Beeldvorming van C. elegans met hoge resolutie in alle larvale stadia

Samenvatting

Dit protocol beschrijft op microfluïdische wijze gebaseerde C. elegans time-lapse-beeldvorming gedurende de gehele post-embryonale ontwikkeling.

Samenvatting

Caenorhabditis elegans is een van de meest bestudeerde en best begrepen diermodellen in de biologie geworden. Drie kenmerken zijn de sleutel tot het succes van C. elegans als modelorganisme: de invariante celafstamming, transparantie en genetische traceerbaarheid. Deze maken het ideaal voor een breed scala aan op microscopie gebaseerde studies direct in vivo. Levende C. elegans-larven en volwassenen moeten vaak worden geïmmobiliseerd tijdens het verkrijgen van afbeeldingen. Traditionele immobilisatiemethoden hebben een nadelige invloed op de ontwikkeling van dieren, vooral bij time-lapse-beeldvormingstoepassingen. Hier wordt een gedetailleerd installatie- en bedieningsprotocol voor een nieuwe microfluïdische beeldvormingsmethode geïntroduceerd, die de beperkingen aanpakt die gepaard gaan met traditionele op agar-pad gebaseerde immobilisatie en andere microfluïdische strategieën. Deze aanpak maakt gelijktijdige live beeldvorming mogelijk in verschillende larvale stadia, terwijl de oriëntatie en identiteit van de worm in de loop van de tijd behouden blijven. Om dit te bereiken, wordt een microfluïdische valkanaalarray gebruikt, waarvan de geometrie nauwkeurig is ontworpen om een stabiele wormoriëntatie te behouden en tegelijkertijd groei en rui op te vangen. Immobilisatie wordt vergemakkelijkt door een actieve hydraulische klep die alleen tijdens het verkrijgen van beelden druk uitoefent om wormen tegen het afdekglas te beveiligen. Dit ontwerp maakt beeldvorming met hoge resolutie mogelijk met minimale effecten op de levensvatbaarheid van wormen of ontwikkelingstiming.

Inleiding

Beeldvorming van C. elegans kan op verschillende manieren worden uitgevoerd, afhankelijk van de toepassing, de gewenste doorvoer en de resolutie. Wanneer een hoge resolutie nodig is, maakt de standaardmethode gebruik van agarpads ^1,2,3, een eenvoudige constructie van glasplaatje, agarose en afdekglas. Dieren op deze dia's worden geïmmobiliseerd door de druk die wordt uitgeoefend door een afdekglas. Immobilisatie kan verder worden verbeterd door de toevoeging van verdovende middelen, bijv. levamisol of natriumazide ^1,2, zodat dieren op agarpads perfect stil zijn en met hoge resolutie kunnen worden afgebeeld, inclusief verschillende superresolutiemethoden². Helaas is bekend dat agarpads de ontwikkelingsprogressie beïnvloeden, waarbij de combinatie van hoge uitgeoefende druk en verdovende middelen de ontwikkeling vertraagt of volledige ontwikkelingsstilstand veroorzaakt ^4,5.

Naast deze standaardmethoden zijn er de afgelopen jaren verschillende microfluïdische methodologieën ontstaan, elk met zijn voor- en nadelen of gespecialiseerde gebruiksscenario's ^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}. Gritti et ^al.20 introduceerden bijvoorbeeld een methode waarbij wormen in grote kamers worden opgesloten. Embryo's die in deze kamers worden geplaatst, ontwikkelen zich en bewegen vrij terwijl ze binnen het aangewezen interessegebied op een microscoop blijven. Hoewel deze aanpak over het algemeen effectief is, is deze beperkt tot het gebruik van heldere fluorescerende markers. Meer recentelijk stelden Keil et ^al.21 een aangepaste versie van deze methode voor, met een hydraulische klep op de chip om dieren vast te houden tijdens het verkrijgen van beelden, waardoor enkele beperkingen van de oorspronkelijke aanpak werden aangepakt. Omdat beide methoden echter grotere kamers gebruiken dan die worden gebruikt voor gevangen wormen, blijven de dieren tijdens het experiment bewegen en roteren. Als gevolg hiervan wordt het volgen van ontwikkelingsprocessen een uitdaging en vereist het uitgebreide nabewerking van het beeld om te corrigeren voor bewegingen van dieren.

Om deze beperkingen aan te pakken, wordt de aanpak van Berger et ^al.18 (Figuur 1), waarbij dieren niet in een grote kamer worden gehouden, maar gehuisvest in een valkanaal dat is ontworpen om dieren binnen een korter ontwikkelingsvenster (tot 2,5 larvale stadia) te passen, aangepast. In tegenstelling tot bestaande microfluïdische methoden, behoudt deze benadering de oriëntatie en identiteit van het dier tijdens een experiment en maakt het mogelijk om beelden met hoge resolutie van meerdere wormen parallel en over meerdere larvale stadia binnen een enkel apparaat te verkrijgen.

De dieren worden gevangen met behulp van een gespecialiseerde kanaalgeometrie waarbij de kanaalhoogte dicht bij de dikte van een dier ligt aan het begin van een experiment, waardoor rotatie wordt voorkomen. Kanaalbreedtes en -lengtes worden geselecteerd zodat dieren in de loop van de tijd kunnen bewegen en groeien, waardoor de rui en de overgang van het ene larvale stadium naar het andere worden vergemakkelijkt. Parallellisatie wordt dan eenvoudig bereikt door meerdere vangkanalen naast elkaar te plaatsen, zodat meerdere dieren zichtbaar zijn in een enkel gezichtsveld (FOV, Figuur 1A') en maximaal 41 dieren kunnen worden afgebeeld in een enkele apparaateenheid (Figuur 1A). Dieren op de chip worden continu voorzien van een sterk geconcentreerde bacteriële voedselsuspensie via een laag kanaal, dat tegelijkertijd helpt om dieren aan het einde van de reeks valkanalen op te sluiten (hoogtestap, figuur 1A, rood). Vergelijkbaar met de aanpak van Keil et ^al.21, is een grote hydraulische, on-chip klep geïmplementeerd, die tijdens het verkrijgen van beelden kan worden opgeblazen, waardoor de dieren tegen het dekglas worden gedrukt, waardoor de immobilisatie van de dieren wordt verbeterd (Figuur 1B). Door de bediening van de hydraulische klep te beperken tot alleen de periode voor het verkrijgen van beelden, wordt een nadelig effect op de ontwikkeling van het dier geminimaliseerd, waardoor een betrouwbare ontwikkeling in alle larvale stadia wordt gegarandeerd. In tegenstelling tot de methoden beschreven door Gritti et ^al.20 en Keil et ^al.21, kunnen dieren niet gedurende de gehele post-embryonale ontwikkeling binnen hetzelfde apparaat worden afgebeeld. In plaats daarvan worden vijf verschillende apparaten geïntroduceerd, genaamd L1, L1-4, L2-A, L3-A en L4-A, die respectievelijk het hele L1-stadium en het vroege L2-stadium, het midden-late L1-stadium tot het midden-L4-stadium, het midden-late L2-stadium tot de jonge volwassenheid, het midden-late L3 tot de jongvolwassenheid en de late L4 tot de jongvolwassenheid bestrijken (Figuur 1C), die ononderbroken beeldvorming van grote delen van de post-embryonale ontwikkeling mogelijk maken. Deze benadering wordt gevolgd vanwege de grote toename van de diergrootte van L1 tot volwassenheid, zodat een kanaal dat geschikt is voor L1-dieren veel te klein zou zijn voor volwassenen, wat zou resulteren in ontwikkelingsstop, en een kanaal dat geschikt is voor volwassenen veel te groot zou zijn voor L1-dieren, wat zou resulteren in overmatige beweging, rotatie en dieren die uit de valkanalen ontsnappen.

Met behulp van deze benadering wordt een betrouwbare ontwikkelingsprogressie voor een verscheidenheid aan weefsels bereikt¹⁸, b.v. de post-embryonale ontwikkeling van de hypodermis (L1 tot L4-stadium), inductie van het lot van de vulvale cellen (L2- en L3-stadium), vulvale morfogenese (L3 tot volwassenheid¹⁹) en invasie van ankercellen. Sinds hun introductie zijn deze beeldvormingsapparaten voor de lange termijn gebruikt om een verscheidenheid aan processen te bestuderen^22,23, waarbij het platform zelfs is gecombineerd met technieken zoals AiryScan superresolutiemicroscopie²⁴, waardoor tal van ontdekkingen mogelijk zijn die voorheen onmogelijk waren.

Hieronder worden de operationele aspecten van deze beeldvormingsapparatuur voor de lange termijn geïntroduceerd in een stapsgewijs protocol, waarbij de verwachte resultaten en enkele mogelijke uitdagingen bij het opzetten van het systeem worden benadrukt.

Protocol

De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Fabricage van apparaten

OPMERKING: Alle apparaten zijn gefabriceerd met behulp van het onderstaande protocol, maar apparaten zijn rechtstreeks verkrijgbaar bij de auteurs. Voor elk apparaattype wordt een afzonderlijke wafer vervaardigd, waarbij elke apparaatwafer is vervaardigd uit twee lagen SU8 van verschillende hoogtes (d.w.z. voedsellaag en vallaag). De klepwafer is vervaardigd op een afzonderlijke wafer, met een enkele hoogte van SU-8, waarbij de stappen 1.3-1.6 zijn weggelaten. De silanen zijn giftig en geven bijtende dampen af. Deze stap moet daarom in een zuurkast worden uitgevoerd. Voor details over de fabricageprocedure, zie Berger et ^al.18.

1. Reinig wafers met behulp van luchtplasma.
2. Draai de eerste SU8-laag rond en bak vervolgens zacht op 95 °C.
3. Leg de eerste laag bloot, gevolgd door een nabak op 95 °C en ontwikkeling.
4. Voer de plasmareiniging opnieuw uit na de ontwikkeling en het drogen van de wafer.
5. Draai de tweede SU8-laag af, gevolgd door een zachte bak op 95 °C (voer indien nodig een eerste baksel uit op 65 °C).
6. Lijn het tweede masker uit met de bestaande elementen met behulp van uitlijningsmarkeringen aan weerszijden van de wafer en belicht vervolgens de tweede laag.
7. Na het bakken, ontwikkelen van de wafel en vervolgens hard bakken op 200 °C.
8. Behandel de wafer gedurende minstens 2 uur met chloortrimethylsilaan.
9. Bereid een batch van 20 g PDMS pre-polymeer (deel A) voor en meng deze grondig met de 1 g van de cross-linker (verhouding 20:1, deel B) (zie materiaaltabel).
10. Ontgas gedurende 10 minuten of totdat alle bubbels zijn verdwenen.
11. Verwijder 2 ml van het PDMS-mengsel en reserveer voor stap 1.13.
12. Voeg nog eens 3 g cross-linker toe aan het resterende PDMS-mengsel en meng grondig (eindverhouding ca. 5:1).
13. Gebruik de batch van 20:1 PDMS om de apparaatwafer gedurende 30 s met 750 tpm te draaien.
14. Plaats de klepwafer in een aluminium schaal en giet de 5:1 PDMS erop. Ontgas de wafer van het apparaat gedurende ongeveer 10 minuten. Verwijder na het ontgassen de resterende luchtbellen met een pipet.
15. Bak zowel de ventiel- als de apparaatlaag ongeveer 15/20 minuten op 70 °C.
16. Beoordeel de uitharding van het apparaat en de kleplagen door ze voorzichtig te onderzoeken met een pipetpunt of een pincet. De kleplaag moet stevig zijn, terwijl de apparaatlaag enigszins plakkerig moet blijven.
17. Maak de kleplaag los en knip deze op de gewenste maat met behulp van een scalpel of scheermesje.
18. Prik een toegangsgat in het ventielkanaal (meter 20).
19. Plaats de wafer van het apparaat onder een stereomicroscoop die is uitgerust met verlichting aan de bovenkant.
20. Plaats het PDMS-stuk met de kleplaag voorzichtig op de apparaatwafel.
21. Lijn de klep- en apparaatkenmerken nauwkeurig uit en zorg ervoor dat alle ingesloten lucht tussen de lagen wordt verwijderd.
22. Breng het gemonteerde apparaat over naar een oven en bak het een nacht op 70 °C.
23. Maak het apparaat los van de wafel.
24. Pons alle resterende toegangsgaten (schaal 20).
25. Verbind het PDMS met behulp van luchtplasma op een dekglas en plaats het gebonden apparaat vervolgens enkele uren in een oven op 70 °C.

2. Bereiding van wormen

OPMERKING: In dit gedeelte wordt de bereiding van wormen door bleken beschreven, waardoor grote aantallen (honderden) dieren kunnen worden gegenereerd. Andere synchronisatiemethoden, zoals handmatig picken, zijn mogelijk, maar zijn doorgaans tijdrovender en arbeidsintensiever. Alle wormen die in het protocol worden gebruikt, worden volgens de standaardprotocollen bewaard bij 20 °C en op NGM-platen die zijn gezaaid met E. coli OP50.

1. Beginnend met borden met veel drachtige dieren.
2. Was dieren van de plaat met behulp van M9-buffer.
3. Voeg 5% NaClO en 5 M NaOH toe aan de wormsuspensie (200 μl/100 μl voor elke 1 ml wormsuspensie).
4. Schud de bleekmix voorzichtig totdat de dieren uit elkaar beginnen te vallen (~10 min).
5. Centrifugeer bleekmengsel bij kamertemperatuur, 1300 x g gedurende 1 min.
6. Verwijder het bovenstaande met een pipet en voeg een gelijke hoeveelheid verse M9-buffer toe.
7. Nogmaals, centrifugeren bij kamertemperatuur, 1300 x g gedurende 1 min.
8. Verwijder het bovenstaande en breng de gepelleteerde wormen over in een buis van 15 ml met 5 ml verse M9-buffer.
9. Schud een nacht bij 20 °C.
10. Laat de wormsuspensie door een celzeef van 10 μm lopen.
11. Centrifugeer de wormsuspensie bij 1300 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
12. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de wormen in een gelijk volume M9-buffer.
13. Centrifugeer het wormenmengsel opnieuw op 1300 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
14. Verwijder het bovenstaande en breng de wormen over naar NGM-platen. Als L1-larven nodig zijn, gebruik ze dan onmiddellijk.
15. Zodra de wormen het gewenste ontwikkelingsstadium hebben bereikt, wast u ze van de plaat met behulp van verse S-Basale buffer gefilterd door een filter van 0,2 μm.
16. Laat de wormen door zwaartekracht bezinken of pellets ze door centrifugeren bij 750 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
17. Gooi het bovenstaande weg en voeg een gelijk volume verse S-basale buffer toe.
18. Herhaal de bezink- of centrifugatiestappen (stappen 2.16 en 2.17)
19. Verwijder het bovenstaande en voeg een gelijk volume verse S-basale buffer toe.
20. Voer de bezinkings- of centrifugatiestappen nog een laatste keer uit.
21. Verwijder het grootste deel van de supernatant.
22. Houd de wormen in de buis totdat het experiment begint.

3. Bereiding van bacteriën

OPMERKING: Verschillende bacteriestammen (bijv. OP50, NA22, HT114, enz.) kunnen op de chip worden gebruikt. Pas het aandeel van het dichtheidsgradiëntmedium aan dat aan de voedselmix wordt toegevoegd om verschillen in dichtheid te compenseren. Alle buffers worden door een filter van 0,2 μm geleid om deeltjes te verwijderen.

1. Bereid 40 ml LBroth voor, hetzij in 2 x 20 ml in centrifugebuisjes, steriele erlenmeyers, enz.
2. Inoculeer LB met bacteriën die van een voorraadplaatje zijn geplukt.
3. Kweek de bacteriën tijdens het schudden 's nachts bij 37 °C (~16 uur) (OD₆₀₀ = 1,9).
4. Centrifugeer de bacteriën op 3000 x g gedurende 10 min.
5. Verwijder het bovenstaande en voeg 2 ml verse S-basale buffer toe aan elke buis. Combineer alle buizen.
6. Resuspendeer de bacteriën mechanisch met behulp van een pipet.
7. Centrifugeer de bacteriën op 3000 x g gedurende 5 min.
8. Verwijder het bovenstaande middel en voeg opnieuw 2 ml verse S-Basale buffer toe.
9. Resuspendeer de bacteriën mechanisch met behulp van een pipet.
10. Centrifugeer de bacteriën op 3000 x g gedurende 5 min.
11. Verwijder zoveel mogelijk van het bovenstaande en voeg 1 ml verse S-Basale buffer toe voordat u alle bacteriën mechanisch opnieuw suspendeert.
12. Combineer 0,60 ml dichtheidsgradiëntmedium, 0,38 ml S-Basal + 1% van het gewicht Pluronic F-127 (een niet-ionisch triblock-copolymeer, hier weergegeven als PF) met 1 ml OP50-bacteriesuspensie, of 0,65 ml dichtheidsgradiëntmedium, 0,33 ml S-Basal + 1% van het gewicht PF met 1 ml NA22- of HT114-bacteriënsuspensie.
13. Meng de voedselbereiding grondig met behulp van een vortexmixer.
14. Filtreer het voedsel door een celzeef van 5 μm of 10 μm. Een kleinere zeef is vooral aan te raden bij het gebruik van kleinere apparaten, bijv. L1-apparaten.
    OPMERKING: Voedsel kan maximaal 2 dagen op kamertemperatuur worden bewaard.

4. Voorbereiding van de chips

NOTITIE: Raadpleeg afbeelding 2 voor een schematisch overzicht van het apparaat, de slangen en de aansluitingen. Alle buffers worden door een filter van 0,2 μm geleid om stof te verwijderen. De stalen pin die in de volgende stappen wordt genoemd, verwijst naar een korte, holle buis die wordt gebruikt om de grotere OD-buizen (1/16") te verbinden met de gaten met een kleine diameter die in het PDMS-apparaat zijn vervaardigd. Deze stalen pinnen worden eenvoudig in de binnendiameter van de slang gestoken en vervolgens in het PDMS-materiaal geduwd, waardoor de twee effectief met elkaar worden verbonden.

1. Begin met het vullen van een spuit met gedeïoniseerd (DI) water.
2. Bevestig een naald van 23 G en een lang stuk 1/16" buis, met een holle stalen pen (gebogen in een hoek van 90°) aan het uiteinde. De slang moet lang genoeg zijn om zich uit te strekken van de solenoïde tot de microscooptrap.
3. Vul de slang met DI-water uit de spuit en sluit deze aan op de klepinlaat door de stalen pen in het geperforeerde gat te steken (Figuur 2A,J).
4. Verwijder de spuit en naald en bevestig vervolgens de slang aan de off-chip solenoïde (Figuur 2A,J).
5. Gebruik de beeldvormingssoftware om de solenoïde in te schakelen en het apparaat enkele minuten onder druk te zetten om alle lucht uit de klep te verdrijven. Controleer de voltooiing door de lucht-waterinterface op de chip visueel te controleren, die er donker uit moet zien en in het PDMS-materiaal moet verdwijnen (Figuur 2B).
6. Schakel de solenoïde uit (Figuur 2C).
7. Vul een spuit van 1 ml met de gefilterde bacterieoplossing (~0,5 ml voedsel is voldoende).
8. Bevestig een naald van 30 G en een lang stuk slang van 1/32" aan de naald.
9. Druk op de zuiger om zowel de naald als de aangesloten slang te vullen en zorg ervoor dat er geen lucht in de spuit of slang achterblijft.
10. Steek de 1/32" slang rechtstreeks in de voedselinlaat van het microfluïdische apparaat en gebruik een pincet om schade aan de slang te voorkomen (SMD-pincet wordt aanbevolen) (Figuur 2D,K).
11. Plaats de spuit op de spuitpomp (Figuur 2D).
12. Druk met de duimschroef aan de achterkant op de zuiger van de spuit om het apparaat met vloeistof te vullen. Bij elke open verbinding moet een druppel vloeistof verschijnen (Figuur 2D, pijl).
13. Blokkeer zowel de worminlaat als de uitlaat met een afgedichte stalen pen (een stalen pen met een kort stuk 1/16" slang eraan bevestigd en afgedicht door verbranding) (Figuur 2E,L).
14. Oefen extra druk uit met de duimschroef om eventuele resterende lucht in het apparaat te verwijderen (Afbeelding 2E, pijl).
15. Verwijder de verstopte pin bij de uitlaat en bevestig de afvalcontainer (gemaakt van een cryoviale of microcentrifugebuis, met twee stalen pinnen door het deksel gestoken en vastgezet met lijm). De afvalcontainer is verbonden met een kort stuk 1/16" buis, waarbij het ene uiteinde aan de container is bevestigd en het andere uiteinde is verbonden met een holle stalen pen (90° gebogen) (Figuur 2F,G,M).
16. Druk op de spuit om er zeker van te zijn dat de afvalcontainer goed is aangesloten en dat er geen verstoppingen in het systeem zijn. Duw hiervoor een kleine hoeveelheid vloeistof door het systeem (draai de duimschroef op de spuitpomp) totdat er vloeistof door de afvoerslang stroomt (Afbeelding 2G, pijl).
17. Verwijder de tweede geblokkeerde stalen pen.
18. Duw op de spuit totdat er een kleine druppel vloeistof bij de worminlaat verschijnt (Figuur 2H,N).
19. Bevestig een langer stuk slang van 1/16" (15-20 cm) aan een spuit van 1 ml gevuld met S-Basale buffer, met behulp van een naald van 23 G (Figuur 2H,N).
20. Bevestig een rechte stalen pin van 23 G aan het andere uiteinde van de buis.
21. Vul de naald en slang met buffer van de spuit en zorg ervoor dat er geen lucht in de spuit of slang achterblijft.
22. Steek de stalen pen aan het uiteinde van de slang in de buis met de wormen.
23. Duw een kleine hoeveelheid vloeistof door de slang en zorg ervoor dat er geen lucht achterblijft.
24. Trek de wormen in de slang, maar trek ze niet in de spuit.
25. Duw de spuit die op de wormen is aangesloten totdat er een kleine druppel vloeistof op de stalen pen verschijnt (Figuur 2H).
26. Steek de stalen pen in de worminlaat (Figuur 2I).
    NOTITIE: De voorbereiding van het apparaat kan worden uitgevoerd voorafgaand aan de definitieve wormbereiding en op de microscoop worden gelaten totdat de wormen klaar zijn.

5. Wormbelasting en beeldvorming

1. Plaats het apparaat op een microscoop met lage vergroting (5x of 10x) of op een dissectiemicroscoop.
2. Identificeer de apparaateenheid die momenteel in gebruik is en zoek de worminlaat met behulp van helderveldverlichting.
3. Plaats het apparaat zo dat de inlaat aan de ene kant van het gezichtsveld zichtbaar is en de achterkant van de inlaat van het vangkanaal aan de andere kant.
4. Duw voorzichtig op de zuiger van de wormspuit. De vloeistof zal merkbaar van de inlaat door de kanaalarray naar de uitlaat stromen. De aanwezigheid van bacteriën en het verschil in brekingsindex door de toevoeging van het dichtheidsgradiëntmedium maken de vloeistofstroom zichtbaar.
5. Zorg ervoor dat de wormen uit de inlaat verschijnen en naar de achterkant van de kanaalarray stromen.
6. Duw de dieren voorzichtig in de richting van de kanaalarray. Zodra een dier naar het kanaal kijkt, duw je het in het kanaal en herhaal je dit voor extra dieren.
   OPMERKING: Dieren moeten met hun hoofd naar de uitlaat gericht zijn om gemakkelijk toegang te hebben tot voedsel. Ze kunnen zich oriënteren door aan de zuiger te duwen en te trekken en door te zwemmen.
7. Zodra er voldoende dieren zijn gevangen, plaatst u de spuit, die nog aan de worminlaat is bevestigd, op de microscooptafel, waar deze gedurende het hele experiment zal blijven. Het kan nodig zijn om de wormslang kort van de spuit los te maken om eventuele drukopbouw te verminderen en bevestig deze vervolgens voorzichtig weer aan de stompe naald.
8. Als het laden op een dissectiemicroscoop is uitgevoerd, brengt u het apparaat over naar de beeldmicroscoop. De slang kan aan de chip blijven zitten en de spuit is aangesloten op de pomp.
9. Schakel de spuitpomp in en laat deze draaien met de vooraf ingestelde snelheid van 1 μL/h voor 0.5 μL, verhoog de snelheid met 100 μL/h voor 0.5 μL en verlaag deze terug naar 1 μL/h. Deze cyclus wordt automatisch herhaald voor het hele experiment. Voor informatie over het programmeren van de pomp, zie de gebruikershandleiding van de apparatuur.
10. Plaats het apparaat op de microscooptafel en zorg ervoor dat het stevig wordt vastgehouden (suggesties voor montagemechanismen zijn te vinden in Afbeelding 3A).
11. Als het laden niet op de beeldmicroscoop is uitgevoerd, identificeert u de eenheid van het apparaat die van belang is bij lage vergroting.
12. Schakel over naar de gewenste beeldvergroting.
    OPMERKING: De apparaten zijn compatibel met alle soorten objectieven.
13. Identificeer de dieren en interessegebieden binnen de cascadekanaalarray en stel de gewenste beeldvormingscondities in.
14. Beeld bij de gewenste beeldvormingsomstandigheden, met de on-chip klep, bediend door de solenoïde 10 s vóór beeldacquisitie, zodat de dieren op hun plaats worden gehouden.
    OPMERKING: Door de klep op de chip te bedienen, worden de dieren langer en plat, waardoor mogelijk aanpassingen aan het beeldvormingsgebied van belang (ROI) nodig zijn.

6. Voorbereiding van de installatie

OPMERKING: Dit gedeelte heeft betrekking op de eerste voorbereiding van het bedieningsmechanisme van het apparaat en hoeft niet voor elk experiment te worden herhaald. Zie figuur 3B,C. Omdat veel solenoïdes een hogere spanning vereisen, zal de solenoïde hoogstwaarschijnlijk niet rechtstreeks op de microcontroller worden aangesloten, maar via een relais of MOSFET (zie afbeelding 3C).

1. Identificeer een persluchtbron (bijv. wandvoedingsinstallatie of gasfles).
2. Sluit de drukbron aan op een geschikte drukregelaar (drukbereik 0-2 bar) met behulp van 6 mm slang (wandbron) of bevestig een geschikte regelaar direct op de gasfles.
3. Sluit de drukregelaar aan op de ingang van het magneetventiel (6 mm slang, zie afbeelding 3B).
4. Plaats de solenoïde zo dicht mogelijk bij de microscooptafel (~0.5-1 m van de tafel wordt aanbevolen, hoewel langere afstanden indien nodig mogelijk zijn).
5. Sluit het magneetventiel elektronisch aan op de geselecteerde controller. Er zijn verschillende opties beschikbaar, zoals het bedienen met een aparte microcontrollerkaart (bijv. Arduino) of een bestaande DAq-kaart.

7. Opruimen en opbergen

1. Zodra het experiment is voltooid, verwijdert u het apparaat uit de microscoop.
2. Verwijder de dompelvloeistof. Onderdompelingsolie kan worden verwijderd met organische oplosmiddelen (bijv. aceton, methanol, enz.).
3. Plaats het apparaat op een vlakke ondergrond en koppel alle slangen los, behalve de klepslang. Om elke slang veilig los te koppelen, drukt u de PDMS dicht ernaast naar beneden en trekt u er voorzichtig aan. Til en buig het apparaat niet, omdat hierdoor het afdekglas kan breken.
4. Reinig het PDMS-oppervlak met 70% ethanol.
5. Bewaar het apparaat bij kamertemperatuur met de ventielslang bevestigd.
   NOTITIE: Het apparaat kan opnieuw worden gebruikt totdat alle units zijn gebruikt, waarschijnlijk zonder dat de klepslang hoeft te worden bijgevuld. Het water in de klepslang zal echter over een langere periode verdampen en moet uiteindelijk mogelijk worden bijgevuld.

Resultaten

Ontwerp en afmetingen van het apparaat
Vijf verschillende apparaten zijn ontworpen om alle vier de larvale stadia te huisvesten. Deze voorzieningen zijn als volgt aangeduid: L1, voor L1-larven die onmiddellijk na het uitkomen worden geladen en tot het L2-stadium in beeld worden gebracht; L1-L4, geschikt voor het houden van larven van het midden tot het late L1-stadium tot het begin tot het midden van L4; L2-A, geschikt voor dieren vanaf ongeveer het midden van het L2-stadium tot jonge volwassenheid; L3-A, voor dieren vanaf ongeveer het midden van het L3-stadium tot de jonge volwassenheid; en L4-A, dat geschikt is voor dieren vanaf ongeveer het late L4-stadium tot jonge volwassenheid.

Alle apparaten volgen dezelfde essentiële lay-out, bestaande uit een worminlaat, 1 (of 2 in het geval van media-uitwisseling) bacteriële voedselinlaat(en) en een gemeenschappelijke afvalafvoer. Tussen het inlaat- en uitlaatgedeelte wordt een reeks van 41 parallelle valkanalen geplaatst, waarbij de inlaat- en uitlaatzijde effectief worden gescheiden door het lager gelegen voedseltoevoerkanaal (Figuur 1A,A'). Er werd gekozen voor de kanaalafmetingen die aanzienlijk langer en breder waren dan de wormen die aan het begin van een experiment waren geladen, met een lengte/breedte van 400/15 μm voor L1-apparaten, 575/22 μm voor L1-L4-apparaten, 800/27 μm voor L2-A-apparaten, 900/30 μm voor L3-A-apparaten en 1000/65 μm voor L4-A-apparaten (aanvullend bestand 1, aanvullend bestand 2, Aanvullend dossier 3, aanvullend dossier 4 en aanvullend dossier 5).

De kanaallengte werd gekozen om overeen te komen met de grootte die de dieren aan het einde van het experiment hadden bereikt, terwijl de breedte zo werd gekozen dat wormen aan het begin van het experiment ongeveer tweederde van de kanaalbreedte innamen. Dit ontwerp biedt voldoende ruimte voor groei en beweging tijdens het ruien, terwijl wordt voorkomen dat wormen draaien of draaien. In tegenstelling tot de breedte werd de kanaalhoogte aan het begin van het experiment dicht bij de dikte van de wormen vastgesteld: 8 μm voor vroege L1-larven, 12 μm voor midden/late L1-larven, 15 μm voor mid-L2-larven, 17,5 μm voor mid-L3-larven en 22,5 μm voor late L4-larven, overeenkomend met de L1, L1-L4, L2-A, L3-A, en respectievelijk L4-A-apparaten. De verminderde kanaalhoogte, gecombineerd met een zorgvuldig geselecteerde breedte (met behoud van een hoogte-breedteverhouding van 0,5-0,6), zorgt ervoor dat wormen in een vaste oriëntatie blijven. Met name bij een voldoende kleine kanaalhoogte zijn alle wormen consequent in de gewenste zijdelingse oriëntatie gepositioneerd.

Het voedseltoevoerkanaal werd gefabriceerd op een hoogte van 3 μm voor L1 en 5 μm voor alle andere apparaten, zodat bacteriën de dieren gemakkelijk kunnen bereiken zonder dat de dieren uit de valkanalen ontsnappen. Alle apparaten gebruiken dezelfde voedseltoevoerlaag (aanvullend bestand 6) en dezelfde kleplaag (aanvullend bestand 7). Let op: de kleplaag wordt gefabriceerd op een aparte wafer op een hoogte van 20 μm en alleen op de apparaatlaag geplaatst tijdens de fabricage van het PDMS-apparaat (stap 1.21).

Deze stadiumspecifieke geometrische beperkingen, essentieel om te voorkomen dat wormen van kop naar staart draaien of omkeren, vereisen het gebruik van drie verschillende apparaattypen om alle larvale stadia te accommoderen. Als L1-larven in een kanaal zouden worden geplaatst dat geschikt is voor jonge volwassen dieren, zouden ze niet stabiel blijven en zouden ze snel het vangkanaal verlaten.

C. elegans preparaat
Tenzij anders vermeld, werden de wormen volgens de standaardprotocollen²⁵ gehouden op NGM-platen gezaaid met E. coli OP50 bij 20 °C. Het gedeelte over wormbereiding beschrijft expliciet de bereiding van een gesynchroniseerde wormpopulatie die wordt gebruikt in een beeldvormingsexperiment. Synchronisatie werd uitgevoerd volgens standaardprotocollen met behulp van natriumhypochlorietbleekmiddel²⁶, aangepast met een extra filtratiestap om puin en niet-uitgekomen dieren te verwijderen na een nachtelijke honger. Het doel is om veel gesynchroniseerde L1-larven te verkrijgen, die vervolgens op NGM-platen worden gezaaid of rechtstreeks in het beeldvormingsapparaat worden geladen. Andere synchronisatiemethoden, zoals handmatig plukken of gecontroleerd eieren leggen, zijn even geschikt. Ze zijn echter arbeidsintensiever in het genereren van voldoende dieren (200 per aandoening wordt aanbevolen).

Zodra de wormen het gewenste stadium hebben bereikt, kunnen ze voorzichtig van de NGM-plaat worden gewassen met behulp van schoon S-Basal (idealiter gefilterd door een filter van 0,2 μm). Het doel is om zoveel mogelijk dieren te verzamelen zonder bacteriën of puin van de plaat te verzamelen. Dieren worden verzameld in een kleine centrifugebuis en 2-3 keer gewassen met verse S-Basale buffer, waarbij uiteindelijk zoveel mogelijk vloeistof wordt verwijderd. Dieren worden dan direct uit het geconcentreerde volume gehaald. Als de dierconcentratie te laag is, zal het laden langzamer zijn, waardoor een grotere hoeveelheid vloeistof door het apparaat moet stromen en het risico op verstopping van vangkanalen met vuil toeneemt.

Bacteriële voedselbereiding
Bacteriegroei wordt uitgevoerd volgens standaardprotocollen, waarbij de initiële bacterieconcentratie (OD₆₀₀ = 1,9) ongeveer 40 keer is toegenomen in S-Basale buffer (gefilterd door een filter van 0,2 μm) en gemengd met het dichtheidsgradiëntmedium en S-Basale buffer die PF bevat (gefilterd door een filter van 0,2 μm). Het verwachte resultaat van deze processtap is de bereiding van een zeer dichte bacteriesuspensie en het voorkomen van bacteriesedimentatie tijdens het beeldvormingsexperiment. De hoge dichtheid is nodig om de dieren op de chip te voeden met de lage stroomsnelheden die worden gebruikt bij de levering van media (1 μL/uur). Het doel van het dichtheidsgradiëntmedium is om te voorkomen dat bacteriën tijdens het experiment neerslaan, en het doel van PF is om te voorkomen dat bacteriën aan de kanaalwanden blijven kleven. Zowel het dichtheidsgradiëntmedium als het PF zijn niet giftig en hebben geen invloed op de levensvatbaarheid van dieren.

Als in een experiment een ander bacterietype wordt gebruikt, moet de noodzakelijke concentratie van het dichtheidsgradiëntmedium worden bepaald. Dit kan worden bereikt door bacteriënsuspensie te mengen met verschillende hoeveelheden van het medium, gevolgd door centrifugeren. Als de concentratie van de dichtheidsgradiënt te laag is, zullen bacteriën bezinken; Als de concentratie te hoog is, gaan bacteriën drijven. Zodra een geschikte concentratie is gevonden, wordt aanbevolen het resultaat te valideren door het bacteriemengsel ongeveer 48 uur bij kamertemperatuur te laten staan om aan te geven hoe het voedsel zich tijdens het experiment zal gedragen. Na het experiment wordt eveneens aanbevolen om de spuit waardoor de bacteriën worden toegevoerd te controleren en ervoor te zorgen dat bacteriën niet bezinken of drijven. Het verschil in volume als gevolg van het toevoegen van verschillende hoeveelheden Optiprep kan worden gecompenseerd door meer of minder S-Basal + 1% van het gewicht PF toe te voegen. Op dezelfde manier kunnen extra media of verbindingen (bijv. auxine) aan de suspensie worden toegevoegd en wordt het extra volume afgetrokken van het volume S-Basal + 1% van het gewicht PF.

Voorbereiding van de installatie
Stel het druktoevoersysteem zo dicht mogelijk bij de microscoop op, zodat het gemakkelijk kan worden bediend. Alle slangen, met name de 1/16"-slang die op de chip is aangesloten, moeten kort blijven (minder dan 0.5 m voor de 1/16" OD-slang) (Afbeelding 2 en Afbeelding 3B). Zoals aangegeven in het bovenstaande gedeelte, kan computerbesturing van de on-chip-klep op verschillende manieren worden bereikt. Het zou mogelijk moeten zijn in elke microscoopsoftware (getest in Micro-Manager, Metamorph, NIS en ZenBlue), hetzij door een speciale microcontrollerkaart aan te sluiten (bijv. Arduino) of door het systeem aan te sluiten op een bestaande data-acquisitie (DAq) kaart, met behulp van een digitale uitgang. De geselecteerde borduitgang moet dan worden geconfigureerd als een sluiter, die 10 s vóór de beeldacquisitie wordt ingeschakeld of handmatig wordt bediend tijdens de installatie van het apparaat. Zoals eerder vermeld, wordt het niet aanbevolen om de solenoïde rechtstreeks op de microcontroller aan te sluiten; in plaats daarvan verbinding maken via een MOSFET of relaisschakelaar zodat de solenoïde en de microcontroller elektronisch geïsoleerd blijven (Afbeelding 3C).

Net als bij de druktoevoerslangen, moet u alle andere slangen naar de spaan (1/16" OD en 1/32" OD) zo kort mogelijk houden. Houd de worm- en afvalslangen (1/16" OD) onder respectievelijk 2.5 cm en 20 cm. De toevoerslang voor bacteriën (1/32" OD) moet lang genoeg zijn om verbinding te maken van de spuitpomp naar het apparaat zodra deze op de microscooptafel is geplaatst. Het is echter sterk aan te raden om dit zo veel mogelijk in te korten en de spuitpomp dicht bij de microscooptafel te plaatsen, bijv. naast de tafel, met behulp van een plank of bovenop een couveusebehuizing. Elke lengte slang die aan het systeem wordt toegevoegd, zal de tegendruk verhogen die wordt gevoeld bij het laden van dieren in het apparaat en de totale druk op gevangen dieren verhogen.

Bediening van het apparaat
Alle slangen kunnen in dit stadium worden voorbereid en aangesloten op de respectievelijke stompe naald, stalen pen en spuit (begin van protocol stap 4). Zoals hierboven vermeld, houd de slanglengte zo kort mogelijk (Figuur 2J-N). Belangrijk is dat er voor wordt gezorgd dat er geen luchtbellen in de spuiten of slangen achterblijven, aangezien deze de belading van de dieren verstoren en ertoe kunnen leiden dat dieren tijdens het experiment uit het vangkanaal ontsnappen. Luchtbellen kunnen op verschillende manieren uit de spuit worden verwijderd, bijvoorbeeld door de spuit te vullen, om te keren en voorzichtig te schudden zodat de luchtbellen naar de bovenkant van de spuit stijgen (het wordt niet aanbevolen om de spuit aan te tikken, omdat dat ertoe kan leiden dat er extra luchtbellen worden opgesloten). Als alternatief kan de spuit worden gevuld door deze in de buffer te steken en de zuiger snel op en neer te bewegen om de meeste luchtbellen snel te verwijderen.

Zodra de spuit gevuld en vrij van luchtbellen is, worden de botte naald en de slang bevestigd en gevuld met buffer. Er moet ook speciale aandacht worden besteed aan het vullen van de spuit, omdat er gemakkelijk lucht kan worden opgesloten in het plastic deel van de stompe naald. Als er lucht is ingesloten, vervang dan de naald. Als alternatief kan het probleem worden verlicht door de naald voor te vullen met vloeistof, bijvoorbeeld met behulp van een pipet.

Als alle componenten op hun plaats zitten, kan de slang aan het apparaat worden bevestigd, te beginnen met de slang die de solenoïde en de on-chip-klep verbindt (Figuur 2A-C,J). Deze slang is in eerste instantie gevuld met gedeïoniseerd water en het systeem staat onder druk om alle lucht uit het doodlopende klepkanaal te verwijderen. PDMS is gasdoorlatend; dus de verhoogde druk zal alle lucht uit het kanaal in het PDMS duwen, waardoor het klepkanaal gevuld blijft met water. Dit proces kan met een microscoop worden gevolgd, zodat het hele klepkanaal gevuld is. Na het vullen van de klep kan de bacterietoevoer worden aangesloten en kan het apparaat worden gevuld en onder druk worden gezet door alle open inlaten/uitlaten te blokkeren (Figuur 2D,E,K,L). Lucht wordt verplaatst en het proces kan met een microscoop worden gevolgd. Zodra alle lucht is verplaatst, moeten de bacteriën het apparaat gelijkmatig vullen. De blokkeerpennen worden verwijderd en de afvalinzamelingsbuis wordt aangesloten (Figuur 2F,G,M). Op dit punt moet er een kleine hoeveelheid vloeistof door het apparaat in de afvalverzamelbuis stromen, waarbij ervoor moet worden gezorgd dat alle aansluitingen op de buis open zijn. Dit kan visueel worden bevestigd voordat de slang op de opvangbuis wordt aangesloten. Als er geen vloeistof naar de afvalverzamelbuis stroomt, is deze waarschijnlijk verstopt. Dit zou resulteren in drukopbouw over het experiment, wat een negatief effect zou hebben op de gevangen dieren. Als de slang of de aansluitingen verstopt zijn, verwijder deze dan en reinig alle verbindingen met een naald of spoel ze door met een met water gevulde spuit.

Ten slotte kan de wormslang worden aangesloten (Figuur 2H,N). Wormen worden uit de centrifugebuis opgezogen door ze eenvoudig in de slang te zuigen die aan de met S-Basal gevulde spuit is bevestigd. De dieren mogen alleen in de slang worden getrokken, niet in de spuit. De slang kan dan op het apparaat worden aangesloten. Daarvoor wordt een kleine hoeveelheid vloeistof uit het apparaat en de wormslang geduwd en worden de twee druppels zo met elkaar verbonden dat er tijdens het laden geen lucht in het apparaat wordt geduwd.

Worm laden
Als alle verbindingen tot stand zijn gebracht, kunnen dieren worden geladen door aan de zuiger van de wormspuit te duwen en te trekken. Dieren worden vanuit de inlaat naar de cascade gespoeld; Ze zullen echter van nature tegen de stroom in zwemmen die ze ervaren. Dieren moeten daarom worden geheroriënteerd met hun hoofd naar het valkanaal gericht. De juiste oriëntatie van de dieren wordt bereikt door op de zuiger te duwen en te trekken en de dieren de tijd te geven om in de gewenste richting te draaien. Dit kan bijna worden bereikt op basis van een enkele worm, maar vereist enige oefening. Zodra de dieren correct zijn georiënteerd, kunnen ze in het vangkanaal worden geduwd en naar het einde van het kanaal worden geschoven, waar een hoogtetrede ze tegenhoudt (Figuur 1A,B). Als dieren het kanaal niet kunnen betreden, zijn ze te groot voor het geselecteerde apparaat en moeten ze in een groter apparaat worden afgebeeld. Als dieren kunnen draaien of omdraaien wanneer ze in het vangkanaal worden geplaatst, zijn ze te jong en moet er een kleiner apparaat worden gebruikt, of moeten de dieren nog een paar uur groeien.

Belangrijk is dat dieren in verschillende kanalen elkaar niet beïnvloeden. Daarom zullen dieren die verkeerd zijn geladen, geen invloed hebben op dieren die correct zijn geladen, maar ze zullen niet voldoende toegang hebben tot voedsel en zullen daarom langzamer groeien of de ontwikkeling stoppen.

Als de dieren op de juiste leeftijd worden geladen, zou er minimale beweging langs de lengtekanaalas moeten optreden. Dieren zijn echter vrij om te wiebelen (Figuur 1B) en beginnen binnen een paar minuten te eten. Als dieren aanzienlijke bewegingen langs de lengtekanaalas vertonen, wordt dit waarschijnlijk veroorzaakt door drukopbouw in het apparaat of door een luchtbel die ergens in de slang, stompe naald of spuit zit. Drukopbouw in het apparaat kan worden opgeheven door de wormslang voorzichtig los te maken van de botte naald en deze voorzichtig weer te bevestigen. Als er ondanks de bovengenoemde stappen en voorzorgsmaatregelen een luchtbel in het systeem is blijven zitten, moet mogelijk de hele wormspuit worden verwijderd en vervangen door een nieuwe zonder luchtbellen. Luchtbellen in het systeem fungeren als veren die tijdens het laden worden samengedrukt en na het laden van dieren langzaam worden losgelaten. De stroming die wordt gecreëerd door het uitzetten van de luchtbellen kan resulteren in instabiliteiten van het systeem, waardoor de dieren uit de vangkanalen worden geduwd.

Beeldacquisitie en -ontwikkeling op de chip
Ten slotte, zodra de dieren zijn geladen, kan de beeldacquisitie beginnen. In principe zijn de apparaten compatibel met de meeste beeldvormingsmethoden, helderveld, epifluorescentie 18,19,22,23 (Figuur 4), draaiende schijf confocaal¹⁹ en zelfs superresolutiemodaliteiten (AiryScan²⁴), aangezien alle beeldvorming wordt uitgevoerd door een 170 μm dik afdekglas. Het microfluïdische apparaat vertoont dan ook weinig tot geen effect op de haalbare beeldkwaliteit op de chip. Er moeten echter geschikte beeldvormingsomstandigheden worden gekozen die geen invloed hebben op de levensvatbaarheid van dieren, ongeacht de beeldvormingsmodaliteit. Hoge excitatie-intensiteiten zullen gemakkelijk resulteren in fluorofoorverbleking en ontwikkelingsstilstand vanwege de hoge energie en warmte die op het monster wordt gegeven. Korte belichtingstijden (~10 ms) en lage excitatie-intensiteiten (minder dan 10% van een typische fluorescentie-LED-bron) worden aanbevolen, wat een bruikbaar beeld oplevert bij een contrastinstelling van min = 0 en max = 1000 (bij gebruik van een 16-bits camera) (Afbeelding 4).

Representatieve gegevens verkregen met behulp van de L1-, L1-4- en L2-A-apparaten worden weergegeven in figuur 4. Toont de ontwikkeling van de epitheelcellen van C . elegans vanaf het uitkomen/nachtelijke uithongering tot het midden van het L2-larvale stadium (Figuur 4A, aanvullende film 1), inductie van de 1°-noodlottige vulva-voorlopercellen en hun daaropvolgende delingen van laat L1 tot het vroege L4-larvale stadium (Figuur 4B, Aanvullend Filmpje 2) en ten slotte de vorming van de C. elegans vulva vanaf het vroege L3-larvale stadium tot eversie bij de overgang naar volwassenheid (Figuur 4C, Aanvullende film 3).

Elke toepassing gaat vergezeld van een kwantificering van verschillende ontwikkelingstimingmetrieken. Afbeeldingen in Figuur 4A,B worden weergegeven zonder enige toegepaste nabewerking, d.w.z. er is geen deconvolutie of beeldregistratie toegepast. Afbeeldingen in Figuur 4C daarentegen werden gedeconsolideerd²⁷ en geregistreerd, wat de verbeteringen in beeldkwaliteit benadrukt die mogelijk zijn bij het gebruik van beeldvormingsapparatuur voor de lange termijn.

Ten eerste, het identificeren van het begin van elke naadceldeling voor dieren zoals weergegeven in Figuur 4A (zie Aanvullende Film 1 voor een voltijdse cursus), met vermelding van de consistente en tijdige deling van alle cellen over 12 dieren (Figuur 4D). Met behulp van de naadcellen werd ook de algemene ontwikkelingstiming in alle vier de larvale stadia beoordeeld en werd vastgesteld dat alle naadceldelingen voltooid waren na 12,0 uur ± 1,7 uur (gemiddelde ± SD) in L1 (n = 22), 10,2 uur ± 1,0 uur in L2 (n = 27), 10,9 uur ± 1,4 uur in L3 (n = 27) en 14,6 uur ± 2,2 uur bij L4-dieren (n = 19). Deze gegevens komen overeen met literatuurwaarden ^2,28 en waarden gemeten bij dieren die op de plaat worden gekweekt, leverden mediane ontwikkelingstijden op voor L1 15 uur (n = 21), L2 10 uur (n = 15), L3 12 uur (n = 21) en L4 12,5 uur (n = 61) (aangepast van Berger et ^al.18). De kleine vertragingen die zijn waargenomen, zijn waarschijnlijk een gevolg van beeldacquisitie en de daaruit voortvloeiende fototoxiciteit of de verhoogde opsluiting zodra de dieren zijn gegroeid en een vangkanaal zullen vormen.

Ten tweede volgden we de groei van dieren in de L2- en L3-stadia, waarbij we de lengte van de geslachtsklieren kwantificeerden als een uitstekende indicator voor ontwikkelingsprogressie (Figuur 4E, zie Aanvullende film 2 voor een voltijdse cursus). Net als bij de celdeling in de naad, kon de precieze lengte van de geslachtsklieren worden gemeten dankzij de rechte oriëntatie van de dieren, en er werd een consistente groei van de geslachtsklieren gevonden bij alle afgebeelde dieren (n = 19). De eerste VPC-deling in deze experimenten werd 14,26 uur ± 2,47 uur na het begin van het experiment waargenomen (~30 uur na het zaaien), terwijl de tweede 1,46 uur ± 0,13 uur later plaatsvond (n = 19). Deze gegevens komen goed overeen met de literatuurwaarden die zijn vastgesteld op NGM-platen^29,30. Euling en Ambros³⁰ ontdekten dat de eerste deling na ongeveer 29 uur plaatsvond en de tweede ongeveer 3 uur later.

Ten slotte werd de tijd gekwantificeerd waarmee specifieke stadia in de ontwikkeling van de vulva worden bereikt (Figuur 4F, zie Aanvullende Film 3 voor de voltijdse cursus), waarbij specifiek de tijd werd beoordeeld die nodig was om over te gaan van invaginatie (L4.0, t1) naar het midden-L4-stadium (L4.5, t4) volgens de substadia gedefinieerd door Mok et ^al.31. De gemiddelde progressietijd tussen t1-t2 was 3,8 uur ± 1,2 uur, tussen t2-t3 was 3,5 uur ± 1,2 uur en tussen t3-t4 was 2,8 uur ± 1,6 uur (n = 7), wat wijst op een ongeveer lineaire ontwikkelingsprogressie. Net als bij de ontwikkelingstimingtest lijken deze tijden, met name t1-t2, enigszins vertraagd in vergelijking met de gerapporteerde literatuurwaarden (t1-t2: 0,7 uur, t2-t3: 3 uur, t3-t4: 2,3 uur³¹), mogelijk als gevolg van de smalle afmetingen van het apparaat die de vervelling vertragen. Desalniettemin blijft de ontwikkelingstiming zeer consistent bij dieren, en ze gaan allemaal met succes naar volwassenheid.

Compensatie van de beweging van dieren en microscoopdrift
De beweging van dieren in een enkele Z-stack is doorgaans minimaal wanneer de klep op de chip wordt bediend. Van dieren wordt echter niet verwacht dat ze helemaal stil blijven staan. De resterende jitter die in een enkele stapel wordt waargenomen, kan worden gecompenseerd door de druk te verhogen om de klep op de chip te activeren, de gebruikte belichtingstijd te verkorten of de geselecteerde Z-stap te verhogen om de acquisitie van de schoorsteen te versnellen. De acquisitietijd van de stapel kan verder worden verkort door gebruik te maken van een piëzo-Z-drive, wat resulteert in een aanzienlijk snellere Z-beweging in vergelijking met een conventionele microscoopfocusaandrijving, of door gebruik te maken van multi-band filters (bijv. GFP/mCherry) zodat afzonderlijke kleuren kunnen worden verkregen zonder de noodzaak van tijdrovende filtervervangingen. Ter referentie: in de gegeven voorbeelden (Figuur 4 en Aanvullende Film 1, Aanvullende Film 2 en Aanvullende Film 3) was de opslagacquisitietijd doorgaans tussen de 3 en 8 seconden. Resterende beweging kan indien nodig ook worden verwijderd door middel van verschillende beeldregistratiemethoden.

Van dieren op chip wordt verwacht dat ze gestaag groeien. Interessante kenmerken zullen dus onvermijdelijk verschuiven langs de longitudinale kanaalas (Figuur 4A,B, Aanvullende Film 1 en Aanvullende Film 2). Daarom wordt aanbevolen om het beeldvormende gezichtsveld zo in te stellen dat het interessante kenmerk kan uitgroeien tot het gezichtsveld en niet verloren gaat in de loop van een experiment (Figuur 1B en Figuur 4A,B). Als alternatief kunnen dieren worden afgebeeld in meerdere aangrenzende gezichtsveldbogen, die het hele dierenlichaam bestrijken. Dit kan echter extra fototoxiciteit en stress met zich meebrengen. Net als bij Z-motion kunnen verschillende registratieprocedures de beweging van dieren in het kanaal in de loop van de tijd compenseren. Als dieren een grillige beweging langs de lengteas vertonen, die uitgebreider is dan wat aan de groei kan worden toegeschreven, wordt dit waarschijnlijk veroorzaakt door een luchtbel.

Elk apparaat voor langetermijnbeeldvorming bevat zes afzonderlijke beeldvormingseenheden, die elk voor een afzonderlijk experiment kunnen worden gebruikt. Elke eenheid kan maximaal 41 dieren huisvesten en de valkanalen zijn zo geplaatst dat meerdere dieren in één gezichtsveld kunnen worden afgebeeld. Bovendien kunnen meerdere FOV's worden afgebeeld binnen een enkele eenheid of apparaat. Zoals bij alle microscoopmonsters, kan beweging over het monsteroppervlak focusdrift veroorzaken als gevolg van verlies van onderdompelingsmedia. Deze drift kan worden gecompenseerd door een onderdompelingsolie met een lagere viscositeit te gebruiken of door middel van verschillende autofocusmodaliteiten. Het is echter mogelijk dat sommige hardware-autofocussystemen niet werken wanneer ze worden gebruikt met een PDMS-microfluïdisch apparaat, omdat deze de overgang van glas naar een waterig medium als referentiepunt gebruiken (monsterzijde van het afdekglas). Een groot deel van het gezichtsveld is gevuld met siliconen in het apparaat, dat een hogere brekingsindex heeft dan water; Hoewel dit geen invloed heeft op de beeldkwaliteit, kan het wel een negatieve invloed hebben op de autofocus. Bij het afbeelden van een enkel gezichtsveld is de focusdrift die in het apparaat wordt waargenomen minimaal (minder dan 2 μm). Als er overmatige focusdrift wordt waargenomen, kan dit het gevolg zijn van de thermische instabiliteit van het microscoopsysteem of de omgeving, overmatige XY-beweging die meerdere gezichtspunten verkrijgt, of onjuiste montage van het apparaat op de microscoop (zie afbeelding 3A voor voorgestelde montagemechanismen).

Evenzo kunnen overmatige XY-beweging en onjuiste montage ook leiden tot XY-drift. Aangezien het apparaat en het microscoopobjectief zijn verbonden via de dompelvloeistof, kunnen snelle bewegingen in X, Y of Z ervoor zorgen dat er krachten op het apparaat worden uitgeoefend. Als de apparaten correct zijn gemonteerd en er geen externe krachten op inwerken, zijn ze uitzonderlijk stabiel met minimale focusdrift en geen XY-drift.

Ten slotte, als specifieke systeemparameters niet geschikt zijn, kunnen de PDMS-microfluïdische apparaten de ontwikkeling van dieren nadelig beïnvloeden. De levensvatbaarheid wordt beïnvloed door een te hoge klepdruk, hoge fototoxiciteit als gevolg van hoge excitatie-intensiteiten, lange belichtingstijden of korte tijdsintervallen tussen schoorsteenacquisities. Vooral wanneer dit systeem voor het eerst wordt gebruikt, wordt het beoordelen van de levensvatbaarheid van dieren met behulp van een heldere fluorescerende marker of helderveldbeeldvorming ten zeerste aanbevolen, om ervoor te zorgen dat de beeldvormingsconditie de groei van het dier niet beïnvloedt. Zodra dieren zich betrouwbaar ontwikkelen, kunnen de beeldvormingsparameters indien nodig worden gevarieerd.

Afbeelding 1: Indeling van het apparaat en schematische werking. (A) Apparaatoverzicht met een enkele eenheid met de worminlaat (i), de bacteriële voedselinlaat (ii) en de algemene uitlaat (iii). (EEN') Vergrote weergave van het valkanaal in een L2-A-apparaat, waarbij het aantal wormen wordt gemarkeerd dat zichtbaar is in een enkel gezichtsveld bij verschillende vergrotingen (40x-100x). (B) Werkingsprincipe van de klep op de spaan. Als de kabel is uitgeschakeld, wordt de hoogte van het kanaal zo gekozen dat de dieren comfortabel in het vangkanaal kunnen passen. Bij AAN neemt de kanaalhoogte af, waardoor het dier op het dekglas wordt gedrukt, waardoor de gevangen dieren omkeerbaar worden geïmmobiliseerd. Afbeeldingen tonen twee gevangen dieren op de chip met verworven met de on-chip klep UIT en met de klep AAN, waarbij de dieren zichtbaar rechttrekken en uitrekken onder druk. Het bovenste dier correct belast en gericht naar de voedselbron (), en het onderste dier naar weg gericht (X). (C-C") Schematische instelling van het apparaat. (C) Beschikbare apparaatformaten. L1 is geschikt voor dieren van het L1 tot het midden van het L2-stadium, L1-4 voor dieren van het midden-L2 tot het midden van L4-larvale stadium en L2-A voor dieren van het midden-L2-larvale stadium tot de volwassenheid. Schaalbalken zijn (A) 1000 μm, (B) 100 μm en (C) 50 μm. De figuur is gedeeltelijk overgenomen van Berger et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 2: Apparaat instellen en verbinden. (A-I) Schematisch overzicht van het installatieproces. (A) Aansluiting van 1/16" met water gevulde slang op de klepinlaat met behulp van een holle stalen pen (grijs), met het andere uiteinde bevestigd aan het druktoevoersysteem. (B) Vullen van de on-chip hydraulische klep via de off-chip solenoïde en het apparaat enkele minuten onder druk zetten. (C) Deactivering van de druk alvorens door te gaan naar de volgende stappen. (D) Aansluiting van een spuit met bacterieel voedsel op de voedselinlaat met behulp van een slang van 1/32" en een stompe naald van 30 G, gevolgd door het vullen van het apparaat totdat er vloeistof verschijnt bij beide open aansluitingen. (E) Afdichting van de worminlaat en afvaluitlaat met stalen pennen geblokkeerd door een stuk 1/16" slang () en het apparaat onder druk zetten met behulp van de voedselspuit en pomp (via duimschroefafstelling), waarbij de druk gedurende enkele minuten wordt gehandhaafd. (F) Verwijdering van de stekkers van (E), zodat er vloeistofdruppels ontstaan bij elke open verbinding. (G) Aansluiting van de afvalcontainer via een kort stuk 1/16" slang en een holle stalen pen. (H) Bevestiging van een met buffer gevulde spuit aan het hulpmiddel met behulp van een holle stalen pin en een stompe naald van 23 G. Wormen worden in de slang getrokken voordat deze op het apparaat wordt aangesloten, zodat er geen lucht wordt binnengebracht door vloeistofdruppels aan het uiteinde van de inlaat en de slang uit te lijnen. (I) Definitieve installatie met alle apparaatverbindingen tot stand gebracht. (J) Afbeelding van het apparaat met klepslang aangesloten op de inlaat en solenoïde (achtergrond), overeenkomend met (AC). (K) Vergrote weergave van het apparaat met aangesloten voedseltoevoerslangen, met twee vloeistofdruppels (pijlen) op de worminlaat en afvaluitlaat, overeenkomend met (D). (L) Vergrote weergave van het apparaat met aangesloten voedseltoevoerslangen en de worminlaat en afvoer van de afvalstoffen geblokkeerd, overeenkomend met (E). (M) Vergrote weergave van het apparaat met aangesloten afvalslang en container, overeenkomend met (G). (N) Eindmontage met alle slangaansluitingen op hun plaats, overeenkomend met (I). Gedeeltelijk aangepast van Berger et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Hardware setup. (A-A') Voorgestelde montage van het apparaat. (A) Mogelijke houder voor een rechtopstaande microscoop. Apparaten zijn bevestigd aan een rechthoekig, 3D-geprint frame met een grote centrale uitsparing. Twee kleine stroken dubbelzijdige tape worden in eerste instantie op het afdekglas geplaatst, aan weerszijden van het PDMS-gedeelte van het apparaat. Het 3D-geprinte frame wordt vervolgens over het apparaat geplaatst, zodat het PDMS-gedeelte door de uitsparing steekt en het frame stevig op de dubbelzijdige tape wordt gedrukt, waardoor het apparaat permanent aan het frame wordt bevestigd. Het frame houdt het apparaat daarom op een veilige manier vast en wordt zelf op de microscooptafel gehouden met behulp van magneten die in het frame en de objecttafel zijn ingebed. Dit zorgt voor een stabiele montage van het apparaat en voorkomt botsing van het microscoopobjectief met bevestigingsmateriaal. Alle slangen worden naar de voorkant van het apparaat geleid. (EEN') Mogelijke montage voor een omgekeerde microscoop. Een set klemmen houdt het apparaat stevig vast. Zorg ervoor dat de clamps drukken het apparaat op het stage-inzetstuk om XY-beweging tijdens het gebruik te voorkomen. (B) Weergave van de onderdelen van het druksysteem. (i) 6 mm OD polyurethaan slang aangesloten op een drukbron. (ii) G1/8-naar-6 mm push-in-adapter die de slang (i) verbindt met de drukregelaar (iii). De slang wordt vervolgens aangesloten op een solenoïde (vi) via een M5-naar-6 mm push-in-adapter (v), en ten slotte wordt de slang aangesloten op een luer-lock-naar-weerhaakconnector (vii) en een stompe 23 G-naald (viii) op de 1/16" OD-slang die is aangesloten op het microfluïdische apparaat. (C) Schematisch overzicht van de elektronische aansluitingen en het gemonteerde druksysteem. (i) De TTL-trigger (+3.3-5 V) gegenereerd door een Arduino, een DAq-kaart of een andere microcontroller, samen met een geschikte voeding (ii, 24 VDC) is aangesloten op een MOSFET (iii) en de elektronische aansluitingen van de solenoïde zoals weergegeven in het schema, met een flyback-diode (iv) aangesloten op de voedingsaansluitingen van de solenoïdes. Zodra een TTL-signaal van de microcontroller naar de poort van de MOSFET is verzonden, wordt +24 VDC toegepast op de normaal gesloten solenoïde en wordt de hydraulische klep op de chip opgeblazen. Zodra het TTL-signaal is verwijderd, wordt de druk opgeheven en loopt de hydraulische klep op de chip leeg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve resultaten. (A) Dier met een epitheliale junctiemaker (ML2615, dlg-1(mc103[dlg-1::gfp])) die groeit van nachtelijke hongersnood tot vroeg/midden L2-larvale stadium, met behulp van het L1-apparaat. Zichtbaar zijn de delende naadcellen, evenals de P-cellen, die migreren en zich delen naar het late L1-larvale stadium. (B) Dieren die groeien vanaf het late L1-larvale stadium tot het vroege L4-stadium, met behulp van het L1-4-apparaat. Zichtbaar is een marker voor de 1°-fated vulva precursor cell (VPC) (AH1187, arIs92[egl-17::cfp]), met een enkele cel die vroeg in het experiment zichtbaar is, gevolgd door twee rondes van zichtbare celdelingen in het L3-larvale stadium. (C) Dieren die groeien vanaf het late L2-larvale stadium tot de vroege volwassenheid, met behulp van het L2-A-apparaat. Zichtbaar is een epitheliale junctiemaker (AH5786, hmr-1(cp21[hmr-1::gfp + LoxP])), die het zich ontwikkelende vulvale weefsel markeert dat verschillende toroïdale structuren vormt, en een gecombineerd beeld met een marker voor de baarmoederankercel (AC) (AH5786, qyIs50[Pcdh-3>mCherry::moeABD, unc-119(+)]) die het vulvale weefsel binnendringt tegen het einde van het L3-larvale stadium en de weefsels verbindt. Voor alle experimenten (A-C) wordt het gezichtsveld in eerste instantie zo ingesteld dat slechts een deel van de dieren zichtbaar is. Naarmate het experiment vordert, zal het dier meer van het kanaal vullen, waarbij de kenmerken langs de kanaalas verschuiven als gevolg van de groei van het dier. (D) Tijdstip waarop de afzonderlijke naadceldelingen zich beginnen te delen tijdens het L1-larvale stadium (n = 12). Invoegen markeert naadcelidentiteiten (H1-V6) langs de voorste-achterste lichaamsas. (E) Toont de groei van de geslachtsklieren in de tijd voor dieren in figuur 4B (n = 19). (F) Toont de tijd die nodig is om 4 verschillende ontwikkelingstijdstippen in vulvale morfogenese (t1-t4) te bereiken, wat een consistente overgang aangeeft voor alle afgebeelde dieren (n = 7). Schaalbalken zijn (A,B) 50 μm en (C) 25 μm. Zie Aanvullende Film 1, Aanvullende Film 2 en Aanvullende Film 3 voor de voltijdse cursus. De boxplots tonen de mediaanwaarden (rode lijnen) met bovenste en onderste kwartielen en balken die de extremen van de verdeling aangeven, exclusief uitschieters. De figuur is een bewerking van Berger et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende film 1: Enkele C. elegans-larve die zich ontwikkelt van nachtelijke hongersnood tot het vroege L2-stadium. Weergegeven worden geprojecteerde epifluorescentiebeelden met maximale intensiteit (totale hoogte van de projectie is 1,5 μm), in verder onbewerkt formaat. Zichtbaar zijn alle naad-, celdeling- en fusie-gebeurtenissen die zich voordoen in het gespecificeerde stadium (boven). De kenmerken worden geschetst met behulp van de DLG-1::GFP-markering (epitheliale junctie) met tussenpozen van 15 minuten gedurende in totaal 25 uur. De film is hergebruikt van Berger et ^al.18. Klik hier om deze film te downloaden.

Aanvullend filmpje 2: Enkele larve ontwikkelt zich van het late L1-stadium tot het vroege L4-stadium, waarbij een EGL-17::CFP-marker tot expressie komt (1°-fated vulvale precursor cell (VPC)). In het begin van L2 (~400 min) manifesteert EGL-17::CFP-fluorescentie zich in P6.p, waarbij de intensiteit voortdurend toeneemt. Tijdens L3 ondergaat P6.p twee opeenvolgende delingsrondes, waarbij de 1-cel, 2-cel en 4-cel stadia van vulva-ontwikkeling worden gevormd. De beelden worden weergegeven met tussenpozen van 30 minuten gedurende in totaal 34 uur. De film is hergebruikt van Berger et ^al.18. Klik hier om deze film te downloaden.

Aanvullend filmpje 3: Bovenaanzicht: Z-projectie van de zich ontwikkelende vulva vanaf het L3-stadium tot aan de L4/volwassen overgang. Onderaanzicht: X-projectie van dezelfde vulva in de tijd. Beide weergaven tonen de initiële deling van de VPC's, gevolgd door invaginatie, vorming en vergroting van de ringkernen, gevolgd door collaps tijdens eversie. Epifluorescentiebeelden worden weergegeven na bijsnijden, deconvolutie, registratie en projectie. De kenmerken worden geschetst door de HMR-1::GFP-markering (hypodermis en VPC's) en de mCherry::moeABD-markering (die de AC aangeeft). De film is hergebruikt van Berger et ^al.18. Klik hier om deze film te downloaden.

Aanvullend bestand 1: CAD-bestand voor het L1-apparaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: CAD-bestand voor het L1-4-apparaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: CAD-bestand voor het L2-A-apparaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: CAD-bestand voor het L3-A-apparaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: CAD-bestand voor het L4-A-apparaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: CAD-bestand voor de structuur van de voedseldistributie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 7: CAD-bestand voor de kleppenlegger. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit artikel heeft de werking beschreven van een uniek microfluïdisch beeldvormingsplatform voor de lange termijn, dat geschikt is voor beeldvorming met hoge resolutie en het volgen van verschillende ontwikkelingsprocessen in C. elegans tijdens alle vier de larvale stadia tot in de vroege volwassenheid¹⁸. Het vermogen om ontwikkelingsprocessen in de loop van de tijd in vivo te volgen, met behulp van deze beeldvormingsmethode en andere, is onmisbaar geworden op veel gebieden van C. elegans-onderzoek en heeft het mogelijk gemaakt om voorheen ontoegankelijke vragen te beantwoorden 23,24,29.

In tegenstelling tot traditionele beeldvormingsmethoden met behulp van agarpads en eerder gepubliceerde op microfluïdica gebaseerde beeldvormingsstrategieën op lange termijn, behoudt deze benadering de identiteit en oriëntatie van de worm gedurende het hele experiment, waardoor complexe ontwikkelingsprocessen in de loop van de tijd kunnen worden gevolgd. Ongeacht het ontwikkelingsstadium zijn dieren beperkt tot een van de 41 parallelle valkanalen, elk aangesloten op een voedseltoevoer op de chip en afgedekt door een grote hydraulische klep. Immobilisatie van alle gevangen wormen vindt plaats door het opblazen van de hydraulische klep, waarbij de wormen alleen tijdens het verkrijgen van beelden op het afdekglas worden gedrukt. High-throughput beeldvorming is mogelijk dankzij de smal uit elkaar geplaatste val channel array, waarbij meerdere dieren zichtbaar zijn binnen een enkel gezichtsveld. De beeldvormingsapparatuur voor de lange termijn is compatibel met de meeste microscoopopstellingen, waarvoor minimale extra hardware nodig is (minder dan $ 1000) en geen aanpassingen aan bestaande hardware. De bediening van de apparaten is opzettelijk eenvoudig, dus alle gebruikers moeten het snel kunnen leren door het bovenstaande protocol en de geschetste resultaten te volgen.

Kortom, dieren kunnen op de chip worden afgebeeld in maximaal 2,5 larvale stadia (Figuur 1C). Dieren worden in eerste instantie gesynchroniseerd en ofwel direct op de chip geladen (L1-apparaat) of op de NGM-plaat gezaaid tot het gewenste ontwikkelingsstadium (L1-L4- en L2-A-apparaten). Dieren op de chip worden gevoed met behulp van een sterk geconcentreerde bacteriesuspensie en geïmmobiliseerd met behulp van een hydraulische klep op de chip die wordt bediend door de beeldvormingssoftware (Figuur 1B). Dieren worden met behulp van een spuit in de vangkanalen gemanoeuvreerd, waarbij dieren zorgvuldig met de kop naar de voedseltoevoer worden gericht en ten slotte dieren aan het einde van de valkanalen worden gevangen (Figuur 1A en Figuur 2). Er moet voor worden gezorgd dat er geen lucht in de spuiten, stompe naalden en slangen zit, omdat luchtbellen de positie van het dier gemakkelijk kunnen verstoren. Apparaten zijn compatibel met de meeste beeldvormingsmodaliteiten^18,19,24, aangezien het PDMS-materiaal zeer transparant, niet-fluorescerend en afgedicht is tegen een dun dekglas (Afbeelding 4, Aanvullende film 1, Aanvullende film 2 en Aanvullende film 3). Voorzichtigheid is echter geboden bij het selecteren van beeldvormingsomstandigheden, aangezien lange belichtingstijden en hoge excitatie-intensiteiten de levensvatbaarheid van dieren gemakkelijk zullen beïnvloeden en zullen resulteren in fotobleken.

Naast de gepresenteerde versie van deze beeldvormingsmethode zijn er verschillende aanpassingen aan het protocol mogelijk en al beschikbaar. De meest eenvoudige aanpassing is het vervangen van de standaard bacteriestammen, bijvoorbeeld door bacteriën die RNAi tot expressie brengen¹⁸ of bacteriën met andere voedingswaarden³². Bacteriestammen kunnen gemakkelijk worden uitgewisseld door het Optiprep-gehalte aan te passen om rekening te houden met verschillen in dichtheid. Evenzo kan een willekeurig aantal verbindingen aan het bacteriële voedsel worden toegevoegd, bijvoorbeeld auxine, voedingsstoffen of kleine molecuul geneesmiddelverbindingen, en hun effect wordt direct in vivo waargenomen, zonder dat er wijzigingen in het protocol nodig zijn. In het bijzonder is een media-uitwisselingsapparaat ontwikkeld voor door auxine geïnduceerde eiwitafbraak of elke toepassing die getimede of omkeerbare blootstelling nodig heeft door een voedselinlaat aan de lay-out van het apparaat toe te voegen zonder de geometrie of werking te veranderen. De extra inlaat maakt het mogelijk om eenvoudig te schakelen tussen twee verschillende omstandigheden, bijv. auxine en geen auxine, die op dezelfde manier op het apparaat zijn aangesloten als hier weergegeven voor een enkele voedselbron, en de resulterende veranderingen worden direct waargenomen. Er werden ook apparaatvarianten ontwikkeld waarbij de hydraulische klep niet wordt gedeeld over alle eenheden op een apparaat, maar voor elke eenheid wordt gescheiden, zodat meerdere omstandigheden binnen hetzelfde apparaat kunnen worden afgebeeld en afzonderlijk kunnen worden geëxperimenteerd, waardoor de potentieel schadelijke effecten van lange klepbedienings- en acquisitietijden worden verminderd. Ten slotte werden, naast de oorspronkelijke apparaatvarianten beschreven in Berger et ^al.18, twee nieuwe apparaatvarianten ontwikkeld, L3-A en L4-A (hier geïntroduceerd), waardoor beeldvorming mogelijk is vanaf het midden van L3 of midden L4 stadium tot de volwassenheid. Het doel van deze aanpassingen is om de starttijd van een experiment uit te stellen tot een later larvale stadium, zodat grotere dieren kunnen worden geladen in toepassingen waar de eerdere ontwikkelingsstadia niet van belang zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3/2 klep	Distrelec	154-22-898 en 154-22-899	Alternatief voor bovenstaande. Elektromagneetschakelaar die de drukregelaar met de op-chipklep verbindt.
Arduino	Distrelec	301-01-956	Optionele microcontroller afhankelijk van de geselecteerde controller en interface.
Bacto-Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705	Voor L Broth productie.
Bacto-Yeast	Thermo Fisher Scientific	212750	Voor L Broth productie.
Blunt naald 23G	Gonano Dosiertechnik	GGA723050	Blunt naald die de 1/16" slang verbindt met een spuit.
Blunt naald 30G	Gonano Dosiertechnik	IG-TE730050	Blunt naald die de 1/32" slang verbindt met een spuit.
C. elegans Construct 1	NA	NA	AH5786 LGI: hmr-1(cp21[hmr-1::gfp + LoxP]) Marston, D.J. et al. MRCK-1 drives apical constriction in C. elegans by linking developmental patterning to force generation. Curr. Biol. 26 (16), 2079-2089. 2016.
C. elegans Construct 2	NA	NA	AH1187 LGII: arIs92[egl-17::cfp] Yoo, A.S., Bais, C., Greenwald, I. Crosstalk between the EGFR and LIN-12/Notch pathways in C. elegans vulval development. Science. 303 (5658), 663-666. 2004.
C. elegans Construct 3	NA	NA	AH5786 LGV: qyIs50[Pcdh-3>mCherry::moeABD, unc-119(+)] Ziel, J.W., Hagedorn, E.J., Audhya, A., Sherwood, D.R. UNC-6 (netrin) orients the invasive membrane of the anchor cell in C. elegans. Nat. Cell Biol., 11 (2), 183-189. 2009.
C. elegans Construct 4	NA	NA	ML2615 LGX: dlg-1(mc103[dlg-1::gfp]) Vuong-Brender, T.T.K., Suman, S.K., Labouesse, M. The apical ECM preserves embryonic integrity and distributes mechanical stress during morphogenesis. Development. 144 (23), 4336-4349. 2017.
Kabel	Distrelec	143-46-644	Nodig als de elektromagneet van distrelec wordt geselecteerd. Kabel die de elektromagneet met de MOSFET verbindt.
Chlorotrisylaan	Sigma Aldrich	386529-25ML	Sileen voor wafer passivatie.
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8667	Voor  S-Basal productie.
Flyback diode	Distrelec	110-52-628	Flyback diode die de microcontroller beschermt.
Holle stalen pin	Gonano Dosiertechnik	GGA7R23050	23G holle stalen pin die de 1/16" slang verbindt met het apparaat.
L Broth	NA	NA	Bereid in huis volgens standaardrecept. 10 g Bacto-tryptone, 5 g Bacto-gist, 5 g NaCl, H2O tot 1 liter, pH tot 7,0 met 1 M NaOH
Long-term Imaging Device L1	NA	NA	Long-term imaging apparaat voor L1 tot vroege/middelste L2 larven. Gemaakt in huis, beschikbaar op verzoek. Ook beschikbaar als media-uitwisselingsvariant.
Long-term Imaging Device L1-4	NA	NA	Long-term imaging apparaat voor middelste L1 tot middelste L4 larven. Gemaakt in huis, beschikbaar op verzoek. Ook beschikbaar als media-uitwisselingsvariant.
Long-term Imaging Device L2-A	NA	NA	Long-term imaging apparaat voor middelste L2 tot volwassenheid (eversio). Gemaakt in huis, beschikbaar op verzoek. Ook beschikbaar als media-uitwisselingsvariant.
Long-term Imaging Device L3-A	NA	NA	Long-term imaging apparaat voor middelste L3 tot volwassenheid (eversio). Gemaakt in huis, beschikbaar op verzoek. Ook beschikbaar als media-uitwisselingsvariant.
Long-term Imaging Device L4-A	NA	NA	Long-term imaging apparaat voor middelste L4 tot volwassenheid (eversio). Gemaakt in huis, beschikbaar op verzoek. Ook beschikbaar als media-uitwisselingsvariant.
M9 Buffer	NA	NA	Bereid in huis volgens standaardrecept.
MOSFET	Distrelec	303-41-391	Metaal-oxide-halfgeleiderveldeffecttransistor, gebruikt om de 24VDC die nodig is voor de elektromagneet te schakelen.
NGM platen	NA	NA	Bereid in huis volgens standaardrecept.
Nylon Luer-fitting	Fisher Scientific	11776048	Adapter van OD 6mm slang naar 23G blunt naald.
Optiprep	Sigma Aldrich	D1556	Dichtheidsaanpassingsvloeistof.
PDMS	Ameba	Elastosil RT601A/B	PDMS-elastomeerkit.
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443	Niet-ionogene oppervlakteactieve stof.
Kaliumdiwaterstoffosfaat	Sigma Aldrich	1.37039	Voor  S-Basal productie.
Kaliumwaterstoffosfaat	Sigma Aldrich	1.05099	Voor  S-Basal productie.
Voeding 24VDC	Distrelec	301-63-304	24VDC voeding. Selecteer een voeding die geschikt is voor de geselecteerde elektromagneet.
Precisie drukregelaar	Distrelec	154-23-578	Alternatief voor bovenstaande. Drukregelaar.
Drukmeter G1/8	Distrelec	154-23-643	Drukmeter die op de drukregelaar wordt bevestigd.
PU Slang OD 6mm	Distrelec	154-23-866	Slang die de drukbron en regelaar verbindt, evenals de regelaar en elektromagneetschakelklep.