Matrix-gebaseerde DNA-extractie voor gerichte sequencing van de volgende generatie op ontsmette sputummonsters

Summary

We presenteren een geoptimaliseerde methode voor DNA-extractie uit ontsmet sputum met behulp van een matrix-gebaseerde extractiemethode in combinatie met een magnetische parelzuivering voor downstream gerichte next-generation sequencing van Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

Sequencing van de volgende generatie (NGS) wordt nu erkend als een krachtig hulpmiddel voor een tijdige en nauwkeurige diagnose van resistente tuberculose (DR-TB). Targeted NGS (tNGS) biedt een gestroomlijnde aanpak door zich te concentreren op specifieke genen die verband houden met resistentie tegen geneesmiddelen, waarbij de behoefte aan traditionele, op cultuur gebaseerde methoden met doorlooptijden variërend van weken tot maanden wordt omzeild. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) heeft tNGS aanbevolen als een waardevolle strategie voor het verbeteren van de diagnose van tuberculose (tbc) om de behandeling te begeleiden en de behandelingsresultaten te verbeteren, met name in omgevingen met beperkte middelen. Onder de door de WHO aanbevolen tNGS-testen hebben we een methode geselecteerd die snelle en uitgebreide gevoeligheidstests voor geneesmiddelen, bepaling van de afstamming en stamtypering biedt. Hoewel er gestandaardiseerde DNA-extractiemethoden beschikbaar zijn, kunnen deze tijdrovend en arbeidsintensief zijn. Om deze uitdaging aan te gaan, hebben we een vereenvoudigd, op matrix gebaseerd DNA-extractieprotocol geoptimaliseerd in combinatie met magnetische parelzuivering. Deze methode biedt een snelle en efficiënte aanpak voor het extraheren van DNA rechtstreeks uit ontsmette sputumsedimenten, waardoor een snelle stroomafwaartse tNGS-analyse mogelijk is. Door het DNA-extractieproces uit sputumsediment te stroomlijnen, zou dit protocol een bredere acceptatie van tNGS in routinematige klinische omgevingen kunnen vergemakkelijken, wat uiteindelijk zou kunnen bijdragen aan betere patiëntresultaten en zou kunnen bijdragen aan wereldwijde inspanningen op het gebied van tbc-bestrijding.

Introduction

Naar schatting 3,7 miljoen mensen met tuberculose werden in 2023 wereldwijd niet gediagnosticeerd en behandeld, wat de aanzienlijke bedreiging van tuberculose voor de wereldwijde gezondheid benadrukt^. De WHO schat dat ongeveer 400.000 mensen in 2023 rifampicineresistente (RR-TB) of multiresistente tuberculose (MDR-TBC) ontwikkelden¹. Het snel diagnosticeren en behandelen van tuberculose en DR-tbc is essentieel voor het bereiken van de mijlpalen en doelstellingen voor het verminderen van de incidentie en mortaliteit van tuberculose¹.

Vertrouwen op conventionele kweekmethoden en fenotypische gevoeligheidstesten voor geneesmiddelen (pDST) vertraagt de bepaling van het resistentieprofiel van klinische isolaten en behandeling, met doorlooptijden van 6-8 weken, en vereist een complexe biocontainment-infrastructuur. Routinematige diagnostische tests, in combinatie met NGS van DR-TB, kunnen een uitgebreid resistentieprofiel voor geneesmiddelen bieden en de personalisatie van MDR-TB-regimes verbeteren, terwijl ook de tijd tot effectieve behandeling wordt verkort van weken of maanden tot dagen ^2,3,4.

In 2023 en 2024 heeft de WHO het gebruik van tNGS aanbevolen als een nieuwe diagnostische klasse om snel de gevoeligheid voor eerste- en tweedelijns anti-tbc-geneesmiddelen te bepalen⁵. Dit maakt het een waardevol hulpmiddel voor het begeleiden van behandelingsbeslissingen zonder de noodzaak van Mycobacterium tuberculosis (MTB) -cultuur in laboratoria van bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3). Een tNGS-benadering is een gecondenseerde vorm van sequencing die polymerasekettingreactie (PCR) gebruikt om gendoelen die resistentie tegen geneesmiddelen verlenen te amplificeren voorafgaand aan sequencing. Onder de door de WHO aanbevolen tNGS-tests hebben we de Deeplex Myc-TB-test geselecteerd, waarvan is gemeld dat deze voldoet aan de op klassen gebaseerde criteria voor het detecteren van resistentie tegen rifampicine, isoniazide, ethambutol, pyrazinamide, fluorchinolonen, amikacine, streptomycine, linezolid, bedaquiline en clofazimine. We gebruiken deze test om de geschiktheid van het DNA dat met dit protocol is geëxtraheerd voor stroomafwaartse tNGS te evalueren.

Daarnaast publiceerde de WHO de 2e^{editie van} de catalogus van mutaties die verband houden met resistentie tegen geneesmiddelen bij MTB, met een routekaart voor het gebruik van sequencing van het hele genoom (WGS) en tNGS om de gevoeligheid voor geneesmiddelen te voorspellen en de behandeling te begeleiden⁶. Een recente systematische review en meta-analyse toonden aan dat tNGS een gevoeligheid en specificiteit had van respectievelijk 94,1% en 98,1% voor de detectie van geneesmiddelresistentie, gebaseerd op 23 doelen in verschillende resistentieverlenende regio's in het MTB-genoom, vergeleken met pDST⁷.

De implementatie van deze methoden blijft echter een uitdaging vanwege de complexiteit en kosten die specifiek verband houden met de vereiste workflows, infrastructuur en apparatuur. Een cruciale uitdaging is het isoleren van voldoende mycobacterieel DNA van hoge kwaliteit rechtstreeks uit het sediment van ontsmet sputum, een cruciale stap voor stroomafwaartse tNGS-toepassingen. Om dit aan te pakken, presenteren we een snelle en eenvoudige DNA-extractiemethode die is afgestemd op tNGS.

De gestandaardiseerde DNA-extractiemethode voor de geselecteerde MTB tNGS-test omvat een interne handleiding en geautomatiseerd protocol⁸. Hier beschrijven we een vereenvoudigd, op matrix gebaseerd DNA-extractieprotocol (Figuur 1). De methode maakt gebruik van de InstaGene Matrix (IGM), die metalen en eiwitten bindt, waardoor hoogwaardige nucleïnezuurextractie rechtstreeks uit ontsmette sputumsedimenten mogelijk is. Dit alternatief zorgt voor een snellere doorlooptijd en voldoende DNA-opbrengst voor downstream tNGS. Dit protocol overwint de complexiteit van de handmatige en geautomatiseerde methoden en zorgt tegelijkertijd voor hoogwaardige tNGS voor de snelle diagnose van varianten die resistentie verlenen in MTB. Met de groeiende belangstelling voor het gebruik van tNGS binnen de mycobacteriologie, zou dit protocol de acceptatie ervan in routinematige diagnostische workflows kunnen vergemakkelijken.

Figuur 1: Schematische weergave van de methoden voor het extraheren van mycobacterieel DNA uit ontsmette sputumsedimentmonsters met behulp van een matrixsuspensie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Dit onderzoek is goedgekeurd door de Research Ethics Committee: Biological and Environmental Safety (REC: BES) aan de Universiteit van Stellenbosch: BES-2024-25384 en de Human Research Ethics Committee: N21/09/093 en N09/11/296.

1. Voorbereiding van het sputumsedimentmonster

OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een laboratorium van bioveiligheidsniveau drie (BSL3) voorafgaand aan DNA-extractie.

1. Bereid een aliquot voor van het sputumsedimentmonster dat eerder is ontsmet met N-acetyl-L-cysteïne (NALC) en natriumhydroxide (NaOH) (NALC/NaOH) door 500 μL-2 ml over te brengen naar een buis van 1.5 ml of 2 ml met een lage binding.
2. Zet de buisjes met sputumsedimentmonsters rechtop in een buisrek en plaats de monsters in een oven bij 80 °C en incubeer gedurende 1 uur om de mycobacteriën te inactiveren door middel van warmtebehandeling.
3. Verwijder na 1 uur het buisrek met monsters, veeg de buisoppervlakken af en plaats ze in een geschikte container voor transport naar een laboratorium van bioveiligheidsniveau twee (BSL2).
   NOTITIE: Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur voordat u ze verder hanteert of opbergt.

2. DNA-extractie met behulp van de matrixsuspensie en een hogesnelheidshomogenisator (Figuur 2)

1. Voordat u begint, voegt u drie glasparels met een diameter van 2 mm toe aan buisjes met schroefdop van 1,5 of 2 ml, losjes afgedekt en autoclaaf (idealiter ten minste een dag voor DNA-extractie).
2. Haal de matrixsuspensie uit de koelkast en plaats deze op een magnetische roerder (een magneet zit in de reagensfles) om het reagens op kamertemperatuur te brengen en het reagens te mengen.
3. Schakel het verwarmingsblok in en verwarm voor op 56 °C (als er twee verwarmingsblokken beschikbaar zijn, verwarm dan de tweede voor op 100 °C.
   OPMERKING: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd op een laboratoriumtafel in een BSL2-faciliteit:
4. Centrifugeer het door warmte geïnactiveerde sputumsedimentmonster gedurende 15 minuten bij 16.800 × g (of volle snelheid). Zuig met een pipet van 20-200 μL de supernatant voorzichtig aan en gooi deze weg, zodat de pellet ongestoord blijft.
5. Meng de matrixsuspensie door voorzichtig te schudden (niet vortexen) en voeg 200 μL van de goed gemengde matrix toe om de pellet opnieuw te suspenderen.
6. Pipetteer het volledige volume in een buis met schroefdop van 1,5 ml met daarin drie voorgesteriliseerde glasparels met een diameter van 2 mm.
7. Leg de monsters in een verwarmingsblok en incubeer ze gedurende 15 minuten bij 56 °C.
   NOTITIE: Direct na het verwijderen van het monster uit het verwarmingsblok, stelt u het verwarmingsblok in op 100 °C na stap 2.7, als er maar één verwarmingsblok beschikbaar is.
8. Homogeniseer de monsters met behulp van een vortex gedurende 10 s om de cellen te verspreiden.
9. Leg de monsters in een verwarmingsblok en incubeer gedurende 10 minuten bij 100 °C.
10. Homogeniseer de monsters met behulp van een hogesnelheidshomogenisator met de volgende parameters: één cyclus van 60 s bij 4,0 m/s.
11. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 5 min. Breng 130 μL van het DNA-bevattende supernatans over naar een verse 1,5 ml buisje met een lage binding zonder de pellet (matrix met celresten) te verstoren. Gooi het eerste buisje met de matrix en celresten weg.
    OPMERKING: VEILIGE STOPPLAATS. Als u stopt, vries de monsters dan in bij -20 °C totdat u klaar bent om door te gaan met de DNA-zuivering.
12. Ga verder met DNA-zuivering met behulp van magnetische kralen.

Figuur 2: Op matrix gebaseerde DNA-extractiemethode in combinatie met een snelle homogenisator. Afkorting: HSH = high-speed homogenisator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. DNA-zuivering met behulp van magnetische kralen (Figuur 3)

OPMERKING: Voordat u doorgaat met de DNA-zuivering, voert u stap 3.1 en 3.2 uit.

1. Haal de magnetische kralen uit de koelkast en zet de container 30 minuten op kamertemperatuur om in evenwicht te komen. U kunt ook de magnetische kralenfles vortexen om alle kralen opnieuw te suspenderen en een aliquot van 1.280 μL in een nieuwe buis op te zuigen (voor zuivering van 21 monsters) en op kamertemperatuur plaatsen om in evenwicht te komen.
2. Bereid een batch van 9 ml 80% ethanol voor door 7,2 ml pure ethylalcohol toe te voegen aan 1,8 ml gefilterd en gesteriliseerd water.
   OPMERKING: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd op een laboratoriumtafel in een BSL2-faciliteit.
3. Draai de magnetische kralenfles of het voorbereide aliquot grondig om ervoor te zorgen dat de kralen voor gebruik opnieuw worden gesuspendeerd. Herhaal de vortex na elke 10 monsters om een homogene suspensie te garanderen.
4. Voeg 1,2x volume (156 μL) van de magnetische kralen toe aan het geëxtraheerde DNA (130 μL).
   OPMERKING: Voor monsters met grotere hoeveelheden DNA (cultuur) kan een kleiner deel van het monster worden verwerkt (bijv. 50 μL) en worden gezuiverd met 1,2x volume magnetische kralen.
5. Meng de samples door 10x te pipetteren. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
6. Plaats de monsters op het magnetische rek van 1,5 ml of totdat de vloeistof helder wordt. Zuig het bovenstaande voorzichtig op en gooi het weg zonder de kralen te verstoren.
7. Voeg met de buisjes op de magneet 200 μL 80% ethanol toe, zorg ervoor dat de korrels ongestoord blijven en laat 30 s incuberen.
8. Zuig de ethanol voorzichtig op en gooi deze weg zonder de kralen te verstoren.
9. Herhaal stap 3.7 voor in totaal twee wasbeurten.
10. Verwijder na de tweede wasbeurt de ethanol en gooi deze weg. Verwijder eventuele resterende ethanol met een pipet van 1-10 μL.
11. Laat de tubes 10 minuten open om de kralen aan de lucht te drogen, of totdat de kralen er mat uitzien.
    OPMERKING: Laat de kralen niet te droog drogen en barsten.
12. Zodra de kralen er mat uitzien, verwijdert u onmiddellijk de buisjes uit de magneet en voegt u 50 μL nucleasevrij water (NFW) rechtstreeks toe aan de kralen in elk monster. Nadat u NFW aan alle buisjes hebt toegevoegd, mengt u elk afzonderlijk monster door 10x te pipetteren. Inspecteer de tube op eventuele parels die aan de binnenkant van de tube vastzitten en herhaal de mengstap indien nodig. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: De incubatie kan worden verlengd van 5 minuten tot 10 minuten, maar verkort de incubatietijd niet tot minder dan 5 minuten.
13. Plaats de buisjes terug op het magnetische rek gedurende 3 minuten of totdat de vloeistof helder is. Breng met de buisjes op het magnetische rek het DNA-bevattende supernatans over in een duidelijk gemarkeerde, steriele, laagbindende buis. Zorg ervoor dat kralen niet worden overgedragen aan de supernatant.
    OPMERKING: Als er tijdens het overbrengen parels zichtbaar zijn in de pipetpunt, pipetteer dan het bovenstaande terug in de buis op het magnetische rek om nog 3 minuten te scheiden. Breng geen kralen over in de nieuwe tube.
    VEILIG STOPPUNT. Als u stopt, vriest u de monsters in bij -20 °C totdat u klaar bent om verder te gaan met kwantificeren met behulp van een NGS-geschikte methode en vervolgens PCR-amplificatie met behulp van een MTB-tNGS-test.

Figuur 3: DNA-zuivering en -concentratie met behulp van magnetische kralen. Afkortingen: NFW = nucleasevrij water; tNGS = gerichte next-generation sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Beschrijving van het monster
In totaal werden 165 sputumsedimentmonsters, positief voor zuurvaste bacillen (AFB) op microscopie met een bacteriële belasting van ten minste 1+, routinematig verzameld en verwerkt door de National Health Laboratory Services (NHLS) Green Point, Kaapstad, Zuid-Afrika. DNA werd geëxtraheerd uit sputumsedimentmonsters met behulp van twee verschillende volumes [ongeveer 2 ml (n = 102) en 500 μl (n = 63)]. Deze vergelijking werd uitgevoerd om te beoordelen of het kleinere sedimentmonstervolume voldoende DNA zou kunnen opleveren voor stroomafwaarts tNGS.

Figuur 4 toont een boxplot-vergelijking van de totale DNA-concentratie (ng/μL) over verschillende sputumuitstrijkjes (1+, 2+ en 3+) en sputumsedimentvolumes (2 ml en 500 μL). De DNA-opbrengst neemt over het algemeen af bij gebruik van 500 μL sediment voor extractie, met variabiliteit tussen uitstrijkjes. De gemiddelde DNA-concentraties geëxtraheerd uit sedimentmonsters met een volume van ten minste 2 ml waren dus gemiddeld hoger dan de DNA-concentratie geëxtraheerd uit 500 μL sedimenten, gestratificeerd door AFB van het monster.

Figuur 4: Impact van het sputumsedimentvolume op de DNA-opbrengst over uitstrijkjes heen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5 toont boxplots die het gemiddelde aantal sequencing-lezingen (gemiddelde dekkingsdiepte) illustreren van alle doelen voor sputumsedimentmonsters met verschillende uitstrijkjes (1+, 2+ en 3+) verwerkt uit twee verschillende invoervolumes (2 ml en 500 μL). Uitschieters worden weergegeven door individuele punten en de y-as wordt weergegeven op een logaritmische schaal om variatie in dekking op te vangen. Het hoge interkwartielbereik voor 3+ monsters geëxtraheerd uit de 500 μL-sedimenten suggereert een grotere variabiliteit met hogere bacteriële belastingen.

Figuur 5: Vergelijking van het gemiddelde aantal sequencing-lezingen (dekkingsdiepte) voor alle doelen in uitstrijkjes en sample-invoervolumes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6 toont de evaluatie van de aanvaardbaarheid van sequentieresultaten met behulp van de bioinformaticapijplijn van de bijbehorende webapplicatie. De kwaliteitsscores voor de sequentiebepaling zijn gecategoriseerd als +++ (zeer acceptabel), ++ (acceptabel), + (marginaal acceptabel), - (onacceptabel) en ND (niet bepaald). Het ontbreken van een balk in de grafiek geeft aan dat er geen resultaten zijn verkregen voor die specifieke categorie. Uitstrijkje graad 1+ vertoont een hoger aandeel onaanvaardbare en ND-resultaten in vergelijking met uitstrijkjes graad 2+ en 3+ voor de 500 μL invoervolumemonsterset. Monsters geëxtraheerd uit 500 μL sputumsediment hadden een gemiddelde sequencingdekkingsdiepte van 4.316 vergeleken met 4.810 voor monsters geëxtraheerd uit 2 ml sputumsediment. Dit suggereert dat DNA geëxtraheerd uit sputumsediment voldoende was om stroomafwaarts tNGS uit te voeren, ongeacht het invoervolume.

Op basis van de verdeling van de aanvaardbaarheid van het sequentieresultaat hadden monsters met een uitstrijkje van 3+ het hoogste succespercentage, waarbij de meeste monstersequenties werden gescoord als ++ en +++ in vergelijking met monsters van 1+ en 2+ uitstrijkjes. Voor de 500 μL invoermonsters is het aandeel monsters in de categorieën - en + relatief hoger voor alle uitstrijkjes in vergelijking met de 2 ml invoermonsters. Dit suggereert dat meer monsters in de minderwaardige, minder acceptabele categorieën vallen voor de 500 μL-invoer. Voor de invoermonsters van 2 ml is er een hoger aandeel monsters in de categorieën van hogere kwaliteit, ++ en +++, met name voor uitstrijkjes van klasse 3+. Dit suggereert dat monsters met een input van 2 ml meer kans hebben om betere sequentiekwaliteitsscores te produceren in vergelijking met monsters met een input van 500 μl.

Figuur 6: Verdeling van kwaliteitsscores op basis van uitstrijkjes en invoervolumes van samples. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De combinatie van de op matrix gebaseerde extractiemethode in combinatie met een hogesnelheidshomogenisator werd oorspronkelijk gepubliceerd door Shea et ^al.9. Deze methode is ontwikkeld en geoptimaliseerd voor WGS van DNA geëxtraheerd uit MTBC-culturen ^9,10. We hebben deze methode geoptimaliseerd voor gebruik met een MTB tNGS-test. De DNA-extractie en zuivering van 21 monsters had een gecombineerde doorlooptijd van 4 uur en 40 minuten, inclusief incubatie- en centrifugatiestappen. De betrouwbaarheid van het beschreven protocol in combinatie met een kralenopruiming voor DNA-extractie uit monsters met uitstrijkjes variërend van 1+ tot 3+ wordt aangetoond op basis van de gemiddelde opbrengst (Figuur 4), de algehele dekkingsdiepte van alle doelen samen (Figuur 5) en de aanvaardbaarheidsscore van het sequentieresultaat zoals bepaald door de bijbehorende webapplicatie (Figuur 6).

Een recente studie vond geen consistente relatie tussen uitstrijkjes en DNA-concentratie of sequencing-leesdiepte. De auteurs suggereerden dat variabiliteit in monsterverwerking en opruimstappen de prestaties in monsters met een hoge uitstrijkkwaliteit kan beïnvloeden, vooral wanneer verontreinigingen niet efficiënt worden verwijderd. Bovendien blijft sequentiebepaling van sputumsediment een uitdaging vanwege de complexiteit van de DNA-pool, waar niet-doelwit-DNA kan concurreren met MTB-DNA¹¹. Hoewel we geen duidelijke correlatie hebben waargenomen tussen de DNA-concentratie van de invoer en de sequentiediepte, is het belangrijk op te merken dat de DNA-invoer vóór de doel-PCR niet hoger mag zijn dan 100 ng, volgens de instructies van de fabrikant, omdat dit kan leiden tot PCR-remming. Bovendien kunnen een hogere bacteriële belasting, 2+ en 3+ sputumsedimentmonsters meer verontreinigingen bevatten, zoals menselijk DNA, celresten en andere remmers, die de PCR-amplificatie en bibliotheekvoorbereiding kunnen verstoren.

De zuiveringsstap functioneert ook als een concentratiestap, waardoor de opbrengst van mycobacterieel DNA voorafgaand aan tNGS wordt verbeterd. Deze methode is effectief voor het verwerken van monsters met een lage bacteriële belasting en heeft betrouwbare prestaties aangetoond met volumes zo klein als 500 μL, waardoor het geschikt is voor routinematige omgevingen waar een beperkt monstervolume beschikbaar is. De toepassing ervan kan de behoefte aan vervolgbezoeken aan klinieken verminderen, waardoor het risico op verlies van patiënten voor follow-up wordt geminimaliseerd. Bovendien is de methode eenvoudig en vereist deze geen geavanceerde laboratoriumexpertise, wat de integratie in omgevingen met beperkte middelen verder ondersteunt.

Er moeten echter enkele punten over het protocol worden opgemerkt. Monsters mogen niet onmiddellijk na incubatie bij 80 °C worden ingevroren of gekoeld. Snelle afkoeling onmiddellijk na warmtebehandeling kan condensatie veroorzaken op de binnenoppervlakken van de buis, wat leidt tot verdunning van het monster en mogelijk van invloed is op de stroomafwaartse DNA-extractie. Bovendien kan plotselinge afkoeling het risico op degradatie van het monster vergroten door nucleïnezuurfragmentatie of enzymatische activiteit te bevorderen die mogelijk niet volledig is geïnactiveerd tijdens de warmtebehandeling. Deze overwegingen zijn met name relevant bij het verwerken van sputummonsters voor MTB-detectie. Volgens de aanbevelingen van de WHO voor Ziehl-Neelsen-kleuring komt een uitstrijkgraad van 1+ overeen met 10-99 AFB per 100 olie-immersievelden, 2+ geeft 1-10 AFB per veld aan in ten minste 50 velden, en 3+ staat voor meer dan 10 AFB per veld in ten minste 20 velden¹².

Een beperking van deze methode is het gebrek aan automatisering vanwege de vereiste van handmatige homogenisatie met behulp van een hogesnelheidshomogenisator of kralenklopapparaat. Om dit aan te pakken, zijn de voortdurende inspanningen gericht op het verfijnen van het protocol door kortere incubatietijden, lagere incubatietemperaturen en alternatieve benaderingen van homogenisatie met hoge snelheid te testen.

Deze op matrix gebaseerde DNA-extractiemethode, gecombineerd met een snelle homogenisator, is dus een snelle DNA-extractietechniek die gebruik maakt van hitte en kralen om genomisch DNA vrij te maken en tegelijkertijd PCR-remmers, zoals metalen en eiwitten, te verwijderen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alternatief: Benchmark BeadBlaster 24	Benchmark Scientific	D2400
AMPure XP Bead-Based Reagens	Beckman Coulter	A63881
Autoclage of steriele glazen kralen (2 mm)	Sigma-Aldrich	Z273627-1EA
Ethyl alcohol, puur	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Filter pipette tips (10 µL)	Bio-Smart Scientific	FT-10-R
Filter pipette tips (1000 µL)	Bio-Smart Scientific	FT1000-R
Filter pipette tips (20 µl)	Bio-Smart Scientific	FT20-R
Filter pipette tips (200 µL)	Bio-Smart Scientific	FT200-R
Verwarmingsblok variërend van 37 °C tot 100 °C	Eppendorf	5382000031
Hogesnelheids homogenisator (HSM) als FastPrep-24	MP Biomedicals	116005500
Incubator 80 °C	Lasec Group	IBLPDHG-9030A
InstaGene Matrix	Bio-Rad Laboratories Inc.	BBRD7326030
Laagbindende microbuisjes (1,5 mL of 2 mL)	Eppendorf	EP0030108051-250EA
Magnetisch rek voor 1,5 – 2 mL buisjes	Thermo Fisher Scientific Inc.	12321D
Magnetische roerder	Merck	Z671886
Microcentrifuge	Eppendorf	5406000046
Milli-Q IX 7015 Zuiver Waterzuiveringssysteem	Merck	ZIX7015T0C
Nuclease-vrij water (NFW), moleculaire kwaliteit	Thermo Fisher Scientific Inc.	AM9937
Pipetten (P10, P20, P200 en P1000)	Eppendorf	EP3123000918-1EA
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33231
Qubit fluorometer instrument	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226
Schroefdopbuisjes (1,5 mL)	Scientific Specialties Inc.	P2TUB056C-0001.5ST
Vortex	Lasec Group	WMBB0L0E0216