Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Screening van linzenvelden op de aanwezigheid van Fusariumverwelking en wortelrot in Turkije onder een terrestrisch klimaat

859 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68156

⸱

11 april 2025

 ,  ,  , 
1Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Yozgat Bozok University, 2Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Tokat Gaziosmanpaşa, 3Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Yozgat Bozok University

In dit artikel

Samenvatting

Uit een onderzoek in de provincie Yozgat bleek dat biotische factoren, zoals schimmelziekten zoals verwelking en wortelrot, de linzenproductie beperken. Fusarium-isolaten werden gevonden in 95,4% van de monsters, wat wijst op periodieke lokale onderzoeken en regelmatige monitoring voor duurzame technologieontwikkeling en effectieve controlestrategieën.

Samenvatting

Linzen is een belangrijke zelfbestoven peulvruchtplant. De productie ervan wordt beperkt door verschillende biotische factoren, met name schimmels die het verwelkings- en wortelrotcomplex veroorzaken. De studie had tot doel de regionale epidemiologie en etiologie van fytopathogene schimmelmiddelen te begrijpen om bestrijdingsstrategieën te ontwikkelen tegen Fusarium spp in de bodem. Deze studie onderzocht 83 plaatsen waar linzen in de provincie Yozgat worden gezaaid op verwelkings-, wortel- en kroonrotziekten veroorzaakt door veel voorkomende Fusarium-soorten in 2022 en 2023. Symptomatische linzenplanten werden verzameld voor schimmelisolatie en identificatie. De Fusarium-isolaten werden gegroepeerd op basis van de morfologie van de kolonie en gekweekt op PDA-medium. Bovendien werden genomische DNA's verkregen uit Fusarium-isolaten geanalyseerd met behulp van PCR en vergeleken met andere Fusarium-isolaten die zijn geregistreerd in de NCBI GenBank. Genetische relaties tussen Fusarium-isolaten werden bepaald met behulp van de Maximum Parsimony (MP)-methode in het Mega 11-programma. De resultaten, de gemiddelde incidentie en de ernst van de ziekte van verwelkings- en wortelrotziekten in de provincie Yozgat, werden vastgesteld op respectievelijk 16,9% en 38,6%. Fusarium-isolaten werden gevonden in 95,4% van de monsters. Er was 99,5% tot 100% nucleotidesequentiehomogeniteit onder F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum en F. solani isolaten, en de meest geïsoleerde soort was F. oxysporum. Het MP-dendrogram van Fusarium-isolaten was verdeeld in twee hoofdtakken, de eerste tak omvatte alle F. solani-isolaten . De tweede hoofdtak omvatte andere Fusarium-soorten die in de huidige studie en in NCBI GenBank zijn geïsoleerd. De studie stelt periodieke lokale onderzoeken voor om de frequentie van Fusarium-verwelking voor onderdrukking in linzen te bepalen. Tijdige onderdrukking van op fusarium gebaseerde schade wordt sterk aanbevolen om de ziekte onder controle te houden en het linzenproductiesysteem te behouden.

Inleiding

Linzen (Lens culinaris Medik.), een kleine eetbare peulvrucht die behoort tot de familie Fabaceae, is een zelfbestuivend gewas in het koele seizoen met naaldachtige bladeren en witte tot lichtpaarse of donkerpaarse bloemen1. Het werd ongeveer 10.000 jaar geleden door mensen gedomesticeerd in het Mesopotamische deel van de Vruchtbare Halve Maan en verspreidde zich snel naar de Nieuwe Wereld, inclusief het Middellandse-Zeebekken en Centraal-Azië, en later werd het genaturaliseerd naar Amerika2. Het wereldwijde linzenteeltgebied is ongeveer 5,5 miljoen hectare met een productie van 6,6 miljoen ton3. Türkiye staat op de 4eplaats in de linzenproductie, na Canada, India en Australië. De linzenteelt in Turkije is erg belangrijk en is goed voor 6,7% van de wereldproductie. De totale linzenproductie van Türkiye bedraagt 474.000 ton en wordt geproduceerd in ten minste 40 provincies4. Ongeveer 89,5% van de linzenproductie van Türkiye bestaat uit rode en groene linzen, die 10,5% van de winteroogst in de regio Zuidoost-Anatolië uitmaken. De rest van het gewas wordt geteeld als zomergewassen. De provincies Yozgat (39,5%), Konya (23,7%), Kırşehir (16,3%), Çorum (7,6%) en Ankara (2,9%) dragen grotendeels bij aan de productie van groene linzen4. De productie van linzen kan worden beperkt door biotische en abiotische stressfactoren. Vorst en droogte zijn de meest voorkomende abiotische stressfactoren bij de productie van groene linzen in de zomer5. Schimmelziekten zoals verwelking, wortel- en kroonrotcomplex veroorzaakt door Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium en Fusarium soorten zijn de belangrijkste schimmelziekten, die een combinatie van ziekten veroorzaken, waaronder demping, zaailingsziekte, verwelking en wortelrot, afhankelijk van het tijdstip van infectie, gevoeligheid van de gastheer en meteorologische omstandigheden 6,7, 8. okt.

Fusarium is een draadvormige onvolmaakte schimmel die voorkomt in bodem, planten en organische substraten en is een kosmopolitisch geslacht onder deze ziekteverwekkers9. Het veroorzaakt verschillende ziekten zoals Fusarium-verwelking, wortel- en wortelhalsrot, evenals Fusarium-kopziekte in tarwe, Fusarium-verwelking in komkommerachtigen en wortelrot in de meeste peulvruchten, waaronder linzen 10,11,12. Vasculaire verwelking, wortel- en wortelhalsrot veroorzaakt door Fusarium spp. is de belangrijkste ziekte van linzen in veel linzenteeltgebieden wereldwijd10. Fusarium oxysporum is de meest voorkomende Fusarium-soort die wordt geassocieerd met verwelkings-, wortel- en wortelhalsrot in linzen. Wereldwijd worden verwelkings-, wortel- en kroonrotziekten veroorzaakt door F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani en F. verticillioides in linzenplantgebieden7. Verwelkings-, wortel- en kroonrotziekten veroorzaakt door Fusarium spp. komen zowel in zaailing- als in volwassen stadia voor en veroorzaken plotselinge verwelking, uitdroging en uiteindelijk afsterven van de bladeren. Symptomen van de ziekte zijn onder meer zaadrot, wortelrot, verwelkende bovenste blaadjes, groeiachterstand, krimp en krullen van bladeren. In de middelste en late stadia van het vullen van de peulen zijn de zaden meestal gekrompen en zijn de wortelsymptomen onder meer groeiachterstand, bruine verkleuring, beschadigde penworteluiteinden en proliferatie van secundaire wortels. Verkleuring van het vaatweefsel kan niet in alle gevallen worden waargenomen13.

In de regio Centraal-Anatolië zijn in beperkte aantallen onderzoeken uitgevoerd naar de status van verwelkings- en wortelrotziekten in linzen. Yozgat heeft een mild en gematigd klimaat met overvloedige regenval in de winter in vergelijking met de zomer en is geclassificeerd als Dsb (warm, vochtig terrestrisch klimaat) door Köppen en Geiger14. De gemiddelde temperatuur is 9.6 °C met een gemiddelde neerslag van 512 mm. Yozgat bevindt zich in het noordelijk halfrond. De zomer valt in juni, juli, augustus en september. Het is erg belangrijk om informatie te hebben over de regionale epidemiologie en etiologie van de fytopathogene schimmelmiddelen die de ziekte veroorzaken voor het ontwikkelen van verschillende bestrijdingsstrategieën tegen Fusarium spp. in de bodem, om de ziekte te bestrijden15. In deze context zijn de doelstellingen van de huidige studie het bepalen en identificeren van de ziekteparameters (ziekteprevalentie, incidentie en ernst) van verwelkings-, wortel- en kroonrotziekten in linzen door een onderzoek uit te voeren in de provincie Yozgat, waar ongeveer 40% van de totale productie van groene linzen afzonderlijk plaatsvindt, het pathogene Fusarium soorten die verwelking en wortelrot in linzen veroorzaken door middel van morfologische en moleculaire analyses, en om de individuele virulentieniveaus van de Fusarium-soorten te bepalen door het uitvoeren van pathogeniteitstests.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Veldonderzoek, bemonstering en schimmelisolatie

OPMERKING: Volgens Endes16 zijn er in 2022 en 2023 onderzoekswerkzaamheden uitgevoerd. In totaal werden 83 linzenplantgebieden in negen districten in de provincie Yozgat geobserveerd op verwelkings-, wortel- en wortelhalsrotziekte (Figuur 1).

  1. Selecteer linzenvelden met een oppervlakte van meer dan 1000m2 als bemonsteringsgebied. Verzamel elk monster door willekeurig van de rand naar het midden of midden van het veld te lopen door zigzaggen langs de diagonalen te lopen met behulp van een frame van 1 m2 , en plaats het willekeurig op minimaal drie willekeurig geselecteerde verschillende punten. Verzamel linzenplanten die vanaf elk punt ziektesymptomen vertonen, doe ze in papieren zakken en breng ze over naar het laboratorium voor gebruik in schimmelisolatie- en identificatiestudies.
    OPMERKING: De wortels en wortelkoren van zieke linzenplanten die naar het laboratorium werden overgebracht, werden eerst gewassen met kraanwater om grove resten te verwijderen; later werden ze onderworpen aan oppervlaktedesinfectie voor de isolatie van de schimmelpathogenen, zoals beschreven in Endes16.
  2. Week zieke plantenweefsels 10-15 s in 70% ethanol en spoel vervolgens 3x gedurende 3 minuten elk in steriel water. Houd ze allemaal 5 minuten in 1% natriumhypochloriet (NaOCl) en spoel ze 3x gedurende 5 minuten elk opnieuw met steriel water.
  3. Droog de natte plantenweefsels op filterpapier in een steriele kast om het desinfectieproces van het oppervlak te voltooien. Snijd vervolgens de gedesinfecteerde plantenweefsels in stukken van 5-10 mm lang en plaats 4-5 stukken op een PDA-medium met 0,01% streptomycine in petrischaaltjes (diameter 90 mm). Zet de petrischaaltjes 4-7 dagen in een broedmachine in het donker bij 25 ± 1 °C en observeer de schimmelgroei.
    OPMERKING: De zich ontwikkelende schimmelisolaten werden gezuiverd door middel van de enkelvoudige sporenisolatiemethode. Voor dit doel werd de studie van Choi et al.17 naar het verkrijgen van enkelvoudige sporenculturen van schimmels die behoren tot Ascomyceten, Basidiomyceten, Coelomyceten en Hyphomyceten aangepast en gebruikt zoals hieronder beschreven.
  4. Om schimmelisolaten te zuiveren, moeten de schimmelisolaten die aan het einde van de isolatiestudies zijn verkregen, in een incubator worden bewaard bij 25 ± 1 °C gedurende 12 uur fluorescerend licht / 12 uur duisternis gedurende 15 dagen om de vorming van anamorfe reproductiestructuren op PDA te bevorderen.
  5. Weeg ongeveer 100 mg schimmelmycelium van 15 dagen oude culturen af met een spatel, breng het over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en maal het vervolgens grondig met steriele plastic stampers voor homogenisatie.
  6. Voeg 1 ml steriel water toe en draai gedurende 1 minuut om de overdracht van sporen in het water te garanderen. Om het aantal sporen dat in het water terechtkomt aan te passen, zuigt u 20 μL van dit mengsel op met een pipet en controleert u het aantal sporen onder een 10-voudige vergroting van de lichtmicroscoop.
  7. Wanneer de hoeveelheid sporen groter is dan de gewenste hoeveelheid, verdun dan het sporen-watermengsel in verhoudingen zoals 1/10, 1/100 en 1/1000. Zorg voor een mengsel met 4-6 sporen in het gezichtsveld van de microscoop.
  8. Neem 100 μl van de bereide sporensuspensie en breng deze over in petrischaaltjes met een diameter van 90 mm die PDA-medium bevatten, aangevuld met 0,1% streptomycine. Spreid vervolgens de overgedragen suspensie uit op de PDA met een Drigalski-spatel.
  9. Incubeer de bereide petrischaaltjes in het donker bij 25 ± 1 °C gedurende 12-24 uur. Aan het einde van deze periode worden kleine stukjes hyfen overgebracht die zijn ontwikkeld uit een enkele conidia met een inoculatielus naar een nieuw petrischaaltje met PDA-medium. Elke cultuur die uit elke spore wordt verkregen, is een enkele sporencultuur. Bewaar deze om te worden gebruikt in pathogeniteitstests en morfologische en moleculaire identificatie.
    OPMERKING: Het belangrijkste doel is om schimmelisolaten lange tijd in leven te houden zonder hun morfologie, genetica en virulentie te veranderen. Het opslagproces werd uitgevoerd met behulp van twee verschillende methoden18,19. Alle opslagmethoden die in dit onderzoek zijn gebruikt, worden hieronder in detail toegelicht.
    1. De eerste methode om monsters op te slaan is als volgt. Kweek schimmelisolaten op PDA-medium bij 25 ± 1 °C met een 12:12 uur donker: licht gedurende 15 dagen om myceliumschijven met een diameter van 4 mm te verkrijgen die in steriel water kunnen worden bewaard.
    2. Snijd myceliumschijven (4 mm diameter, 10 schijven) met een kurkboorder uit schimmelculturen die onder de bovengenoemde omstandigheden groeiden. Breng de myceliumschijven over in microcentrifugebuisjes met 1 ml steriel water. Bewaar de monsters in microcentrifugebuisjes in de koelkast bij -20 °C gedurende 6 maanden.
    3. De tweede methode om monsters op te slaan is als volgt. Neem eerst een snufje van de zuivere schimmelschijf van de enkelvoudige sporenculturen die zijn verkregen met een inoculatielus en breng deze over naar petrischalen die PDA bevatten aangevuld met chlooramfenicol, melkzuur, ampicilline, rifampicine, tetracycline, streptomycine, enz.
    4. Kweek gedurende 5-10 dagen voorafgaand aan het opslagproces bij 25 ± 1 °C met een 12 uur: 12 uur donkere: lichte toestand. Snijd en steriliseer 1 cm x 1 cm filterpapier voor algemeen gebruik in een autoclaaf bij 121 °C, 15 psi gedurende 60 min.
    5. Plaats de filterpapiertjes in nieuwe petrischaaltjes met hetzelfde of selectieve medium. Snijd kolonies/sporen uit pure schimmelcultuur en plaats ze op de bovenkant van elk stuk.
    6. Sluit de petrischaaltjes af en plaats ze in een broedmachine onder de juiste groeiomstandigheden (zoals hierboven vermeld). De schimmelisolaten groeien langzaam op filterpapier. Incubeer ongeveer 15 dagen om volledige kolonisatie te garanderen.
    7. Breng de afzonderlijke stukjes papier na sporulatie of volledige kolonievorming op filtreerpapier over in een nieuw petrischaaltje zonder kweekmedium. Zet de petrischaaltjes later in de broedmachine tot het filtreerpapier en de schimmel helemaal droog zijn (ongeveer 20-30 dagen).
    8. Doe na het drogen 10 vellen filterpapier in elke steriele papieren envelop, label elke envelop, doe deze enveloppen in plastic zakken en bewaar de plastic zakken met de enveloppen in een plastic en transparante container bij -20 °C.
  10. Bereken de prevalentie van linzenverwelking, wortel- en kroonrotziekte in Yozgat volgens de onderstaande formule, rekening houdend met de prevalentie van de ziekte in elk linzenveld, gevolgd door de naam van het district van de provincie.
    Prevalentie van ziekten (%) = (a / b) x 100
    waarbij a het aantal zieke velden aangeeft; B geeft het totale aantal onderzochte velden in een district aan.
  11. Bereken de incidentie van de ziekte volgens de gewogen gemiddelde methode gerapporteerd door Bora en Karaca20. Tel de planten in elk vakje in het veld. Verdeel ze in zieke en niet-zieke planten in elk vierkant en bereken de ziekteprevalentie volgens de onderstaande formule.
    Prevalentie van ziekten (%) = (x / y) x 100
    waarbij x het aantal zieke planten aangeeft; Y geeft het totale aantal onderzochte planten aan.
  12. Bereken de ernst van de ziekte volgens de schaal 0-4 van Öğüt21, waarbij 0 = geen symptomen vertoonde, 1 = milde symptomen in 25% van de bladeren; 2 = matige symptomen in 26%-50% van de bladeren; 3= ernstige chlorose en verwelking in 51%-75% van de bladeren; en 4 = zeer ernstige chlorose- en verwelkingsverschijnselen of uitdroging, vervelling, groeiachterstand of dode bladeren bij meer dan 75% planten in dezelfde volgorde (Figuur 2).
  13. Bereken de ernst van de ziekte met behulp van de volgende formule met de verkregen schaalwaarden16.
    Ernst van de ziekte (%) = [∑ [ i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    waarbij ni aantal planten in de schaalwaarde; vi schaalwaarde; V hoogste schaalwaarde; N totaal aantal waargenomen planten; I geeft het aantal lessen aan.

2. Meteorologische gegevens

  1. Voer enquêtestudies uit. Voor dit protocol zijn enquêtes afgenomen in de periodes mei en juni 2022 en 2023. Verkrijg de temperatuur, relatieve vochtigheid en totale neerslagwaarden voor de periode maart-juli in 2022, 2023 en lange jaren van het Directoraat Provinciale Meteorologie in Yozgat (Tabel 1).

3. Morfologische identificatie

  1. Vergelijk de culturele (koloniekleur, luchtmycelium, myceliagroeisnelheid) en conidiale (conidiale afmetingen, vorm, kleur en aantal septum) kenmerken van de Fusarium-isolaten met die van eerdere studies en identificeer voorlopig schimmelsoorten.
  2. Selecteer representatieve monsters uit de groepen die moeten worden gebruikt bij morfologische identificatie. Zuiver deze monsters volgens de enkelvoudige sporenisolatiemethode zoals hierboven vermeld. Let tijdens deze periode op de koloniepigmentatiekenmerken van Fusarium-isolaten , evenals op micro-/macroconidia- en chlamydosporestructuren.
  3. Om de vorming van micromorfologische structuren zoals micro/macroconidia en chlamydosporen in de verkregen zuivere schimmelculturen te bevorderen, incubeer op PDA bij 25 ± 1 °C en 12 uur: 12 uur donker: licht gedurende 25-30 dagen in een incubator. Meet de lengte en breedte van de conidia voor elk Fusarium-isolaat met lichtmicroscopie. Documenteer bovendien de structuur, vorm, kleur en septa of zonder septa van de conidia met behulp van een lichtmicroscoop die bij een digitale camera wordt geleverd.
  4. Groepeer op basis van de bovenstaande waarnemingen de Fusarium-isolaten op soortniveau, zoals beschreven in Leslie en Suerell22.

4. Moleculaire identificatie

OPMERKING: Het totale genomische DNA van de Fusarium-isolaten werd geëxtraheerd met behulp van de volgende methode, die enigszins werd gewijzigd ten opzichte van het protocol van Cenis23. PCR-analyses en elektroforese van Fusarium-isolaten werden uitgevoerd met behulp van het protocol beschreven door Aras en Endes24.

  1. Genomische DNA-extractie van schimmels
    1. Schraap uit een verse cultuur (10 dagen oud) van Fusarium-isolaten gekweekt op PDA 100 mg mycelium met een steriel scalpel en breng het vervolgens over in een microcentrifugebuisje van 2 ml. Incubeer de buisjes een nacht bij -20 °C.
    2. Voeg na een nacht incubatie 500 μL DNA-extractiebuffer (200 mM Tris-HCl pH: 8,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% natriumdodecylsulfaat) toe aan de buisjes en plet met een steriele plastic stamper.
    3. Voeg vervolgens 150 μL 3M natriumacetaat (NaOAc) pH 5,2 toe aan de buisjes en incubeer gedurende 30 minuten bij -20 °C. Centrifugeer na deze fase de buisjes gedurende 10 minuten op 4.000 x g .
    4. Breng na het centrifugeren 400 μl van het bovenstaande aan de bovenkant van de buis over in nieuwe buisjes (1,5 ml) en voeg een gelijk volume isopropanol (2-propanol) toe. Incubeer de nieuwe buisjes gedurende 30 minuten bij -20 °C. Meng gedurende deze tijd de tubes voorzichtig 5x of 6x.
    5. Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 10 minuten om het genomische DNA neer te slaan en gooi alle vloeistof die nog in de buisjes zit weg.
    6. Voeg 1 ml 70% ethanol toe aan de genomische DNA-pellet als een wit of crèmekleurig sediment op de bodem van de buis. Meng de buis voorzichtig 4x-5x op en neer gedurende ongeveer 1 minuut, waarbij u alle ethanol in de buizen weggooit. Open vervolgens de buisjes gedurende 30 minuten in laminaire luchtstroom om de ethanol op de DNA-pellet volledig te verdampen.
    7. Om het genomische DNA op te lossen en lange tijd op te slaan, voegt u 50 μL TE (1M Tris-HCl pH: 8,0; 0,5M EDTA pH 8,0) bufferoplossing toe aan de buisjes en incubeer de buisjes in een waterbad bij 65 °C gedurende 1 uur. Meng gedurende deze tijd de buis voorzichtig 8x-10x op en neer. Bewaar het genomische DNA opgelost in TE-bufferoplossing in een diepvriezer van -20 °C voor gebruik in moleculaire studies.
  2. Gebruik voor PCR-onderzoeken oligonucleotideprimers ITS5 F (5′GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') / ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') om het ITS-gebied van rDNA25 te amplificeren. Voer elke PCR-reactie uit met 2,5 μl 10x PCR-buffer, 2,5 μl MgCl2 (25 mM), 2,5 μl dNTP (2 mM), 0,5 μl van elke primer (10 μM), 2 μl sjabloon-DNA, 0,5 μl Taq DNA-polymerase (1 U/μl, Fermantas) en 14 μl sQH2O in een totaal volume van 25 μl.
  3. Voer voor de PCR-reactie van 25 μl het volgende PCR-programma uit op 95 °C gedurende 2 minuten (initiële denaturatie), gevolgd door 40 cycli; 95 °C gedurende 30 s (denaturatie), 55 °C gedurende 45 s (gloeien), 72 °C gedurende 90 s (verlenging) en 72 °C gedurende 5 minuten (laatste verlenging). Elektrofore PCR-producten gedurende 1,5 uur bij 90 V in 1,5% agarosegel bereid in 1x TAE (Tris Base - IJsazijn - EDTA) bufferoplossing.
    1. Om de TAE-buffer voor gelelektroforese voor te bereiden, lost u 242 g Tris-base op in 700 ml steriel water; voeg de 57,1 ml ijsazijn toe; voeg de 100 ml 0,5 M EDTA-oplossing toe en stel het volume in op 1 l door steriel water toe te voegen. Stel de uiteindelijke pH van de 1 L 50x TAE-buffer in op 8,5. Om de 1x TAE werkende buffer te maken, voeg je 49 delen steriel water toe aan 1 deel van de 50x TAE-buffer.
  4. Bevlek de gels met 0,5 μg/ml ethidiumbromide en inspecteer ze visueel door ze zichtbaar te maken op een UV-transilluminator.
  5. Om de fylogenetische relatie tussen wortel- en kroonrotmiddelsisolaten te onderzoeken, moeten de ITS-genbasequenties worden verkregen door middel van PCR, die bidirectioneel (5'-3' en 3'-5') via een verkoper werden gesynthetiseerd. Vergelijk de basensequenties met de gengegevens van de NCBI (National Center of Biotechnology Information) website en de basensequenties van het ITS-gen van andere Fusarium-isolaten in de wereld met behulp van het Blast-programma. Gebruik dit om de isolaten op soortniveau te identificeren, zoals hieronder beschreven.
    1. Ga naar https://www.ncbi.nlm.nih.gov website. Klik op het tabblad BLAST in het gedeelte Populaire bronnen.
    2. Klik op het tabblad Nucleotide BLAST in het nieuwe venster. Voer in de sectie Queryreeks invoeren in het nieuwe venster de basisreeksen in Fasta-indeling in en schrijf de naam van het onderzoek in de sectie Functietitel.
    3. Vink vervolgens Standaard databases (nr etc.) aan in het tabblad Database in de sectie Zoekset kiezen onderaan.
    4. Vink Sterk vergelijkbare sequenties (megablast) aan op het tabblad Optimaliseren voor in de sectie Programmaselectie en klik op het tabblad BLAST onder aan de pagina.
  6. Gebruik het fylogenetische analyseprogramma MEGA 11 om de fylogenetische verwantschap tussen Fusarium-isolaten te bepalen. Lijn de basensequenties uit met behulp van het ClustalW-programma en creëer de genetische stambomen van de isolaten volgens de maximale spaarzaamheid voor het ITS-gen26.
    1. Om Mega-software te downloaden, gaat u naar de website https://www.megasoftware.net en installeert u Mega-software. MEGA-software wordt GRATIS ter beschikking gesteld voor gebruik in onderzoek en onderwijs.
    2. Sla eerst de sequenties op het bureaublad op als een Kladblok-bestand (.txt) in het FASA-formaat. Voer het Mega-softwareprogramma uit en klik op het tabblad ALIGN . Klik op Uitlijning bewerken/bouwen in het venster. Schakel vervolgens Een nieuwe uitlijning maken in het nieuwe venster in en klik op OK om te bevestigen.
    3. Klik op het tabblad DNA . Verwijder de 1. Volgorde die automatisch in het venster verschijnt en ga naar het bestand bewerken en klik vervolgens op Volgorde invoegen vanuit bestand tabblad. Open het Kladblok-bestand (.txt) dat de sequenties bevat en zich op het bureaublad bevindt.
    4. In dit stadium verschijnen alle sequenties op het scherm. Klik eerst op Elke reeks die op het scherm verschijnt en markeer vervolgens alle reeksen met CTRL + A. Open het uitlijningsbestand en klik vanaf daar op Uitlijnen met Clustal W en klik op OK om het programma in de standaardinstellingen uit te voeren.
    5. Nadat u de verschillen in de uitlijning van de sequenties hebt onderzocht, gaat u naar het gegevensbestand, klikt u op Fylogenetische analyse en klikt u vervolgens op Nee in het selectievakje in het venster om te bepalen of de sequenties eiwitten synthetiseren of niet. Onze sequenties synthetiseren geen eiwitten omdat ze tot de ITS-regio behoren.
    6. Keer terug naar het hoofdvenster van Mega software. Klik op Fylogenie en selecteer Maximale spaarzaamheid samenstellen/testen. Selecteer in het nieuwe venster Bootstrap-methode voor de fylogenietest en voer bootstrap-waarden 1.000 in om de sterkte van de tak te testen. Selecteer op het tabblad Gaps/missing Data Treatment de optie Gedeeltelijke verwijdering, selecteer Subtree-pruning-Regrafting (SPR) als de MP-zoekmethode en klik op OK om de bewerkingen te bevestigen.
    7. Wacht op het resultaat van de analyse om de fylogenetische boom te laten zien.

5. Pathogeniteitstest

  1. Gebruik vier isolaten voor pathogeniteitsonderzoek voor elke representatieve soort van de Fusarium-soorten die met moleculaire methoden zijn geïdentificeerd. Voer pathogeniteitsstudies uit bij 24 °C, 16 uur fluorescerend licht/8 uur donkere fotoperiode, met een luchtvochtigheid van 65% in een ruimte met airconditioning.
  2. Zaai linzenzaden in zwarte plastic flesjes met 45 gaatjes van 5 cm diameter. Bewaar elke injectieflacon 3 minuten in 1% natriumhypochloriet en spoel vervolgens 3x af met steriel gedestilleerd water. Droog de zaden 24 uur in een steriel kastje en zaai met één zaadje in elk gaatje.
    OPMERKING: De linzenzaden van de Kayı 91-variëteit, die gevoelig zijn voor de ziekte, werden gebruikt in alle pathogeniteitstests6. De onderdompelingstechniek van zaailingen werd gebruikt als inoculatiemethode27.
  3. Incubeer zuivere culturen van elk isolaat in PDA bij 24 °C gedurende 7-10 dagen. Schraap de uit de stamcultuur gekweekte kolonies met een spatel van het oppervlak van het medium en bereid de sporen/myceliumsuspensie met steriel gedestilleerd water.
  4. Verwijder grote resten uit de suspensie door filtratie door een 4-laags kaasdoek en pas de sporen/myceliumconcentratie aan op 1 x 106 sporen/ml met behulp van een hemocytometer.
  5. Na deze fase ontwortelt u de wortels van de zaailingen die eerder in de flesjes zijn gekweekt als ze 2-3 echte bladeren hebben. Spoel in kraanwater en verwond de wortels licht met een steriele naald. Dompel deze zaailingen 3 minuten onder in de voorbereide sporen/myceliumsuspensie en verplant ze vervolgens in plastic flesjes met een steriel mengsel van aarde en turf (2:1; v/v).
  6. Voor de zaailingen die als controles worden gebruikt, ontwortelt u hun wortels, verwondt u ze en plant u ze vervolgens door ze alleen in steriel water onder te dompelen. Voer 3 weken na het inoculatieproces evaluaties uit van de pathogeniteitstest volgens de schaal van 0-4.
  7. Nadat de berekende waarden voor de ernst van de ziekte waren onderworpen aan hoektransformatie, onderwerpt u de verkregen waarden aan een variantieanalyse en evalueert u de verschillen tussen de gemiddelden volgens de HSD-test van Tukey (p = 0,05). Ernst van de ziekte: Isolaten met 0%-15% werden beoordeeld als zeer lage virulentie (LV), isolaten met 16%-35% werden beoordeeld als lage virulentie (LV), isolaten met 36%-50% werden beoordeeld als matige virulentie (O), isolaten met 51%-70% werden beoordeeld als hoge virulentie (VV), isolaten met 71%-100% werden geëvalueerd als zeer hoge virulentie (VV) en isolaten zonder ziektesymptomen werden geëvalueerd als saprofytische of epifytische isolaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bepaling van ziekteparameters
In totaal werden 83 linzenzaaigebieden in negen verschillende regio's van Yozgat geëvalueerd op basis van symptomen van verwelkings-, wortel- en kroonrotziekte, die zich uitstrekten over een oppervlakte van 1,1984 x 106 m2 (tabel 2). Symptomen van verwelkings- of wortelrotziekte werden op alle velden aangetroffen. De incidentie van verwelkings- en wortelrotziekte in Y...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Van fusariumverwelking is bekend dat het in sommige delen van de wereld ernstige economische opbrengstverliezen veroorzaakt31. De ziekte werd voor het eerst gemeld in Hongarije32 en later gemeld in veel landen, zoals Egypte, India, Myanmar, Nepal, Pakistan, Turkije, Syrië en de VS33. Kumar et al.34 rapporteerden een brede verspreiding van linzenverwelking, wortel- en wortelhalsrot met...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door het Bozok University Project Coordination Application and Research Center, BAP-eenheid met projectnummer FÇD-2022-1096. Deze studie maakt deel uit van de PhD-studie van Sevim Atmaca.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(S)-melkzuurMerck100366Werdt gebruikt als antibioticum in studies.
2-propanolMerck109634Wordt gebruikt in moleculaire studies.
Verstelbare micro automatische pipette (0,1-2,5 µL)Eppendorf ResearchLB.EP.3123000012Wordt gebruikt om kleine volumes vloeistoffen te meten.
Verstelbare micro automatische pipettenset (2 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1.000 µl)Eppendorf ResearchLB.EP.4924000916Wordt gebruikt om kleine volumes vloeistoffen te meten.
AgarMerck110453Voor gebruik bij het maken van schimmelmedia.
AgaroseSigma-Aldrich18300012Voor gebruik bij gelvoorbereiding in elektroforese.
Klimaatkamer?klimlabWerdt gebruikt om planten te kweken onder gecontroleerde omstandigheden.
AmpisilineSigma-AldrichA9393Werdt gebruikt als antibioticum in studies.
Analytische precisiebalansShimadzu ATX224Werdt gebruikt om de vaste materialen die in het onderzoek werden gebruikt, af te wegen.
AutoclaafsterilisatorZealway GF-120DRHet werd gebruikt om vaste en vloeibare materialen in elke fase van het onderzoek te steriliseren.
Binoculaire microscoopLeica DM750Voor gebruik bij morfologische diagnose.
Biologische veiligheidskabinetHFsafe Class II A2Om de veiligheid van de werkruimte, de gebruiker, de omgeving en de werking te waarborgen.
CentrifugaalDLAB DM1424LB.DL.903001124Wordt gebruikt om deeltjes in een monster te scheiden op basis van hun vorm, grootte en dichtheid
ChloramfenicolSigma-Aldrich220551Werdt gebruikt als antibioticum in studies.
KurkboorderstelSigma-AldrichZ165220Het werd gebruikt om monsters uit schimmelcultuur in petrischalen te nemen.
Dekglas en diaISOLAB075.01.006 / 075.02.005Werdt gebruikt bij de voorbereidingsprocessen voor microscoopstudies.
D(+)-glucose monohydraatMerck108342Voor gebruik bij het maken van schimmelmedia.
DFC450 met digitale cameraLeicaDigitale microscoopcamera met c-mount interface en met een 5 megapixel ccd-sensor.
Dm750 binoculaire microscoop LeicaMIC5246Werdt gebruikt voor morfologische identificatie van schimmels.
DNA gelelektroforesethermo fisher scientificB2-UVT
Dna gel ladingsverf (6x)Thermo ScientificR0611Voor gebruik in moleculaire diagnostiek.
dNTP mixThermo ScientificR0192Wordt gebruikt in moleculaire studies.
Dreamtaq pcr mastermixes (2x)Thermo ScientificK1082Voor gebruik in moleculaire diagnostiek.
Drigalski spatelISOLAB082.03.001Het werd gebruikt om schimmelculturen die in petrischalen waren gekweekt, te schrapen en te verspreiden.
Edta Thermo Scientific17892Voor gebruik in moleculaire diagnostiek.
EthanolMerck100983Wordt gebruikt in moleculaire studies en studies over oppervlaktedesinfectie.
EthidiumbromideSigma-AldrichE7637Wordt gebruikt om dna in gels tijdens gelelektroforese te kleuren.
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Sigma-AldrichE6758Wordt gebruikt in moleculaire studies.
FilterpapierISOLAB107.58.158Wordt gebruikt in studies over stamculturen.
Droger met geforceerde luchtZHICHENG ZXDS-A-1090Voor gebruik bij incubatieprocessen.
AfzuigkapElektromag EM1201LB.EM.EM1201Het werd gebruikt om schadelijke chemische dampen, gassen en stof te beheersen.
Gel-imagingsysteemSyngene G:BOX Chemi XX6Voor gebruik in moleculaire diagnostiek.
Generuler 50 bp dna ladderThermo ScientificSM0372Voor gebruik in moleculaire diagnostiek.
GlazijnzuurMerck1005706Wordt gebruikt in moleculaire studies.
GlycerolMerck104094Voor gebruik in stamculturen van schimmels.
LancetISOLAB048.50.002Wordt gebruikt om zieke weefsels uit plantmonsters te verwijderen.
MagnesiumchlorideSigma-Aldrich814733Wordt gebruikt in moleculaire studies.
MeetlintISOLAB016.07.500Wordt gebruikt om vloeistofvolumes te meten.
MicrocentrifugebuisjesISOLAB0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003Wordt gebruikt om verschillende volumes vloeistoffen op te slaan.
PCR-buisISOLAB123.01.002Het werd gebruikt om dna-mix in PCR-studies te plaatsen.
PetrischalenISOLAB120.13.090Voor gebruik bij het kweken van schimmelcultuur.
PipetpuntenISOLAB005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004Om vloeistofvolumes te overbrengen die in analyses worden gebruikt.
Plastic zakISOLAB039.30.005Werdt gebruikt om monsters naar het laboratorium te vervoeren.
Kunststof potToXAWerdt gebruikt om planten te kweken.
Tang, klemmenISO

Referenties

  1. Skrzypkowski, W., Kiełkowska, A. Current status of haploidization in cool-season grain legume crop species. Agriculture. 14 (7), 1031(2024).
  2. Liber, M., Duarte, I., Maia, A. T., Oliveira, H. R. The history of lentil (Lens culinaris subsp. culinaris) domestication and spread as revealed by genotyping-by-sequencing of wild and landrace accessions. Front Plant Sci. 12, 628439(2021).
  3. FAOSTAT. , Food and Agriculture Organization of the United Nations. Database on Crops https://www.fao.org/faostat/en/#data (2022).
  4. TÜİK. Agricultural statistics report. , Turkish Statistical Institute. Türkiye. (2023).
  5. Baxevanos, D., et al. Lentil cultivar evaluation in diverse organic mediterranean environments. Agronomy. 14 (4), 790(2024).
  6. Aydın, M., Koç, M., Sağır, A. Investigations on determination of soilborne fungal pathogens causing root rot, crown rot and wilt on lentil in Southeast Anatolia Region. Plant Protect Bulletin. 44 (1), 93-103 (2004).
  7. Zitnick-Anderson, K., et al. Fusarium species associated with root rot of lentil (Lens culinaris) in North Dakota. Plant Health Prog. 22 (4), 524-528 (2021).
  8. Kushwaha, D. A. A research book of seed mycoflora of chickpea (Cicer arietinum). , books.google.com (2020).
  9. Ekwomadu, T. I., Mwanza, M. Fusarium fungi pathogens, identification, adverse effects, disease management, and global food security: A review of the latest research. Agriculture. 13 (9), 1810(2023).
  10. Jiskani, A. M., et al. A destructive disease of lentil: Fusarium wilt of lentil. Plant Arch. 21 (1), 2117-2127 (2021).
  11. Alisaac, E., Mahlein, A. K. Fusarium head blight on wheat: biology, modern detection and diagnosis and integrated disease management. Toxins. 15 (3), 192(2023).
  12. Yang, F., et al. Effects of rhizosphere microbial communities on cucumber Fusarium wilt disease suppression. Microorganisms. 11 (6), 1576(2023).
  13. Kumari, N., Katoch, S. Wilt and root rot complex of important pulse crops: their detection and integrated management. Management of Fungal Pathogens in Pulses. Fungal Biology. , Springer. Cham. (2020).
  14. Köppen, W., Geiger, R. Handbuch der klimatologie. , Gebrüder Borntraeger. Berlin. (1936).
  15. Agrios, G. N. Plant Pathology. , 5th Edn, Elsevier Academic Press. Amsterdam. (2005).
  16. Endes, A. Occurrence and distribution of Chickpea root rot and wilt disease in Yozgat Kırşehir and Kırıkkale Provinces. Çukurova J Agri Food Sci. 38 (2), 284-298 (2023).
  17. Choi, Y. W., Hyde, K. D., Ho, W. H. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 29-38 (1999).
  18. Baskarathevan, J., Jaspers, M. V., Jones, E. E., Ridgway, H. J. Evaluation of different storage methods for rapid and cost effective preservation of Botryosphaeria species. New Zealand Plant Protect. 62, 234-237 (2009).
  19. Dikilitaş, M., Katırcıoğlu, Z., Altınok, H. Latest developments and methods on long-term storage, protection, and recycle of fungi and fungal material. JAgric Fac HR U. 15 (1), 55-69 (2011).
  20. Bora, T., Karaca, İ Measurement of disease and damage in cultivated plants. , Ege University Press. Turkey. (1970).
  21. Öğüt, E. Pathogenic and molecular characterization of some Fusarium spp. causing root rot and wilt on lentil with determination of variety reactions in south eastern Anatolia. , Mustafa Kemal University, Institute of Science and Technology. (2015).
  22. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium Laboratory manual. , Blackwell Publishing. (2006).
  23. Cenis, J. L. Rapid extraction of fungal DNA for PCR amplification. Nuc Acids Res. 20 (9), 2380(1992).
  24. Aras, S., Endes, A. Effect of Fusarium oxysporum infection on strawberry under calcium, iron, and zinc deficiency conditions. Zemdirbyste-Agri. 110 (1), 71-78 (2023).
  25. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protoc A Guide Metho Appl. , 315-322 (1990).
  26. Endes, A. Characterization and pathogenicity of Botryosphaeriaceae species associated with Gummosis, Dieback, Trunk and Branch Cankers of almond trees in Türkiye. J Agri Sci. 30 (4), 698-711 (2024).
  27. Gordon, T. R., Okamoto, D., Jacobson, D. J. Colonization of muskmelon and non-susceptible crops by Fusarium oxysporum f. sp. melonis and other species of Fusarium. Phytopathology. 79 (10), 1095-1100 (1989).
  28. Xu, X., et al. Fusarium species associated with maize leaf blight in Heilongjiang Province, China. J Fungi. 8 (11), 1170(2022).
  29. Fonseca-Guerra, I. R., Chiquillo-Pompeyo, J. C., Benavides Rozo, M. E., Díaz Ovalle, J. F. Fusarium spp. associated with Chenopodium quinoa crops in Colombia. Sci Rep. 12 (1), 20841(2022).
  30. Khan, M. F., et al. First report of damping-off and seedling rot of Hemp (Cannabis sativa) caused by Fusarium solani in North Dakota, U.S.A. Plant Dis. 107 (1), 232(2023).
  31. Chaudhary, R. G., Saxena, D. R., Dhar, V., Singh, R. K., Namdev, J. K. Prevalence of wilt-root rot and their associated pathogens at reproductive phase in lentil. Arch Phytopathol Plant Protect. 43 (10), 996-1000 (2010).
  32. Fleischmann, R. Some observations on Maize smut in Hungary. Pflanzenbau. 14 (5), 199-206 (1937).
  33. Bedasa, T. Distribution and management of Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. lentis) of lentil (Lens culinaris Medikus) in Central Highlands of Ethiopia. , Haramaya University Doctoral dissertation. (2018).
  34. Kumar, S., et al. Vascular wilt disease of lentil: A review. J Lentil Res. 4, 1-14 (2010).
  35. Chenari, S., Abbasi, S., Chehri, K. Phylogeny and host specificity of Fusarium solani species complex isolated from chickpea, lentil and common bean. Arch Phytopathol Plant Protect. , 1-15 (2024).
  36. Rathod, A., et al. Isolation of causal organism of wilt and collar rot of lentil and its pathogenicity tests. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 10 (12), 276-282 (2021).
  37. Hayit, T., Endes, A., Hayit, F. The severity level classification of Fusarium wilt of chickpea by pre-trained deep learning models. J Plant Pathol. 106 (1), 93-105 (2024).
  38. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 13 (4), 414-430 (2012).
  39. Fletcher, J. D., Broadhurst, P. G., Bansal, R. K. F. avenaceum: A pathogen of lentil in New Zealand. New Zealand J Crop Horticultural Sci. 19 (2), 207-210 (1991).
  40. Al Ahmad, M., Mouselli, N. Wilt and root rot of lentis. Lens. 14 (1/2), 27-31 (1987).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Fusarium-soortenbodemgebonden pathogenenisolatie van schimmelsPCR-analysekoloniemorfologieziekteincidentiegenetische relaties

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.