Innovatieve fractionering van vetweefsel voor het omzetten van vet in gespecialiseerde componenten

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat autoloog vetweefsel kan transformeren in verschillende vetbestanddelen met verschillende fysisch-chemische eigenschappen en functies.

Samenvatting

Traditionele autologe vetweefseltransplantatie wordt vaak gebruikt voor volumevergroting en weefselregeneratie. De uniforme fysische en biologische eigenschappen van vettransplantaten leiden echter vaak tot suboptimale prestaties in diverse patiëntscenario's en veelzijdige vereisten. Voortbouwend op de fundamenten van autologe vettransplantatie, introduceren we een baanbrekende benadering die autologe vetcomponenttransplantatie wordt genoemd. Dit innovatieve concept integreert een zorgvuldig ontworpen protocol dat gericht is op het omzetten van autoloog vetweefsel in een breed scala aan vetcomponenten, elk gekenmerkt door unieke fysisch-chemische eigenschappen die zijn afgestemd op specifieke toepassingen in verschillende klinische contexten. Door middel van een reeks fysische methoden kan vetweefsel worden getransformeerd in een Adipose Matrix Complex (AMC) dat voldoende stijve ondersteuning biedt, High-Density Fat (HDF) voor verdere vulling, Stromale Vasculaire Fractie (SVF)-gel voor kleine en/of precieze injecties, en Adipose Collagen Fragment (ACF) voor fijne rimpels en/of gezichtsverjongingsbehoeften. Deze verschillende vetcomponenten bezitten inherente kenmerken die zich lenen voor nauwkeurige en gerichte transplantatiestrategieën, die inspelen op de genuanceerde eisen van de individuele behoeften van de patiënt. Het nieuwe fractioneringsprotocol voor vetweefsel heeft een groot potentieel voor een revolutie in de transplantatie van vetweefsel. Het biedt een nieuw perspectief en een nieuwe methodologie voor meer verfijnde en op maat gemaakte transplantatie.

Inleiding

Autologe vetweefseltransplantatie is een veelgebruikte techniek voor volumetrische verbetering en weefselregeneratie, gedreven door vooruitgang in de voorbereiding van de donorplaats, vetextractie, verwerking en implantatie 1,2,3,4. De uniforme fysische en biologische eigenschappen van traditionele vettransplantaten beperken echter vaak hun effectiviteit bij het aanpakken van uiteenlopende klinische behoeften⁵. Om deze beperkingen te overwinnen, heeft ons onderzoeksteam een innovatief fractioneringsprotocol voor vetweefsel ontwikkeld, waarbij autoloog vet wordt omgezet in gespecialiseerde componenten met verschillende fysisch-chemische eigenschappen en functies.

Het primaire doel van het protocol is het fractioneren van autoloog vetweefsel in gespecialiseerde componenten - Adipose Matrix Complex (AMC), Stromale Vasculaire Fractie (SVF)-gel en Adipose Collagen Fragment (ACF), elk ontworpen om specifieke klinische uitdagingen aan te pakken. Door componenten te voorzien van unieke eigenschappen, zoals verbeterde stijfheid, hoge celdichtheid en collageenrijke formuleringen, maakt het protocol nauwkeurige en gerichte transplantatiestrategieën mogelijk 6,7,8,9,10,11.

Traditionele vettransplantatie, hoewel effectief voor volumevergroting, voldoet vaak niet aan de genuanceerde eisen van complexe klinische scenario's. De onvoorspelbare vetopname leidt tot onstabiel volumeherstel. Bovendien kunnen ze, vanwege de uniforme fysische en biologische eigenschappen van traditionele vettransplantaten, geen gerichte vulling bieden voor gebieden met specifieke transplantatievereisten, zoals structurele ondersteuning, het uitvoeren van nauwkeurige injecties op kleine gebieden en het bereiken van gerichte collageenstimulatie. Deze problemen vereisen vaak meerdere operaties, waardoor de pijn en financiële last van patiënten toenemen ^1,2,5. Dit fractioneringsprotocol pakt deze beperkingen aan door vetweefsel specifiek te verrijken met een gehalte van bijzondere waarde uit traditioneel vetweefsel. Door dit proces vormen we vetweefselcomponenten met op maat gemaakte eigenschappen, waardoor clinici een veelzijdige toolkit krijgen voor een gepersonaliseerde behandeling. In vergelijking met synthetische vulstoffen of traditionele vettransplantatie, maakt de aanpak gebruik van autoloog weefsel, waardoor het risico op afstoting van het immuunsysteem wordt geëlimineerd en biocompatibiliteit wordt gegarandeerd³. Bovendien creëert het fractioneringsproces componenten met unieke eigenschappen, zoals AMC, dat structurele ondersteuning biedt en een lage absorptiesnelheid heeft; SVF-gel, die nauwkeurige injecties geeft en wordt gekenmerkt door een hoge dichtheid van stromale vasculaire fractiecellen; en ACF, een collageeneiwitsteiger die in staat is tot gecontroleerde afgifte van vetfactoren, die potentieel vertoont voor klinische toepassingen bij huidverjonging ^7,9,11. Deze aanpak vermindert ook de noodzaak van herhaalde procedures door de retentie van transplantaten en de patiënttevredenheid te verbeteren^10,12.

Het concept van het fractioneren van biologische weefsels om therapeutische resultaten te optimaliseren is goed ingeburgerd, zoals te zien is in de scheiding van bloed in plasma, rode bloedcellen en bloedplaatjes voor gerichte medische toepassingen. In de afgelopen jaren zijn het onderzoek en de klinische toepassingen van vetweefselcomponenten ook geleidelijk gevorderd 13,14,15,16,17,18. Dit vetfractioneringsprotocol bouwt voort op dit principe en isoleert componenten met verschillende eigenschappen voor klinisch gebruik op maat. Clinici kunnen de geschiktheid van deze methode bepalen door rekening te houden met de anatomische behoeften van de patiënt, de gewenste resultaten (bijv. volumevergroting, structurele ondersteuning of huidverjonging) en beschikbare apparatuur. Dit protocol is met name effectief voor gevallen die nauwkeurige controle over de eigenschappen van het transplantaat vereisen, zoals gezichtsverjonging, littekenrevisie of complexe reconstructieve procedures ^7,10,12.

Protocol

Dit onderzoek is goedgekeurd door de Ethical Review Board in het Nanfang Hospital, Guangzhou, China. Vetweefsel werd verzameld van gezonde donoren die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaven om deel te nemen aan het onderzoek. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het Nanfang Hospital Institutional Animal Care and Use Committee en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Health and Medical Research Council (China).

1. Vet preparaat

1. Algemene anesthesie en infiltratie van tumescente vloeistof
   1. Plaats de patiënt onder algehele narcose. Dien tijdens de intraveneuze inductiefase een combinatie van propofol (2 mg/kg), fentanyl (1,5 μg/kg) en rocuronium (0,6 mg/kg) toe, gevolgd door het behoud van de anesthesiediepte met behulp van sevofluraan (1,5%) en remifentanil (0,1 μg/kg/min). Pas tijdens de procedure het anesthesieplan dynamisch aan op basis van BIS-monitoring (streefwaarde 40-60), bloedsomloopparameters (MAP >65 mmHg) en EtCO₂ (35-45 mmHg).
   2. Plaats de patiënt in rugligging met beschermende vulling op drukpunten en desinfecteer de operatieplaats rigoureus met chloorhexidine-alcohol. Houd u aan aseptische protocollen om het risico op infectie te minimaliseren.
   3. Infiltreer het onderhuidse weefsel van het liposuctiegebied (zoals de buik of dij) met tumescente vloeistof die 0,06% lidocaïne en 0,001% epinefrine bevat met behulp van een spuit van 20 ml. Houd een verhouding van 2:1 aan tussen het infiltraat en het verwachte volume van vetextractie, waarbij het totale injectievolume wordt aangepast aan de specifieke anatomische kenmerken van de patiënt en de grootte van het behandelingsgebied.
   4. Controleer het verdovende effect om volledige tumescente vloeistofinfiltratie te bevestigen. Prik of knijp voor de volgende stap in het liposuctiegebied. Als de patiënt slechts een lichte druk voelt, is infiltratie voldoende, waardoor vet kan worden verzameld met minder ongemak.
2. Vet oogsten
   1. Gebruik een multiport-canule van 3 mm met scherpe zijgaten met een diameter van 1 mm voor het verzamelen van vet. Voer de operatie uit bij -0,75 atm zuigdruk om schade aan het vetweefsel te minimaliseren en de integriteit en levensvatbaarheid van de verzamelde vetcellen te waarborgen.
3. Coleman vet preparaat
   1. Laat het opgevangen vet, dat in een spuit van 60 ml wordt gedaan, 10 minuten stilstaan om de vloeibare componenten op de bodem van de container te laten bezinken.
   2. Gooi het vloeibare gedeelte op de bodem voorzichtig weg en vang de bovenste, relatief zuivere vetlaag op om onzuiverheden zoals bloed en tumescente vloeistof te verwijderen.
   3. Bewaar het verzamelde vet in de spuit van 60 milliliter en centrifugeer op 1.200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om de componenten verder te stratificeren.
   4. Gooi na het centrifugeren het vloeibare gedeelte op de bodem weer weg. Behoud de bovenste vetlaag, die wordt gedefinieerd als Coleman-vet, in de 60-
      milliliter spuit.
4. Vetmonsterafname met hoge en lage dichtheid
   1. Breng de bovenste 2/3 van het Coleman-vet over in een reageerbuis van 20 ml en definieer het als vet met een lage dichtheid (LDF).
   2. Breng de resterende onderste 1/3 van het Coleman-vet over in een andere reageerbuis van 20 ml en definieer het als vet met hoge dichtheid (HDF).

2. Extractie van componenten

1. Preparaat van het vetmatrixcomplex (AMC)
   1. Leid de HDF door een filterapparaat met een huls en drie interne zeven (1,5 mm filterschermafstand).
   2. Verzamel het aangehechte weefsel en droog het uit in een filterzak met 100 mazen omgeven door gaas. Bepaal het eindpunt door het weefsel te observeren terwijl het met een tang wordt opgepakt; Wanneer er geen duidelijke vloeistofdruppels vallen bij het oppakken van de tang, geeft dit aan dat de uitdroging het gewenste effect heeft bereikt. Het eindproduct werd geïdentificeerd als AMC. Bewaar de resterende HDF voor toekomstig gebruik.
2. Stromale vasculaire fractie (SVF)-gel extractie
   1. Mechanische emulgering van LDF: Emulgeer de LDF mechanisch door deze tussen twee spuiten te leiden die zijn verbonden door een vrouw-naar-vrouw Luer-Lok-connector met een inwendige diameter van 1,4 mm met een snelheid van 10 ml/s gedurende 1 minuut.
   2. Centrifugeer het geëmulgeerde LDF op 1.600 x g gedurende 3 min. Verzamel de middelste laag, die lijkt op een gelachtige substantie, als SVF-gel.
3. Productie van vetcollageenfragmenten (ACF)
   1. Verpulvering van LDF: Verpulver het LDF in een gespecialiseerde ACF-extractor bij 30.000 tpm gedurende 60 s om een vetsuspensie te verkrijgen.
   2. Filteren: Breng de vetsuspensie over in spuiten van 20 ml. Sluit het aan op een unidirectioneel filter van 0,25 mm, duw op de zuiger en vang het filtraat op in een andere spuit van 20 ml. Sluit vervolgens deze spuit aan op een unidirectioneel filter van 0,15 mm, duw opnieuw op de zuiger en vang het laatste filtraat op in een derde spuit van 20 ml. Centrifugeer vervolgens de vetsuspensie gedurende 3 minuten op 3.000 x g .
   3. Verzamel het vaste gedeelte aan de onderkant als ACF.

3. Testen van vetcomponenten

1. Stijfheid testen
   1. Gebruik een apparaat met een krachtmeetsensor met een bereik van 0 N tot 225 N en een elektromagnetische actuator die een axiale verplaatsing van 6 mm mogelijk maakt.
   2. Klem elk weefselmonster (AMC en Coleman-vet) vast en pas een voorspanning van 25 - 30 N toe om speling te elimineren en rek te veroorzaken. Stel de hellingsbelasting in op 8 mm/s en registreer de hoogste kracht die werd bereikt voordat het monster elektronisch scheurde. Het apparaat berekent vervolgens de weefselstijfheid.
2. Hematoxyline en eosine (HE) en Masson-kleuring
   1. Fixeer de monsters in 4% paraformaldehyde om hun structuur te behouden. Dehydrateer in ethanolgradiënt om water te verwijderen, wat nodig is voor het daaropvolgende inbeddingsproces.
   2. Integreer de monsters in paraffine, een proces waardoor de monsters gemakkelijker in dunne secties kunnen worden gesneden. Snijd vervolgens de in paraffine ingebedde monsters door.
   3. Bevlek de secties met de trichrome vlekken van HE en Masson. Onderzoek de monsters met behulp van scanning-elektronenmicroscopie (SEM).
3. Transplantatie studies
   1. Selecteer 70 naakte muizen met een Health SPF-niveau, met een gewicht van 15 - 18 g en een leeftijd van 4 - 6 weken (ongeacht het geslacht). Houd de muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling, gehuisvest in individuele kooien met een licht/donkercyclus van 12 uur en voorzien van standaard voedsel en water ad libitum.
   2. Verdoofd muizen door intraperitoneale injectie van pentobarbitalnatrium (50 mg/kg). Controleer de diepte van de anesthesie met behulp van de teenknijpreflex. Breng oogzalf aan om uitdroging te voorkomen.
   3. Injecteer 0,3 ml bereid AMC- of vetweefsel (Coleman-vet in de controlegroep) in de onderhuidse weefsels van elke muis, en dien als basislijn voor het vettransplantaat. Houd de dieren in de gaten totdat ze weer bij bewustzijn komen en breng ze dan over naar hun kooien.
   4. Op dag 7, 14, 30, 60 en 90 na de transplantatie oogst u de transplantaten door ze voorzichtig te scheiden van het omliggende weefsel. Meet hun volumes. Het retentiepercentage van grafts werd als volgt gedefinieerd:
      retentiepercentage (%) = het transplantaatvolume op het moment van de oogst/injectievetvolume (hier 0,3 ml) x 100%.

Resultaten

Door middel van verschillende mechanische ingrepen die tijdens het chirurgische proces zijn uitgevoerd, hebben we met succes vetweefsel getransformeerd in afzonderlijke vetcomponenten met verschillende kenmerken. Dit zijn, in volgorde, de AMC die voldoende robuuste ondersteuning biedt (Figuur 1A), de HDF voor verdere vulling (Figuur 1B), de SVF-gel voor nauwkeurige injecties in kleine gebieden (Figuur 1C

Discussie

Dit fractioneringsprotocol voor vetweefsel omvat verschillende cruciale stappen die zorgen voor de succesvolle isolatie van gespecialiseerde componenten. Ten eerste scheidt de centrifugatie van geoogst vetweefsel het in vet met een hoge dichtheid (HDF) en vet met een lage dichtheid (LDF), elk met verschillende cellulaire en extracellulaire matrix (ECM) samenstellingen^23,24. HDF, rijk aan levensvatbare adipocyten en stromale vascu...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.001% Epinephrine	Sigma-Aldrich	E4375
0.06% Lidocaine	Sigma-Aldrich	L5647
3-mm Multiport Cannula	Tulip Medical Products, San Diego, CA, USA	/
50-ml Centrifuge Tubes	Corning	430829
BOSE ElectroForce Load Testing Device	Bose Corporation	/
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004176
Female-to-Female Luer-Lok Connector	BD Biosciences	309628
Filtering Device with Sleeve and Sieves	Custom-made (Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.)	/
Gauze	Medline Industries	MDS093944
Hematoxylin/Eosin Staining Kit	Sigma-Aldrich	HT110116
Masson's Trichrome Staining Kit	Sigma-Aldrich	HT15
Nude mice	Southern Mdical University	/
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Round Stainless-Steel Filter Screen (0.15 mm)	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Round Stainless-Steel Filter Screen (0.25 mm)	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Sterilized 100 Mesh Filter Bag	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Stromal Vascular Fraction (SVF)-Gel Extractor	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200056
Western Blot Analysis Kit	Bio-Rad	1705061