Method Article

Een eenvoudige en efficiënte methode voor het testen van immunomodulerende middelen voor het genereren van tolerogene dendritische cellen uit menselijke CD14+ -monocyten

DOI:

10.3791/68159

⸱

April 11th, 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een procedure om het vermogen van farmacologische middelen te beoordelen om tolerogene dendritische cellen te genereren uit naïeve van monocyten afgeleide dendritische cellen in vitro en om hun potentie te valideren door autologe regulerende T-celgeneratie te genereren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tolerogene dendritische cellen (tolDC's) zijn een subset van dendritische cellen (DC's) waarvan bekend is dat ze naïeve T-cellen beïnvloeden in de richting van een regulerend T-cel (Treg) fenotype. TolDC's worden momenteel onderzocht als therapieën voor auto-immuniteit en transplantatie, zowel als celtherapie als als methode om tolDC's te induceren uit endogene DC's. Tot op heden is het aantal bekende middelen om tolDC's te induceren uit naïeve DC's echter relatief klein en is hun potentie om Tregs in vivo te genereren inconsistent geweest, met name therapieën die tolDC's induceren uit endogene DC's. Dit biedt de mogelijkheid om nieuwe verbindingen te verkennen om tolerantie te genereren.

Hier beschrijven we een methode om nieuwe immunomodulerende verbindingen in vitro te testen op monocyt-afgeleide DC's (moDC's) en hun functionaliteit te valideren om autologe Tregs te genereren. Eerst verkrijgen we PBMC's en isoleren we CD14+ monocyten en CD3+ T-cellen met behulp van in de handel verkrijgbare magnetische scheidingskits. Vervolgens differentiëren we monocyten in moDC's, behandelen we ze gedurende 24 uur met een gevestigde immunomodulator, zoals rapamycine, dexamethason, IL-10 of vitamine D3, en testen we hun verandering in tolerogene markers als validatie van het protocol. Ten slotte co-kweken we de geïnduceerde tolDC's met autologe T-cellen in aanwezigheid van anti-CD3/CD28-stimulatie en observeren we veranderingen in Treg-populaties en T-celproliferatie. We stellen ons voor dat dit protocol wordt gebruikt om de werkzaamheid van nieuwe immunomodulerende middelen te evalueren om reeds gedifferentieerde DC's te herprogrammeren naar tolDC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritische cellen (DC's) zijn cruciale bemiddelaars tussen aangeboren en adaptieve immuniteit. DC's, die zich voornamelijk bevinden in slijmvliezen, huid en lymfoïde weefsel, zijn de primaire antigeenpresenterende cellen (APC's)1. DC's nemen vreemde eiwitten op en verwerken en presenteren deze op belangrijke histocompatibiliteit (MHC) eiwitten tot naïeve T-cellen. DC's brengen specifiek MHC klasse II-eiwitten tot expressie, zoals humaan leukocytenantigeen-DR (HLA-DR) bij mensen. De activeringstoestand van de DC's bij blootstelling aan antigeen is van cruciaal belang voor de stroomafwaartse T-celrespons

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle monsters van menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) werden verkregen uit de Human Immunology Core van de University of Pennsylvania van geanonimiseerde donoren met voorafgaande goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB) van de University of Pennsylvania met toestemming van de patiënt.

Optioneel: Terwijl we bij deze methode vers geïsoleerde PBMC's gebruikten die waren verkregen uit een academisch laboratorium, kunnen PBMC's worden geïsoleerd uit volbloed of met leukaferese verrijkte bloedproducten. We raden aan om de dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode te gebru....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een protocol beschreven voor menselijke PBMC's, isoleer zowel CD3+ T-cellen als CD14+ -monocyten met behulp van in de handel verkrijgbare magnetische scheidingskits, differentieer monocyten in CD14-, HLA-DR+, CD141+, CD1c+ moDC's met behulp van GM-CSF en IL-4, behandel ze gedurende 24 uur en co-cultuur met autologe T-cellen met anti-CD3/CD28-stimulatie gedurende 72 uur. Een experimenteel schema is weergegeven in .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een betrouwbare en veelzijdige methode om de functionaliteit van immunomodulerende middelen te beoordelen om tolDC's uit moDC's te induceren en hun functionaliteit te valideren om Tregs te genereren uit autogene T-cellen ex vivo. Er zijn verschillende cruciale stappen in dit protocol. Ten eerste zijn monocyten notoir gevoelige cellen en moeten ze worden verkregen uit verse, niet eerder ingevroren PBMC's voor de beste resultaten. Monocyten moeten zo snel mogel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen de Human Immunology Core (HIC) van de University of Pennsylvania bedanken voor het verstrekken van verse menselijke PBMC's van donoren. De HIC wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH P30 AI045008 en P30 CA016520.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-158General Cell Culture
1.5 mL Centrifuge TubeVWR77508-358General Cell Culture
10 mL Serological PipetsVWR414004-267General Cell Culture
100-1000 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-164General Cell Culture
15 mL Conical TubeVWR77508-212General Cell Culture
20-200 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-160General Cell Culture
2-MercaptoethanolMP Biomedical194834T Cell Culture
50 mL Conical TubeVWR21008-736General Cell Culture
60 x 15 mm Dish, Nunclon DeltaThermo Fischer150326General Cell Culture
96 Well Conical (V) Bottom Plate, Non-Treated SurfaceThermo Fischer277143General Cell Culture
96 well Flat Bottom PlateThermo Fischer161093General Cell Culture
APC/Cyanine7 anti-human CD272 (BTLA) AntibodyBiolegend344518Flow Cytometry
Attune NxT (Red/Blue Laser, 7 Channel)Thermo FischerA24863Flow Cytometry
BSAThermo Fischer15260-037General Cell Culture
CD14 Monoclonal Antibody (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42Flow Cytometry
CD1c Monoclonal Antibody (L161), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42Flow Cytometry
CD209 (DC-SIGN) Monoclonal Antibody (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42Flow Cytometry
CD25 Monoclonal Antibody (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Flow Cytometry
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42Flow Cytometry
CD4 Monoclonal Antibody (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Flow Cytometry
CD69 Monoclonal Antibody (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Flow Cytometry
CD86 Monoclonal Antibody (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Flow Cytometry
CD8a Monoclonal Antibody (RPA-T8), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42Flow Cytometry
Conical Bottom (V-well) 96 Well PlateThermo Fischer2605Flow Cytometry
Cryogenic Vials, 2 mLThermo Fischer430488T Cell Culture
Dimethylsulfoxide (DMSO), Sequencing GradeThermo Fischer20688General Cell Culture
DPBSThermo Fischer14200166General Cell Culture
EasySep Human Monocyte Isolation KitStem Cell Technologies19359Cell Separation
EasySep Human T Cell Isolation KitStem Cell Technologies17951Cell Separation
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000Cell Separation
EDTAThermo FischerAIM9260GGeneral Cell Culture
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLStem Cell Technologies38025Cell Separation
Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal AntibodyThermo Fischer14-9161-73Flow Cytometry
Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670701General Cell Culture
Fixable Viability Dye eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Flow Cytometry
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SetThermo Fischer00-5523-00Flow Cytometry
FOXP3 Monoclonal Antibody (PCH101), PE-Cyanine5.5Thermo Fischer35-4776-42Flow Cytometry
HBSSThermo Fischer14170-112General Cell Culture
Heat Inactivated Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670801General Cell Culture
HEPES (1 M)Thermo Fischer15630106moDC Cell Culture
HLA-DR Monoclonal Antibody (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Flow Cytometry
Human CD3/CD28/CD2 T Cell ActivatorStemCell Technologies10970T Cell Culture
Human GM-CSF Recombinant ProteinThermo Fischer300-03moDC Cell Culture
Human IL-10 ELISA Kit, High SensitivityThermo FischerBMS215-2HSELISA
Human IL-4, Animal-Free Recombinant ProteinThermo FischerAF-200-04moDC Cell Culture
Human PBMC (Freshly Isolated)UPenn HICN/ACells
Human TNF alpha ELISA KitThermo FischerBMS223-4ELISA
Light Microscope (DMi1)Lucia391240General Cell Culture
Lipopolysaccaride (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC Cell Culture
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitThermo FischerL34975Flow Cytometry
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fischer11140050T Cell Culture
Penicillin-Streptomycin (100x)Thermo Fischer15140122General Cell Culture
Pipette ControllerVWR77575-370General Cell Culture
Rapamycin, 98+%Thermo FischerJ62473.MFmoDC Cell Culture
RPMI 1640 with GlutamaxThermo Fischer61870-036General Cell Culture
Separation BufferStem Cell Technologies20144Cell Separation
T Cell Stimulation Cocktail (500x)Thermo Fischer00-4970-93T Cell Culture
UltraComp eBead Plus Compensation BeadsThermo Fischer01-3333-41Flow Cytometry
Variable Pipette SetFischer Scientific05-403-152General Cell Culture

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsMonocyte Derived Dendritic CellsImmunomodulatory AgentsRegulatory T CellsCD14 Positive MonocytesFlow CytometryMagnetic Cell SeparationT Cell ProliferationImmunomodulator TreatmentFoxp3 Treg Induction

Related Articles