Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en kweek van primaire retinale Müller-cellen van Sprague-Dawley (SD) ratten

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68129

⸱

17 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Sichuan Province Ophthalmopathy Prevention & Cure and Visual Function Protection with TCM Laboratory, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Retinal Image Technology and Chronic Vascular Disease Prevention & Control and Collaborative Innovation Center, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ophthalmology, Ziyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Ophthalmology, Ineye Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het isoleren van primaire retinale Müller-cellen van neonatale Sprague-Dawley (SD) ratten. De procedure omvat enucleatie van de oogbollen, dissectie van netvliesweefsel, extractie en identificatie van cellen en belangrijke overwegingen voor latere celkweek.

Samenvatting

Retinale Müller-cellen (RMC's) spelen een cruciale rol bij het bieden van structurele ondersteuning en het reguleren van verschillende functies in het netvlies. Als kerncomponent van de retinale micro-omgeving vervullen RMC's verschillende vitale functies. Door hun overvloedige ionkanalen, liganden, receptoren, transmembraantransporters en enzymsystemen dragen deze cellen bij aan de secretie van neurotransmitters en trofische factoren, reguleren ze het netvliesmetabolisme en behouden ze de homeostase van waterionen. Met name RMC's zijn onlangs geïdentificeerd als een belangrijke bron van endogene retinale regeneratieve stamcellen, die nieuwe therapeutische doelen bieden voor de behandeling van retinale degeneratieve ziekten. Daarom is het bestuderen van RMC's essentieel voor het begrijpen van de pathologische mechanismen die ten grondslag liggen aan netvliesaandoeningen. Deze studie stelt systematisch een gestandaardiseerd experimenteel protocol op dat trypsinevertering en zuivering van primaire RMC's, morfologische observatie met behulp van omgekeerde optische microscopie en hematoxyline- en eosine (HE) kleuring, specifieke eiwitidentificatie door middel van immunofluorescentiekleuring en celzuiverheidsanalyse via flowcytometrie omvat. Dit protocol dient als een waardevolle referentie voor zowel fundamenteel onderzoek als klinische toepassingen met betrekking tot RMC's, ter ondersteuning van de exploratie van hun mechanismen bij netvliesaandoeningen en ter bevordering van de ontwikkeling van therapeutische strategieën.

Inleiding

Retinale Müller-gliacellen (RMC's), de overheersende macroglia in het netvlies, vormen de kern van de retinale neurovasculaire eenheid 1,2. RMC's beslaan bijna de gehele dikte van het netvlies en omhullen bijna alle retinale neuronen en microvasculatuur. Hun processen strekken zich uit naar het binnenste beperkende membraan (ILM), waarbij apicale eindvoeten worden gevormd, en naar beneden naar het buitenste beperkende membraan (OLM), waar ze gespecialiseerde microvilli3 ontwikkelen. Deze unieke architectuur stelt RMC's in staat om te functioneren als de primaire structurele steiger voor de organisatie van het netvlies 4,5.

RMC's zijn verrijkt met ionkanalen, liganden, receptoren, transmembraantransporters en enzymen6, en ze nemen deel aan het retinale glucosemetabolisme via glycolyse7. Kaliumionkanalen (Kir2.1, Kir4.1) en waterkanaaleiwitten (AQP4, AQP9, AQP11) reguleren samen de ionen- en waterhomeostase over het celmembraan, waardoor het fysiologisch evenwicht van het netvlies behoudenblijft 7. Bovendien absorberen en wissen RMC's neurotransmitters die worden afgegeven door neuronen, waaronder glutamaat, γ-aminoboterzuur (GABA) en glycine 7,8.

Pathologische aandoeningen zoals diabetische retinopathie7, glaucoom9 en retinitis pigmentosa10 kunnen RMC's beschadigen, de bloed-retinale barrière verstoren, ontstekingen veroorzaken, de vasculaire permeabiliteit verhogen en de netvliesfunctie aantasten. RMC's worden ook erkend als latente intrinsieke bronnen van retinale regeneratieve cellen 11,12. Bij vissen en bepaalde amfibieën kunnen RMC's dedifferentiëren in retinale voorlopercellen die neuronen vervangen die verloren zijn gegaan door verwonding13. In het netvlies van volwassen zoogdieren brengen RMC's stamcelgerelateerde markereiwitten tot expressie14,15, waardoor ze het potentieel hebben om te differentiëren tot retinale neuronen en beschadigde cellen te vervangen bij degeneratieve ziekten zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, glaucoom en diabetische retinopathie16. Primaire RMC's bootsen hun in vivo toestand nauwkeurig na en zijn van grote waarde bij het bestuderen en behandelen van retinale degeneratieve ziekten. De literatuur bevat echter weinig gevestigde methoden voor het isoleren en kweken van primaire RMC's, met name van neonatale Sprague-Dawley (SD) ratten.

Dit protocol maakt gebruik van 3-5 dagen oude neonatale SD-ratten, zonder geslachtsvoorkeur. Onder steriele omstandigheden worden de oogbollen ontkernd en wordt netvliesweefsel verteerd met behulp van trypsine. Primaire RMC's worden vervolgens geïsoleerd via centrifugatie en zuivering voor daaropvolgende kweek en passaging. Morfologische analyse met behulp van omgekeerde optische microscopie in combinatie met hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring toonde aan dat de geïsoleerde cellen karakteristieke RMC-kenmerken vertoonden. Immunofluorescentiekleuring bevestigde de expressie van RMC-specifieke eiwitmarkers, waaronder glutaminesynthetase (GS), cellulair retinaldehydebindend eiwit (CRALBP), Vimentin, aquaporine-4 (AQP4) en inwaarts gelijkrichter kaliumkanaal 4.1 (Kir4.1). Flowcytometrische analyse na labeling met GS- en CRALBP-antilichamen toonde een celzuiverheid van ≥90% aan, wat voldoet aan de vastgestelde criteria voor op RMC gebaseerde biologische experimenten en geschiktheid voor latere functionele studies garandeert. Tijdens het experimentele proces vertoonden cellen in de vierde passage een verminderde hechting aan de kweekfles, morfologische veranderingen en tekenen van veroudering, wat uiteindelijk leidde tot celdood. Daarom werden in latere experimenten alleen cellen uit de eerste drie passages gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en gezichtsonderzoek en zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Ethics Number: 2024069). Vijftig specifieke pathogeenvrije (SPF) Sprague-Dawley-ratten (3-5 dagen oud, geslacht niet gespecificeerd, lichaamsgewicht 7-10 g) werden in het onderzoek gebruikt. De dieren werden commercieel verkregen en gehuisvest in het Experimental Animal Center van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Facility Use License No.: SYXK [Sichuan] 2024-049) onder standaard laboratoriumomstandigheden. Details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn te vinden in de materiaaltabel.

1. Isolatie en cultuur van primaire RMC's

  1. Voorbereiding van experimentele items
    1. Steriliseer de volgende items voor gebruik gedurende ten minste 30 minuten onder ultraviolet licht op de schone bank: T25-kweekkolven, centrifugebuizen en rekken, pipetten en standaards, containers voor vloeibaar afval, sigarettenaanstekers, alcohollampen en markers.
    2. Steriliseer de volgende items door voor gebruik te autoclaveren: 1 ml pipetpunten, buigplaat, glazen petrischaaltjes met deksel, gebogen pincet, 45 μm nylon gaas (300 mesh), getande pincet, tandeloos pincet en micro-hoornvliesschaar.
  2. Voorbereiding op de omgeving: Desinfecteer de omgeving en de operatietafel voor oogboldissectie met ultraviolet licht gedurende meer dan 30 minuten. Spuit alcohol op de handen van de onderzoeker elke keer voordat u de schone bank betreedt en verlaat. Stel de broedmachine in op 37 °C en 5% CO2. Spuit de handen van de onderzoeker in met alcohol voor en na het openen van de couveuse.
  3. Bereiding van de oplossing: Bereid D-Hank's oplossing, fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM hoge glucose), foetaal runderserum (FBS, door warmte geïnactiveerd), penicilline/streptomycine-oplossing (100x) en 0,25% trypsine-EDTA-oplossing.
    OPMERKING: Verwarm DMEM en FBS voor gebruik in een waterbad van 37 °C.
    1. Bereid D-Hank's en PBS-oplossingen die 1% penicilline/streptomycine bevatten door 100 μL penicilline/streptomycine-oplossing toe te voegen aan respectievelijk 10 ml D-Hank's of PBS-oplossing.
    2. Bereid het volledige kweekmedium voor door 100 μl penicilline/streptomycine-oplossing en 2 ml FBS toe te voegen aan 10 ml DMEM met een hoog glucosegehalte.
      OPMERKING: Bereid oplossingen op een schone laboratoriumtafel en gebruik ze indien mogelijk onmiddellijk. Bewaar het volledige kweekmedium voor elk gebruik bij 4 °C en verwarm tot 37 °C. Weggooien als het langer dan een week wordt bewaard.
  4. Oog verwijderen
    1. Euthanaseer neonatale SD-ratten door cervicale dislocatie (zonder CO2 -verstikking) op een gesteriliseerde werkbank volgens institutioneel goedgekeurde protocollen. Dompel de lichamen 5 minuten onder in 75% alcohol voor desinfectie en breng ze vervolgens over naar een steriele gebogen schaal.
    2. Giet de oplossing van D-Hank in twee glazen kweekschaaltjes van 10 cm.
    3. Gebruik een getande pincet om het ooglid langs de ooglidspleet open te scheuren om de oogbol bloot te leggen.
    4. Gebruik een tandeloos pincet dat open en evenwijdig aan de ooglidspleet wordt gehouden om de orbitale naar beneden te drukken. Zodra de oogzenuw is bereikt en de oogbol zichtbaar is, sluit u het pincet om de oogbol op te tillen en te extraheren.
    5. Plaats de oogbol in een glazen kweekschaal met D-Hank's oplossing, spoel deze af en breng deze over naar een andere schaal met verse D-Hank's oplossing.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de oogbol intact blijft. Idealiter zou een deel van de oogzenuw vast moeten blijven zitten om de scheiding van netvliesweefsel te vergemakkelijken.
  5. Retinale dissectie
    1. Bereid een gesteriliseerde, lege kweekschaal met deksel voor en stel de microscoop af.
    2. Plaats de glazen kweekschaal uit stap 1.4.5 onder de microscoop. Gebruik een gebogen oogheelkundige microtang om het gebied tussen het hoornvlies en de oogzenuw voorzichtig te fixeren om het hoornvlies bloot te leggen.
    3. Prik in de corneosclerale overgang met behulp van een micro-hoornvliesschaar. Snijd op een cirkelvormige manier langs de limbus en maak vervolgens symmetrische sclerale incisies van ongeveer 2 mm lang. Laat de tang los en klem deze opnieuw vast op de kruising van de oogzenuw en de sclera.
    4. Gebruik een tweede tang om voorzichtig in de buurt van de oogzenuwwortel te drukken en de druk op het grensvlak tussen hoornvlies en oogzenuw te richten. Wanneer het lensweefsel verschijnt, verwijdert u het voorzichtig en blijft u drukken totdat het netvliesweefsel tevoorschijn komt.
      NOTITIE: Verwijder de lens voorzichtig om te voorkomen dat er per ongeluk netvliesweefsel wordt geëxtraheerd.
    5. Breng het afgescheiden netvliesweefsel met een tang over naar een ander steriel kweekschaaltje. Dek de schaal af, spuit hem in met alcohol en zet hem op de schone bank.
  6. Extractie van primaire RMC's
    1. Zet de schakelaar voor schone tafelventilatie aan.
    2. Open het deksel van de kweekschaal. Gebruik een pipet met een punt van 1 ml om het netvliesweefsel ongeveer 15 keer op en neer te pipetteren om het in kleine stukjes te breken. Voeg 1 ml 0,25% trypsine toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
    3. Haal de kweekschaal uit de broedmachine en plaats deze op de schone bank. Voeg 2 ml volledig medium toe en pipetteer voorzichtig om de spijsvertering te stoppen.
      OPMERKING: Gebruik tweemaal het volume trypsine om de spijsvertering te beëindigen. Als bijvoorbeeld 1 ml trypsine is gebruikt, eindig dan met 2 ml volledig medium.
    4. Filtreer de celsuspensie door een nylon zeef met 300 mazen in een centrifugebuis van 15 ml. Was de schaal met voorbereide PBS en vang de resterende suspensie op.
    5. Centrifugeer de buis op 878 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Aspiratie en gooi het bovenliggende weg. Resuspendeer de pellet in 2 ml volledig medium en centrifugeer opnieuw op 878 x g gedurende 5 minuten om de cellen te zuiveren.
    6. Gooi na het centrifugeren het bovenstaande weg. Resuspendeer de cellen in 2 ml volledig medium. Voeg vooraf 3 ml volledig medium toe aan elke T25-kolf en voeg vervolgens 1 ml van de celsuspensie toe. Schud de kolf in een kruispatroon en plaats deze in de broedmachine.
    7. Voer de eerste mediumwissel uit na 48 uur incubatie. Haal de kolf uit de broedmachine en plaats deze op de schone bank. Gooi het gebruikte medium weg en was het celaanhangende oppervlak drie keer met 1 ml PBS.
      1. Voeg 5 ml vers compleet medium toe. Ga door met het om de dag wisselen van het medium totdat de celsamenvloeiing meer dan 90% bedraagt, en ga dan verder met subculturen.

2. Passeren van RMC's

OPMERKING: Passage de cellen wanneer de samenvloeiing meer dan 90% bedraagt. In dit protocol moeten primaire culturen doorgaans 5-6 dagen na isolatie worden gepasseerd. De timing van de eerste passage kan variëren, afhankelijk van de beplatingsdichtheid. Pas de celdichtheid aan op 4 x 103 cellen/ml en zaai de cellen in T25-kweekkolven. Wanneer de samenvloeiing na 3-4 dagen >90% bereikt, gaat u verder met passeren.

  1. Haal de T25-kweekkolf uit de broedmachine. Gooi het kweekmedium weg en was de cellen driemaal met 1 ml PBS-oplossing met 1% penicilline/streptomycine.
  2. Voeg 1 ml 0,25% trypsine-EDTA-oplossing toe aan de kolf en incubeer gedurende 1 minuut en 30 s.
  3. Bekijk de kolf onder een omgekeerde microscoop. Wanneer de cellen rond en losgemaakt lijken en beginnen te zweven, verwijdert u de kolf uit de broedmachine. Breng het over naar de schone bank en voeg 2 ml volledig kweekmedium toe om de spijsvertering te beëindigen.
  4. Gebruik een pipet om de celsuspensie op te zuigen. Piket voorzichtig tegen de wand van de kolf om eventuele resterende aanhangende cellen los te maken.
  5. Breng de volledige celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml. Spoel de wand van de kolf af met 2 ml PBS met 1% penicilline/streptomycine en voeg het toe aan dezelfde buis. Centrifugeer de buis op 878 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  6. Gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de celpellet in een geschikt volume volledig medium. Passage de cellen in een verhouding van 1:2 of 1:3 naar behoefte.
    OPMERKING: Gebruik cellen bij passage 2 (P2) voor stroomafwaartse experimenten (Figuur 1).

3. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring

  1. Zaadpassage 2 (P2) cellen in een plaat met 6 putjes met vooraf geplaatste steriele dekglaasjes met een dichtheid van 2 x 105 cellen per putje. Voeg 2 ml volledig kweekmedium toe aan elk putje. Wanneer de cellen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, gooit u het kweekmedium weg en spoelt u elk putje twee keer voorzichtig af met 1 ml PBS.
  2. Voeg 1 ml 4% paraformaldehydefixatief toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten om de cellen te fixeren. Gooi het fixeermiddel weg en was de cellen twee keer met 1 ml PBS.
  3. Voeg 1 ml hematoxylinekleuring toe aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten. Gooi de kleuroplossing weg en spoel de putjes 2-3 keer met 1 ml PBS.
  4. Bekijk de cellen onder een microscoop. Als de hematoxylinekleuring te donker lijkt, gebruik dan 1% zoutzuuralcohol om overtollige cytoplasmatische vlek te differentiëren en te verwijderen. Was 2-3 keer met 1 ml PBS.
  5. Voeg 1 ml eosinekleuringsoplossing toe aan elk putje. Bekijk de kleuring onder de microscoop gedurende ongeveer 30 s of totdat de gewenste kleurintensiteit is bereikt. Spoel de putjes 2-3 keer met 1 ml PBS. Monteer de dekglaasjes op dia's met behulp van neutrale hars.

4. Immunofluorescentie kleuring

  1. Zaai P2-cellen in een plaat met 6 putjes met vooraf geplaatste steriele dekglaasjes met een dichtheid van 2 x 105 cellen per putje. Voeg 2 ml volledig kweekmedium toe aan elk putje.
    1. Wanneer de cellen ongeveer 80% samenvloeien, gooi je het kweekmedium weg. Verwijder het dekglaasje en plaats het in een vlekkenpotje. Was het dekglaasje drie keer met 1 ml PBS, telkens 5 minuten.
  2. Voeg ongeveer 50 μl permeabilisatieoplossing (Triton X-100: PBS = 1:200) toe om de cellen te bedekken. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur en was vervolgens drie keer met 1 ml PBS, elke keer 5 minuten. Voeg ongeveer 50 μl 3% BSA-blokkerende oplossing toe en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Gooi de blokkeeroplossing voorzichtig weg. Voeg ongeveer 200 μl primaire antilichaamoplossing bereid in PBS toe om het objectglaasje te bedekken: AQP4 (1:100), Kir4.1 (1:200), GS (1:200), CRALBP (1:50) of Vimentin (1:200). Plaats het dekglaasje in een bevochtigde kamer en broed een nacht bij 4 °C.
  4. Was het dekglaasje drie keer met 1 ml PBS, telkens 5 minuten.
  5. Voeg ongeveer 200 μL FITC-gelabeld geiten anti-konijn IgG secundair antilichaam17 toe. Incubeer 50 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was het dekglaasje drie keer met 1 ml PBS, telkens 5 minuten.
  6. Kleur de kernen gedurende 10 minuten met DAPI. Was drie keer met 1 ml PBS, elke keer 5 minuten.
  7. Voeg een druppel anti-fade montagemedium toe aan de dia. Monteer het dekglaasje met de celzijde naar beneden. Sluit af en observeer onder een fluorescentiemicroscoop.

5. Flowcytometrie

  1. Pas de celconcentratie aan op 1.0 x 107 cellen/ml met behulp van flowcytometriekleuringsbuffer.
  2. 100 μL van de eencellige suspensie in twee afzonderlijke monsterbuisjes per toestand. Wijs één buis aan als negatieve (niet-bevlekte) controle.
  3. Voeg 100 μL permeabilisatiemedium A (uit de in de handel verkrijgbare kit, zie Materiaaltabel) toe aan elke buis. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  4. Voeg 3 ml voorgekoelde flowcytometriekleuringsbuffer toe aan elke buis. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het bovenstaande weg.
  5. Voeg 100 μL permeabilisatiemedium B (uit de in de handel verkrijgbare kit) toe aan elke buis en vortex om te mengen. Voeg 0,1 μl CRALBP-antilichaam toe aan de aangewezen monsterbuisjes en 0,8 μl GS-antilichaam aan de corresponderende buisjes. Voeg geen antilichaam toe aan de negatieve controlebuis. Incubeer 30-60 minuten bij 4 °C in het donker.
  6. Voeg 3 ml flowcytometriekleuringsbuffer toe aan elk buisje. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het bovenstaande weg.
  7. Resuspendeer elk buisje in 100 μL flowcytometriekleuringsbuffer. Voeg 1 μL FITC-geconjugeerd geiten anti-konijn IgG (H&L) toe aan elke met CRALBP bevlekte tube, en 1 μL PE-geconjugeerde geiten anti-konijn IgG (H&L) aan elke GS-gekleurde tube. Voeg geen antilichaam toe aan de negatieve controlebuis. Incubeer 30-60 minuten bij 4 °C in het donker.
  8. Voeg 3 ml flowcytometriekleuringsbuffer toe aan elk buisje. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g en gooi het bovenstaande weg.
  9. Resuspendeer elk buisje in 300 μL flowcytometriekleuringsbuffer. Ga onmiddellijk verder met flowcytometrie-analyse; u kunt ook resuspenderen in 500 μl 1%-4% paraformaldehyde, in het donker bewaren bij 2-8 °C en binnen 24 uur analyseren.
  10. Analyseer negatieve en positieve monsters met behulp van de flowcytometriesoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Nadat primaire cellen in de kweekkolf zijn gezaaid, helpen daaropvolgende mediumveranderingen en passage om slecht hechtende RMC's te elimineren en cellulair afval te verwijderen dat tijdens het passeren wordt gegenereerd, waardoor de RMC-populatie in de cultuur wordt verrijkt. RMC's werden geïdentificeerd op basis van hun morfologie met behulp van een omgekeerde optische microscoop (Figuur 1) en hematoxyline- en eosine (H&E)...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het isoleren van primaire RMC's van neonatale SD-ratten. Het protocol omvat alle fasen, inclusief pre-experimentele voorbereidingen, oogbolenucleatie, isolatie van netvliesweefsel en stapsgewijze procedures voor RMC-extractie, kweek, passage en identificatie. Het benadrukt ook de belangrijkste overwegingen die tijdens het hele celkweekproces in acht moeten worden genomen, en biedt gestandaardiseerde technische richtlijnen voor gerelateerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs hebben geen belangenconflict met betrekking tot de inhoud van dit artikel.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Sichuan Provincial Nature Foundation Fund (2023NSFSC0690).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1% Triton X-100SolarbioT8200
0.25% Trypsin-EDTAHyclone SH30042.01B
1% zoutzuur alcoholBIOSYSTEMS3803651E
4% ParaformaldehydeSolarbioP1110
45μm nylon gaas (300 maas)SolarbioYA0926
6 wel plaatServicebioIMC202302001
6 cm glazen Petri-schaalNormax5058541
75% AlcoholKESHIGEA004
Aquaporin-4 (AQP4)Proteintech Group, Inc16473-1-AP
BSAServicebioGC305010
Celcultuur incubatorThermoFORMA311
cellulair retinaldehyde-bindend eiwit (CRALBP)HUABOIHA721330
CentrifugeHunan XiangyiTDZ5-WS
Schone werkbankZHICHENGZHJH-C12
HoornmesjesJinzhongBXGJ
DAPISolarbioG1012
D-Hank oplossingSolarbioH1045
DMEM  hoge glucose mediumGibcoC11995500BT
Foetaal bovien serum (FBS)Sbjbio life SciencesBC-SE-FBS01
FIX&PERM Medium AMultiSciencesGAS006/2
FIX&PERM Medium BMultiSciencesGAS006/2
flow cytometrie kleuring bufferMultiSciencesS1001
Fluoromount-G fluorescent montagemediumSourthernBiotech0100-01
Glutamine Synthetase Polyklonaal AntilichaamProteintech Group, IncPTG-11037-2-AP-50ul
Geit 324 Anti-Konijn IgG H&L PEBiossbs-0295G-PE
Geit Anti- 323 Konijn IgG H&L FITCBiossbs-0295G-FITC
Hematoxyline-eosine (HE) kleuringskitSolarbioG1120
Hogedruk desinfectiemachinezealway(xiamen) instrument IncGI80DS
Omgekeerde fluorescentiemicroscoopNikon SMZ1500
Omgekeerde fasecontrastmicroscoopLeica DMIL
inwaarts rectificerende kaliumkanaal 4.1 (Kir4.1)Proteintech Group, Inc12503-1-AP
Neutrale harsSolarbioG8590-100
Penicilline-Streptomycine Oplossing (100×)HycloneSV30010
Fosfaat Buffer saline (PBS) (pH7.2- 7.4)SolarbioP1020-500ml
Secundaire antilichaam (FITC-gelabelde geit anti-konijn)ServicebioGB22303
Sprague-Dawley ratten Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd.Productie Licentie Nr.: SCXK [Sichuan] 2020-0030
T25 CultuurflesCornning 430639
Tornadobuizen: 15mLWHB WHB-15-1
Tornadobuizen: 50mLWHB WHB-50-1
ultra violet desinfectie sterilisatorGEMEISIxd06
VimentinAbcamab92547

Referenties

  1. Bringmann, A., Pannicke, T., Grosche, J., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  2. Kugler, E. C., Greenwood, J., MacDonald, R. B. The "neuro-glial-vascular" unit: The role of glia in neurovascular unit formation and dysfunction. Front Cell Dev Biol. 9, 732820(2021).
  3. Reichenbach, A., Bringmann, A. Glia of the human retina. Glia. 68 (4), 768-796 (2020).
  4. Subirada, P. V., Paz, M. C., Ridano, M. E., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. Eur J Neurosci. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  5. Wang, J., O'Sullivan, M. L., Mukherjee, D., et al. Anatomy and spatial organization of Müller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
  6. Beverley, K. M., Pattnaik, B. A. Inward rectifier potassium (Kir) channels in the retina: Living our vision. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (3), C772-C782 (2022).
  7. Lai, D., Wu, Y., Shao, C., et al. The role of Müller cells in diabetic macular edema. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (10), 8(2023).
  8. Coughlin, B., Schnabolk, G., Joseph, K., et al. Systemic complement inhibition reduces intraocular inflammation and retinal cell death in murine models of glaucoma. J Neuroinflammation. 16, 212(2019).
  9. Alarcon-Martinez, L., Shiga, Y., Villafranca-Baughman, D., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
  10. Strong, S., Liew, G., Michaelides, M. Retinitis pigmentosa-associated cystoid macular oedema: Pathogenesis and avenues of intervention. Br J Ophthalmol. 101 (1), 31-37 (2017).
  11. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).
  12. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. J. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).
  13. Norrie, J. L., et al. Latent epigenetic programs in Müller glia contribute to stress and disease response in the retina. Dev Cell. 60 (8), 1199-1216.e7 (2025).
  14. Too, L. K., Gracie, G., Hasic, E. Adult human retinal Müller glia display distinct peripheral and macular expression of CD117 and CD44 stem cell-associated proteins. Acta Histochem. 119 (2), 142-149 (2017).
  15. Bhatia, B., Jayaram, H., Singhal, S. Differences between the neurogenic and proliferative abilities of Müller glia with stem cell characteristics and the ciliary epithelium from the adult human eye. Exp Eye Res. 93 (6), 852-861 (2011).
  16. Grigoryan, E. N. Cell sources for retinal regeneration: Implication for data translation in biomedicine of the eye. Cells. 11 (23), 3755(2022).
  17. Dong, S., Li, X., Chen, Z. MMP28 recruits M2-type tumor-associated macrophages through MAPK/JNK signaling pathway-dependent cytokine secretion to promote the malignant progression of pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 60(2025).
  18. Vardimon, L., Ben-Dror, I., Havazelet, N. Molecular control of glutamine synthetase expression in the developing retina tissue. Dev Dyn. 196 (4), 276-282 (1993).
  19. Xu, Q. A., Boerkoel, P., Hirsch-Reinshagen, V. Müller cell degeneration and microglial dysfunction in the Alzheimer's retina. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 145(2022).
  20. Bunt-Milam, A. H., Saari, J. C. Immunocytochemical localization of two retinoid-binding proteins in vertebrate retina. J Cell Biol. 97 (3), 703-712 (1983).
  21. Masri, R. A., et al. Immunohistochemistry and spatial density of Müller cells in the human fovea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 46(2025).
  22. Kolesnikov, A. V., Kiser, P. D., Palczewski, K. Function of mammalian M-cones depends on the level of CRALBP in Müller cells. J Gen Physiol. 153 (1), e202012675(2021).
  23. Xue, Y., Shen, S. Q., Jui, J. CRALBP supports the mammalian retinal visual cycle and cone vision. J Clin Invest. 125 (2), 727-738 (2015).
  24. Pereiro, X., Beriain, S., Rodriguez, L. Characteristics of whale Müller glia in primary and immortalized cultures. Front Neurosci. 16, 854278(2022).
  25. Tran, T. L., Bek, T., Holm, L. Aquaporins 6-12 in the human eye. Acta Ophthalmol. 91 (6), 557-563 (2013).
  26. Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (2), 42-47 (2015).
  27. Zeng, Q., Xia, X. B. Study on the differentiation of retinal ganglion cells from rat Müller cells in vitro. Yan Ke Za Zhi. 46 (7), 615-620 (2010).
  28. Backstrom, J. R., et al. Phenotypes of primary retinal macroglia: Implications for purification and culture conditions. Exp Eye Res. 182, 85-92 (2019).
  29. Liu, X., Tang, L., Liu, Y. Mouse Müller cell isolation and culture. Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).
  30. Pereiro, X., et al. Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice Müller glia in order to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 14 (7), (2020).
  31. Wang, M., Ma, W., Zhao, L. Adaptive Müller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. J Neuroinflammation. 8, 173(2011).
  32. Tomaszewski, R., Gad, M. S., Negoita, P. Isolation of primary mouse retinal glial Müller cells. J Vis Exp. (210), e66237(2024).
  33. Li, Q., Cheng, Y., Zhang, S. TRPV4-induced Müller cell gliosis and TNF-α elevation-mediated retinal ganglion cell apoptosis in glaucomatous rats via JAK2/STAT3/NF-κB pathway. J Neuroinflammation. 18 (1), 271(2021).
  34. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  35. Reichenbach, A., Wolburg, H., Richter, W. Membrane ultrastructure preservation and membrane potentials after isolation of rabbit retinal glial (Müller) cells by papain. J Neurosci Methods. 32 (3), 227-233 (1990).
  36. Harstad, H. K., Ringvold, A. Scanning and transmission electron microscopy of Müller cells isolated from rabbit retina. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 223 (1), 29-34 (1985).
  37. Guidry, C. Isolation and characterization of porcine Müller cells. Myofibroblastic dedifferentiation in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (5), 740-752 (1996).
  38. Qiu, A. W., Wang, N. Y., Yin, W. J. Retinal Müller cell-released exosomal miR-92a-3p delivers interleukin-17A signal by targeting Notch-1 to promote diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 1(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Primaire celkweekdissectie van het netvliestrypsine-verteringSprague-Dawley rattenimmunofluorescentiekleuringflowcytometriehematoxyline-eosin kleuringglutaminesynthetaseretinale stamcellen
Isolatie en kweek van primaire retinale Müller-cellen van Sprague-Dawley (SD) ratten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.