Experimentele screeningprotocollen, immunocytochemie en op microscopie gebaseerde beeldvormingstechnieken voor penium margaritaceum

Summary

Dit rapport beschrijft de fundamentele methoden die worden gebruikt om de eencellige streptofytalg, Penium margaritaceum, te kweken en experimenteel te manipuleren. Het biedt ook fundamentele protocollen voor op microscopie gebaseerde beeldvorming, waaronder het labelen van levende cellen met monoklonale antilichamen en andere fluorescerende sondes en scanning-elektronenmicroscopie.

Abstract

De celwand is het eerste onderdeel van signaalontvangst/transductie voor een plantencel tijdens de ontwikkeling en bij het reageren op abiotische en biotische stressoren uit de omgeving. De cel bewaakt voortdurend de integriteit van zijn celwand en moduleert deze als reactie op stress. Het ophelderen van de specifieke structurele en biochemische modulaties die in de celwand optreden, is een moeilijke taak, vooral bij het gebruik van meercellige planten en hun organen/weefsels. Dit komt door beperkingen met betrekking tot wat kan worden opgelost in een individuele cel die deel uitmaakt van een complex meercellig netwerk. De eencellige streptofytalg, Penium margaritaceum, is onlangs gebruikt in onderzoeken naar pectinedynamiek, fenotypische plasticiteit op basis van celwanden en meerdere aspecten van algencelbiologie. Het eenvoudige fenotype, de duidelijke celwand die veel componenten heeft die met name lijken op de celwanden van landplanten, en het gemak van immunocytochemische en experimentele studies maken het een krachtig modelorganisme in de biologie van de plantencelwand. Het doel van deze studie is om de basistechnieken aan te reiken voor het kweken, experimenteel manipuleren en screenen van toegepaste stressoren. Screeningsprotocollen voor immunocytochemie, confocale laserscanningmicroscopie, beeldvorming en scanning-elektronenmicroscopie, beeldvorming van de celwandstructuur. Evenzo kunnen veel van de beschreven technieken worden aangepast voor een breed scala aan andere cel- en moleculaire studies.

Introduction

De celwand van een plant is een complex polymeer netwerk dat meerdere rollen heeft in het leven van een plantencel¹. De integriteit van de celwand wordt tijdens de ontwikkeling en als reactie op omgevingsstress voortdurend door de cel gecontroleerd en moduleert dienovereenkomstig in chemie en structuur. Penium margaritaceum is een eencellige groene alg die onlangs is gebruikt in studies naar Streptofyt-algen (Streptophyta, de groep groene algen die het nauwst verwant is aan en voorouder is van landplanten²).

In de afgelopen twee decennia is P. margaritaceum een belangrijk organisme geweest in onderzoek naar de celwand en extracellulaire matrixdynamiek, endomembraansysteemactiviteiten, manifestatie van celvorm en plantevolutie 3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Het doel van dit werk is om onderzoekers van plantencelwanden te voorzien van de fundamentele methoden om P. margaritaceum te kweken, het experimenteel te manipuleren met behulp van op microplaten gebaseerde technieken en de structuur van de celwand te bewaken met behulp van immunocytochemische labeling en beeldvorming met levende cellen met licht- en elektronenmicroscopietechnieken. P. margaritaceum heeft veel overeenkomsten in de biochemie van de celwand met de primaire celwanden van landplanten. We hebben meerdere protocollen bedacht die gebruik maken van het unieke eencellige fenotype van deze alg en een snelle manier bieden om de dynamiek van de celwand te bestuderen die vaak moeilijk te volgen is in meercellige planten. Deze technieken zullen nuttig zijn voor plantencelwandbiologen die gedetailleerde celwanddynamieken willen ophelderen, vooral die welke zich bezighouden met pectine, en dienen als startpunt voor studies over de biologie van planten- en streptofytenalgencellen.

Protocol

OPMERKING: Penium margaritaceum is verkregen bij de Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Cultuurcollectie van algen aan de Universiteit van Göttingen, SAG; soort #2640.

1. Cultuur in stand houden

1. Houd de alg in vloeibaar Woods Hole medium (WH¹²) dat ook kan worden aangevuld met grondwaterextract (d.w.z. 40 ml per L medium). Houd culturen op 20-25 °C met een licht: donkercyclus van 16 uur:8 uur met 3,5 klux (74 μmol fotonen/m²/s) koel wit fluorescerend licht.
2. Bereid subculturen wekelijks voor en gebruik celculturen als ze 10-14 dagen oud zijn. Peniumculturen zijn 6 maanden levensvatbaar en kunnen gedurende deze tijd worden gebruikt om subculturen te starten. De alg zal ook groeien op 1%-2% agar gestold WHM.
3. Voor routinematige synchronisatie van de celcyclus plaatst u cellen van 10-14 dagen oude culturen gedurende 2-6 weken in het donker bij 20-25 °C. Was na deze tijd de cellen met verse WHM (zie hieronder) en cultuur zoals hierboven beschreven.

2. Labelen van celwand met monoklonale antilichamen

OPMERKING: P. margaritaceum is bedekt met een primaire celwand die veel van dezelfde bestanddelen bevat als in de primaire celwanden van landplanten¹¹. Veel van de monoklonale antilichamen (mAbs) die tegen epitopen van de celwand van landplanten worden gekweekt, herkennen componenten van de P. margaritaceum-celwand . Bronnen van deze antilichamen zijn onder meer het Complex Carbohydrate Research Center van de University of Georgia (ccrc@uga.edu) of Kerafast (kerafast.com). Na celwandlabeling van levende cellen met primaire mAbs die specifiek zijn voor celwandepitopen en fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen (bijv. FITC, TRITC), kunnen de cellen terug in cultuur worden gebracht zonder de gezondheid van de cel of celwandafzetting aan te tasten. De fluorescerende labeling van de celwand blijft voor onbepaalde tijd en de nieuw uitgescheiden celwand presenteert zich als donkere (d.w.z. niet-gelabelde) zones die kunnen worden gemeten om de celexpansiesnelheid te bepalen en/of opnieuw kunnen worden gelabeld met mAbs of andere sondes.

1. Verwijder 5 ml actief groeiende vloeibare celcultuur (10-14 dagen oud) en plaats deze in een plastic centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer op een tafelcentrifuge op 1.000 x g gedurende 1 min.
2. Giet het supernatant af en gooi het weg. Resuspendeer de pellet in 5 ml verse WHM. Plaats de dop stevig en schud de buis krachtig gedurende 10 s om de pellet opnieuw te suspenderen en verwijder alle extracellulaire polymere substantie of EPS van het celwandoppervlak.
3. Centrifugeer op 1.000 x g gedurende 1 min. Herhaal stap 2.2 en centrifuge. Resuspendeer de pellet in 1 ml verse WHM en breng 200 μl aliquots van de celsuspensie over in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.
4. Sluit de buisjes af en centrifugeer in een microcentrifuge op 1.000 x g. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellet opnieuw in 400 μl verse WHM.
5. Voeg aan de suspensie 20 μL mAb toe (bijv. JIM5, een mAb van ratten met specificiteit voor laag methylveresterd homogalacturonaat; uiteindelijke verdunning is 1/20 met WHM). Draai de buis, wikkel hem in aluminiumfolie en plaats hem 90 minuten op een laboratoriumrotator. Voor het beste resultaat vortex de buis 2x tijdens de incubatiestap van 90 minuten.
6. Centrifugeer de celsuspensie bij 1.000 x g gedurende 1 min. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellet opnieuw in 500 μl verse WHM. Sluit de buis af en draai de celsuspensie gedurende 10 s.
7. Herhaal stap 2.6 2x. Resuspendeer de pellet na het centrifugeren in 400 μl WHM en 8 μl geitenanti-rat TRITC of FITC (verdund 1:75 met WHM). Vortex, wikkel de buis in aluminiumfolie en plaats deze 90 minuten op een laboratoriumrotator.
8. Herhaal stap 2.6 en 2.7. Resuspendeer de pellet in 100 μL groeimedium, sluit de buis af en wikkel deze in aluminiumfolie tot hij klaar is om te beelden.
   OPMERKING: Het incuberen van de cellen in WHM met een blokkerend middel zoals No Fat Carnation Instant melk (1%) of runderserumalbumine (1%) voorafgaand aan incubatie in de mAbs kan ook worden gebruikt, maar onze ervaring is dat dit niets doet om de kwaliteit of intensiteit te labelen. Penium zet zijn celwand niet uit en produceert in het donker geen grote hoeveelheden EPS. Het gelabelde antilichaam blijft minimaal 3-4 dagen intact. Beeldvorming hoeft dus niet onmiddellijk te worden uitgevoerd. Andere mAbs kunnen hier worden toegepast, maar concentraties moeten worden getest. Voor chemische en fysische screeningsonderzoeken kan men meerdere ml celsuspensie labelen, die enkele dagen in het donker wordt bewaard en wordt gebruikt in microplaatstudies. Cellen kunnen ook pas vóór de behandeling worden gelabeld met het primaire antilichaam, later gevolgd door het secundaire antilichaam.

3. Het meten van celwand en celuitbreidingssnelheden in de loop van de tijd

1. Neem 1 ml cellen die zijn gelabeld met JIM5-TRITC en plaats 1 ml WHM in een microcentrifugebuis van 1.5 ml. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.000 x g en gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de pellet in 250 μL WHM en vortex om de cellen te mengen.
2. Voeg aan elk putje van een petrischaaltje met 12 wells 1 ml WHM toe. Op dit moment kunnen specifieke remmers en groeiregulatoren aan elk putje worden toegevoegd. In dit artikel demonstreren we de effecten van het verhogen van het calciumgehalte tijdens de incubatie.
3. Neem 30 μL geëtiketteerde celsuspensie (stap 1) en voeg toe aan elk putje van de microtiterplaat. Draai de plaat voorzichtig rond om te mengen. Afdichten met transparante folie.
4. Cultuur zoals hierboven (stap 1.1) gedurende 24 uur, 48 uur of 72 uur. Verwijder op bepaalde tijden 250 ml celsuspensie uit elk putje en plaats het in een microcentrifugebuisje van 1.5 μl.
5. Centrifugeer op 1.000 x g gedurende 1 min. Verwijder de supernatant. Resuspendeer de pellet in 50 μL groeimedium en vortex.
6. Plaats een druppel van 15 μL van de celsuspensie op een glasplaatje en dek af met een dekglaasje van 22 x 22 (dikte 1,5). Observeer cellen met een fluorescentiemicroscoop met behulp van een TRITC-filter bij 10x -20x.
7. Maak afbeeldingen van ten minste 50-100 cellen. Meet en registreer voor elke cel de totale cellengte en de lengte van de donkere zone (d.w.z. de nieuwe wand die tijdens de incubatie na het labelen wordt geproduceerd).
8. Bepaal het gemiddelde % nieuwe celwanden in de cultuur. Herhaal dit voor cellen die na 48 uur en 72 uur worden verzameld om informatie te verkrijgen over de uitzetting van de celwand in de loop van de tijd.
   OPMERKING: Stappen 3.5-3.8 leveren een dichte celsuspensie op die beeldvorming van veel cellen in één gezichtsveld mogelijk maakt. Dit maakt handmatig meten veel handiger. Veel camerasoftwareprogramma's zorgen voor het handig en/of automatisch meten van celafmetingen die bij deze alg kunnen worden gebruikt. Men kan de cellen ook verzamelen en ze zoals hierboven labelen met JIM5, maar anti-rat FITC vervangen als het secundaire antilichaam. Met behulp van een confocale laserscanmicroscoop (CLSM) kan men cellen in beeld brengen met zowel de FITC- als de TRITC-filters. De fluorescerende signalen kunnen vervolgens worden toegewezen aan verschillende pseudokleuren. Dit maakt het ook mogelijk om de structuur van de nieuwe celwand die tijdens verschillende behandelingen wordt geproduceerd (gelabeld met JIM5-FITC) te onderscheiden van pre-labeling celwanden (gelabeld met JIM5-TRITC).

4. Timelapse-beeldvorming van celwandexpansie

1. Label de celwand met JIM5-TRITC zoals hierboven beschreven (stappen 2.1-2.8). Verdun de cellen 10x in WHM en voeg een druppel van 50 μL cellen toe op een dekglaasje of een petrischaaltje met glazen bodem.
2. Laat de cellen in het donker 2 minuten aan glas hechten. Spoel cellen die niet aan het glas zijn blijven plakken voorzichtig weg met 1 ml WHM. Gebruik een micropipet en voeg WHM voorzichtig druppelsgewijs toe aan het glas.
3. Voeg 30 μL WHM toe aan de cellen die aan het glas zijn bevestigd. Voeg 30 μL warme 4% agarose/WHM toe aan de druppel WHM/cellen. Laat de agarose afkoelen tot kamertemperatuur en stollen.
4. Voeg voor monsters in een petrischaaltje voldoende WHM toe om de in agarose ingebedde cellen volledig te bedekken. Voor cellen op een dekglaasje, keert u het dekglaasje om en plaatst u het voorzichtig over een dia gevuld met WHM.
5. Monteer cellen op een fluorescerende microscoop. Externe verlichting (lamp) kan worden ingesteld, of licht van de microscoop zelf kan worden gebruikt om energie te leveren voor celgroei en beweging. Op een Olympus Ix83 of Ix63 microscoop werkt een vermogen van 5-6 V voor de trans lamp goed. Dit kan vallen en opstaan voor uw systeem vereisen.
6. Maak elke 10-30 minuten een beeld met behulp van de TRITC-filterset voor het volgen van de uitzetting van de celwand. Voeg chemicaliën/enzymen toe aan WHM die in stap 3.8 zijn gebruikt, indien aanwezig.

5. Observeren van de productie van extracellulaire polymere stoffen (EPS)

1. Voorbereiding van cellen: Verkrijg cellen van 5 ml uit culturen van 10-14 dagen oud en was ze zoals in stap 1-4 hierboven.
2. Bereiding van fluorescerende kralen: Voeg aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml 1 druppel (ongeveer 100 μl) fluorescerende kralen van 0,75 μm toe (Polysphere). Voeg 1 ml WHM toe aan de tube en schud krachtig om de kralen weer te suspenderen. Centrifugeer op 10.000 x g gedurende 3 min. Verwijder de supernatant. Voeg 1 ml WHM toe aan de pellet en schud. Centrifugeer op 10.000 x g gedurende 3 min. Resuspendeer de pellet in 500 μl WHM.
3. Bereiding van putjes: Voeg 1 ml WHM-medium toe aan de putjes van een plaat met 12 putjes. Voeg remmers of groeiregulatoren toe aan de gewenste concentratie en draai voorzichtig. Voeg 10 μL van de kralenoplossing toe en draai de plaat voorzichtig rond om de kralen te mengen. Voeg 10 μL gewassen cellen toe aan elk putje en draai de plaat voorzichtig rond.
4. Kweek de celplaat zoals hierboven (1.1). Plaats de plaat na 24 uur voorzichtig (pas op dat u niet mengt) op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een FITC-filter. De kralen hechten zich aan de EPS en onthullen de patronen van EPS-release. Fotografeer de cellen op 4x, 10x of 20x.

6. Timelapse-beeldvorming van EPS-spoorvorming

1. Voer time-lapse-beeldvorming uit in een plaat met 12 putjes (stap 3.2), zoals hierboven bereid, of in een afzonderlijk petrischaaltje. Volg stap 1-4. In plaats van de cellen onder tl-verlichting te kweken, kunnen de cellen worden gekweekt terwijl ze op een omgekeerde fluorescerende microscoop zijn gemonteerd.
2. Beeld cellen elke 5-10 minuten af om de celbeweging zo goed mogelijk vast te leggen. Fluorescerende kralen zijn zichtbaar met een FITC-filterset, maar voor geconcentreerde kralen gebruik je het helderveldkanaal. Externe verlichting (lamp) kan worden ingesteld, of licht van de microscoop zelf kan worden gebruikt om energie te leveren voor celgroei en beweging. Op een Olympus Ix83 microscoop werkt een vermogen van 5-6 V voor de translamp goed. Dit kan vallen en opstaan voor uw systeem vereisen.

7. Correlatieve structurele analyse van de celwand met scanning-elektronenmicroscopie (SEM)

OPMERKING: Veranderde kenmerken van de celwand die worden waargenomen in levende cellen die zijn gelabeld met celspecifieke antilichamen, kunnen worden afgebeeld voor gedetailleerde kenmerken met behulp van SEM. Deze correlatieve benadering maakt het mogelijk om ultrastructurele gegevens te verkrijgen die kunnen worden vergeleken met de fluorescentiegegevens.

1. Verkrijg 1 ml van een celsuspensie (gecontroleerd of experimenteel behandeld) in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Centrifugeren op 4.000 x g gedurende 1 min.
2. Gooi het bovenstaande weg. Dompel de buis met de pellet onder in vloeibare stikstof, of als deze niet beschikbaar is, plaats deze dan in een vriezer van -80 °C. Ingevroren cellen kunnen enkele maanden bij -80 °C worden bewaard.
3. Haal de buis tijdens de verwerking van de celwand uit de vriezer en laat deze 15 minuten ontdooien. Resuspendeer de pellet in 20 μl WHM en breng een druppel suspensie met dichte cellen aan op een dekglaasje van 45 mm x 50 mm.
4. Leg een tweede dekglaasje op de druppel om een sandwich te maken. Plaats op een laboratoriumtafel en druk continu op de sandwich om de cellen te scheuren (bijv. 30 s).
5. Scheid de glazen dekglaasjes voorzichtig en was de gescheurde cellen in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer op 500 x g gedurende 1 min.
6. Giet het bovenstaande af. De korrel moet wit of lichtgroen zijn. Als uit de daaropvolgende beeldvorming blijkt dat er niet voldoende cellen zijn gescheurd, herhaal dan stap 3 met de pellet hier.
7. Resuspendeer de pellet die de celwanden bevat in D-H₂O en herhaal stap 7.4 en 7.5. Resuspendeer de pellet in 100 μl D-H₂O en doe deze in een centrifugebuis van 1,5 ml.
8. Zorg voor een Cambridge-stomp (straal van 6 mm of 8 mm) en plak koolstoftape (EMS) op het oppervlak. Plaats vervolgens 5 μL druppels van de geresuspendeerde celwandsuspensie (stap 7) op de carbontape. Observeer het aantal celwanden met behulp van een ontleedmicroscoop. Als de suspensie te dicht is, verdun deze dan met D-H2O.
9. Plaats de stomp in een afgedekte bak en laat hem drogen (2 uur tot een nacht). Sputter bedek de stomp gedurende 50 s met behulp van een palladiumdoel (andere doelen kunnen ook worden gebruikt). Observeer de cellen bij 5 kV, spotgrootte, op 10 cm van de secundaire elektronendetector.
   OPMERKING: Door de celwandsuspensie te verdunnen voordat u druppels op de koolstoftape deponeert, worden celwanden die zich op elkaar afzetten, beperkt.

Results

De labeling van de celwand van P. margaritaceum met anti-pectine mAbs (bijv. JIM5) onthult een netwerk van calciumgecomplexeerde vezels en uitsteeksels die een regelmatig patroon of rooster vormen (Figuur 1). De pectine wordt afgezet in het celcentrum of de landengte, waar het oudere pectine naar de polen verplaatst (Figuur 2). Etikettering met een ander pectine-antilichaam-achtige JIM7 benadrukt de initiële secretie va...

Discussion

P. margaritaceum is een effectief organisme voor het ophelderen van de dynamiek van de ontwikkeling van celwanden en ECM-secretie in planten en streptofytenalgen. De belangrijkste kenmerken zijn onder meer een eencellige gewoonte en gemak bij het onderhouden van culturen en experimentele manipulatie, een primaire celwand met een duidelijk uitwendig pectinerooster en andere polymeren, gemak bij het labelen van levende cellen met celwandgerichte mAbs die op tijd kunnen worden gevo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcent. Tubes	Fisher Scientific	01-549-740
12 welled microplate	Fisher Scientific	50-233-6077
22 x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	12-541-016
45x 50 cm coverslips	Brain Research	4550-1.5D
Agar	Sigma Aldrich	A9414
anti-rat FITC	Sigma Aldrich	F6258
anti-rat TRITC	Sigma Aldrich	T4280
calcium chloride	Sigma Aldrich	C4981
Cambbridge stubs	EMS	75183-65
Fluoview CLSM	Evident	Fluoview 1200
JIM5	Kerafast	ELD004
JIM7	Kerafast	ELD005
Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-675
Micropipetors	BioRad	1660499EDU
Penium margaritaceum	Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Culture Collection of Algae at Göttingen University	2640
Polysphere kit	Polysciences	18336
SEM	ThermoFisher	Quattro SEM
sputter coater	EMS	Q150V
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-414