteer 10 μL phalloïdine-gestabiliseerde actine, 3 μL 10x F-buffer, 0,3 μL 100 mM ATP, 6 μL 2 M KCl en ddH₂O tot een eindvolume van 30 μL (inclusief volume geassocieerd met het toevoegen van myosine in de volgende stap) in een microcentrifugebuis op ijs.
3. Voeg dimeer gelabelde myosine uit de bereide bouillon toe aan de gewenste concentratie, waarbij een molaire verhouding van myosine tot actine van ≤ 1:6 wordt aangehouden.
4. Centrifugeer de resulterende oplossing koud (4 °C) bij 100.000 x g gedurende 30 min. Inactieve myosine bindt zich aan actinefilamenten en blijft gebonden. De inactieve myosine- en actinefilamenten vormen tijdens het centrifugeren een pellet.
5. Verwijder het bovenstaande (dat actieve myosine bevat) en bewaar het bij 4 °C voor gebruik in experimenten.
6. Schat de myosineconcentratie met behulp van dezelfde spectrofotometrische methode om de myosineconcentratie na het labelen te meten.
   OPMERKING: Bij de eiwit- en ATP-concentraties die in het supernatant blijven, wordt de absorptiepiek van 280 nm verduisterd door de ATP-absorptiepiek van 260 nm, dus het meten van de concentratie door de absorptie geassocieerd met de fluorofoor of een relatieve fluorescentiemeting is nauwkeuriger.

3. Bereid de oplossing van de oppervlakteactieve stof voor

OPMERKING: De oppervlakteactieve oplossing kan ook voorgemengd en klaar voor gebruik worden gekocht.

1. Begin met een schoon glazen flesje. Spoel de injectieflacon af met water en ethanol om mogelijke verontreinigingen in de olie, die een oplosmiddel is voor de oppervlakteactieve stof, te verwijderen. Gebruik injectieflacons van borosilicaatglas met een met polytetrafluorethyleen (PTFE) beklede dop.
2. Neem 5-20 mg fluorsurfactant op met behulp van een pipetpunt en deponeer op de bodem van een glazen injectieflacon. Meet de hoeveelheid oppervlakteactieve stof per gewicht met behulp van een balans met een nauwkeurigheid van minder dan een milligram.
3. Pipetteer de juiste hoeveelheid gefluoreerde olie om een oplossing van 2 gew.% te maken en sluit de injectieflacon.
   OPMERKING: De olie is vluchtig, dus sluit de injectieflacon direct na het meten.
4. Vortex op lage snelheid om te mengen.
   OPMERKING: De oplossing kan nu enkele weken bij 4 °C worden bewaard. De leeftijd en kwaliteit van de oppervlakteactieve stof kunnen zowel de verdringing als het uiterlijk van de actine beïnvloeden. Actine dat gespikkeld lijkt, aan het oppervlak kleeft of niet naar het oppervlak verdringt, kan erop wijzen dat een verse oplossing van oppervlakteactieve stoffen nodig is. Opslag onder stikstofgas kan de houdbaarheid verlengen.

4. Bereid de monsterkamer voor (drie opties)

OPMERKING: In dit gedeelte wordt een procedure beschreven voor het construeren van drie standaard monsterkamers die worden gebruikt voor het voorbereiden van monsters voor microscopie. De volgende twee secties hebben betrekking op het voorbereiden van het eigenlijke monster en het passiveren van de monsterkamer voor het laden van monsters.

1. Optie 1: Flowcell
   OPMERKING: Een eenvoudige flowcel is in veel laboratoria een standaard manier om microscoopmonsters te maken. Voor dit protocol is het bijzonder geschikt voor de monsters die zijn omhuld met emulsiedruppels. Het kan moeilijk zijn om grote, vlakke gezichtsvelden te bereiken met de oppervlakteactieve oppervlaktecoating die in dit protocol wordt beschreven, dus voor 2D-monsters zijn opties 2 en 3 vaak beter reproduceerbaar. De kanaalgeometrie kan ook leiden tot ongelijkmatige menging van componenten die op latere tijdstippen worden toegevoegd, zoals myosine.
   1. Plaats 2 stukken dubbelzijdig plakband parallel aan elkaar over de breedte van het microscoopglaasje om de grenzen van het flowcell-kanaal te vormen. Het kanaal tussen de twee stukken tape moet ongeveer 2 mm breed zijn.
      OPMERKING: Kleinere kanalen helpen voorkomen dat emulsies vast komen te zitten in het begindeel van het kanaal. Om een goede afdichting te maken, gebruikt u stukjes tape die net langer zijn dan de breedte van de glasdia en snijdt u deze bij na het bouwen van de flowcell.
   2. Plaats het dekglaasje over het tapekanaal. Zorg ervoor dat het dekglaasje loodrecht op het microscoopglaasje staat. Gebruik hiervoor een dekglaasje van 30 mm x 40 mm, omdat het een kleine overhang geeft wanneer het op een dia wordt geplaatst.
   3. Om een goede afdichting te creëren en luchtbellen tussen de tape en het dekglaasje te elimineren, drukt u op het gedeelte van het dekstrookje dat in contact komt met dubbelzijdig plakband.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat u het dekglaasje niet breekt tijdens het aandrukken langs de randen. Wrijven over het gebied met een afgerond voorwerp, zoals het uiteinde van een afgedekte marker, werkt goed om de tape naar beneden te drukken.
   4. Snijd met een scheermesje overtollige tape van het microscoopglaasje en het dekglaasje, zodat de enige zichtbare tape zich in het monsterkanaal bevindt.
      NOTITIE: Wees voorzichtig met het voltooien van deze stap, want het is gemakkelijk om per ongeluk het dekglaasje te breken terwijl u de tape probeert te verwijderen.
2. Optie 2: Cilinder op een onbehandeld dekglaasje
   OPMERKING: Deze optie is geschikt voor 2D vlakke monsters. Het is handig om op verschillende tijdstippen componenten toe te voegen tijdens microscopie-experimenten. Deze monsterkamer mag niet worden gebruikt voor emulsies, die crème in plaats van bezinksel, waardoor beeldvorming wordt bemoeilijkt.
   1. Spoel het dekglaasje en de glazen klooncilinder af met water, ethanol en water. Aan de lucht laten drogen.
   2. Plak met een dunne laag epoxy van 5 minuten de glazen klooncilinder op het dekglaasje.
      OPMERKING: Het is handig om kracht uit te oefenen op de cilinder terwijl de epoxy droogt door een schoon voorwerp op de cilinder te plaatsen. Een klein petrischaaltje of het dekglaasje kan goed werken.
3. Optie 3: Cilinder op een met silaan beklede dekstrip
   OPMERKING: Deze optie resulteert reproduceerbaar in een groot, vlak gebied in het midden van de kamer en vermindert de bulkstroom van het monster. Om dit te bereiken, werd een hydrofoob gebied gecreëerd dat wordt omgeven door een hydrofiel gebied op het dekglaasje, wat resulteert in een eindmonster met een actinenetwerk op een gepassiveerd, beperkt gebied waar de actine is verankerd aan de hydrofiele gebieden aan de rand van de kamer. Deze monsterkamer mag niet worden gebruikt voor emulsies, die crème in plaats van sediment in buffer veroorzaken, waardoor beeldvorming wordt bemoeilijkt.
   1. Bereid dekglaasjes voor met een silaanlaag om ze hydrofoob te maken.
      1. Plaats schone glazen dekglaasjes in een roestvrijstalen rek. Reinig het glas vooraf door sonicatie in wasmiddel of ethanol indien gewenst.
      2. Verdun in een glazen kleurschaaltje trimethoxy(octyl)silaan tot een 2%-oplossing in isopropanol.
      3. Dompel de dekglaasjes 10 minuten onder in de oplossing.
      4. Vervang de oplossing door water om te spoelen. Til de dekglaasjes zes keer op en dompel ze opnieuw onder. Herhaal het proces nog vier keer met tussendoor de waterverversing.
      5. Dek de rekken af met aluminiumfolie om dekglaasjes te beschermen tegen stof en droog ze af bij 25-30 °C.
   2. Plaats een met octylsilaan behandeld dekglaasje op de bodem van een glazen petrischaal of een andere open glazen container die in de ultraviolette (UV)-ozonreiniger past.
   3. Plaats met een tang een PTFE-vierkant van 2 mm x 2 mm (gesneden uit een vel) op het dekglaasje dat als masker zal dienen voor de volgende UV-ozonbehandeling.
   4. Behandel het dekglaasje gedurende 10 minuten met UV-ozon. Dit proces maakt het glas hydrofiel in de blootgestelde gebieden die niet door het PTFE-masker worden bedekt.
   5. Verwijder de schaal voorzichtig zonder het dekglaasje of PTFE-vierkant te verstoren. Plak een glazen klooncilinder op het dekglaasje met behulp van 5 minuten epoxy. Zorg ervoor dat de cilinder het PTFE-vierkant omringt, dat met een tang kan worden verwijderd nadat de epoxy is opgedroogd.
      OPMERKING: Het PTFE-vierkant kan in toekomstige experimenten worden hergebruikt.

5. Het actinenetwerk samenstellen

OPMERKING: Het volgende is voor de bereiding van een monster van 50 μL. Voor cilindermonsters kan een groter volume de effecten van de meniscus verminderen en de stabiliteit van het monster vergroten.

1. Voeg aan een microcentrifugebuis 5 μl 10x F-buffer, ddH₂O toe die nodig is om het uiteindelijke volume op 50 μl te brengen, 1 μl 25 vol% bèta-mercaptoethanol, 1 μl 225 mg/ml glucose, 1 μl van een mengsel van glucoseoxidase (135 mg/ml) en catalase (85.000 eenheden/ml), 1 μl 25 mM ATP, en 10 μL 2 gew.% 15 centipoise methylcellulose. Pipetten grondig mengen.
   OPMERKING: Bèta-mercaptoethanol is een toxine. Vermijd morsen en vervuiling. De reagentia glucoseoxidase, catalase, glucose en bèta-mercaptoethanol zitten in het monster om een zuurstofopvangsysteem te creëren. De methylcellulosestockoplossing wordt bereid door te roeren bij 4 °C en kan enkele weken bij 4 °C worden bewaard. Methylcellulose kan uit de oplossing neerslaan en moet opnieuw worden bereid als er zichtbare neerslag is of als de actine-crowding slecht is.
2. Optioneel: Voeg verknopingseiwit toe (0,1-1 crosslinkereiwit voor elke 1 actinemonomeer). Pipet mix.
   OPMERKING: Verknopingseiwit (en) kan ook worden toegevoegd na actinepolymerisatie en 10-20 minuten worden gebindt voordat myosine wordt toegevoegd. Dit heeft de voorkeur voor crosslinkerconcentraties die hoog genoeg zijn om actinefilamenten te bundelen - de bundels zijn gelijkmatiger en reproduceerbaarder verdeeld op het grensvlak tussen oppervlakteactieve stof en water. De cilindermonsterkamer is geschikt voor het toevoegen van een crosslinker nadat de actine is gepolymeriseerd.
3. Voeg phalloidine toe (1 falloïdine voor elke 1-3 actinemonomeren), indien gewenst. Pipet mix.
4. Meng in een aparte buis niet-geëtiketteerd en geëtiketteerd actine zodanig dat wanneer het actinemengsel volledig aan het monster van 50 μL wordt toegevoegd, de totale concentratie 2.64 μM zal zijn. Gebruik een verhouding van 1 geëtiketteerd actinemonomeer voor elke 9 niet-geëtiketteerde actinemonomeren. Pipet mix.
   OPMERKING: De actinemonomeren beginnen te polymeriseren wanneer ze aan de monsteroplossing worden toegevoegd. Het afzonderlijk toevoegen van de actine gelabelde en niet-gelabelde actine kan resulteren in actine die gespikkeld lijkt met donkere en fluorescerende gebieden langs de contouren van een enkel filament. De actinemonomeervoorraden worden gemengd om uniform geëtiketteerde actinefilamenten te garanderen. Actinezuivering en -etikettering worden beschreven in³¹.
5. Optioneel: Om vloeibare kristallen of andere experimenten te maken met korte actinefilamenten, voegt u afdekeiwit toe aan de actinemix uit stap 5.4. De exacte hoeveelheid aftoppingseiwit hangt af van de actieve fractie van het eiwit en de lengte van de beoogde actinefilamenten, maar doorgaans is ongeveer 1-10 mol% aftoppingseiwit (ten opzichte van de actine) voldoende om korte filamenten te maken voor experimenten met vloeibare kristallen. Het afdekken van eiwitzuivering wordt beschreven in³⁶.
6. Om te beginnen met het polymeriseren van actine, voegt u het actinemengsel toe aan de F-bufferoplossing en het pipettenmengsel.
7. Laat de actine polymeriseren in de microcentrifugebuis bij RT en voeg het na 10-30 minuten toe aan de monstercel.
8. Optioneel: Als u een cilindermonster voorbereidt, zuigt u de hele oplossing op in een pipetpunt, zodat deze klaar is om te pipetteren in stap 7.4 van het laden van de cilindermonsterkamer.

6. Optioneel: Emulsies bereiden

OPMERKING: Het is soms handig om deze monsters te bereiden in emulsies, die een beperkte monsterkamer bieden. De emulsies worden bereid met behulp van vergelijkbare reagentia als Chowdhury et al., wat resulteert in een oliecontinue fase met door oppervlakteactieve stoffen gemedieerde waterige emulsiedruppels⁴¹. In aanwezigheid van een depletiemiddel, zoals methylcellulose, dat in dit protocol wordt gebruikt, zullen de actinemonsters zich verdringen tot het waterige grensvlak van deze emulsie. Voor monsters waarop dit protocol is gebaseerd, wordt geen verschil gezien tussen het polymeriseren van de actine voor of na het toevoegen aan de emulsies; Er is echter gemeld dat de polymerisatiestap belangrijk is om te overwegen in sommige inkapselingsexperimenten⁴².

1. Voeg 3,5 μL olie-oppervlakteactieve stof toe aan een microcentrifugebuis. Gebruik voor deze stap een transparante, lichtgekleurde of doorzichtige microcentrifugebuis.
2. Voeg zonder te mengen 5 μl van de actineoplossing toe aan de bovenkant van de olie-oppervlakteactieve stoflaag. Sluit de microcentrifugebuis.
3. Terwijl u de bovenkant van de microcentrifugebuis vasthoudt, tikt u tegen de onderkant van de buis om in eerste instantie een schuim te maken met zichtbare emulsies. Blijf de buis bewegen totdat het schuim geen onderscheidende kenmerken meer vertoont wanneer het wordt verlicht, wat wijst op micro-emulsies.
   OPMERKING: Bij het bereiden van een monster in emulsies moet een flowcel of een andere monsterkamer gereed zijn voordat het actinemonster wordt gemaakt. De monsterkamer van de glazen cilinder werkt niet goed voor emulsies, omdat deze crème tot de luchtinterface hebben in plaats van bezinksel tot het dekglasoppervlak.

7. Laad de monsterkamer (cilinderkamers)

1. Pipetteer 5 μl olie-oppervlakteactieve oplossing in de bodem van de glazen cilinderkamer
   OPMERKING: Als alternatief kunnen monsters worden gemaakt door het oppervlak te passiveren met een ondersteunde lipidedubbellaag 11,29,30.
2. Kantel het dekglaasje en draai het langzaam zodat het dekglaasoppervlak en de onderste cilinder zijn bedekt met de oppervlakteactieve oplossing.
3. Verwijder overtollige olie-oppervlakteactieve oplossing met een pipet om een zo dun mogelijke olielaag te krijgen, terwijl de vluchtige olie niet volledig kan verdampen.
4. Voeg de monsteroplossing uit stap 5.7 onmiddellijk toe aan de kamer.
5. Bedek de kamer met een klein stukje PTFE-tape om verdamping en stroming te voorkomen.

8. Alternatief: Laad de monsterkamer (flowcel)

1. Om het laden van de flowcel voor te bereiden, mengt u een kleine hoeveelheid epoxy van 5 minuten. Een druppel met een oppervlakte van minder dan 0,5 cm² is meestal voldoende.
2. Om het monster in de stroomcel te plaatsen, pipetteert u eerst 1-3 μl olie-oppervlakteactieve oplossing in het monsterkanaal van de stroomcel om een kleine prop oplossing te maken die het kanaal nat maakt.
3. Piket onmiddellijk een hoeveelheid monsteroplossing of emulsiesuspensie langzaam in de ingang van de stroomcel om het kanaal te vullen. Voor een kanaal van ongeveer 2 mm is het volume doorgaans ongeveer 8 μL. De ingang is de kant waaraan de olie-oppervlakteactieve oplossing is toegevoegd.
   1. Als het monstervolume groter is dan het volume van de flowcel, voert u het monster door de flowcell door een pluisvrij doekje of filterpapier aan het andere uiteinde van het kanaal te plaatsen.
   2. Als de meniscus van de olie-oppervlakteactieve oplossing is teruggetrokken, waardoor er een luchtspleet is ontstaan, kantel dan eerst de flowcel om de luchtspleet bij de ingang te verwijderen voordat u het monster toevoegt.
4. Voeg indien nodig extra olie-oppervlakteactieve oplossing toe totdat er geen lucht meer zichtbaar is in het kanaal of om het monster (met name voor emulsies) verder in het kanaal te duwen.
5. Dicht elke kant van het kanaal af met 5 minuten epoxy (gemengd vlak voor het laden van de stroomcel).

9. Afbeelding en voeg myosine toe

1. Monteer het monster op de microscoop en start timelapse-beeldvorming van actine met behulp van een 20x, 40x, 60x of 100x objectief met onderdompeling in olie of water om een voldoende grote numerieke opening te bieden voor beeldvorming met hoge resolutie. Als polymerisatie in de monsterkamer is, laat polymerisatie dan ~30 minuten toe of totdat er geen filamentverlenging of -beweging meer zichtbaar is.
2. Optioneel: Crosslinker toevoegen.
3. Voeg myosine toe via optie 1 of 2 hieronder.
   1. Voeg myosine toe als een dimeer dat aan de bovenkant van het monster wordt gepipeteerd (mengen is niet nodig omdat het myosinedimeer zal diffunderen).
   2. Voeg myosine toe als voorgepolymeriseerde filamenten. Pipet, meng ongeveer de helft van het totale volume heel langzaam om te voorkomen dat de overvolle actine wordt verstoord.
      OPMERKING: De ideale methode voor myosine om naast het verkrijgen van de gewenste filamentdichtheid of -grootte op het dekglaasoppervlak kan variëren voor verschillende actine-architecturen en moet experimenteel worden bepaald.
4. Start time-lapse-beeldvorming.

Results

Een breed scala aan actine-assemblages kan worden gevormd in modelsystemen met behulp van gezuiverde eiwitten door de algemene strategie te volgen die in deze methoden wordt beschreven, waarbij actine wordt gepolymeriseerd tot filamenten in aanwezigheid van accessoire-eiwitten die de assemblagearchitectuur wijzigen (Figuur 1). Wanneer actine wordt gepolymeriseerd tot filamenten zonder crosslinkers of afdekkend eiwit, vormt het verstrengelde filamentnetwerken...

Discussion

Er zijn veel overwegingen bij het produceren van reproduceerbare actine-assemblages. Een van de meest kritische voor het produceren van reproduceerbare, analyseerbare gegevens is het dekglasoppervlak van de monsterkamer. De eiwitten in in vitro actinemonsters, met name myosine, zijn extreem plakkerig en hechten zich aan onbehandelde of slecht behandelde glazen oppervlakken, waardoor een monster onbruikbaar wordt (Figuur 5A). We hebben een standaardm...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-123
008-Fluorosurfactant	RAN Biotechnologies	00115081361-6525	Alternatief voor voorgemengde oplossing
008-FluoroSurfactant in HFE7500	RAN Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-2wtH-50G	Voorgemengde oplossing
2-mercaptoethanol (β-mercaptoethanol)	Sigma Aldrich	63689	CAS-nummer: 60-24-2 Stockoplossing: 25 mM in MilliQ-water, bewaard bij 4 °C
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375	CAS-nummer: 7365-45-9
5 min Epoxy	Devcon	14250
Actin	Cytoskeleton, Inc.	AKL99-A	>99% zuivere konijnenskeletspier (Alternatief voor zuiveren)
Actin (rhodamine labeled)	Cytoskeleton, Inc.	AR05-A	Konijnenskeletspier (Alternatief voor zuiveren)
Adenosine 5′-triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich	A6419	CAS-nummer: 34369-07-8 Stockoplossing: 25 mM in MilliQ-water, bewaar bij -20 °C Bewaar bevroren om hydrolyse te voorkomen
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C5670	CAS-nummer: 10043-52-4
Capping Protein (Muis)			Gezuiverde overexpressie uit E.coli met een HisTag Stockoplossing: 20 mM in capping-eiwitbuffer bij -80 °C
Catalase uit runderlever	Sigma Aldrich	C9322	CAS-nummer: 9001-05-2 Stockoplossing: 85 ku/mL, bewaar gesplitst met glucose-oxidase bij -20°C
Dekglas	Fisherbrand	12544C	Borosilicaat, #1.5, 24 mm x 40 mm Fisherbrand niet Fisher Finest
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G8270	CAS-nummer: 50-99-7 Stockoplossing: 225 mg/mL in MilliQ-water, bewaar bij -20 °C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	3860-OP	CAS-nummer: 3483-12-3 Stockoplossing: 1 M in MilliQ-water, bewaar bij -20 °C
Dubbelzijdig plakband	3M	3136
Ethyl alcohol 200 Proof	PHARMCO	111000200	CAS-nummer: 64-17-5 200 proof
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889	CAS-nummer: 67-42-5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884	CAS-nummer: 60-00-4
Glucose Oxidase	Sigma Aldrich	345386	CAS-nummer: 9001-37-0 Stockoplossing: 135 mg/mL in MilliQ-water, bewaar gesplitst met catalase bij -20 °C
Glycerol	Sigma Aldrich	356352M	CAS-nummer: 56-81-5
Imidazole	Fisher Bioreagents	BP305-50	CAS-nummer: 288-32-4
Magnesium Chloride (MgCl2)	Fisher Bioreagents	BP214	CAS-nummer: 7786-30-3, 7791-18-6
Methylcellulose	Sigma Aldrich	M0512	CAS-nummer: 9004-67-5 15 centipoise
Microscope Slides Plain	Electron Microscopy Sciences/Gold Seal	63710-05	3"x1", 1 mm dik
MilliQ water	Millipore	CUFBI001	Ultrapuur water
Novec-7500 Engineered Fluid	3M	7100134816	Alternatief voor voorgemengde oplossing
Potassium Chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911	CAS-nummer: 7447-40-7
Potassium Phosphate (KPO4)	Sigma Aldrich	P3786	CAS-nummer: 7758-11-4
Konijnenskeletspier acetonpoeder	Pel-Freez Biologicals	41995-1	Gebruikt bij het zuiveren van actin (alternatief voor aankoop) Bewaar rond 30 mM in actin Buffer G bij -80 °C
Sodium Azide	Sigma Aldrich	71289	CAS-nummer: 26626-22-8
Tetramethylrhodamine-C6-maleimide	AnaSpec	AS-81445	CAS-nummer: 174568-68-4 Gebruikt bij het zuiveren van actin (alternatief voor aankoop) Bewaar rond 30 mM in actin Buffer G bij -80 °C. Gebruikt bij het labelen van actin (alternatief voor aankoop)
Tris Hydrochloric Acid (Tris HCl)	Sigma Aldrich	648317	CAS-nummer: 1185-53-1
Ultrasoon bad	Emerson Branson	CPX2800H