Een fijne motorische taak om gewrichtskinematica te bestuderen in een preklinisch model van neurodegeneratieve ziekten

Samenvatting

De huidige studie beschrijft een test voor fijn motorisch gedrag voor het onderzoeken van motorische stoornissen in knaagdiermodellen, waaronder de TgF344-AD-rat, met behulp van machine learning.

Samenvatting

Motorische disfunctie is een kritiek, maar vaak ondergewaardeerd onderdeel van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en aanverwante vormen van dementie. Nieuw onderzoek heeft aangetoond dat taken met betrekking tot fijne motoriek, visueel-ruimtelijk vermogen en uitvoerende functie bij mensen potentieel kunnen hebben bij het vroegtijdig opsporen van ziekten. Er is echter weinig bekend over de exacte mechanismen waarmee deze taken cognitieve en functionele achteruitgang in verband met AD voorspellen. In de huidige methode werd een fijne motorische taak, Kinematic Motor Ability Task (KINEMAT), gecreëerd om veranderingen in motorische vaardigheden tijdens ziekteprogressie in preklinische modellen van AD te onderzoeken in vergelijking met andere neurodegeneratieve ziekten en normale veroudering met behulp van gratis, open-source machine learning-software. Hier werd een proof-of-concept opgesteld met het ontwerp, het testen en de implementatie van de fijne motorische taak in een pilotstudie van Fisher 344 CDF-ratten met en zonder door Harmaline geïnduceerde motorische stoornissen. Aanvullende validatie, met een rattenmodel voor de ziekte van Alzheimer (TgF344-AD), toonde de haalbaarheid van het model en de taakgevoeligheid verder aan. Ratten werden getraind om door een kleine gleuf aan de voorkant van de kamer te reiken om met verschillende moeilijkheidsgraden een suikerpellet uit een van de drie kommen te halen. Het ophalen van pellets werd gescoord aan de hand van een van de drie classificaties: succes (met succes de suikerpellet pakken en eten), drop (grijpt maar laat de traktatie vallen bij het grijpen) of falen (bereik waarbij geen pellet wordt verkregen of pellets uit de kom worden geslagen bij een poging om te grijpen). Significante verschillen in motoriek werden waargenomen tussen controleratten en met harmaline behandelde ratten, wat blijkt uit een verminderd totaal bereik en een grotere variabiliteit van de poothouding. TgF344-AD-ratten vertoonden ook een verminderd totaal bereik, evenals verminderde successen in alle kommen. Door dit te valideren als een fijne motorische taak bij knaagdieren, heeft het toekomstig potentieel om normale veroudering en preklinische modellen van neurodegeneratieve ziekten, waaronder AD, te bestuderen, aangezien pathologie en symptomen in de loop van de tijd optreden.

Inleiding

Het is aangetoond dat de motorische functie is aangetast bij mensen met dementie als gevolg van de ziekte van Alzheimer (AD) of andere subtypes (bijv. dementie met Lewy-lichaampjes). Grijpkracht en loopsnelheid kunnen onderscheid maken tussen cognitief gehandicapte en niet-gehandicapte oudere volwassenen ^1,2, maar kunnen niet noodzakelijkerwijs onderscheid maken tussen verschillende subtypes van dementie (d.w.z. lage specificiteit)^1,2. Er blijft dus behoefte aan nieuwe diagnostische hulpmiddelen voor vroege dementie, mogelijk in combinatie met machine learning, voor het evalueren van complexe patronen en relaties tussen gedrag en ziektetoestand ^3,4. Diermodellen zijn waardevol voor het onderzoeken van de progressie van neurodegeneratieve ziekten om inzicht te bieden in het vroege begin van de ziekte, gedragscorrelaten en het integreren van machine learning in analysepijplijnen om onderscheid te maken tussen ernst en presentatie ^5,6,7.

Nieuwe gedragsmethoden bij mensen hebben taken geïdentificeerd waarbij fijne motoriek en cognitieve verwerking betrokken zijn, zoals visueel-ruimtelijk vermogen en executieve functie ^8,9,10. Een functionele taak van de bovenste ledematen kan bijvoorbeeld patronen van neurodegeneratie volgen en milde cognitieve stoornissen (MCI) onderscheiden van AD. Bij deze taak verplaatsen mensen rauwe bruine bonen (twee tegelijk) met behulp van een lepel van een centrale thuisbeker naar een doelbeker. De fase van de taak waarin bonen met de lepel worden verkregen, vertoont sterkere associaties met cognitie (met name visueel-ruimtelijk geheugen) dan de fase waarin de bonen naar de doelbeker worden getransporteerd^11,12. Als de lepel de beker binnengaat, kan deze de bonen in de beker verstoren, wat betekent dat de bewegingen van de deelnemer de taak moeilijker kunnen maken. Verder, naarmate de proef vordert en het aantal bonen in de thuisbeker afneemt, wordt de taak moeilijker (d.w.z. de tijd om de bonen met de lepel te verwerven neemt toe)¹³. Het is aangetoond dat deze taak correleert met AD-specifieke pathologie (amyloïde)^9,14 en neurodegeneratie (hippocampale atrofie)^10,15, wat suggereert dat de prestaties ervan kunnen afhangen van neurale circuits en gedragsprocessen die vroeg in het ziekteproces worden beïnvloed. Het is bekend dat het initiëren, plannen, uitvoeren en corrigeren van bewegingen wordt gecontroleerd door een divers netwerk dat de hersenen doorkruist, inclusief de motorische cortex, waarbij cellichamen van bovenste motorneuronen in de hersenschors synapseren op lagere motorneuronen in het ruggenmerg¹⁶. Deze lagere motorneuronen communiceren rechtstreeks met de spieren om de beweging bij de neuromusculaire overgang te controleren. Stijgende banen vervoeren sensorische informatie van de periferie naar het ruggenmerg, terwijl dalende kanalen in de hersenen richtinggevende informatie doorgeven over hoe en waar terug te keren naar spieren^17,18. Begrijpen hoe deze routes selectief worden beïnvloed door AD-pathologie is van cruciaal belang voor het begrijpen van ziekteprogressie, vooral omdat genetische diermodellen, waaronder de 3xTg-AD-muis en de TgF344-AD-rat, eerder zijn gebruikt om te bestuderen hoe AD-genen de voortbeweging, coördinatie en andere motorische stoornissen beïnvloeden 19,20,21. Meestal zijn deze taken gericht op grove motorische stoornissen met betrekking tot beweging van het hele lichaam, maar motorische stoornissen bij mensen zijn veel variabeler, wat moeilijk te identificeren kan zijn bij knaagdieren²². Er zijn daarom nieuwe taken nodig om de kloof tussen menselijke en dierlijke modellen te overbruggen om deze variabiliteit vast te leggen.

Een hersengebied dat vaak betrokken is bij motorische stoornissen en tremoren is het cerebellum²³. Het cerebellum is een belangrijke regulator van precieze en gecoördineerde bewegingen en fungeert als een verwerker van sensorische informatie om feedback te geven via dalende paden om deze vrijwillige beweging te corrigeren en aan te passen^24,25. Het is belangrijk op te merken dat cerebellaire atrofie is erkend bij personen met AD, maar in tegenstelling tot andere regio's zoals de hippocampus, correleert verhoogde amyloïde afzetting in het cerebellum niet met verhoogde atrofie²⁶. Hoewel de progressie van AD-pathologie anders is in het cerebellum, zijn er multisynaptische bidirectionele verbindingen tussen het cerebellum en de hippocampus die waarschijnlijk verstoord zijn in 27,28,29 na Christus. Er zijn met name functionele verbindingen tussen het cerebellum en de hippocampus, aangezien geheugenstoornissen zijn gedocumenteerd na resectie van de cerebellaire tumor 30,31,32,33,34,35,36,37. Bij knaagdieren worden de cellen van de hippocampus verstoord met een cerebellaire verstoring³⁸. Deze overlappende tekorten in geheugen, gezelligheid en motorische controle benadrukken het belang van het blootleggen van mogelijke vroege veranderingen in motorische paden die optreden vóór cognitieve achteruitgang 30,31,38,39. Met de implementatie van fijne motorische taken in vroeg AD-onderzoek, kunnen we beginnen met het hervormen van het traditionele begrip van AD als gewoon een cognitieve stoornis en diagnostische inspanningen verleggen naar vroege motorische veranderingen die ziekteprogressie kunnen voorspellen en mogelijk beter te onderscheiden zijn tussen cognitief gehandicapte en niet-gehandicapte ouder wordende individuen.

Om te begrijpen hoe fijnmotorisch gedrag een indicatie kan zijn van veranderingen in de hersenstructuur, werd een knaagdierversie van de hierboven beschreven menselijke taak gemaakt en getest. Deze knaagdiertaak heeft de naam KINEMAT (KINEmatic Motor Ability Task) gekregen en wijkt af van eerdere bereiktaken waarbij een enkele pellet van een voetstuk of trap moet worden gehaald en de meer simplistische score als gevolg van consistente plaatsing van de pellets in alle stadia van de taak 40,41,42,43,44,45,46^{, 47,48}. Deze taak voor het bereiken van fijne motoriek omvat nieuwe scoremethoden, kommen met verschillende moeilijkheidsgraden en zelfverstorende functies om de menselijke tegenhanger na te bootsen, waarbij pelletbewegingen en daaropvolgende aanpassingen van de deelnemersstrategie centraal staan in het ontwerp. Deze taak maakt gebruik van de machine learning-tools, Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) en keypoint-MoSeq ^49,50, waardoor een onbevooroordeelde en kwantitatieve meting van de fijne motoriek en het bereikgedrag mogelijk is. Terwijl andere opmerkelijke computationele modellen zijn ontwikkeld voor bekwame reiktaken bij knaagdieren ^44,45,51, elimineert keypoint-MoSeq ruis om een nauwkeurige kwantificering van beweging en grijphoudingen mogelijk te maken⁵⁰. Taakprestaties en motorische leerstrategie werden gereconstrueerd met behulp van een krachtige machine vision-camera bij typische en motorisch gestoorde ratten met behulp van Harmaline⁵². Harmaline hyperactiveert de inferieure olivariumkern en verstoort de cerebellaire functie door glutamaterge klimvezels^53,54. Daarnaast werd de fijne motoriek onderzocht in een subgroep van TgF344-AD-ratten. Er werd dus verwacht dat de fijne motorische taak meetbare stoornissen zou vinden bij met Harmaline behandelde en TgF344-AD-ratten ten opzichte van hun typische tegenhangers als proof-of-concept. Dit protocol beschrijft het construeren van de fijne motorische taak, het trainen en testen van dieren en het kwantificeren van bereikgedrag met behulp van SLEAP en keypoint-MoSeq.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Arizona State University.

1. Ontwerp en constructie van de kamer

1. Bereid de heldere acrylpanelen voor. De schema's van de doos bevinden zich op https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask. Snijd heldere acrylaat panelen op de volgende afmetingen (alle panelen zijn 1 cm dik):
   1. Knip twee zijpanelen uit: 26 cm × 22 cm.
   2. Knip een bovenpaneel uit: 27 cm × 12 cm.
   3. Snijd het eerste bodempaneel uit: 26 cm x 10 cm
   4. Snijd het tweede bodempaneel uit: 26 cm x 11 cm
   5. Snede van een frontpaneel: 20 cm × 11 cm.
   6. Uitsnijden van een achterpaneel: 20 cm x 12 cm
   7. Snijd een sleuf voor het voorpaneel uit (140 mm x 12 mm). Plaats de sleuf in het midden, met de onderkant uitgelijnd met de onderkant van het paneel.
   8. Snijd een binnengroef uit: 1 cm. Maak aan de binnenranden van de zijpanelen een inkeping of groef zodat het voorpaneel stevig in en uit kan schuiven.
      OPMERKING: Als de schuiffunctie niet nodig is, kan het voorpaneel permanent worden gelijmd om de constructie te vereenvoudigen.
   9. Boor gelijkmatig verdeelde gaten (5 mm in diameter) in het tweede bodempaneel zodat pellets erdoorheen kunnen vallen als ze vallen. We plaatsen de gaten op 1 cm afstand van elkaar in een rasterpatroon.
2. Zet de kamer in elkaar met lijm (Figuur 1A).
   OPMERKING: Gebruik een sterke, transparante lijm die speciaal is ontworpen voor acrylmaterialen.
   1. Zijpanelen: Breng een doorlopende lijn lijm aan langs de randen van het bodempaneel. Plaats de zijpanelen verticaal en druk stevig aan. Laat de lijm uitharden volgens de fabricage-instructies.
   2. Achterpaneel: Breng lijm aan op de achterranden van de zij- en onderpanelen. Plaats het achterpaneel en druk het op zijn plaats.
   3. Bovenpaneel: Breng lijm aan op de bovenranden van de zij- en achterpanelen. Plaats het bovenpaneel en druk stevig aan.
   4. Voorpaneel: Schuif het voorpaneel voorzichtig in de groeven op de zijpanelen, zodat het goed maar soepel past, of breng lijm aan langs de randen van het voorpaneel en bevestig het aan de zij-, boven- en onderpanelen.
      1. Test de beweging van het paneel en controleer of het precies is uitgelijnd met de rest van de kamer.
3. Set-up verlichting
   1. Plaats het infrarood (IR) licht aan het andere uiteinde van de testkamer, gericht naar de kamer. Leg een vel wit bouwpapier op de kamer om het licht naar beneden te weerkaatsen.
      OPMERKING: Verlichting is van cruciaal belang voor een goede tracking en alle opnames moeten worden gemaakt onder IR-licht in een donkere kamer.
4. Bereid de trainingsschaal voor.
   1. Fabriceer de trainingskom met een radius van 31 mm en een verlenging van 32 mm met behulp van een 3D-printer. STL-bestand beschikbaar op https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask (Figuur 1B: bovenaan)
   2. Bevestig de trainingskom aan de onderkant van de kamer direct voor de sleuf. Plaats de kom zo dat de bovenrand zich ongeveer boven ooghoogte van de rat in de kamer bevindt, met behulp van een ondersteunende standaard, zoals een blok hout.
5. Bereid de testkommen voor (Figuur 1B: midden en onder).
   1. Print de kommen met behulp van de meegeleverde STL-bestanden. Er zijn twee verschillende komontwerpen: "Plain-Less" en "Plinko". (https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask)
      1. Inspecteer op maatnauwkeurigheid en duurzaamheid (afmetingen: 50 mm diep x 40 mm breed).

2. Computer- en camerahardware

1. Gebruik een statief om de camera stevig te bevestigen.
2. Plaats de camera op ongeveer 15-20 cm van het voorpaneel van de kamer.
   1. Pas de hoogte en hoek van het statief aan, zodat de camera een isometrisch beeld van 45° van zowel de sleuf als de kom vastlegt.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het gezichtsveld van de camera de rattenpoot en het volledige bereik, de sleuf en de trainings- of testkom omvat. Test indien nodig verschillende hoeken en afstanden om een optimaal zicht te bereiken.
3. Download software om te koppelen met de camera voor gedragsopnames (https://www.teledynevisionsolutions.com/products/spinnaker-sdk) en open de software om de camera te gebruiken om gedrag vast te leggen.
   1. Gebruik de volgende camera-instellingen: opnamemodus: continu, framesnelheid: 216 Hz, belichtingsmodus: getimed, automatische belichting: uit, belichtingstijd: 4430 μs, versterking automatisch: uit, versterking: 16,85 dB, gamma: 0,8.
   2. De opname-instellingen zijn als volgt: H264-bestandstype, bitsnelheid van 5 miljoen (5.000.000).
   3. Om 10 minuten op te nemen, voert u 130.000 frames in en gebruikt u de streamingmodus om op te slaan.
      OPMERKING: Het gebruik van een speciale machine met minimaal 16 GB RAM en een interne solid-state harde schijf van 1 TB voor het opslaan van gegevens wordt aanbevolen.

Figuur 1: Schema van de fijne motoriek. (A) Cartoonweergave van de fijne motorische taak waarbij een rat door een gleuf reikt om een suikerpellet te bemachtigen. Bereiken worden geregistreerd voor machine learning-analyse. Er worden drie afzonderlijke kommen gebruikt: een (linksonder) trainingskom, (middenonder) Plain/Less kom en de (rechtsonder) Plinko kom met rood omcirkelde obstakels. (B) Schema's van het ontwerp van elke kom, inclusief (boven) trainingskom, (midden) Plain/Less kom en (onder) Plinko kom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Voorbereiding van dieren

1. Koppel huisvest (minimaal) Fisher 344 CDF-ratten (mannetje en vrouwtje, >3 maanden oud) in een omgekeerde licht/donker-cyclus om testen mogelijk te maken wanneer de dieren het meest actief zijn.
2. Weeg alle knaagdieren 1 week voor het begin van de gewenning en geef ~30 g voer voor een knaagdier van meer dan 300 g en ~15 g voor een knaagdier 100-300 g om de dieren op 90% lichaamsgewicht te houden.
   1. Weeg de ratten dagelijks en pas het voer dienovereenkomstig aan, waarbij de hoeveelheid voer met 1-2 g per dag wordt verminderd totdat het knaagdier 90% lichaamsgewicht bereikt. Dagelijks gebruik zal ook helpen om de dieren te laten wennen aan de onderzoeker.
   2. Ga tijdens het wennen en testen door met deze procedure, waarbij u het voer met +/- 0,5 g aanpast wanneer het gewicht onder of boven de drempel daalt.
   3. Weeg tijdens het testen de dieren voordat de taak wordt gestart en geef vervolgens het toegewezen voer onmiddellijk bij terugkeer naar de kooi na voltooiing van de taak.
      OPMERKING: Elk plotseling gewichtsverlies (>15%) gedurende 1-2 dagen kan wijzen op een onderliggend probleem en er moet een dierenarts worden geraadpleegd.

4. Gewenning (2 dagen)

1. Schakel het IR-licht, de camera en de computer in.
2. Plaats de trainingskom met pellets in de openingsgleuf en zorg ervoor dat de punt van de kom iets in het apparaat steekt (aanvankelijk ongeveer 2 cm).
3. Breng de kooien over naar de testruimte en laat de ratten 5 minuten acclimatiseren.
4. Dag 1: Voeg in paren gehuisveste ratten toe aan de kamer en laat ze 20 minuten verkennen. Plaats 3-5 suikerpellets in de thuiskooi na het testen, zodat ratten vertrouwd kunnen raken met de pellets.
   OPMERKING: De korrelgrootte van 45 mg maakt het mogelijk om een enkele korrel op te halen.
5. Reinig de kamer met een desinfecterend doekje tussen ratten. Aan het einde van de dag besproeien met ethanol om te desinfecteren.
6. Dag 2: Wen knaagdieren individueel aan het apparaat met behulp van dezelfde procedure (20 min). Als knaagdieren angstig lijken of de voorkant van het apparaat en de kom vermijden, blijf dan wennen totdat dit gedrag is verdwenen. Blijf pellets geven als traktatie in de thuiskooi (3-5 pellets).
   1. Om de vertrouwdheid en de benadering van de kom te bevorderen, beweegt u de langwerpige buis tijdens de gewenning geleidelijk verder in de sluiter van het apparaat, waarbij u de punt 0,5 cm per keer dichter bij het knaagdier beweegt om het bereiken te vergemakkelijken.
      OPMERKING: Gewenning, testen en training moeten allemaal op dezelfde locatie onder rood licht worden uitgevoerd om de impact van een nieuwe omgeving te elimineren.

5. Vormgeven (10 dagen)

1. Schakel het IR-licht, de camera en de computer in.
2. Breng de kooien over naar de kamer en laat de ratten 5 minuten acclimatiseren.
3. Gebruik de trainingskom om 1-5 pellets langs de extensie te leggen, waarbij de extensie de eerste dag volledig in het apparaat wordt geplaatst. Train dieren in sessies van 10 minuten. Opname tijdens het vormgeven is optioneel.
   OPMERKING: Om de knaagdieren vertrouwd te maken met de pellets, is het belangrijk om een paar suikerpellets in het apparaat zelf te plaatsen om de afkeer van de pellets in de kom te verminderen. Knaagdieren zullen waarschijnlijk de pellets in het apparaat eten omdat ze gemakkelijk te verkrijgen zijn en deze pellets in de kom zullen herkennen. Het is belangrijk om ze te laten wennen aan het kijken naar de juiste richting van het apparaat en om te wennen aan het aanraken van de kom.
4. Begin op de volgende trainingsdagen met het intrekken van de komverlenging van het apparaat. Dit vereist dat knaagdieren de opening van het apparaat aan de voorkant naderen en interactie met het verlengstuk net buiten het apparaat aanmoedigen.
   1. Het ontwerp maakt een specifieke plaatsing van pellets mogelijk. Plaats de pellets bijvoorbeeld aan het einde van de kom die zich het dichtst bij het knaagdier bevinden en beweeg ze geleidelijk verder weg om het knaagdier aan te moedigen uit het apparaat te reiken.
5. Naarmate knaagdieren zich meer op hun gemak voelen bij het nemen van pellets vanaf de rand van de extensies, al is het maar via de mond, begin dan pellets via het pincet te introduceren om het reikgedrag aan te moedigen.
   1. Houd een pellet in het pincet net buiten het apparaat, zodat knaagdieren het pincet gewoon kunnen aanraken. Beloon dit gedrag onmiddellijk om verder reiken aan te moedigen.
   2. Naarmate knaagdieren zich meer op hun gemak voelen bij het aanraken van het pincet, laat ze dan iets verder uit het apparaat reiken om de pellet aan te raken of vast te pakken door het pincet net iets verder van de opening van het apparaat te houden.
      OPMERKING: Houd aantekeningen bij over al het gedrag van dieren, vooral als dieren bang zijn voor de kom of er niet bij kunnen. Deze dieren hebben mogelijk extra vormdagen nodig.
6. Zodra knaagdieren minimaal 3 dagen continu en onafhankelijk bereiken (Figuur 2A), gaan ze over op de gewone kom totdat het reikengedrag is vastgesteld (continu reiken gedurende 3 dagen met ten minste 10 onafhankelijke bereiken per dag).
   1. Wanneer u de knaagdieren in de gewone kom introduceert, zorg er dan voor dat de kom zoveel mogelijk gevuld is met pellets, zodat de knaagdieren de pellets over de zijkant van de kom kunnen visualiseren.
      OPMERKING: Het kan in dit stadium nodig zijn om het bereik met een pincet aan te moedigen.
7. Reinig de kamer met een desinfecterend doekje tussen ratten. Aan het einde van de dag besproeien met ethanol om te desinfecteren.

6. Bereid je voor op het testen:

1. Het testen wordt voltooid gedurende 9 dagen (Figuur 2A), waarbij elk knaagdier 3 proeven per kom uitvoert, waarbij elke proef van 10 minuten op opeenvolgende dagen plaatsvindt.
   OPMERKING: Het testen kan het beste 's ochtends worden uitgevoerd.
2. Weeg de ratten op elke testdag. Als ze klaar zijn, worden ratten 30-60 minuten in thuiskooien achtergelaten voordat ze worden getest, omdat wegen stress kan veroorzaken en het reikgedrag kan remmen.
3. Zet de computer aan en stel de kom in. Sluit de camera en het licht aan. Open de opnamesoftware en pas de camera-instellingen aan zoals beschreven in sectie 2 van het protocol.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ten minste 200 frames per seconde (fps) op te nemen om alle pootbewegingen vast te leggen.
4. Lijn de kom uit in het frame van de camera en visualiseer deze in de opnamesoftware door op de afspeelknop te drukken. Plaats de kom gelijk met het apparaat en de camera in een hoek van 45° ten opzichte van de zijkant van de kom.
   1. Beweeg de camera om het reiken direct vast te leggen om de individuele vinger- en handpalmbeweging te bestuderen, evenals de beweging die verband houdt met de hoogte van de handpalm boven de kom tijdens het reiken.
   2. Plaats de camera direct loodrecht op de kom om arm- en handbewegingen van en naar de kom vast te leggen, maar niet de plaatsing van de cijfers of details over grijpgedrag.
      OPMERKING: Hoewel een hoek van 45° wordt aanbevolen om beweging langs de x-, y- en z-vlakken vast te leggen, kunnen andere configuraties gemakkelijker informatie vastleggen voor het gewenste onderzoek.

7. Testen (9 dagen)

1. Plaats de ratten in de kamer om 1 uur te wennen.
2. Plaats de eerste kom op het platform van de kom en zet deze vast met tandwas. Zorg ervoor dat de voorkant van de kom gelijk ligt en gecentreerd is met de opening van het apparaat.
3. Geef het videobestand in Spinview een naam met het rattenidentificatienummer, de opnamedatum en het tijdstip van opname.
4. Plaats de rat in het apparaat. Sluit het deksel en leg het witte karton erop om het licht af te buigen.
5. Controleer nu nogmaals de camerahoek om er zeker van te zijn dat de juiste scène wordt vastgelegd en pas de kom aan als deze niet gecentreerd is.
6. Giet de juiste hoeveelheid pellets in de kom en druk op Start Recording.
   Dag 1-3 Gewone kom: ~100 pellets
   Dag 4-6 Minder kom: ~50 pellets
   Dag 7-9 Plinko schaal: ~50 pellets
7. Blijf tijdens het testen in de kamer om de rat continu in de gaten te houden, maak aantekeningen over de prestaties en het gedrag van de rat en voeg indien nodig pellets toe om de juiste hoeveelheid te behouden.
   1. Zorg er voor de gewone kom voor dat knaagdieren pellets over de rand van de kom kunnen zien en dat er altijd pellets kunnen worden verkregen (dwz vul de kom tijdens de proef naarmate de pellets afnemen, pellets worden gelaagd).
   2. Voor de Less-kom: controleer of de pellets niet op elkaar zijn gestapeld en of er wat ruimte is tussen de pellets, zodat ze zich kunnen verspreiden wanneer de rat probeert te bereiken.
   3. Voor de Plinko kom: zorg ervoor dat er voldoende korrels zijn om tussen de obstakels door te kunnen.
8. Breng het dier terug naar zijn thuiskooi en zorg voor het toegewezen voer. Reinig de kamer met een desinfecterend doekje tussen ratten.
9. Aan het einde van de dag besproei je met ethanol om de hele kamer te desinfecteren om je voor te bereiden op de volgende dag.
   OPMERKING: Als u zowel mannelijke als vrouwelijke knaagdieren test, zorg er dan voor dat u de geslachten in evenwicht brengt met sommige vrouwtjes en sommige mannetjes die eerder in de ochtend zijn getest, en een vergelijkbare mix die later wordt getest. Houd de volgorde van de testers gedurende het hele experiment aan.

Figuur 2: Training en testen van ratten die de fijne motorische taak uitvoeren. (A) Tijdlijn van het experiment. Ratten waren twee dagen gewend aan het apparaat en ondergingen vervolgens gedurende 10 dagen vormgevingsprocedures. Dieren werden getest op fijne motoriek in alle drie de kommen gedurende drie dagen per kom. Vervolgens werden de dieren geïnjecteerd met Harmaline en gedurende drie dagen opnieuw getest op elke kom. (B) Ratten (n = 6) ondergingen twee verschillende kommen (trainingskom en Plain) tijdens vormgevingsprocedures, en het komtype werd op dag 5 omgeschakeld om het bereik te verbeteren. Er was een significante toename in vormgeving gedurende 10 dagen om de criteria te bereiken (F(9, 45) = 13,5, p < 0,001). De grijze balk geeft de omschakeling aan tussen de originele en de huidige langwerpige trainingskom met buis. (C) Voor het testen van alle drie de kommen was er een significant verschil in totale bereiken gedurende de 9 testdagen (F(8, 32) = 3,74, p = 0,003). Opmerking: Rat 2 is verwijderd na het vormen. De Plinko kom resulteerde in significante verschillen tussen de Less (p = 0,001) en Plain bowl (p = 0,027). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Modelleren van fijne motorische verstoring met behulp van Harmaline

OPMERKING: Om de effecten van motorische stoornissen op de fijne motoriek en de prestaties bij de fijne motoriek te identificeren, werden ratten geïnjecteerd met Harmaline (10 mg/kg), een β-carboline-alkaloïde die een omkeerbare remmer is van monoamineoxidase-A en zich richt op de inferieure olijf 52,55,56,57. Harmaline in knaagdiermodellen beïnvloedt de houding en het evenwicht, beperkt de fijne motorische coördinatie en veroorzaakt motorische verstoring in de bovenste ledematen.

1. Weeg de ratten om de juiste dosis Harmaline te berekenen.
2. Laat ratten 1 uur wennen aan de testruimte.
3. Zet de computer aan en stel de kom in. Sluit de camera en het licht aan. Open de opnamesoftware en pas de camera-instellingen aan zoals beschreven in sectie 2 van het protocol.
4. Injecteer knaagdieren met Harmaline (10 mg/kg, i.p.).
5. Giet na 15 minuten de pellets in de juiste kom en begin met opnemen. Test de rat op elke kom gedurende 3 dagen.
   Dag 1 Gewone kom: ~100 pellets
   Dag 2 Minder kom: ~50 pellets
   Dag 3 Plinko kom: ~50 pellets
   OPMERKING: Controleer de injectieplaats op afwijkingen, waaronder huidirritatie, pijnlijk gedrag, ataxie, onderkoeling en houdingsveranderingen tot 3 uur na de injectie. Blijf na de 3 uur-vensters controleren op eventuele gedragsveranderingen, inclusief latenties om te eten of te drinken, of eventuele resterende tremor.

9. Video-analyse met behulp van machine learning

OPMERKING: Na het verzamelen van gegevens en video-opname werden de bereiken met de hand geteld en als volgt gescoord: Succes (pellet ophalen en consumeren), Drops (haalt de pellet op maar laat de pellet vallen voordat deze wordt geconsumeerd), Mislukking (kan pellet niet ophalen). Deze met de hand gescoorde gegevens werden gebruikt als ground-truth-gegevens voor de machine learning-analyse.

1. Met behulp van aangepaste Python-code op https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask werden vergelijkingen gemaakt tussen met Baseline en met Harmaline behandelde dieren om veranderingen in bereikprestaties te identificeren (Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5 en Figuur 6).
2. Om de gewrichtskinematica van reikgedrag te analyseren, inclusief reiktraject, pootconformatie en positie, en veranderingen in reikstrategie voor de verschillende soorten kommen, gebruikt u de gratis en open-source machine learning-software Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) (zie https://sleap.ai/ voor een uitgebreidere uitleg en een stapsgewijze handleiding voor het gebruik van het open-source programma⁴⁹).
   OPMERKING: SLEAP⁴⁹ kan worden gedownload op https://github.com/talmolab/sleap.
3. Open een nieuw project en voeg 3 video's toe van de bereiktaak.
4. Maak een skelet dat bestaat uit 15 knooppunten: 1 bovenarm, 1 pols, 1 middenpalm, 4 basis, 4 knokkels en 4 vingertopknopen (download skelet op https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask).
5. Voeg randen toe tussen de knooppunten zodat de bovenarm aansluit op de pols en vervolgens op het midden van de handpalm. Verbind vanuit het midden van de handpalm de basis-, knokkel- en vingertopknopen zodat het midden van de handpalm altijd de startknoop is (Afbeelding 7A).
6. Label minimaal 50 frames voorafgaand aan de hardlooptraining. Hier kan men een nieuw model trainen of de modellen voor centered en centroid gebruiken op de github: https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask.
7. Zodra het model is getraind, opent u een nieuwe video en voert u deductie uit: trackin.match: hebzuchtig, n_instances:1, tracking.clean_instance_count: 1, tracking.target_instance_count: 1, tracking.pre_cull_to_target: 1.
   OPMERKING: Deductie kan worden uitgevoerd als een bash-script op een lokaal cluster. Voor bijgehouden video's moet mogelijk proeflezen (zie https://sleap.ai/ voor instructies voor proeflezen).
8. Om de knooppunten verder te analyseren en de verschillen tussen de groepen in gezamenlijke kinematica te begrijpen, gebruikt u het gratis en open-source keypoint-MoSeq⁵⁰ (zie https://github.com/dattalab/keypoint-moseq voor details over downloaden en gebruiksaanwijzingen).
9. Creëer discrete lettergrepen van gedrag met behulp van keypoint-MoSeq⁵⁰ (Figuur 7B). Voer aanvullende analyses uit om de overgangsfrequentie, waarschijnlijkheid en veranderingen in de frequentie van overgangen tussen harmalijn en basislijncondities per kom in kaart te brengen (Figuur 7C, D). Zie https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask voor de analysecode.

Figuur 3: Veranderingen in het reiken over kommen en behandeling. (A) Voor baseline-testen (n = 5) was er over alle 3 de kommen een significant verschil in totale bereiken (H(df) = 8,48, p = 0,014, Kruskal-Wallis), waarbij meer bereiken voorkwamen met het Plinko-komtype (p = 0,011, Post-hoc Dunn's test met Bonferroni-correctie). (B) Harmaline (n = 5) verstoring resulteerde niet in verschillen tussen de soorten kommen. Fouten worden gerapporteerd als S.E.M. *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vergelijking van de prestaties tussen de omstandigheden en tussen de verschillende soorten kommen. (A) Er was een significante kom (F(2) = 5,78, p = 0,007) en uitkomstverschil (F(2) = 3,92, p = 0,029) tijdens het baselinetesten. Bereikpogingen namen toe naarmate het type kom moeilijker werd, hoewel het bereik werd verminderd ten opzichte van de basislijn over alle kommen in de harmaline-toestand. (B) Er werden geen verschillen gevonden bij met Harmaline behandelde ratten voor het bereiken van het bereik in de kommen. (C) Er was een significant verschil in uitkomst (F(2) = 2,07, p < 0,001) tijdens baselinetesten bij analyse op prestatie. (D) Er werden geen verschillen gevonden bij met Harmaline behandelde ratten wat betreft de prestaties van de kom of de uitkomst. Fouten worden gerapporteerd als S.E.M. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Vergelijking van baseline en harmaline condities. (A) Er waren geen verschillen in prestatiesucces tussen condities. (B) Voor het aantal mislukkingen was er een significant verschil tussen de basislijn- en harmalijne condities (H(df) = 4,85, p = 0,028, Kruskal-Wallis) met een significant effect gevonden in de harmalineconditie (p = 0,028, post-hoc Dunn's test met Bonferroni-correctie). Fouten worden gerapporteerd als S.E.M. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Leer- en bereikpercentages. (A) Harmaline-dieren hadden een verstoord leerpercentage in vergelijking met de uitgangsconditie (t-stat = 2,833, p = 0,022). (B) Voor het totale bereik per minuut was er een significante interactie tussen kom (minder) en conditie (harmaline) (F(1,5) = 9,83, p = 0,002, gemengd lineair model) en kom (plinko) en conditie (harmaline) (F(1,5) = 22,67, p < 0,001, gemengd lineair model). Harmaline verminderde het totale aantal bereiken per minuut voor alle soorten kommen (Less: p = 0,01, Plinko: p < 0,001) in vergelijking met de uitgangswaarde. Fouten worden gerapporteerd als S.E.M. *p < 0,05, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Machine learning identificeert unieke houdingen en taakstrategie. (A) Knooppunten op de rattenpoot gelabeld met SLEAP. (B) Voorbeelden van lettergrepen die tijdens het bereiken door keypoint-MoSeq zijn geïdentificeerd. (C) Matrix van bigramovergangsfrequenties tussen opeenvolgende lettergrepen. Overgangskansen worden genormaliseerd door het totale aantal bigrammen. (D) Een overgangsgrafiek waarin de verschillen in lettergreepovergangen tussen Harmaline en Baseline worden vergeleken. Knooppunten van de grafiek vertegenwoordigen lettergrepen en de randen geven overgangen tussen de lettergrepen aan. Meer prominente randen geven lettergreepovergangen met hogere frequenties aan. Rode verbindingen duiden op een opgereguleerde overgang, terwijl een blauwe verbinding een neerwaarts gereguleerde overgang aangeeft bij met harmaline behandelde dieren. Rode cirkels geven een opwaarts gereguleerd gebruik aan, terwijl een blauwe cirkel een neerwaarts gereguleerd gebruik van de aangegeven lettergreep aangeeft bij met harmaline behandelde dieren. Paren lettergrepen met frequenties kleiner dan 0,005 werden uitgesloten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Nadat ratten een voedselbeperking van 90% lichaamsgewicht hadden bereikt, waren ze 2 dagen gewend aan de kamer en ondergingen ze vervolgens gedurende 1-2 weken vormgevende procedures. Het aantal succesvolle, gedropte en mislukte bereiken werd gescoord door een getrainde waarnemer die blind was voor elke aandoening. In de loop van 9 dagen (baseline) werden ratten getest op fijne motoriek op 3 verschillende komconfiguraties (Plain, Less en Plinko). Vervolgens werden dezelfde ratten (n = 5 ...

Discussie

Het bereiken van taken voor knaagdieren is meestal beperkt tot enkele pellets en omvat geen obstructies of zelfverstorende kenmerken, die veel voorkomende problemen zijn voor patiënten met neurodegeneratieve pathologie. De hier gepresenteerde methode, waarbij gebruik wordt gemaakt van zowel een opnieuw ontworpen taak die pellets bereikt als machine learning, kan zowel coördinatie als strategie detecteren door analyse van pose-kenmerken en overgangen, naast individuele vingerbewegingen. D...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3D-printmateriaal	Amazon (Overture)	B07PGY2JP1	PLA-gloeidraad 1,75 mm PLA 3D-printergloeidraad, dimensionale nauwkeurigheid +/- 0,03 mm
Camera	Edmond Optics	BFS-U3-13Y3M-C	1,3 MP, Mono, 170 FPS, ON Semi PYTHON 1300 x2
Camerakabels	Edmond Optics	ACC-01-2300	USB 3.1, 3 m, Type-A naar Micro-B (met vergrendeling) kabel
Cameralens	Thor labs	MVL5WA	4,5 mm EFL, F/1,4, 1/2" formaat machine vision lens
Camera naar statief verbinding	Edmond Optics	88-210	Verbinding voor camera naar statief
Reinigingsdoekjes	Amazon (Sani-Cloth)	B00KMZ7KMO	AF3 oppervlaktedesinfecterende reinigingsdoekjes Mild geur 160 stuks P13872
Computer	Dell	Precision	Intel Core i7-13700 @ 2,1 GHz, NVIDIA T1000 8 GB, RAM 16 GB
IR-licht	Amazon (Serlium)	B0BJFDBT44	Camera IR-licht 48 LED IR verlichtingslampen Waterdicht infrarood nachtzichtlicht voor beveiligingscamera CCTV
Paneel lijm	Amazon (Sdintar)	B0B1DLRPNZ	Glaas lijm
Plexiglas	Amazon (TOOLINHAND US)	B0BRJ1L8TR	12 × 12" heldere gegoten acryl/plexiglas platen - transparant 1/8” dik (3 mm)
Python	Python Software Foundation	Python 3.7
Spinview	Teledyne Technologies	Versie 3.1.0.79
Suikerkorrels (45 mg)	Bioserv	F0023	45 mg, ongesmaakt 50.000/doos; Ingrediënten: sucrose, dextrose, magnesiumstearaat, calciumsilicaat, minerale olie
Statief	Amazon (YOUYI)	B086PYJF9D	Amazon flexibele bureau webcam statief
Pincet	Fine Science Tools	11064-07	Iris pincet
Was	Amazon (Orthomechanics)	B00FKDC0UU	Genuine Orthowax