Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Oprichting en histologische analyse van slokdarmorganoïden die de progressie van normale naar kankerachtige weefsels modelleren

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68149

⸱

30 mei 2025

 ,  ,  , 
1Department of Etiology and Carcinogenesis, National Cancer Center/National Clinical Research Center/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) and Peking Union Medical College (PUMC), 2Key Laboratory of Cancer Genomic Biology, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) and Peking Union Medical College (PUMC), 3Changping Laboratory, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft de opstelling en histologische analyse van slokdarmorganoïdemodellen die verschillende stadia van tumorprogressie vertegenwoordigen. Deze methode stelt onderzoekers in staat om veranderingen in cellulaire morfologie, ruimtelijke organisatie en moleculaire markerexpressiepatronen te bestuderen tijdens de overgang van normale naar kankerweefsels.

Samenvatting

Organoïden zijn naar voren gekomen als een cruciaal hulpmiddel voor het bevorderen van het begrip van tumorigenese en kankertherapie. Door humane organoïdemodellen te genereren die verschillende tumorstadia vertegenwoordigen en histologische analyses uit te voeren, is het mogelijk om een beter begrip te krijgen van de veranderingen in cellulaire morfologie, ruimtelijke architectuur en de expressie van belangrijke moleculaire markers naarmate de tumor vordert. Deze studie presenteert een uitgebreid protocol voor het opzetten en kweken van slokdarm plaveiselcelorganoïden. Daarnaast schetst het protocol methoden voor het beoordelen van de expressiepatronen en ruimtelijke organisatie van kritische moleculen binnen de organoïden, met behulp van technieken zoals fixatie, inbedding en kleuring. Door middel van dit protocol werden significante veranderingen geïdentificeerd in de ruimtelijke structuur van slokdarmplaveiselepitheelcellen en in de expressie van verschillende tumorbiomarkers tijdens tumorigenese. Het protocol vergemakkelijkt de constructie en histologische analyse van organoïden, waardoor onderzoekers de ruimtelijke architectuur en moleculaire veranderingen van epitheelcellen in verschillende stadia van tumorigenese en therapeutische interventie kunnen onderzoeken.

Inleiding

Tumorigenese is een complex, meerfasig proces dat wordt gekenmerkt door progressieve moleculaire en morfologische veranderingen in cellen 1,2. Slokdarmplaveiselcelcarcinoom (ESCC), een veel voorkomende maligniteit met een slechte prognose 3,4, illustreert deze stapsgewijze progressie door vier verschillende stadia: normaal slijmvlies, laaggradige intra-epitheliale neoplasie (LGIN), hooggradige intra-epitheliale neoplasie (HGIN) en invasief carcinoom5. Gedurende deze stadia vertonen epitheelcellen dynamische veranderingen in moleculaire expressiepatronen en ruimtelijke organisatie, vergezeld van systematische veranderingen in de weefselmorfologie naarmate deze evolueert van een normale naar een kwaadaardige toestand 6,7. Ondanks de vooruitgang in het begrijpen van de pathogenese van ESCC, heeft het gebrek aan experimentele modellen die ruimtelijke en temporele aspecten van tumorevolutie getrouw samenvatten - terwijl systematische histologische en moleculaire analyses mogelijk zijn - een dieper mechanistisch begrip van ziekteprogressie en therapeutische ontwikkeling belemmerd.

Hoewel 2D onsterfelijke kankercellijnen een belangrijke bijdrage hebben geleverd aan het begrip van oncogenese, zijn ze inherent beperkt in het repliceren van de biologische complexiteit en pathologische kenmerken van inheemse tumoren8. Diermodellen, hoewel ze in vivo context bieden, voorspellen vaak slecht menselijke reacties vanwege soortspecifieke verschillen9. Organoïden daarentegen zijn naar voren gekomen als een transformatief preklinisch platform dat de cellulaire heterogeniteit, architectuur en functionaliteit van menselijke weefsels getrouw bewaart 10,11,12,13. Als preklinische modellen vangen organoïden de kenmerken van primaire tumoren beter op, waardoor gedetailleerd onderzoek mogelijk is naar belangrijke moleculaire gebeurtenissen en cellulaire veranderingen tijdens tumorprogressie14. Chen et al. gebruikten bijvoorbeeld patiënt-afgeleide slokdarmorganoïden uit verschillende stadia van ESCC om epitheel-fibroblastinteracties op te helderen, en valideerden uiteindelijk de ANXA1-FPR2-signaleringsas als een kritische aanjager van ESCC-pathogenese6. Evenzo gebruikten Ko et al. genetisch gemanipuleerde slokdarmorganoïden om de belangrijkste genetische determinanten te identificeren die ESCC-initiatie en immuunontwijking aansturen, en demonstreerden hoe organoïdemodellen ziektekenmerken effectief kunnen recapituleren en nieuwe therapeutische doelen kunnen onthullen15.

De huidige methodologie lost belangrijke problemen op in de modellering van slokdarmkanker door een reproduceerbaar protocol op te stellen voor het genereren van meertraps ESCC-organoïden die de histologische progressie van normaal epitheel naar invasief carcinoom weerspiegelen. Dit systeem integreert geoptimaliseerde kweekomstandigheden met behulp van een L-WRN-geconditioneerd medium om de epitheliale stamheid te behouden, gecombineerd met gestandaardiseerde protocollen voor histologische verwerking en multiplex-immunofluorescentie (mIF) -analyse, en biedt een ideaal platform om ruimtelijke en moleculaire veranderingen tijdens tumorigenese longitudinaal te analyseren. Vergeleken met alternatieve technieken zoals 2D-culturen, behoudt dit organoïde platform op unieke wijze de weefselarchitectuur, waardoor de visualisatie van ruimtelijk georganiseerde moleculaire markers mogelijk is, waaronder het immuuncheckpoint-eiwit PD-L1 (CD274), dat immuunontwijking van tumoren bemiddelt door T-celresponsen te remmen 16,17,18 en de proliferatiemarkering Ki-67. Het protocol maakt het mogelijk om organoïden uit normale slokdarm- en precancereuze weefsels te passageren, waardoor onderzoekers een continu organoïdemodel kunnen bouwen van normaal weefsel tot tumor19. Door een gedetailleerde analyse van ruimtelijke en moleculaire veranderingen tijdens tumorigenese mogelijk te maken, biedt dit protocol onderzoekers een krachtig hulpmiddel om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en progressie van kanker, wat mogelijk kan leiden tot verbeterde therapeutische strategieën.

Deze methodologie is met name geschikt voor onderzoekers die onderzoek doen naar epitheliale carcinogenese, interacties tussen tumormicro-omgeving of therapeutische reacties bij ESCC en gerelateerde plaveiselcelmaligniteiten. Het modulaire ontwerp maakt aanpassing mogelijk om andere moleculaire markers of signaalroutes te bestuderen, op voorwaarde dat de juiste validatiestappen worden opgenomen. Door een gestandaardiseerd maar flexibel platform aan te bieden, wil dit protocol het preklinisch onderzoek in de tumorbiologie bevorderen en de vertaling van mechanistische inzichten naar gerichte therapieën versnellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (goedkeuring nrs. 20/069-2265, 22/221-3423 en 23/305-4047). Monsters van slokdarmweefsel werden tussen 2021 en 2024 verkregen van patiënten die een operatie of vroege screening op plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm (ESCC) ondergingen in het Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, met als doel het vaststellen van menselijke slokdarmorganoïden. Geen van de patiënten die in deze studie waren opgenomen, had chemotherapie of radiotherapie gekregen voorafgaand aan de monsterafname. Van alle deelnemers werd geïnformeerde toestemming verkregen en relevante klinische informatie werd uit medische dossiers gehaald. Een volledige lijst van reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, is te vinden in de Materiaaltabel.

1. Bereiding van slokdarmepitheliale organoïden

  1. Bereiding van L-WRN-geconditioneerd medium
    1. Bereiding van de L-WRN-cellijn
      1. Ontdooi de L-WRN-cellijn (opslag bij -80 °C) in een waterbad van 37 °C gedurende 1-2 minuten. Meng met 5 ml voorverwarmd basaalkweekmedium (DMEM aangevuld met 10% FBS).
      2. Centrifugeer het mengsel op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
      3. Gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de cellen met 2-3 ml vers voorverwarmd selectiemedium (DMEM met 10% FBS, 0,5 mg/ml hygromycine B en 0,5 mg/ml G-418).
        LET OP: Houd het medium op 4 °C (maximale opslag 1 maand).
      4. Breng de cellen over in een kweekschaaltje van 10 cm met het selectiemedium. Kweek de cellen bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
    2. Passage van de L-WRN-cellijn
      1. Dissocieer confluente cellen met behulp van 0,025% trypsine-EDTA (1-2 minuten bij 37 °C) en splits in een verhouding van 1:2.
    3. Afname van het L-WRN-geconditioneerde medium
      1. Vervang het kweekmedium door het basale kweekmedium bij 80% celconfluentie. Breng het bovenstaande over in een centrifugebuis.
      2. Filtreer door het membraan van 0,22 μm om celresten te verwijderen. Verzamel het filtraat als een L-WRN-geconditioneerd medium.
        OPMERKING: Bewaar L-WRN-geconditioneerd medium bij 4 °C (1 week) of bij -80 °C (6 maanden).
  2. Preparaat van humaan slokdarmorganoïde kweekmedium (H-EOCM)
    1. H-EOCM voorbereiding
      1. Vortex het L-WRN-geconditioneerde medium (volume van 1,5 ml) na 4 uur evenwicht bij 4 °C.
      2. Combineer Advanced DMEM/F12 medium met deze additieven om H-EOCM te creëren: 3% L-WRN-geconditioneerd medium, 1× Anti-Anti, 1× L-glutamine, 1× N2 supplement, 1× B27 supplement, 0,15 mM HEPES, 40 ng/ml EGF, 10 μM Y-27632 en 50 μM A83-01.
        OPMERKING: Bewaar de H-EOCM bevroren bij -20° C voor een houdbaarheid van zes maanden.
  3. Pre-experimentele voorbereiding
    1. Ontdooi H-EOCM door het gedurende 4 uur op 4 °C te houden.

2. Oprichting van menselijke slokdarmorganoïde

  1. Voorbereiding van materialen
    1. Ontdooi de basaalmembraanmatrix en H-EOCM bij 4 °C. Steriliseer chirurgische scharen en pincetten voor het volgende experiment.
    2. Koel de pipetpunten voor tot 4 °C. Verwarm de 24-putjesplaat voor op 37 °C.
  2. Weefselverwerking en celisolatie
    OPMERKING: ESCC-tumorweefsel, dysplastische laesies (≤2 cm van de tumormarge) en overeenkomend normaal slokdarmweefsel (≥5 cm van de tumorrand) werden verzameld bij dezelfde personen met ESCC die een chirurgische resectie ondergingen. Bovendien werden meertraps slokdarmmonsters verkregen via een ESCC-programma voor vroege detectie en screening, zoals beschreven in onze eerdere studies 6,7.
    1. Reinig het monster driemaal met wasbuffer op kamertemperatuur (PBS met 1×Anti-Anti en 0,15 mM HEPES) in centrifugebuisjes van 5 ml.
      OPMERKING: Was de monsters meer dan drie keer om het risico op besmetting te verminderen.
    2. Hak het weefsel in 1 mm3 fragmenten met behulp van een steriele schaar. Breng de fragmenten over in centrifugebuisjes van 1,5 ml.
    3. Suspendeer het monster met 1 ml digestiebuffer en schud het gedurende 10-20 minuten bij 37 °C, 50-100 tpm, om het weefsel te verteren.
    4. Centrifugeer het mengsel 5 minuten bij 400 x g bij 4 °C. Gooi supernatant weg.
    5. Resuspendeer het precipitaat in 500 μl 0,025% trypsine-EDTA. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C. Voeg 1 ml DMEM toe aangevuld met 10% FBS om de enzymatische activiteit te stoppen.
    6. Haal de suspensie door een steriel filter van 70 μm. Vang het filtraat op in een centrifugebuis van 1,5 ml.
    7. Centrifugeer het filtraat gedurende 5 minuten bij 400 x g bij 4 °C. Gooi supernatant weg. Resuspendeer de cellen met 100 μL H-EOCM.
  3. Organoïde zaaien
    1. Bepaal de celdichtheid en bereid vervolgens een verse centrifugebuis van 1,5 ml voor met 5.000-15.000 cellen in suspensie.
    2. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij 4 °C. Zuig het bovenstaande voorzichtig op. Resuspendeer de cellen voorzichtig in 50-100 μL van de basaalmembraanmatrix en verdeel ze gelijkmatig.
      OPMERKING: Bewaar de basaalmembraanmatrix bij 4 °C om stolling te voorkomen.
    3. Voeg 50 μL basaalmembraanmatrix met de gemengde cellen toe aan het midden van elke plaat met 24 putjes. Polymeriseer de matrix van het basaalmembraan door een incubatie van 37 °C (duur van 30 minuten).
    4. Voeg 500 μL voorverwarmd H-EOCM (37 °C) toe om de basaalmembraanmatrix te bedekken. Kweek de organoïden in een bevochtigde 5% CO2 -incubator bij 37 °C.
  4. Medium vervanging
    1. Zuig het verbruikte medium op en vul aan met 500 μL verse H-EOCM (opgewarmd tot 37 °C).
      OPMERKING: Vervang H-EOCM met tussenpozen van 3 dagen.

3. Passeren van organoïden

  1. Voorbereiding van materialen
    1. Ontdooi de basaalmembraanmatrix en H-EOCM bij 4 °C. Koel de pipetpunten voor tot 4 °C. Verwarm de 24-putjesplaat voor op 37 °C.
  2. Vertering van organoïde
    1. Verwijder het H-EOCM medium voorzichtig. Voeg 500 μL voorgekoelde passagebuffer (Advanced DMEM/F12 met 1× Anti-Anti en 0,15 mM HEPES, voorgekoeld tot 4 °C) toe aan de put om de basaalmembraanmatrix te smelten.
    2. Combineer de basaalmembraanmatrix met de doorgangsbuffer in een centrifugebuis van 1,5 ml. Was de put met 500 μL voorgekoelde passagebuffer en verzamel de buffer om eventuele resterende organoïden op te halen.
    3. Centrifugeer de buffer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij 4 °C. Zuig het bovenstaande voorzichtig op. Voeg 500 μL recombinant trypsine toe aan de buis en incubeer voor enzymatische vertering (37 °C, 15 min). Resuspendeer met tussenpozen van 5 minuten.
    4. Centrifugeer het verteerde monster (400 x g, 5 min, 4 °C). Gooi het bovenstaande weg. Herhaal stap 3.2.6 en 3.2.7. Resuspendeer de cellen in 100 μl H-EOCM.
  3. Organoïde zaaien
    1. Herhaal stap 2.3 voor het zaaien van organoïden.

4. Organoïde invriezen en terugwinnen

  1. Organoïde invriezen
    1. Herhaal stap 2.1 voor de materiaalvoorbereiding.
    2. Voor de vertering van de organoïden herhaal je stap 3.2.
    3. Organoïde invriezen
      1. Bepaal de celdichtheid en bereid vervolgens een verse centrifugebuis van 1,5 ml voor met 10.000 cellen in suspensie.
      2. Centrifugeer de monsters bij 400 x g gedurende 5 minuten bij RT. Zuig het bovenstaande voorzichtig op.
      3. Resuspendeer de cellen met 500-1000 μL cryopreservatiemedium. Breng over naar een nieuwe cryobuis. Vries de cryobuis 24 uur in bij -80 °C. Archiveer in een opslagsysteem voor vloeibare stikstof voor langdurige conservering.
  2. Ontdooien van invriezende organoïde
    1. Herhaal voor de voorbereiding van de materialen stap 2.1.
    2. Ontdooien van invriezende organoïde
      1. Ontdooi de cryobuis snel in een waterbad van 37 °C gedurende 2-3 minuten. Breng het bevroren materiaal over naar 9 ml voorverwarmde basale cultuur (37 °C) en breng de cellen gelijkmatig in suspensie.
      2. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 400 x g (bij RT). Zuig het bovenstaande voorzichtig op.
    3. Organoïde zaaien
      1. Voor het zaaien van de organoïden herhaal je stap 2.3.

5. Histologische analyse van organoïde

  1. Bereiding van in paraffine ingebedde secties
    1. Voorbereiding van materialen
      1. Steriliseer 50 ml inbeddingsmatrix (waterige oplossing: 2% agar + 2,5% gelatine) in een kolf van 250 ml via een autoclaaf. Verdeel 5 ml in centrifugebuisjes van 15 ml. Bewaren bij kamertemperatuur.
    2. Organoïde fixatie
      1. Herhaal stap 3.2.1-3.2.2. Resuspendeer het neerslag met 1 ml doorgangsbuffer in een verse buis van 1,5 ml.
      2. Centrifugeer bij 400 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Verwijder de supernatant. Resuspendeer de organoïden in 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of gedurende ten minste 6 uur bij 4 °C.
    3. Organoïde inbedding
      1. Centrifugeer het mengsel (400 x g, 5 min, RT). Verwijder de supernatant. Voeg 1 ml van de doorgangsbuffer toe aan de buis en suspendeer de neerslag.
      2. Centrifugeer het mengsel (400 x g, 5 min, RT). Verwijder de supernatant.
      3. Plaats een tube (15 ml) met inbeddingsmedium (5 ml) in het waterbad (100 ml, 150 ml container). Magnetron op maximaal vermogen tot het water begint te koken.
        NOTITIE: Draai de dop van de tube van 15 ml los voordat u deze in de magnetron zet.
      4. Resuspendeer de organoïden met 50 μL inbeddingsgel in een centrifugebuis van 1,5 ml. Koel de tube af tot 4 °C totdat de gel volledig is uitgehard.
      5. Breng de gestolde gel over in 70% ethanol. Bewaren bij 4 °C.
    4. Bereiding van paraffineblokken
      1. Dehydrateer de gel door middel van ethanolreeksen (30% → 50% → 70% → 80% → 95% → 100%), 30 minuten per concentratie.
      2. Doe de gestolde gel 30 minuten in helder xyleen. Dompel de gestolde gel onder in paraffine en veranker deze met behulp van een verwarmd paraffinestation.
      3. Snijd plakjes van 4 μm dik met een microtoom. Monteer op dia's en droog gedurende 1 uur bij 65 °C. Bewaren in droge omstandigheden.
  2. Immunohistochemie (IHC) kleuring van organoïde plakjes
    1. Ontwaxen en hydratatie
      1. Verwarm de plakjes in tissueklaringsmiddel bij 65 °C gedurende 40 min. Dompel de objectglaasje 20 minuten onder in vers tissueklaringsmiddel bij kamertemperatuur.
      2. Verwerk de dia's door glazen trays met ethanolserie: dompel 10 minuten onder in 100% ethanol en herhaal één keer, breng dan 5 minuten over op 95% ethanol, gevolgd door 85% ethanol gedurende 5 minuten, vervolgens 75% ethanol gedurende 5 minuten en plaats ten slotte 10 minuten in 4% PFA.
      3. Voeg gesteriliseerd water toe aan de thermostabiele kamer en houd 5 minuten op de shaker op 80 tpm. Herhaal deze stap twee keer.
    2. Antigeen ophalen
      1. Voeg Tris-EDTA-antigeen (pH 9,0) oplossing toe aan de thermostabiele kamer om de objectglaasjes onder te dompelen. Zet de thermostabiele kamer met de dia's in de magnetron op maximale intensiteit (700 W, 3 min) tot het kookt. Blijf in de magnetron staan op een lage vermogensstand (70 W, 15 min) en koel af tot kamertemperatuur.
      2. Was 2 minuten in gedestilleerd water op een shaker op 80 tpm. Herhaal twee keer. Omcirkel de locatie van organoïden met een histologische pen.
    3. Peroxidase blokkeren
      1. Laat peroxidaseblokkerende oplossing vallen om het monstergebied te bedekken. Incubeer in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
      2. Breng de dia's over naar een thermostabiele kamer. Wassen in PBST (PBS + 0,1% Tween 20) gedurende 2 minuten op 80 tpm. Herhaal twee keer.
    4. Incubatie van primaire antilichamen
      1. Veeg voorzichtig de overtollige PBST-druppels op de dia's weg.
        OPMERKING: Vermijd het aanraken van organoïden op dia's.
      2. Laat verdund primair antilichaam vallen om het organoïde gebied te bedekken. Incubeer in een vochtigheidskamer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 8-14 uur bij 4 °C. Herhaal deze stap.
    5. Incubatie van secundaire antilichamen
      1. Herhaal stap 5.2.4.1. Laat verdund HRP secundair antilichaam vallen om het organoïde gebied te bedekken. Incubeer in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Herhaal deze stap.
    6. DAB (3,3′-diaminobenzidine) kleuring
      1. Herhaal stap 5.2.4.1. Laat 1× DAB vallen om het organoïde gebied te bedekken. Incubeer in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur tot de kleur bruin wordt.
      2. Dompel de dia's 5-10 s onder in gedestilleerd water om de kleurverandering te beëindigen. Herhaal de stap.
    7. Hematoxyline-kleuring
      1. Kleur 5-8 minuten in hematoxyline. Differentiëren in 1% zure alcohol (1% HCl in 70% alcohol) gedurende 5-10 s.
      2. Dompel de dia's 5-10 s onder in gedestilleerd water. Herhaal deze stap.
    8. Dehydratie
      1. Verwerk de glaasjes door glazen trays in opeenvolgende volgorde: dompel ze 5 minuten onder in 75% ethanol, breng ze 5 minuten over op 85% ethanol, verplaats ze 5 minuten naar 95% ethanol, gevolgd door twee afzonderlijke onderdompelingen in 100% ethanol van elk 10 minuten en plaats ze ten slotte in xyleen gedurende twee opeenvolgende perioden van 20 minuten.
    9. Schuif montage
      1. Voeg xyleen toe aan neutraal tandvlees totdat het transparant wordt. Laat iets aan de lucht drogen. Laat vervolgens de kauwgom met xyleen vallen om het organoïde gebied te bedekken.
      2. Breng een dekglaasje aan. Scan en analyseer de dia.
  3. Multiplex immunofluorescentie (mIF) kleuring
    1. Herhaal stap 5.2.1 voor het ontwaxen en hydrateren.
    2. Herhaal stap 5.2.3 voor peroxidaseblokkering.
    3. Herhaal stap 5.2.3 voor het ophalen van antigeen.
    4. Schapen serum blokkering.
      1. Herhaal stap 5.2.4.1. Voeg schapenserumblokkerende oplossing toe om het organoïde gebied te bedekken. Incubeer in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
      2. Was 2 minuten in PBST. Herhaal twee keer.
    5. Herhaal voor incubatie van primaire antilichamen stap 5.2.4.
    6. Herhaal voor incubatie van secundaire antilichamen stap 5.2.4.1.
      1. Laat een specifieke secundaire antilichaamoplossing vallen om het organoïde gebied te bedekken. Incubeer in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Herhaal stap 5.2.3.2.
        OPMERKING: Bescherm dia's vanaf deze stap tot het einde van het experiment tegen licht.
    7. Fluorescerende kleurstof kleuring
      1. Herhaal stap 5.3.4.1. Laat een fluorescerende verfoplossing vallen om het organoïde gebied te bedekken.
      2. Incubeer in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 10-20 minuten. Herhaal stap 5.2.3.2.
    8. Herhaal voor meervoudige kleuring de stappen 5.3.3-5.3.7.
    9. DAPI-kleuring
      1. Herhaal stap 5.2.4.1. Laat DAPI-oplossing vallen om het organoïde gebied te bedekken. Herhaal stap 5.2.3.2. Herhaal vervolgens stap 5.3.4.2.
      2. Dompel de dia's 2 minuten onder in gesteriliseerd water.
    10. Schuif montage
      1. Laat het antifade-montagemedium vallen om het organoïde gebied te bedekken. Breng een dekglaasje aan.
    11. Verkrijg digitale afbeeldingen met behulp van een diascanner en analyseer ze.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft organoïdebemonstering en histologische analyse in verschillende stadia van ESCC-tumorigenese (Figuur 1). Door bemonstering van normaal slokdarmslijmvlies, laaggradige intra-epitheliale neoplasie (LGIN), hooggradige intra-epitheliale neoplasie (HGIN) en tumorweefsels van ESCC-patiënten, kunnen organoïden worden geconstrueerd die verschillende stadia van tumorigenese vertegenwoordigen. Verder werden deze organoïden door paraffine ingebe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het vaststellen en histologisch analyseren van organoïden vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in het modelleren van tumorprogressie. Het protocol biedt opmerkelijke voordelen ten opzichte van bestaande methoden voor het bestuderen van tumorigenese20. In tegenstelling tot traditionele 2D-celcultuursystemen, behouden organoïden een complexe driedimensionale architectuur en cellulaire heterogeniteit die de in vivo omstandigheden beter weerspiegelen....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële of belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken alle patiënten en artsen die hebben deelgenomen aan het onderzoek in het Cancer Hospital, de Chinese Academie voor Medische Wetenschappen (CAMS) en het Peking Union Medical College (PUMC). Deze studie wordt gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (82203156 tot S.Z.), het National Key Research and Development Program of China (2023YFC3503200 tot S.Z.) en het Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences (2023-I2M-QJ-002 tot S.Z.). Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 μm filterMerckCat#SLGPR33RB
24-well plateCorningCat#3524
4% ParaformaldehydeBeyotimeCat# P0099
70 μm steriele zeefFalconCat#352350
A83-01Tocris BioscienceCat# 2939
Advanced DMEM/F12GibcoCat# 12634028
AgarSolarbioCat# A8190
Anti-Anti (Antibiotic-Antimycotic)GibcoCat# 15240062
B-27 supplementGibcoCat# 17504044
CO2 incubatorThermo Cat#371GPCN
Collagenase IVGibcoCat# 17104019
CryostorSTEMCELLCat# 07930
DMEMCorningCat# 10-013-CV
EGFGibcoCat# PHG0313
Fetaal bovien serumCell TechnologiesCat# 30070
G-418SigmaCat# A1720
GelatinSolarbioCat# G8061
GlutaMAXGibcoCat# 35050061
Growth factor-reduced MatrigelCorningCat# 354230
HE staining kitBeijing Yili Fine Chemicals Co., LtdNA
HEPESGibcoCat# 15630080
Histological penZsbioCat#ZLI-9305
Hygromycin BSigmaCat# 400050
Immunohistochemische staining kitZSGB-BIOPV-8000
L-WRNATCCCRL-3276; RRID:CVCL_DA06
N-2 supplementGibcoCat# 17502048
Neutral gum ZsbioCat#ZLI-9555
Opal 5-Color Manual IHC KitPANOVUECat# 10144100100
PBSMeilunBioCat#MA0015
Rabbit Monoclone anti-PD-L1CSTCat# 13684; RRID:AB_2687655
Rabbit Polyclonal anti-Ki67AbcamCat# ab16667; RRID:AB_302459
Rabbit Polyclonal anti-KRT6AProteintechCat# 10590-1-AP; RRID: AB_2134306
SchapenserumZsbioCat#ZLI-9056
TrypLE ExpressGibcoCat# 12604021
TrypLE-EDTAGibcoCat#15400-054
Whole slide image scannerHamamatsuCat#C13210
Y-27632Selleck ChemicalsCat# S1049

Referenties

  1. Zhang, S., et al. Tumor initiation and early tumorigenesis: Molecular mechanisms and interventional targets. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 149(2024).
  2. Sánchez-Danés, A., Blanpain, C. Deciphering the cells of origin of squamous cell carcinomas. Nat Rev Cancer. 18 (9), 549-561 (2018).
  3. Abnet, C. C., Arnold, M., Wei, W. -Q. Epidemiology of esophageal squamous cell carcinoma. Gastroenterology. 154 (2), 360-373 (2018).
  4. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  5. Lin, D. -C., Wang, M. -R., Koeffler, H. P. Genomic and epigenomic aberrations in esophageal squamous cell carcinoma and implications for patients. Gastroenterology. 154 (2), 374-389 (2018).
  6. Chen, Y., et al. Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer Cell. 41 (5), 903-918.e8 (2023).
  7. Chang, J., et al. Genomic alterations driving precancerous to cancerous lesions in esophageal cancer development. Cancer Cell. 41 (12), 2038-2050.e5 (2023).
  8. Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nat Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  9. Loewa, A., Feng, J. J., Hedtrich, S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 1 (8), 545-559 (2023).
  10. Tang, X. -Y., et al. Human organoids in basic research and clinical applications. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 168(2022).
  11. Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. J Hematol Oncol. 15 (1), 58(2022).
  12. Yan, H. H. N., Chan, A. S., Lai, F. P. -L., Leung, S. Y. Organoid cultures for cancer modeling. Cell Stem Cell. 30 (7), 917-937 (2023).
  13. Jiang, Y., et al. Establishing mouse and human oral esophageal organoids to investigate the tumor immune response. Dis Model Mech. 17 (1), dmm050319(2024).
  14. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  15. Ko, K. -P., et al. Key genetic determinants driving esophageal squamous cell carcinoma initiation and immune evasion. Gastroenterology. 165 (3), 613-628.e20 (2023).
  16. Kornepati, A. V. R., Vadlamudi, R. K., Curiel, T. J. Programmed death ligand 1 signals in cancer cells. Nat Rev Cancer. 22 (3), 174-189 (2022).
  17. Jiang, X., et al. Role of the tumor microenvironment in PD-L1/PD-1-mediated tumor immune escape. Mol Cancer. 18 (1), 10(2019).
  18. Magré, L., et al. Emerging organoid-immune co-culture models for cancer research: From oncoimmunology to personalized immunotherapies. J Immunother Cancer. 11 (5), e006290(2023).
  19. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  20. Fujii, M., Sekine, S., Sato, T. Decoding the basis of histological variation in human cancer. Nat Rev Cancer. 24 (2), 141-158 (2024).
  21. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  22. Tong, L., et al. Patient-derived organoids in precision cancer medicine. Med. 5 (11), 1351-1377 (2024).
  23. Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).
  24. Sun, C. -P., Lan, H. -R., Fang, X. -L., Yang, X. -Y., Jin, K. -T. Organoid models for precision cancer immunotherapy. Front Immunol. 13, 770465(2022).
  25. Kobayashi, H., et al. The origin and contribution of cancer-associated fibroblasts in colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 162 (3), 890-906 (2022).
  26. Du, L., et al. Targeting stemness of cancer stem cells to fight colorectal cancers. Semin Cancer Biol. 82, 150-161 (2022).
  27. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  28. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  29. Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (4), 203-222 (2020).
  30. Han, X., et al. Landscape of human organoids: Ideal model in clinics and research. The Innovation. 5 (3), 100620(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Tumorigenese modelleringorgano dkweekmultiplex immunofluorescentiebasaalmembraanmatrixplaveiselcelcarcinoomtumorbiomarkersruimtelijke architectuurepitheelcellen
Oprichting en histologische analyse van slokdarmorganoïden die de progressie van normale naar kankerachtige weefsels modelleren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.