Experimentele screeningprotocollen, immunocytochemie en op microscopie gebaseerde beeldvormingstechnieken voor penium margaritaceum

Summary

Dit rapport beschrijft de fundamentele methoden die worden gebruikt om de eencellige streptofytalg, Penium margaritaceum, te kweken en experimenteel te manipuleren. Het biedt ook fundamentele protocollen voor op microscopie gebaseerde beeldvorming, waaronder het labelen van levende cellen met monoklonale antilichamen en andere fluorescerende sondes en scanning-elektronenmicroscopie.

Abstract

De celwand is het eerste onderdeel van signaalontvangst/transductie voor een plantencel tijdens de ontwikkeling en bij het reageren op abiotische en biotische stressoren uit de omgeving. De cel bewaakt voortdurend de integriteit van zijn celwand en moduleert deze als reactie op stress. Het ophelderen van de specifieke structurele en biochemische modulaties die in de celwand optreden, is een moeilijke taak, vooral bij het gebruik van meercellige planten en hun organen/weefsels. Dit komt door beperkingen met betrekking tot wat kan worden opgelost in een individuele cel die deel uitmaakt van een complex meercellig netwerk. De eencellige streptofytalg, Penium margaritaceum, is onlangs gebruikt in onderzoeken naar pectinedynamiek, fenotypische plasticiteit op basis van celwanden en meerdere aspecten van algencelbiologie. Het eenvoudige fenotype, de duidelijke celwand die veel componenten heeft die met name lijken op de celwanden van landplanten, en het gemak van immunocytochemische en experimentele studies maken het een krachtig modelorganisme in de biologie van de plantencelwand. Het doel van deze studie is om de basistechnieken aan te reiken voor het kweken, experimenteel manipuleren en screenen van toegepaste stressoren. Screeningsprotocollen voor immunocytochemie, confocale laserscanningmicroscopie, beeldvorming en scanning-elektronenmicroscopie, beeldvorming van de celwandstructuur. Evenzo kunnen veel van de beschreven technieken worden aangepast voor een breed scala aan andere cel- en moleculaire studies.

Introduction

De celwand van een plant is een complex polymeer netwerk dat meerdere rollen heeft in het leven van een plantencel¹. De integriteit van de celwand wordt tijdens de ontwikkeling en als reactie op omgevingsstress voortdurend door de cel gecontroleerd en moduleert dienovereenkomstig in chemie en structuur. Penium margaritaceum is een eencellige groene alg die onlangs is gebruikt in studies naar Streptofyt-algen (Streptophyta, de groep groene algen die het nauwst verwant is aan en voorouder is van landplanten²).

In de afgelopen twee decennia is P. mar....

Protocol

OPMERKING: Penium margaritaceum is verkregen bij de Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Cultuurcollectie van algen aan de Universiteit van Göttingen, SAG; soort #2640.

1. Cultuur in stand houden

1. Houd de alg in vloeibaar Woods Hole medium (WH¹²) dat ook kan worden aangevuld met grondwaterextract (d.w.z. 40 ml per L medium). Houd culturen op 20-25 °C met een licht: donkercyclus van 16 uur:8 uur met 3,5 klux (74 μmol fotonen/m²/s) koel wit fluorescerend licht.
2. Bereid subculturen wekelijks voor en geb....

Results

De labeling van de celwand van P. margaritaceum met anti-pectine mAbs (bijv. JIM5) onthult een netwerk van calciumgecomplexeerde vezels en uitsteeksels die een regelmatig patroon of rooster vormen (Figuur 1). De pectine wordt afgezet in het celcentrum of de landengte, waar het oudere pectine naar de polen verplaatst (Figuur 2). Etikettering met een ander pectine-antilichaam-achtige JIM7 benadrukt de initiële secretie va.......

Discussion

P. margaritaceum is een effectief organisme voor het ophelderen van de dynamiek van de ontwikkeling van celwanden en ECM-secretie in planten en streptofytenalgen. De belangrijkste kenmerken zijn onder meer een eencellige gewoonte en gemak bij het onderhouden van culturen en experimentele manipulatie, een primaire celwand met een duidelijk uitwendig pectinerooster en andere polymeren, gemak bij het labelen van levende cellen met celwandgerichte mAbs die op tijd kunnen worden gevo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcent. Tubes	Fisher Scientific	01-549-740
12 welled microplate	Fisher Scientific	50-233-6077
22 x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	12-541-016
45x 50 cm coverslips	Brain Research	4550-1.5D
Agar	Sigma Aldrich	A9414
anti-rat FITC	Sigma Aldrich	F6258
anti-rat TRITC	Sigma Aldrich	T4280
calcium chloride	Sigma Aldrich	C4981
Cambbridge stubs	EMS	75183-65
Fluoview CLSM	Evident	Fluoview 1200
JIM5	Kerafast	ELD004
JIM7	Kerafast	ELD005
Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-675
Micropipetors	BioRad	1660499EDU
Penium margaritaceum	Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Culture Collection of Algae at Göttingen University	2640
Polysphere kit	Polysciences	18336
SEM	ThermoFisher	Quattro SEM
sputter coater	EMS	Q150V
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-414