Method Article

Een eenvoudige en efficiënte methode voor het testen van immunomodulerende middelen voor het genereren van tolerogene dendritische cellen uit menselijke CD14+ -monocyten

DOI:

10.3791/68159

⸱

April 11th, 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een procedure om het vermogen van farmacologische middelen te beoordelen om tolerogene dendritische cellen te genereren uit naïeve van monocyten afgeleide dendritische cellen in vitro en om hun potentie te valideren door autologe regulerende T-celgeneratie te genereren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tolerogene dendritische cellen (tolDC's) zijn een subset van dendritische cellen (DC's) waarvan bekend is dat ze naïeve T-cellen beïnvloeden in de richting van een regulerend T-cel (Treg) fenotype. TolDC's worden momenteel onderzocht als therapieën voor auto-immuniteit en transplantatie, zowel als celtherapie als als methode om tolDC's te induceren uit endogene DC's. Tot op heden is het aantal bekende middelen om tolDC's te induceren uit naïeve DC's echter relatief klein en is hun potentie om Tregs in vivo te genereren inconsistent geweest, met name therapieën die tolDC's induceren uit endogene DC's. Dit biedt de mogelijkheid om nieuwe verbindingen te verkennen om tolerantie te genereren.

Hier beschrijven we een methode om nieuwe immunomodulerende verbindingen in vitro te testen op monocyt-afgeleide DC's (moDC's) en hun functionaliteit te valideren om autologe Tregs te genereren. Eerst verkrijgen we PBMC's en isoleren we CD14+ monocyten en CD3+ T-cellen met behulp van in de handel verkrijgbare magnetische scheidingskits. Vervolgens differentiëren we monocyten in moDC's, behandelen we ze gedurende 24 uur met een gevestigde immunomodulator, zoals rapamycine, dexamethason, IL-10 of vitamine D3, en testen we hun verandering in tolerogene markers als validatie van het protocol. Ten slotte co-kweken we de geïnduceerde tolDC's met autologe T-cellen in aanwezigheid van anti-CD3/CD28-stimulatie en observeren we veranderingen in Treg-populaties en T-celproliferatie. We stellen ons voor dat dit protocol wordt gebruikt om de werkzaamheid van nieuwe immunomodulerende middelen te evalueren om reeds gedifferentieerde DC's te herprogrammeren naar tolDC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritische cellen (DC's) zijn cruciale bemiddelaars tussen aangeboren en adaptieve immuniteit. DC's, die zich voornamelijk bevinden in slijmvliezen, huid en lymfoïde weefsel, zijn de primaire antigeenpresenterende cellen (APC's)1. DC's nemen vreemde eiwitten op en verwerken en presenteren deze op belangrijke histocompatibiliteit (MHC) eiwitten tot naïeve T-cellen. DC's brengen specifiek MHC klasse II-eiwitten tot expressie, zoals humaan leukocytenantigeen-DR (HLA-DR) bij mensen. De activeringstoestand van de DC's bij blootstelling aan antigeen is van cruciaal belang voor de stroomafwaartse T-celrespons2. Onrijpe DC's brengen verschillende patroonherkenningsreceptoren (PRR's) tot expressie die klassen van moleculen herkennen die pathogene geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) worden genoemd, zoals de bacteriële wandcomponent, lipopolysaccharide (LPS)3. Bij PRR-stimulatie worden DC's gerijpte DC's en reguleren ze belangrijke co-stimulerende eiwitten van T-cellen, zoals CD80, CD86 en CD40, en scheiden ze pro-inflammatoire cytokines af, zoals tumornecrosefactor-alfa (TNFα), waardoor de differentiatie van naïeve T-cellen in conventionele effector- of helper-T-cellen2 wordt vergemakkelijkt. Integendeel, als de rijping van gelijkstroom wordt onderbroken of als gelijkstroomcellen zich ontwikkelen in een tolerogene omgeving, kunnen gelijkstroomcellen een tolerogene gelijkstroomtoestand (tolDC's) genereren4. TolDC's downreguleren klassieke co-stimulerende receptoren van T-cellen en reguleren in plaats daarvan tolerantiereceptoren zoals geprogrammeerde celdood ligand 1 (PD-L1) en B- en T-lymfocytendemper (BTLA) en genereren onderdrukkende cytokines zoals interleukine 10 (IL-10) en transformerende groeifactor bèta (TGF-β)4. Dit is geen uitgebreide lijst van tolerantiemarkers en in feite is er beperkte consensus over welke tolDC-markers geschikt zijn om de tolDC-toestand5 te definiëren. Met dit in het achterhoofd stellen we voor om regulerende T-cellen (Treg) te genereren als een functionele marker die zou moeten worden gebruikt om de effectiviteit van verschillende tolDC-inductiemiddelen te vergelijken.

Naast tolDC/gerijpte DC-activeringstoestanden, kunnen DC's ook worden gecategoriseerd op basis van hun afstamming of weefsellocatie, waarbij elke subset een iets andere functionaliteit vertoont. Hoewel de tolDC/gerijpte DC-deling minder definitief is en meer als een continuüm bestaat, hebben afstammingsdelingen goed gedefinieerde markers bij zowel mensen als muizen. DC-precursoren worden gevormd in het beenmerg, maar er zijn twee hoofdsubtypes van DC's op basis van hun afstamming: 1) plasmacytoïde dendritische cellen (pDC's), die voortkomen uit lymfoïde afstammingslijnen en 2) conventionele dendritische cellen (cDC's), die voortkomen uit myeloïde afstammingslijnen. Bij mensen zijn pDC's gerijpt in lymfoïde organen, brengen CD303 tot expressie en reageren zeer goed op virale infecties6. CD11c, dat cDC's tot expressie brengt, is ondertussen gerijpt in perifere weefsels en bestaat in twee verschillende subtypes, CD1c+ cDC1's en CD141+ cDC2, die elk verschillende T-celresponsen genereren7. Bovendien kunnen alle cDC's voorkomen in weefselresidente (CD103-) of migrerende (CD103+) substaten8. Ten slotte kunnen cellen uit monocytenlijnen (CD14+) onder bepaalde omstandigheden worden geïnduceerd in de richting van een dendritisch celfenotype en worden ze geïdentificeerd als CD14-, CD141+, CD1c+ 9. Deze cellen, bekend als van monocyten afgeleide DC's (moDC's), worden het meest gebruikt voor ex vivo-analyse bij mensen, aangezien monocyten ongeveer 10-30% van de menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uitmaken, terwijl pDC's slechts 1-3% uitmaken10. Dit maakt moDC's een aantrekkelijke keuze, maar het is ook bekend dat moDC's inflammatoir zijn dan typische cDC's geïsoleerd uit primair weefsel9.

Er zijn momenteel twee brede categorieën van inspanningen om tolDC's te gebruiken om klinische tolerantie te genereren. Ten eerste worden tolDC's gegenereerd uit monocyten voor gebruik als celtherapie. In dit paradigma worden moDC's doorgaans gedifferentieerd met behulp van IL-4/GM-CSF gelijktijdig met immunomodulatoren zoals vitamine D3, rapamycine (rapa), IL-10, dexamethason of combinaties van deze11,12. Deze tolDC's zijn onderzocht als autologe celtherapieën voor auto-immuniteit en transplantaties13. Het andere gebruik van tolDC's is het herprogrammeren van endogene DC's naar tolDC's met behulp van gratis medicijnen of nanodragers om zowel immunomodulator als interessant antigeen af te leveren 14,15,16. Inductie van reeds gedifferentieerde DC's is echter een grotere uitdaging vanwege de ontwikkeling van robuuste metabole fenotypes van DC's die typisch in contrast staan met het tolDC-metabolisme17,18. Dit is een hoge lat voor de meeste farmacologische immunomodulatoren; om deze reden rapporteren de meeste endogene DC-herprogrammeringsstudies effectieve DC-onderdrukking en vaak enige Treg-inductie, maar missen ze klinisch succes, vaak vanwege een gebrek aan T-celpersistentie 15,19,20. Dit benadrukt de noodzaak van strategieën om potentiële tolDC-inductiemiddelen uit bestaande DC's te identificeren.

Hier presenteren we een methode voor in vitro evaluatie van immunomodulerende middelen tegen gedifferentieerde moDC's met de eindmetriek van autologe Treg-inductie. Dit protocol is ontworpen om de effectiviteit te beoordelen van immunomodulerende middelen om reeds gedifferentieerde menselijke moDC's te herprogrammeren in de richting van tolerantie. Bovendien valideert dit protocol de functionaliteit van geherprogrammeerde tolDC's om Tregs te genereren tegen autologe T-cellen die zijn geïsoleerd uit hetzelfde PBMC-monster. Dit in tegenstelling tot andere protocollen die tolerantie induceren tijdens differentiatie en/of tolDC's uitdagen met T-cellen van allogene donoren21. In dit protocol gebruiken we het gebruikelijke verdraagmiddel rapa als voorbeeld, maar tonen we ook de beperkte effectiviteit aan van met rapa behandelde moDC's om Tregs te genereren. In onze representatieve resultaten tonen we ook de werkzaamheid aan van andere veel voorkomende immunomodulerende behandelingen zoals IL-10, dexamethason en vitamine D3. We stellen ons voor dat dit protocol wordt gebruikt om potentieel effectievere tolDC-inducerende middelen te screenen tegen reeds gevestigde moDC's22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle monsters van menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) werden verkregen uit de Human Immunology Core van de University of Pennsylvania van geanonimiseerde donoren met voorafgaande goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB) van de University of Pennsylvania met toestemming van de patiënt.

Optioneel: Terwijl we bij deze methode vers geïsoleerde PBMC's gebruikten die waren verkregen uit een academisch laboratorium, kunnen PBMC's worden geïsoleerd uit volbloed of met leukaferese verrijkte bloedproducten. We raden aan om de dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode te gebruiken, aangezien dit een gevestigde en betrouwbare methode is die elders wordt beschreven23.

1. Isolatie van monocyten/T-cellen en moDC-differentiatie

  1. Isolatie van monocyten en T-cellen uit PBMC's - Dag 1
    1. Verkrijg 200 miljoen menselijke PBMC's van een gezonde donor. Bewaar de cellen in een tube van 15 ml en leg ze op ijs.
    2. Aliquot 50 ml scheidingsbuffer (geleverd in in de handel verkrijgbare scheidingskits) in een conische buis.
      OPMERKING: Separatiebuffer kan ook worden vervangen door DPBS met 2% foetaal runderserum (FBS) en 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA).
    3. Haal de PBMC-buis uit het ijs en vul deze met scheidingsbuffer. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten.
    4. Zuig het bovenstaande op met behulp van een serologische pipet van 10 ml. Resuspendeer de celpellet in 4 ml aanbevolen medium met behulp van een serologische pipet.
    5. Verdeel de suspensie in twee verschillende buisjes van 15 ml, voeg 2 ml per buis toe (5 × 107 cellen/ml per buisje). Label de ene buis "T" en de andere "Monocyten".
    6. Haal de Human Monocyte Isolation Kit op en volg het protocol van de fabrikant om monocyten te isoleren uit de met monocyten gelabelde buis.
    7. Haal de Human T Cell Isolation Kit op en volg het protocol van de fabrikant voor de tweede buis om T-cellen te isoleren.
  2. Uitplating van monocyten voor differentiatie en bevriezing van T-cellen - Dag 1
    1. Verwarm 50 ml moDC Culture Medium (tabel 1) minimaal 10 minuten voor op 37 °C.
    2. Centrifugeer de buisjes van 15 ml met verrijkte monocyten en het buisje van 15 ml met T-cellen uit stap 1.1 bij 250 g × gedurende 5 minuten.
    3. Aspiratie van het bovenlevende. Resuspendeer monocyten in 1 ml moDC-kweekmedium en T-cellen in T-celkweekmedium (tabel 1) door op en neer te pipetteren. Zorg ervoor dat de pellet goed wordt verspreid.
    4. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde cellenteller of handmatige hemacytometer met behulp van Trypan Blue-kleuring.
      OPMERKING: Voor de representatieve gegevens werden 10 miljoen T-cellen en 3 miljoen monocyten geïsoleerd.
    5. Neem de tube met monocyten en voeg 9 ml warm moDC Culture Medium toe aan de suspensie voor een eindvolume van 10 ml. Voeg vervolgens 100 μL elk 10 μg/ml GM-CSF en 10 μg/ml IL-4 voorraad toe voor een uiteindelijke concentratie van 100 ng/ml van zowel GM-CSF als IL-4 in de media. Breng de suspensie over in een petrischaaltje en label het als "moDC" (dag 1) en incubeer bij 37 °C met 5% CO2.
    6. Neem de T-celbuis en meng 1 ml T-cel Freeze Medium (tabel 1) met 1 ml T-celsuspensie. Verdeel in twee cryovials van 2 ml (1 ml/flacon); Sluit goed af (eindconcentratie van 5 miljoen cellen per injectieflacon). Plaats de cryovials in een vrieskamer met balanceerbuizen in ongebruikte putjes. Bewaar de kamer een nacht bij -80 °C en breng de cryovials vervolgens over naar een cryotank.
    7. Ververs op dag 4 het medium met de toevoeging van 5 ml vers moDC Culture Medium en voeg elk 100 μL GM-CSF- en IL-4-voorraad toe. Gedifferentieerde moDC's zullen op dag 7 klaar zijn.

2. Immunomodulerende geneesmiddelen toevoegen voor het genereren van tolerogene moDC's

  1. Stel de moDC-plaat in.
    1. Haal op dag 7 de gedifferentieerde moDC's uit de incubator en breng de moDC-celsuspensie over in een buis van 50 ml.
    2. Centrifugeer de suspensie bij 250 × g gedurende 5 min. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de celpellet in 1 ml warme moDC-kweekmedia door op en neer te pipetteren. Tel de cellen met een hemacytometer en verdun de cellen tot een concentratie van 3 × 105 cellen/ml in warm moDC-kweekmedium dat 100 ng/ml, gm-csf en IL-4 bevat.
    3. Voeg 3 × 104 cellen/putje in 100 μl toe aan het gewenste aantal putjes in een weefselkweekplaat met 96 putjes met platte bodem.
      OPMERKING: Voor representatieve resultaten hebben we in totaal 48 putjes gebruikt (vier condities in drievoud voorbereid op vier verschillende analyses in secties 3 en 4), maar dit kan worden aangepast voor maximaal 60 putjes. Vul alle resterende putjes met 100 μL/putje PBS om uitdroging te voorkomen, vooral de buitenste putjes. We raden aan om voor elke analysemethode verschillende platen te maken.
    4. Voeg 1 μL/putje immunomodulerende geneesmiddelen toe aan de gewenste putjes (hier 10 ng/ml rapa). Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C met 5% CO2.
      OPMERKING: Als u immunostimulatie op dag 8 gebruikt, bereid dan putjes voor op het immunomodulerende geneesmiddel, zowel met als zonder immunostimulatie. Het gebruik van immunostimulatie om moDC's te laten rijpen is optioneel.
  2. Ontdooi T-cellen.
    1. Haal op dag 8 twee cryovials uit de cryotank en ontdooi de cryovials in een warm kralenbad of waterbad bij 37 °C totdat de inhoud begint te smelten (in <3 min).
    2. Als de inhoud begint te smelten, brengt u de injectieflacons over naar een celkweekkap en spuit u 1 ml warme T-celkweekmedia in de injectieflacon om snel te ontdooien. Breng de volledige inhoud van de injectieflacon over in een buisje van 50 ml. Spoel de cryovials af met 1 ml T-celkweekmedium om ervoor te zorgen dat alle cellen in de buis worden overgebracht.
    3. Vul de suspensie bij met Flow Staining Solution (tabel 1) tot 15 ml. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 10 minuten en zuig het supernatant op. Resuspendeer vervolgens de pellet in 5 ml Flow Staining Solution en centrifugeer opnieuw.
    4. Zuig het bovenstaande op en resustribueer de cellen in 1 ml warm T-celkweekmedium. Tel de cellen met behulp van een hemacytometer.
      OPMERKING: De levensvatbaarheid moet in dit stadium >70% zijn; als er grote hoeveelheden dode cellen achterblijven, overbrengen naar een nieuwe buis, 10 ml celkleuringsoplossing toevoegen, centrifugeren bij 200 × g gedurende 5 min, resuspenderen in 1 ml T-celmedia en opnieuw tellen.
    5. Voeg 9 ml warm T-celkweekmedium toe om een eindvolume van 10 ml te maken. Breng de suspensie over in een petrischaaltje. Label het als "Ontdooide T-cellen" en incubeer een nacht bij 37 °C met 5% CO2 om de cellen te laten rusten.
  3. Was de moDC-plaat en voeg eventueel de immunostimulator toe.
    1. Centrifugeer op dag 8 de moDC-plaat (vanaf dag 7) gedurende 5 minuten bij 300 × g .
    2. Zuig het supernatant op, was met warme HBSS, herhaal de centrifugatie, aspireer opnieuw en suspendeer de cellen opnieuw in warm moDC-kweekmedium dat GM-CSF en IL-4 bevat (100 μL/putje).
      OPMERKING: Pas op dat u de cellen niet stoort. Kantel de plaat tijdens het afzuigen. Er kan ongeveer 10 μL in de put achterblijven.
    3. Als u immunostimulatie gebruikt, voeg dan 1 μL/putje van 100x voorraad LPS (of ander immunostimulerend middel) toe aan de gewenste putjes. Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C met 5% CO2.

3. Flowanalyse voor moDC (Validatie + Tolerantie)

  1. Flowanalyse voor validatie van moDC
    1. Bereid op dag 8 antilichaamcocktails voor het validatiepanel, gericht op de volgende markers: HLA-DR, CD14, dendritische celspecifieke C-type lectine (DC-SIGN), CD1c en CD40 zoals beschreven in tabel 2. Verdun alle antilichamen met vloeivlekkenoplossing.
      OPMERKING: Het paneel is ontworpen voor een 7-kanaals rood/blauwe laserflowcytometer.
    2. Haal de moDC-plaat uit de couveuse. Centrifugeer de plaat op 300 × g gedurende 5 min. Verwijder de supernatanten. Optioneel: Bewaar de supernatanten voor ELISA-analyse voor cytokines IL-10 en TNFα met behulp van in de handel verkrijgbare kits volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Voeg 200 μl/putje vloeikleuringsoplossing toe. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten op 300 × g .
    4. Zuig het supernatans op en voeg 50 μl/putje Fc-receptorbindende remmer-antilichaam verdund 1:200 toe in vloeikleuringsoplossing om niet-specifieke binding te blokkeren. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    5. Voeg 50 μl/putje van de bereide antilichaamcocktail van het validatiepanel toe.
    6. Bereid compensatieregelaars voor in de plaat of in buisjes van 1,5 ml door 50 μl compensatiekorrels te mengen met 50 μl van elk verdund antilichaam. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Compensatiekorrels worden hier gebruikt in plaats van cellen voor compensatie vanwege de mogelijk lage expressie van markers op moDC's.
    7. Wassen door centrifugeren op 300 × g gedurende 5 min, het bovenstaande verwijderen en opnieuw suspenderen in 200 μL Flow Staining Solution. Voer twee wasbeurten uit.
    8. Centrifugeer na de laatste wasbeurt opnieuw en suspendeer de cellen in 110 μl/putje Flow Staining Solution. De monsters zijn nu klaar voor flowcytometrie-analyse.
  2. Flowanalyse voor tolerogene moDC (Tolerance Panel)
    1. Bereid net als bij stap 3.1 op dag 8 antilichaamcocktails voor het tolerantiepanel, gericht op de volgende markers: CD86, PD-L1, DC-SIGN, CD1c, BTLA en CD40 (tabel 2).
    2. Herhaal de stappen 3.1.2-3.1.8 en vervang de antilichaamcocktail door de Tolerance Panel-cocktail .

4. Flowanalyse van T-cellen

  1. Combineer T-cellen met behandelde tolerogene moDC's.
    1. Haal op dag 9 de ontdooide T-cel petrischaal uit de broedmachine en breng alle T-cellen over in een buisje van 50 ml. Vul bij met Flow Staining Solution.
    2. Optioneel: Als u een analyse van de proliferatie van T-cellen uitvoert, verdeel de T-cellen dan in twee buisjes.
      1. Draai met de eerste tube gedurende 5 minuten naar beneden op 250 × g en verwijder het supernatant. Beits deze tube met celproliferatiekleurstof volgens de instructies van de fabrikant.
        OPMERKING: We hebben Fixable Viability Dye eFluor 670 gebruikt, waarvoor een incubatiestap van 30 minuten nodig is, gevolgd door twee wasstappen. We raden aan om conische tubes van 50 ml te gebruiken om celverlies te voorkomen en HBSS met 10% HIFBS te gebruiken om na het kleuren te wassen.
      2. Gebruik de tweede buis met ongekleurde T-cellen voor Treg-analyse. Spin, verminder op dezelfde manier bij 250 × g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant, suspendeer opnieuw in warme celkweekmedia en bewaar in de broedmachine tijdens het kleuringsproces. Als er geen T-celproliferatie nodig is, draai dan alle T-cellen naar beneden en vervang ze door warme T-celkweekmedia.
    3. Tel de cellen en verkrijg minstens 4 miljoen (voor alleen Treg-analyse) of 8 miljoen (voor Treg- en T-proliferatieanalyse).
    4. Haal de moDC-plaat uit de incubator met de resterende putjes, centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten en apirate de supernatanten. Voeg 200 μL/well-T-cellen toe bij 1,6 × 105 cellen/well. Voeg ongekleurde T-cellen toe voor Treg-analyseplaten en gekleurde T-cellen voor T-celproliferatieplaten.
      OPMERKING: Hierdoor blijft een T-cel tot moDC-verhouding van 5:1 behouden, aangezien de initiële 3 ×104 moDC's doorgaans licht uitzetten.
    5. Voeg 25 μL/ml anti-CD3/CD28-antilichaamcocktail toe aan alle groepen behalve negatieve controleputjes om T-cellen te stimuleren. Incubeer de plaat gedurende 72 uur bij 37 °C met 5% CO2 tot dag 12.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u gekleurde T-cellen gebruikt voor proliferatieanalyse en ongekleurd voor Treg-analyse.
  2. Treg flow analyse
    1. Kleuring van de oppervlaktemarkering
      1. Bereid op dag 12 antilichaamcocktails voor het Treg Panel (Tabel 2).
      2. Breng alle celsuspensies van de kweekplaat met 96 putjes over in een V-bodemplaat met Flow Staining Solution. Bewaar de supernatanten voor cytokineanalyse.
      3. Was de cellen 2x door centrifugeren (200 × g gedurende 5 minuten gevolgd door 200 μL Flow-kleurstofoplossing). Zet enkele cellen opzij voor compensatiebesturingselementen. Houd er een opzij voor FOXP3-kleuring en voor niet-gekleurde bedieningselementen.
        OPMERKING: We raden aan om 10 μL van alle monsters te kammen voorafgaand aan de laatste centrifuge in stap 4.2.1.3 om de nodige compensatiecontroles te verkrijgen. Dit levert een representatieve steekproef op van alle expressie op oppervlakteniveau van elke marker op de cellen.
      4. Centrifugeer na de tweede wasbeurt 5 minuten bij kamertemperatuur en aspireer bij 200 x g , voeg vervolgens 50 μl/well Fc-receptorbindende remmer-antilichaam toe (verdund 1:200 in Flow Staining Solution). Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
      5. Voeg 50 μL/putje van de bereide Treg Panel-antilichaamcocktail toe.
      6. Meng voor compensatiecontroles 50 μl ongekleurde compensatiecellen met 50 μl van elk afzonderlijk gekleurd antilichaam.
      7. Incubeer de plaat en de compensatieregelaars gedurende 1 uur bij 4 °C. Was de plaat één keer met Flow Stain Solution en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g .
      8. Kleuring met Live/Dead Near-IR-kleurstof verdund in HBSS (1:1.000) bij 200 μL/putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C.
      9. Was de plaat eenmaal met Flow Staining Solution (200 μL/well) op 300 × g gedurende 5 minuten.
    2. Bekleur met FoxP3 volgens de instructies van de fabrikant, waarvoor een incubatie van een nacht nodig is. Hieronder wordt een kort overzicht van het FoxP3-kleuringsprotocol beschreven.
      1. Bereid de FoxP3 fixatie-/permeabilisatiewerkoplossing voor volgens de instructies van de fabrikant. Meng 1 deel FoxP3 Fixatie/Permeabilisatieconcentraat met 3 delen FoxP3 Fixatie/Permeabilisatieverdunningsmiddel. Bereid 200 μL van de werkoplossing per monster.
      2. Incubeer alle monsters in 200 μl/putje van de werkende fixatie-/permeabilisatieoplossing. Laat 1 uur op 4 °C staan.
      3. Bereid 1x Permeabilisatiebuffer voor: Meng 1 deel 10x Permeabilisatiebuffer (verkregen uit een in de handel verkrijgbare kit) met 9 delen gedestilleerd water.
      4. Was de plaat 2x met 1x Permeabilization Buffer (200 μL/well) op 300 × g gedurende 5 min.
      5. Bemiddel met FoxP3-antilichaam (PE-Cy5.5, verdunning 1:300 in 1x permeabilisatiebuffer): Voeg 100 μL/putje van het verdunde FoxP3-antilichaam toe en incubeer een nacht bij 4 °C.
      6. Was de plaat 2x met 1x Permeabilization Buffer (200 μL/well) op 300 × g gedurende 5 min.
      7. Resuspendeer de cellen in 110 μl/putje van de vloeikleuringsoplossing.
      8. Voer flowcytometrie-analyse uit.
  3. Analyse van de proliferatie van T-cellen
    1. Bereid antilichaamcocktails voor het T-proliferatiepanel (tabel 2).
    2. Breng alle celsuspensies van de kweekplaat met 96 putjes over in een V-bodemplaat met Flow Staining Solution. Bewaar supernatanten voor cytokineanalyse.
    3. Was de cellen 2x door centrifugeren (200 × g gedurende 5 minuten gevolgd door 200 μL Flow-kleurstofoplossing). Zet enkele cellen opzij voor compensatiebesturingselementen. Houd er een opzij voor FOXP3-kleuring en voor niet-gekleurde bedieningselementen.
      OPMERKING: We raden aan om 10 μL van alle monsters te kammen voorafgaand aan de laatste centrifuge in stap 4.3.3 om de nodige compensatiecontroles te verkrijgen. Dit levert een representatieve steekproef op van alle expressie op oppervlakteniveau van elke marker op de cellen.
    4. Na de tweede wasbeurt centrifugeren (200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur) en opzuigen, en vervolgens 50 μL/well Fc-receptorbindende remmer-antilichaam toevoegen (verdund 1:200 in Flow Staining Solution). Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Voeg 50 μl/putje van de bereide T Proliferation Panel-antilichaamcocktail toe.
    6. Meng voor compensatiecontroles 50 μl ongekleurde compensatiecellen met 50 μl van elk afzonderlijk gekleurd antilichaam.
    7. Incubeer de plaat en de compensatieregelaars gedurende 1 uur bij 4 °C. Was de plaat één keer met Flow Stain Solution en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g .
    8. Kleuring met Live/Dead Near-IR-kleurstof verdund in HBSS (1:1.000) bij 200 μL/putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    9. Was de plaat eenmaal met Flow Staining Solution (200 μL/putje) op 300 × g gedurende 5 min.
    10. Voer flowcytometrie-analyse uit.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een protocol beschreven voor menselijke PBMC's, isoleer zowel CD3+ T-cellen als CD14+ -monocyten met behulp van in de handel verkrijgbare magnetische scheidingskits, differentieer monocyten in CD14-, HLA-DR+, CD141+, CD1c+ moDC's met behulp van GM-CSF en IL-4, behandel ze gedurende 24 uur en co-cultuur met autologe T-cellen met anti-CD3/CD28-stimulatie gedurende 72 uur. Een experimenteel schema is weergegeven in ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een betrouwbare en veelzijdige methode om de functionaliteit van immunomodulerende middelen te beoordelen om tolDC's uit moDC's te induceren en hun functionaliteit te valideren om Tregs te genereren uit autogene T-cellen ex vivo. Er zijn verschillende cruciale stappen in dit protocol. Ten eerste zijn monocyten notoir gevoelige cellen en moeten ze worden verkregen uit verse, niet eerder ingevroren PBMC's voor de beste resultaten. Monocyten moeten zo snel mogel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen de Human Immunology Core (HIC) van de University of Pennsylvania bedanken voor het verstrekken van verse menselijke PBMC's van donoren. De HIC wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH P30 AI045008 en P30 CA016520.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-158Algemene Cel Cultuur
1.5 mL Centrifuge TubeVWR77508-358Algemene Cel Cultuur
10 mL Serologische PipettenVWR414004-267Algemene Cel Cultuur
100-1000 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-164Algemene Cel Cultuur
15 mL Conische TubeVWR77508-212Algemene Cel Cultuur
20-200 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-160Algemene Cel Cultuur
2-MercaptoethanolMP Biomedical194834T Cel Cultuur
50 mL Conische TubeVWR21008-736Algemene Cel Cultuur
60 x 15 mm Dish, Nunclon DeltaThermo Fischer150326Algemene Cel Cultuur
96 Well Conische (V) Bodem Plaat, Niet-Behandeld OppervlakThermo Fischer277143Algemene Cel Cultuur
96 well Platte Bodem PlaatThermo Fischer161093Algemene Cel Cultuur
APC/Cyanine7 anti-human CD272 (BTLA) AntilichaamBiolegend344518Flow Cytometrie
Attune NxT (Rood/Blauw Laser, 7 Kanaal)Thermo FischerA24863Flow Cytometrie
BSAThermo Fischer15260-037Algemene Cel Cultuur
CD14 Monoclonal Antilichaam (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42Flow Cytometrie
CD1c Monoclonal Antilichaam (L161), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42Flow Cytometrie
CD209 (DC-SIGN) Monoclonal Antilichaam (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42Flow Cytometrie
CD25 Monoclonal Antilichaam (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Flow Cytometrie
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antilichaam (MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42Flow Cytometrie
CD4 Monoclonal Antilichaam (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Flow Cytometrie
CD40 Monoclonal Antilichaam (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Flow Cytometrie
CD40 Monoclonal Antilichaam (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Flow Cytometrie
CD69 Monoclonal Antilichaam (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Flow Cytometrie
CD86 Monoclonal Antilichaam (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Flow Cytometrie
CD8a Monoclonal Antilichaam (RPA-T8), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42Flow Cytometrie
Conische Bodem (V-well) 96 Well PlaatThermo Fischer2605Flow Cytometrie
Cryogene Flessen, 2 mLThermo Fischer430488T Cel Cultuur
Dimethylsulfoxide (DMSO), Sequenering GradeThermo Fischer20688Algemene Cel Cultuur
DPBSThermo Fischer14200166Algemene Cel Cultuur
EasySep Human Monocyte IsolatiekitStem Cell Technologies19359Cel Separatie
EasySep Human T Cel IsolatiekitStem Cell Technologies17951Cel Separatie
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000Cel Separatie
EDTAThermo FischerAIM9260GAlgemene Cel Cultuur
Falcon Ronde Bodem Polystyreen Tubes, 5 mLStem Cell Technologies38025Cel Separatie
Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal AntilichaamThermo Fischer14-9161-73Flow Cytometrie
Fetaal RundserumThermo FischerA5670701Algemene Cel Cultuur
Fixable Viability Dye eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Flow Cytometrie
Foxp3 / Transcriptie Factor Kleuring Buffer SetThermo Fischer00-5523-00Flow Cytometrie
FOXP3 Monoclonal Antilichaam (PCH101), PE-Cyanine5.5Thermo Fischer35-4776-42Flow Cytometrie
HBSSThermo Fischer14170-112Algemene Cel Cultuur
Heat Inactivated Fetaal RundserumThermo FischerA5670801Algemene Cel Cultuur
HEPES (1 M)Thermo Fischer15630106moDC Cel Cultuur
HLA-DR Monoclonal Antilichaam (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Flow Cytometrie
Human CD3/CD28/CD2 T Cel ActivatorStemCell Technologies10970T Cel Cultuur
Human GM-CSF Recombinant EiwitThermo Fischer300-03moDC Cel Cultuur
Human IL-10 ELISA Kit, Hoge GevoeligheidThermo FischerBMS215-2HSELISA
Human IL-4, Dierenvrij Recombinant EiwitThermo FischerAF-200-04moDC Cel Cultuur
Human PBMC (Frisse Geïsoleerde)UPenn HICN/ACellen
Human TNF alpha ELISA KitThermo FischerBMS223-4ELISA
Licht Microscoop (DMi1)Lucia391240Algemene Cel Cultuur
Lipopolysaccaride (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC Cel Cultuur
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dode Cel Kleuring KitThermo FischerL34975Flow Cytometrie
MEM Niet-Essentiële Aminozuren Oplossing (100x)Thermo Fischer1114

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson, A. E., et al. LPS activation is required for migratory activity and antigen presentation by tolerogenic dendritic cells. J Leukoc Bio. 85 (2), 243-250 (2009).
  4. Iberg, C. A., Hawiger, D. Natural and induced tolerogenic dendritic cells. J Immunol. 204 (4), 733-744 (2020).
  5. Ness, S., Lin, S., Gordon, J. R. Regulatory dendritic cells, T cell tolerance, and dendritic cell therapy for immunologic disease. Front Immunol. 12, 633436(2021).
  6. Ali, S., et al. Sources of type I interferons in infectious immunity: Plasmacytoid dendritic cells not always in the driver's seat. Front Immunol. 10, 778(2019).
  7. Fossum, E., et al. Targeting antigens to different receptors on conventional type 1 dendritic cells impacts the immune response. J Immunol. 205 (3), 661-673 (2020).
  8. Kedl, R. M., et al. Migratory dendritic cells acquire and present lymphatic endothelial cell-archived antigens during lymph node contraction. Nat Comm. 8 (1), 2034(2017).
  9. Chow, K. V., Sutherland, R. M., Zhan, Y., Lew, A. M. Heterogeneity, functional specialization and differentiation of monocyte-derived dendritic cells. Immun Cell Biol. 95 (3), 244-251 (2017).
  10. Johnson, R. K., Overlee, B. L., Sagen, J. A., Howe, C. L. Peripheral blood mononuclear cell phenotype and function are maintained after overnight shipping of whole blood. Sci Rep. 12 (1), 19920(2022).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction - A comparative study of human clinical-applicable DC. Clinl Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Navarro-Barriuso, J., et al. Vitamin D3-induced tolerogenic dendritic cells modulate the transcriptomic profile of T CD4+ cells towards a functional hyporesponsiveness. Front Immunol. 11, 599623(2021).
  13. Moorman, C. D., Sohn, S. J., Phee, H. Emerging therapeutics for immune tolerance: Tolerogenic vaccines T cell therapy, and IL-2 therapy. Front Immunol. 12, 657768(2021).
  14. Kenison, J. E., et al. Tolerogenic nanoparticles suppress central nervous system inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (50), 32017-32028 (2020).
  15. Neshat, S. Y., et al. Improvement of islet engrafts via Treg induction using immunomodulating polymeric tolerogenic microparticles. ACS Biomater Sci Eng. 9 (6), 3522-3534 (2023).
  16. Deak, P., Knight, R., Esser-Kahn, A. Robust tolerogenic dendritic cells via push/pull pairing of toll-like-receptor agonists and immunomodulators reduces EAE. Biomaterials. 286, 121571(2022).
  17. Møller, S. H., Wang, L., Ho, P. -C. Metabolic programming in dendritic cells tailors immune responses and homeostasis. Cell Mol Immunoly. 19 (3), 370-383 (2022).
  18. Adamik, J., et al. Distinct metabolic states guide maturation of inflammatory and tolerogenic dendritic cells. Nat Comm. 13 (1), 5184(2022).
  19. Hals, I. K., et al. Investigating optimal β-cell-preserving treatment in latent autoimmune diabetes in adults: Results from a 21-month randomized trial. Diabetes Obes Metab. 21 (10), 2219-2227 (2019).
  20. Gammon, J. M., et al. Engineering the lymph node environment promotes antigen-specific efficacy in type 1 diabetes and islet transplantation. Nat Comm. 14 (1), 681(2023).
  21. Sim, W. J., Malinarich, F., Fairhurst, A. -M., Connolly, J. E. Generation of immature, mature and tolerogenic dendritic cells with differing metabolic phenotypes. J Vis Exp. (112), e54128(2016).
  22. Jia, S., Kim, J., Esser-Kahn, A. P., Deak, P. High-throughput screening identification of novel immunomodulatory combinations for the generation of tolerogenic dendritic cells. Front Med. 10, 1298424(2024).
  23. Dinh, B., et al. Isolation and cryopreservation of highly viable human peripheral blood mononuclear cells from whole blood: A guide for beginners. J Vis Exp. (212), e66794(2024).
  24. Akkaya, B., et al. Regulatory T cells mediate specific suppression by depleting peptide-MHC class II from dendritic cells. Nat Immunol. 20 (2), 218-231 (2019).
  25. Stallone, G., et al. mTOR inhibitors effects on regulatory T cells and on dendritic cells. J Trans Med. 14 (1), 152(2016).
  26. Dahlqvist, G., et al. Modulatory effect of rapamycin and tacrolimus on monocyte-derived dendritic cells phenotype and function. Immunobiology. 226 (1), 152031(2021).
  27. Cimen Bozkus, C., Blazquez, A. B., Enokida, T., Bhardwaj, N. A T-cell-based immunogenicity protocol for evaluating human antigen-specific responses. STAR Protoc. 2 (3), 100758(2021).
  28. Nakayama, M., Michels, A. W. Determining antigen specificity of human islet infiltrating T cells in type 1 diabetes. Front Immunol. 10, 365(2019).
  29. Gregori, S., et al. Differentiation of type 1 T regulatory cells (Tr1) by tolerogenic DC-10 requires the IL-10-dependent ILT4/HLA-G pathway. Blood. 116 (6), 935-944 (2010).
  30. Taner, T., Hackstein, H., Wang, Z., Morelli, A. E., Thomson, A. W. Rapamycin-treated, alloantigen-pulsed host dendritic cells induce Ag-specific T cell regulation and prolong graft survival. Am J Transpl. 5 (2), 228-236 (2005).
  31. Baroja-Mazo, A., Revilla-Nuin, B., Ramírez, P., Pons, J. A. Immunosuppressive potency of mechanistic target of rapamycin inhibitors in solid-organ transplantation. World J Transplant. 6 (1), 183-192 (2016).
  32. Phillips, B. E., Garciafigueroa, Y., Trucco, M., Giannoukakis, N. Clinical tolerogenic dendritic cells: Exploring therapeutic impact on human autoimmune disease. Front Immunol. 8, 1279(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsMonocyte Derived Dendritic CellsImmunomodulatory AgentsRegulatory T CellsCD14 Positive MonocytesFlow CytometryMagnetic Cell SeparationT Cell ProliferationImmunomodulator TreatmentFoxp3 Treg Induction

Related Articles