Methodenartikel

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

DOI:

10.3791/68171

⸱

8 juli 2025

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes < 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De complexe laminaire structuur van het netvlies vormt een aanzienlijke uitdaging voor uitgebreide ruimtelijke moleculaire mapping. De huidige technieken voor het onderzoeken van weefselarchitectuur en moleculaire interacties worden beperkt door technische beperkingen die ruimtelijke relaties in gevaar brengen of moleculaire profilering beperken. Bestaande methoden zoals dwarsdoorsnede, preparaten voor hele monturen, chemische of mechanische dissociaties en dikke vlakdoorsneden verstoren de integriteit van het weefsel, verliezen kritische ruimtelijke context of, meestal, zijn gewoon onverenigbaar met hoogdimensionale ruimtelijke sequencingplatforms.

Deze studie introduceert een cryosectietechniek die dunne (<20 μm) en gezichtssecties produceert met behoud van de ruimtelijke relaties die essentieel zijn voor het in kaart brengen van retinale celverdelingen. De methode behoudt de RNA-integriteit en weefselarchitectuur, terwijl secties worden gegenereerd die compatibel zijn met moleculaire analyseplatforms met hoge doorvoer. De RNA-integriteit blijft behouden omdat deze techniek vers ingevroren weefsel snijdt, wat fabrikanten van ruimtelijke transcriptomische platforms officieel ondersteunen ten opzichte van gepostfixeerd weefsel. We valideren deze aanpak met behulp van meerdere moleculaire profileringsmethoden, waarbij we een succesvolle integratie aantonen met zowel handmatige RNAscope in situ hybridisatie (12 doelen) als Xenium ruimtelijke sequencing (300 doelen). De techniek behoudt consequent de weefselarchitectuur van verschillende monsters, terwijl de RNA-kwaliteit behouden blijft die geschikt is voor deze gevoelige moleculaire toepassingen.

Deze methodologische vooruitgang maakt nieuw onderzoek mogelijk naar de verdelingen van het netvliesceltype, moleculaire gradiënten over laminae en ruimtelijke aspecten van retinale pathologie. De veelzijdigheid van de techniek en de compatibiliteit met moderne ruimtelijke biologieplatforms vormen een basis voor een uitgebreide moleculaire kartering van de complexe cellulaire organisatie van het netvlies.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale neuronen hebben ruimtelijke topografieën ontwikkeld die informatieverwerking vergemakkelijken, wat bij veel soorten resulteert in grove specialisaties zoals fovea's, gebiedscentralisatie en strepen 1,2,3. In tegenstelling tot de welbegrepen diversiteit van de fotoreceptordistributie, is de ruimtelijke specialisatie van de retinale output, gevormd door Retinal Ganglion Cells (RGC's), minder duidelijk. Voor de meeste soorten is de ruimtelijke verspreiding van de RGC's volledig onbekend. Zelfs voor de muis, misschien wel een van de best bestudeerde gewervelde modellen van visuele functie, is minder dan een derde van de RGC-subtypes in kaart gebracht met traditionele technieken zoals immunohistochemie van de hele berg2. Deze technieken mislukken omdat de meeste RGC-subtypes geen specifieke genetische marker hebben. In plaats daarvan is hoger-dimensionale moleculaire informatie nodig voor nauwkeurige RGC-classificatie4 via single-cell RNA-sequencing 5,6,7.

Informatie over de verspreiding van RGC is belangrijk, omdat de topografieën die bij de muis zijn waargenomen duidelijke ecologische correlaties aantonen tussen RGC-plaatsing en visuele functie. Het meest in het oog springende voorbeeld is de ruimtelijke organisatie van de ɑON-S RGC's, die clusteren in het temporale netvlies. Deze regio ontvangt het beeld van de prooi8 tijdens jachtgedrag9. Het wordt ook algemeen erkend dat RGC-subtypes differentieel vatbaar zijn voor ziekte10, en sommige veel voorkomende ziekten zoals glaucoom hebben een ruimtelijke component voor hun progressie11,12. Een belangrijke vraag waar het veld voor staat is dus: wat is de ruimtelijke organisatie van RGC-subtypes als ze het netvliesbetegelen 1? Deze lacune in kennis beperkt momenteel de inzichten in ander visueel gestuurd gedrag en ziekten.

De focus van de huidige methode is om deze moleculaire kennislacunes aan te pakken door middel van een en face cryosectioning-benadering die ruimtelijke relaties behoudt en tegelijkertijd moleculaire analyse met hoge resolutie mogelijk maakt. Moderne platforms voor ruimtelijke sequencing, zoals Xenium van 10X, vertegenwoordigen een transformatieve vooruitgang in moleculaire profilering en bieden ongekende inzichten in weefselorganisatie en cellulaire interacties. Deze platforms, samen met low-plex technieken zoals RNAscope en ruimtelijk barcoded sequencingmethoden zoals Visium, delen echter een kritieke technische beperking: ze vereisen weefselsecties die dunner zijn dan 20 μm. Deze vereiste vormt een bijzondere uitdaging voor netvliesweefsel, dat doorgaans 200 μm dik is.

Tot op heden hebben onderzoekers voornamelijk vertrouwd op dwarsdoorsneden bij het toepassen van deze technologieën op netvliesweefsel13. Hoewel dwarsdoorsneden effectief moleculaire relaties binnen nucleaire en plexiforme lagen onthullen in de context van verticale circuits, zijn ze minder geschikt om de bredere ruimtelijke verdelingen van retinale cellen vast te leggen die preparaten van hele monturen traditioneel hebben onthuld8. Recente pogingen tot doorsnede van de pijler werden beperkt door beperkingen in de dikte van de doorsneden, waarbij studies slechts 50 μm doorsneden bereiktendie 14 te dik waren voor moderne high-plex moleculaire analyseplatforms. Andere historische benaderingen die zijn ingezet om individuele retinale lamina te bestuderen, maar die niet compatibel zijn met moderne ruimtelijke sequencingtechnieken, zijn onder meer enzymatische spijsvertering, gecombineerd met mechanische dissociatie 15,16, of mechanische dissociaties alleen 17,18,19,20. Hier presenteren we een nieuwe cryosectietechniek die speciaal is ontworpen voor dun, gebogen netvliesweefsel dat deze beperkingen overwint. In het kort omvat onze methode het extraheren van de achterste oogkamer, het creëren van reliëfsneden door zowel het netvlies als de sclera, het afvlakken van het weefsel met het binnenste netvlies tegen een dekglas, het inbedden van het weefsel in OCT en ten slotte cryosectie van het buitenste naar het binnenste netvlies (Figuur 1). Onze methode handhaaft ruimtelijke relaties en produceert secties die dun genoeg zijn (<20 μm) voor hoogdimensionale ruimtelijke biologie-instrumenten, zoals gevalideerd door succesvolle implementatie met zowel handmatige RNAscope (12 doelen) als het geautomatiseerde Xenium-platform (300 doelen), wat compatibiliteit aantoont op verschillende complexiteitsschalen van moleculaire analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met en met goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en relevante institutionele richtlijnen die deze methoden goedkeuren onder toezicht van de Universiteit van Colorado. Alle stappen met betrekking tot het gebruik van dieren en euthanasie moeten voldoen aan de lokale regelgeving en experimentele vergunningen. Alle muizen werden met standaardzorg gehuisvest in een geaccrediteerde veterinaire faciliteit met vrije toegang tot voedsel en water. Deze cryosectietechniek bouwt voort op standaard retinale dissectietechnieken die zijn geoptimaliseerd voor C57BL/6-muizen. Om deze techniek te ontwikkelen, werden ongeveer 150 muizen van beide geslachten, variërend in leeftijd van 6 weken tot 2 jaar, gebruikt. De uiteindelijke techniek die hier wordt gecommuniceerd, heeft een slagingspercentage van ongeveer 95%, ongeacht de demografische kenmerken van de muis. Houd er rekening mee dat als een temperatuur voor een stap niet wordt vermeld, een kamertemperatuur van ongeveer 20-25 °C wordt verwacht. Oplossingen zonder vermelde temperatuur werken als ze gekoeld zijn en daarom is het werktemperatuurbereik voor oplossingen 4-25 °C.

1. Ontleding

  1. Verdoof de muis met isofluraan en valideer anesthesie met teenknijpen, of volg de lokale regels en voorschriften om anesthesie op te wekken en te bevestigen, aangezien andere methoden even geschikt zijn.
  2. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie: zet het hoofd van de muis vast met één hand en de basis van de staart met de andere en trek vervolgens in tegengestelde richting. Secundaire euthanasie uitvoeren door onthoofding.
  3. Markeer de temporale pool van de wereldbol op het hoornvlies om de oriëntatie te behouden en een zwak punt voor dissectie te creëren (Figuur 2B en Figuur 3A).
  4. Dompel de bol onder in Ames-oplossing in een schaaltje met een stuk filterpapier (groter dan de bol maar kleiner dan de schaal).
    OPMERKING: Het gebruik van andere oplossingen dan Ames zal leiden tot verslechtering van het netvlies (Figuur 4A).
  5. Gebruik een scherpe #5 tang en irisschaar om voorzichtig alle spieren, fascia, vaatstelsel en zenuwen van de bol te verwijderen (Figuur 2E, F en Figuur 3B) zonder de sclera te doorboren (Figuur 2D).
    OPMERKING: Het aanprikken van de sclera tijdens deze stap (Figuur 4B) zal resulteren in een weefselhernia (Figuur 4C).
  6. Plaats de punt van een irisschaarblad loodrecht op het hoornvliesmerk, met een schaar evenwijdig aan de kop van de oogzenuw. Prik de wereldbol op deze positie door (Figuur 3C,D).
  7. Maak een enkele schone incisie door het hoornvlies en de limbus, verder in de sclera en het netvlies in de richting van de oogzenuwkop (Figuur 3E).
    OPMERKING: Snijd de oogzenuwkop niet door, anders gaan de sclera en het netvlies uit elkaar. De exacte lengte van deze incisie is afhankelijk van de grootte van de wereldbol, die sterk kan variëren tussen oude en jonge dieren, evenals in sommige Cre-lijnen ten opzichte van dieren van het wilde type. We raden aan om ongeveer 1 mm weefsel te laten tussen het diepste deel van deze incisie en de oogzenuwkop.
  8. Plaats het mes loodrecht op de eerste snede (Figuur 3F,G), ongeveer 1 mm achter de limbus (Figuur 2C). Begin radiaal door de sclera en het netvlies te snijden.
    1. Zorg voor een consistente snijlijn posterieur en evenwijdig aan de limbus door een scherpe tang te gebruiken om de wereldbol te geleiden en te draaien. Hoewel het minimaliseren van snijwonden ideaal is, moet u prioriteit geven aan het handhaven van een schoon radiaal pad. Als het netvlies en de sclera uit elkaar gaan, verplaats dan het irisschaarblad om ze samen te knippen.
      OPMERKING: Snijden in de limbus kan leiden tot scheiding van het netvlies van de sclera tijdens lensextractie. Kleine knipjes en rotaties zijn acceptabel. Vermijd het uitoefenen van kracht om het vast te zetten, omdat dit het risico op netvlieshernia inhoudt.
    2. Schat de afstand van 1 mm naar achteren met behulp van de middelste breedte van het irisschaarblad. Als je het niet zeker weet, ga dan naar een meer achterste positie, omdat de verbinding van het netvlies met de limbus naar binnen buigt. Een meer achterwaartse snede vergemakkelijkt vlakke netvliesextractie.
  9. Na het voltooien van de radiale snede evenwijdig aan de limbus, inspecteert u op resterende netvliesverbindingen. Knip deze voorzichtig door met een irisschaar totdat de voorste en achterste boldelen gescheiden zijn.
  10. Gebruik twee paar scherpe #5-tangen om het voorste en achterste deel van de bol voorzichtig te scheiden (Figuur 3H). Bij oudere muizen kunnen transparante vezels de lens verbinden met de retinale cup; Knip deze voorzichtig door met een irisschaar en minimaliseer de scheiding tussen netvlies en sclerus.
    OPMERKING: De lens moet aan de limbus en het hoornvlies blijven zitten.
  11. Gebruik het filterpapier als steunplatform en knip het netvlies met een irisschaar in een patroon van een klaverblad (ook bekend als ijzeren kruis) (Figuur 3I-K).
    OPMERKING: De incisies in het klaverblad moeten korter zijn dan de primaire oriënterende incisie die aanvankelijk door de limbus is gemaakt als registratie van de oriëntatie met deze plak gewenst is. We raden aan om de grootte van deze drie nieuwe radiale incisies te verkleinen tot ongeveer 1-2 mm korter dan de primaire incisie. Als een ander kenmerk, zoals de opsin-gradiënt, wordt gebruikt voor oriëntatie, is het aangewezen dat alle incisies even lang zijn, terwijl er altijd ongeveer 1 mm weefsel tussen het diepste deel van de incisie en de oogzenuwkop behouden blijft om scheiding tussen het netvlies en de sclera te voorkomen.
  12. Herhaal de dissectie met het tweede oog. Om necrose tot een minimum te beperken, moet het tweede oog binnen 10 minuten na euthanasie volledig worden verwijderd.

2. Cryopreservatie

  1. Bereid een plastic wegwerppipet voor door de punt af te snijden om een opening te maken die groter is dan het ontlede netvlies en de sclera (hierna het netvlies genoemd).
  2. Zuig het netvlies voorzichtig in de pipet en leg het op een glazen microscoopglaasje. Verwijder met een laboratoriumdoekje voorzichtig overtollige Ames-oplossing rond het netvlies totdat deze niet meer vrij kan zweven en kan worden afgeplat.
  3. Gebruik twee scherpe #5 pincetten om het netvlies uit te vouwen en plat te plaatsen met de binnenste oogschelp naar boven gericht. Afhankelijk van de grootte van het weefsel, maakt u in elk klaverbladsegment 0,5-2 mm reliëfsneden om het netvlies verder af te vlakken, waarbij u het weefsel zorgvuldig aanpast om vouwen te voorkomen (Figuur 5A). Verwijder de extra Ames-oplossing totdat er vloeistof alleen naast het netvlies achterblijft.
  4. Druk met behulp van een dekglaasje snel op het netvlies (Figuur 5B) met de omringende vloeistof, zodat de buitenste sclera naar boven wijst en de binnenste oogschelp contact maakt met het dekglaasje, dat wil zeggen dat de retinale ganglioncellen naar boven wijzen (Figuur 5C).
  5. Controleer of het netvlies niet gevouwen is en pas het zo nodig aan; voeg Ames-oplossing toe voor eenvoudigere manipulatie. Omdat overtollige vloeistof ervoor zorgt dat het weefsel gaat krullen, gebruikt u een laboratoriumdoekje om alle overtollige Ames-oplossing te verwijderen en laat u het netvlies 5-10 seconden aan de lucht drogen.
    OPMERKING: Als u geen korte droging aan de lucht toestaat, kan dit willekeurig leiden tot weefsel-OCT-scheiding tijdens cryosectie. Overmatig drogen aan de lucht kan leiden tot weefselbeschadiging door zoutkristallen.
  6. Breng OCT-medium aan om het netvlies te bedekken en gebruik een tang om deze laag gelijkmatig over het dekglaasje te verdelen, waardoor retinale flotatie wordt voorkomen. Wacht 30 s totdat het OCT-medium het netvlies heeft doorgedrongen.
  7. Bevries het netvlies in OCT (Figuur 5D) met behulp van een metalen plaat die indirect is gekoeld met vloeibare stikstofdamp of door deze in direct contact te brengen met droogijs.
  8. Bewaar het netvlies op droogijs bij onmiddellijk gebruik of in een vriezer van -80 °C in een plastic zak of container met droogmiddelen als u het voor langere tijd bewaart.

3. Cryosectie

  1. Stel de cryostaatkamer in op -18 °C en de fase op -12 °C. Plaats het netvlies in de kamer om in evenwicht te komen met de temperatuur.
  2. Maak een OCT-koepel op de klauwplaat. Als u hetzelfde model cryostaat gebruikt, zorg er dan voor dat deze koepel de binnenste 2-3 annuli beslaat. Eenmaal ingevroren, snijdt u de OCT-koepel bij om een plat podiumoppervlak te creëren dat evenwijdig aan het blad op de boorkop loopt om de laminaire vlakheid te behouden (Figuur 6A).
  3. Maak of noteer de oriëntatiegids die de klauwplaat relateert aan de cryostaatfase.
    OPMERKING: Op het model cryostaat dat we aanbevelen, is de oriëntatiegids een centrale lijn die is geëtst in de 12-uurspositie boven de boorkophouder, terwijl de boorkop zelf een driehoekige uitsparing heeft op de buitenste annuli. Samen noemen we deze kenmerken de oriëntatiegids. Als uw cryostaat dergelijke kenmerken niet heeft, raden we u aan een permanente marker te gebruiken om uw eigen marker te maken.
  4. Bereid het netvlies voor op overdracht met behulp van een scheermesje door overtollige OCT rond het netvlies lateraal te verwijderen en vervolgens het netvlies voorzichtig van het dekglaasje te scheiden om het mobiel te maken.
  5. Verwijder de boorkop van de tafel en breng een kleine druppel vloeibare OCT aan op het voorbereide vlakke oppervlak van de OCT-fase.
  6. Plaats het netvlies rechtstreeks op de vloeibare OCT. Gebruik een voorgekoeld (-18 °C) glasplaatje om het netvlies 10-30 s tegen het OCT-stadium te houden totdat het bevroren is.
  7. Breng extra OCT aan op het netvlies en het stadium om volledige hechting te garanderen. Bevries op het snelle vriesgebied van de cryostaat. Incubeer het netvlies/OCT-stadium in de cryostaat gedurende minimaal 30 minuten om een volledige hechting te garanderen.
  8. Begin met secties:
    1. Knip het overtollige OCT voorzichtig weg totdat het netvlies zichtbaar wordt (Figuur 6B). Gebruik het scheermesje om overtollige OCT van blokranden te verwijderen.
      OPMERKING: Trek de tafel altijd in voordat u de sectie hervat na handmatig, radiaal bijsnijden. Voor het bijsnijden van plakjes en gezicht raden we aan om dezelfde snijdikte te gebruiken als voor de gewenste secties; De trimdikte kan echter tussen 10 μm en 100 μm liggen, afhankelijk van de voorkeur van de gebruiker.
    2. Ga door met trimmen terwijl u secties inspecteert op de aanwezigheid van sclera. Wanneer de sclera zichtbaar is, past u de hoek van de tafel naar behoefte aan. Ga door met trimmen totdat de secties een gelijkmatige scleraverdeling vertonen, wat zorgt voor een optimale vlakheid en een maximaal klaverbladoppervlak in elke sectie.
    3. Verzamel weefselcoupes (Figuur 6C).
      OPMERKING: De optimale dikte hangt af van de uiteindelijke test die wordt uitgevoerd en moet voldoen aan dit stroomafwaartse protocol. Als er bijvoorbeeld 10X Xenium wordt gebruikt, adviseren wij 20 μm dikke secties. Terwijl voor 10X Visium 15 μm dikke secties meer geschikt zijn.
    4. Gebruik voorgekoelde dia's en manipuleer de secties op hun plaats met behulp van twee penselen.
    5. Plaats een vinger onder de sectie totdat de OCT smelt en het weefsel hecht (ongeveer 5 s).
    6. Leg het glaasje terug op een koud oppervlak om het weefsel opnieuw in te vriezen.
      OPMERKING: Bij het verzamelen van secties in kleine gebieden (bijv. voor Xenium) kunnen meerdere vries-dooicycli nodig zijn. Hoewel dit geen invloed heeft op op sondes gebaseerde technieken, kan het wel van invloed zijn op de RNA-kwaliteit voor onbevooroordeelde sequencing-benaderingen.
  9. Bewaar de objectglaasjes op droogijs voor onmiddellijk gebruik, bij -20 °C voor RNAscope de volgende dag en bij -80 °C voor langdurige opslag.

4. Doeldetectie en microscopie

OPMERKING: Hoewel de techniek compatibel is met andere moleculaire profileringsmethoden, beschrijven we RNAscope als een gevalideerd voorbeeld.

  1. Voorbereiding van het monster:
    1. Haal de glaasjes uit de opslag van -80 °C en verwarm ze gedurende 1 uur bij -20 °C.
      OPMERKING: Objectglaasjes kunnen maximaal 12 uur voor aanvang van de rest van deze procedure bij -20 °C worden bewaard, maar mogen niet te lang bij -20 °C worden bewaard om RNA-degradatie te minimaliseren.
  2. Verwarm de dia's snel gedurende 10 s op 37 °C.
  3. Fixeer het weefsel door de objectglaasjes 30 minuten bij kamertemperatuur onder te dompelen in verse 4% PFA.
  4. Was de dia's grondig met 1x PBS.
  5. Weefseldehydratatie door middel van ethanolreeksen: 50% ethanol gedurende 5 min, 70% ethanol gedurende 5 min, 100% ethanol gedurende 5 min, verse 100% ethanol gedurende 5 min.
    OPMERKING: Dit is een cruciale kwaliteitscontrolestap voor weefselmontage. Als weefselloslating optreedt tijdens uitdroging, duidt dit op OCT-overlap van aangrenzende secties tijdens de montage. Zorgvuldig bijsnijden van overtollig OCT tijdens het snijden en monteren voorkomt dit probleem.
  6. Voorbereiding van de barrière:
    1. Laat de dia's op het werkblad 5 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
    2. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een barrière rond elk weefselgedeelte te trekken. Laat de huidplak 5 minuten volledig drogen bij kamertemperatuur.
  7. Moleculaire detectie:
    1. Breng de Protease IV-behandeling aan voor weefselpermeabilisatie.
    2. Ga verder met het protocol van de fabrikant voor hybridisatie van de doelsonde (2 uur bij 40 °C), signaalversterkingsstappen (drie opeenvolgende versterkers), fluorofoordetectie (vier opeenvolgende rondes voor drie-plex kleuring).
  8. Beeldvorming:
    1. Voer DAPI-nucleaire tegenkleuring uit voordat elk afdekglas wordt gemonteerd.
    2. Monteer het dekglas met behulp van antifade montagemedium.
    3. Afbeelding met behulp van fluorescentiemicroscopie met de juiste filtersets.
    4. Voor multiplexdetectie legt u hetzelfde veld vast in alle vier de detectierondes voor computationele registratie.
    5. Zorg voor consistente belichtingsinstellingen tussen de rondes voor een nauwkeurige signaalvergelijking.
      OPMERKING: Raadpleeg de protocollen van de fabrikant voor volledige details over de implementatie van RNAscope (zie de materiaaltabel). Voor volledig geautomatiseerde platforms zoals Xenium volgt u alle protocolstappen van de fabrikant precies zoals voorzien. Houd er voor alle protocollen rekening mee dat falen als gevolg van weefselloslating hoogstwaarschijnlijk zal optreden tijdens een vroege uitdrogings- of wasstap, vanwege OCT-overlap, zoals vermeld in dit voorbeeldprotocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Succesvolle implementatie van dit protocol produceert intacte en face retinale secties die geschikt zijn voor meerdere moleculaire profileringsbenaderingen, terwijl de ruimtelijke relaties over het netvliesoppervlak behouden blijven. We demonstreren het nut van het protocol door middel van een systematische validatiebenadering, waarbij we evolueren van conventionele immunohistochemie via handmatige multiplex-RNA-detectie naar geautomatiseerde moleculaire profilering met hoge doo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde methode pakt een kritieke technische barrière in de ruimtelijke biologie van het netvlies aan door de productie mogelijk te maken van dunne en gezichtssecties die geschikt zijn voor moderne moleculaire profileringstechnologieën. De meest kritieke stappen in het protocol zijn gericht op weefselbehandeling tijdens de eerste dissectie en de nauwkeurige regeling van temperatuur en hydratatie tijdens cryopreservatie en sectie. Succesvolle implementatie is met n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken de Human Immune Monitoring Shared Resource (RRID:SCR_021985) binnen het University of Colorado Cancer Center (P30CA046934) voor hun deskundige hulp bij het bedienen van het 10X Xenium-platform. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01EY035293).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ames′ MediumSigma-AldrichA1420-10X1LSpecifiek merk niet belangrijk
Beadsmith Thread Zap, Thread BurnerThe Beadsmith Store7.90524E+11Alternatieve cauterisatiemiddelen mogen worden gebruikt
CryostatLeicacm1950Belangrijke overwegingen zijn apart regelbare volume versus stagestemperatuur.
Dry IceNANANA
Fine Science Tools Dumont #5 ForcepsFine Science Tools 1129500NC9889584Specifiek merk niet belangrijk
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisher Scientific23-730-571Specifiek merk niet belangrijk
Fisherbrand High Precision Straight Slender Fine Point Tweezers/ForcepsFisher Scientific12-000-127Specifiek merk niet belangrijk
Fisherbrand Standard Dissecting ScissorsFisher Scientific08-951-20Specifiek merk niet belangrijk
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific22-037-246Specifiek merk niet belangrijk
Integra Miltex Noyes Iris ScissorsIntegra Miltex 18151012-460-278Specifiek merk niet belangrijk
Olympus IX81 spinning disk epifluorescence microscopeVoor figuur 7
RNAscope HiPlexACDBio
Rectangular Cover GlassesFisher Scientific12-541-033Specifiek merk niet belangrijk
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014-25GSpecifiek merk niet belangrijk
Thermo Scientific Nunc Glass Bottom DishesFisher Scientific12-567-400Specifiek merk niet belangrijk
World Precision Instrument Precision Stereo Zoom Trinocular Microscope (IV) on Boom StandWorld Precision Instrument PZMTIVBS50-253-8607Specifiek merk niet belangrijk
Zeiss Axio Imager.M2 epifluorescence microscope Optisch sectioneren ingeschakeld (voor figuur 8)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Heukamp, A. S., Warwick, R. A., Rivlin-Etzion, M. Topographic variations in retinal encoding of visual space. Annu Rev Vis Sci. 6, 237-259 (2020).
  3. Collin, S. P. A web-based archive for topographic maps of retinal cell distribution in vertebrates. Clin Exp Optom. 91 (1), 85-95 (2008).
  4. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. GraSP gene targets to hierarchically infer sub-classes with CuttleNet. bioRxiv. , (2024).
  5. Rheaume, B. A., et al. Single cell transcriptome profiling of retinal ganglion cells identifies cellular subtypes. Nat Commun. 9 (1), 2759(2018).
  6. Tran, N. M., et al. Single-cell profiles of retinal ganglion cells differing in resilience to injury reveal neuroprotective genes. Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).
  7. Yan, W., et al. Mouse retinal cell atlas: Molecular identification of over sixty amacrine cell types. J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).
  8. Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Curr Biol. 24 (3), 310-315 (2014).
  9. Holmgren, C. D., et al. Visual pursuit behavior in mice maintains the pursued prey on the retinal region with least optic flow. eLife. 10, e70838(2021).
  10. Tapia, M. L., Nascimento-dos-Santos, G., Park, K. K. Subtype-specific survival and regeneration of retinal ganglion cells in response to injury. Front Cell Dev Biol. 10, 956279(2022).
  11. Berchuck, S. I., Mukherjee, S., Medeiros, F. A. Estimating rates of progression and predicting future visual fields in glaucoma using a deep variational autoencoder. Sci Rep. 9 (1), 18113(2019).
  12. de Gainza, A., et al. The trajectory of glaucoma progression in 2-dimensional structural-functional space. Ophthalmol Glaucoma. 3 (6), 466-474 (2020).
  13. Choi, J., et al. Spatial organization of the mouse retina at single cell resolution by MERFISH. Nat Commun. 14 (1), 4929(2023).
  14. Kremers, L., et al. Super-resolution STED imaging in the inner and outer whole-mount mouse retina. Front Ophthalmol. 3, 1126338(2023).
  15. Simon, P., Thanos, S. Combined methods of retrograde staining, layer-separation and viscoelastic cell stabilization to isolate retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci Methods. 83 (2), 113-124 (1998).
  16. Lindqvist, N., Vidal-Sanz, M., Hallböök, F. Single cell RT-PCR analysis of tyrosine kinase receptor expression in adult rat retinal ganglion cells isolated by retinal sandwiching. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 75-83 (2002).
  17. Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
  18. Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. -P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions: Molecular clock in rat photoreceptors. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
  19. Jaeger, C., et al. Circadian organization of the rodent retina involves strongly coupled, layer-specific oscillators. FASEB J. 29 (4), 1493-1504 (2015).
  20. Hecht, R. M., Shi, Q., Garrett, T. R., Sivyer, B., Morgans, C. Split retina as an improved flatmount preparation for studying inner nuclear layer neurons in vertebrate retina. J Vis Exp. (203), e65757(2024).
  21. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. A Complete spatial map of mouse retinal ganglion cells reveals density and gene expression specializations. bioRxiv. , (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ruimtelijke transcriptomicanetvlieslamelleringsingle cell sequencingRNAscope hybridisatieXenium ruimtelijke sequencingretinale ganglioncellenmultiplex RNA detectiebehoud van weefselarchitectuur

Gerelateerde artikelen