Hier presenteren we het Spatel Montevideo-protocol voor het vitrificeren van pre-implantatie-embryo's bij muizen en schapen, bestaande uit een zelfgemaakte spatel en met behulp van zelfgemaakte oplossingen. Embryo's worden snel in evenwicht gebracht in twee cryoprotectieve oplossingen van toenemende concentratie, op de spatel geladen, ondergedompeld in vloeibare stikstof en ten slotte verzegeld met een rietje van 0,5 ml.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Spatel Montevideo Apparaat voor de verglazing van embryo's van zoogdieren
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze studie beschrijft een efficiënte en kosteneffectieve vitrificatiemethode voor cryopreservatie van muizen- en schapenembryo's, bekend als de Spatel Montevideo (MVD). Dit protocol maakt gebruik van een zelfgemaakte spatel als draagapparaat, dat wordt bereid met een gel-loader-tip. Embryo's worden snel in evenwicht gebracht in twee zelfgemaakte cryoprotectieve oplossingen met toenemende concentratie, in de spatel geladen en vervolgens direct ondergedompeld in vloeibare stikstof. Ongeveer 30-40 muizenembryo's in de pre-implantatiefase kunnen op de spatel worden geladen, die vervolgens wordt verzegeld met een rietje van 0,5 ml. Het gebruik van spatels in plaats van cryobuizen, die vaak worden gebruikt om verglaasde embryo's te bewaren, optimaliseert de ruimte in de vloeibare stikstofdewars. Bovendien vereist het opwarmingsproces alleen een zelfgemaakte sucrose-oplossing met afnemende concentratie om de embryo's te rehydrateren en hun morfologie te herstellen. Ons laboratorium gebruikt de Spatel Montevideo al meer dan 10 jaar met succes voor pre-implantatie-embryo's van muizen en schapen. De Spatel Montevideo heeft een gemiddeld herstelpercentage (herstelde/gevitrificeerde embryo's) van 84% en een overlevingspercentage (levensvatbare/herstelde embryo's) van 97% aangetoond in muizenembryo's. Verglazing van muizenembryo's heeft betere resultaten opgeleverd dan langzaam invriezen, hoewel er geen verschillen in reproductieve uitkomsten (zwangerschap, bevalling en geboortecijfers) zijn waargenomen. Bij embryo's van schapen zijn vergelijkbare overlevings- en embryoontwikkelingspercentages bereikt met Spatel Montevideo in vergelijking met een commercieel apparaat. Hoewel het zwangerschapspercentage hoger was voor het commerciële apparaat, was het overlevingspercentage van het lam niet significant verschillend tussen de apparaten. De Spatel Montevideo-vitrificatiemethode is een eenvoudige cryopreservatietechniek die kan worden gebruikt om overtollige embryo's op te slaan, een back-up te maken van genetisch gemodificeerde muizenlijnen en schapenmodellen en hun uitwisseling tussen onderzoekers over de hele wereld te vergemakkelijken.
Inleiding
De efficiëntie van genetisch gemodificeerde (GM) dierlijke generatie is aanzienlijk toegenomen als gevolg van de ontwikkeling van op endonuclease gebaseerde methoden, met name CRISPR/Cas9. Veel laboratoria over de hele wereld produceren verschillende genetisch gemodificeerde muizen- en rattenlijnen die moeten worden gecryopreserveerd om genetische drift te voorkomen en de integriteit van het oorspronkelijke fenotype1 te behouden. Bovendien elimineert archivering de noodzaak van constant fokken, wat vaak resulteert in buitensporige aantallen dieren. Sommige laboratoria sturen genetisch gemodificeerde muizenlijnen als ingevroren embryo's of sperma naar internationale opslagplaatsen, waardoor de uitwisseling van deze modellen wordt vergemakkelijkt en het transport van levende dieren wordt vermeden. Dit zorgt voor toegankelijkheid van lijnen zonder het herhaaldelijk genereren van identieke genetisch gemodificeerde diermodellen2. Om deze redenen is cryopreservatie van embryo's en sperma van het grootste belang in elke faciliteit voor genetisch gemodificeerde dieren. Over het algemeen heeft cryopreservatie van embryo's de voorkeur voor het opslaan van genetisch gemodificeerde lijnen, omdat embryo's het volledige diploïde genoom met modificaties bevatten en gemakkelijk kunnen worden hersteld via embryotransfer.
Verglazing is een niet-evenwichtsproces dat wordt gekenmerkt door een onbalans tussen water dat de cel binnenkomt en water dat extracellulaire kristallen eromheen vormt. Deze methode voorkomt de vorming van intracellulaire ijskristallen en onderscheidt het van de langzame bevriezingsmethode (SLF)3 (zie figuur 1). De hoge concentratie cryoprotectanten en direct contact met vloeibare stikstof (LN2) maken een ultrasnelle afkoeling mogelijk (~40 °C/s), waardoor binnen enkele seconden een glasvochtachtige toestand van de monsters wordt bereikt. Bovendien is vitrificatie sneller, gemakkelijker en goedkoper dan langzaam invriezen4. Het vereist minimaal LN2 en maakt meestal gebruik van eenvoudige apparatuur die commercieel kan worden gekocht of zelfgemaakt5 (zie figuur 1).
Bovendien is het opwarmingsproces over het algemeen snel en repliceerbaar. Het moet snel worden uitgevoerd om cryoprotectieve toxiciteit te voorkomen en om de glasvochttoestand te behouden3. Bij het invriezen van embryo's houden veel laboratoria rekening met het gemak van het draagapparaat, de betrouwbaarheid, robuustheid, bewaarcapaciteit en kosten.
We geven de voorkeur aan de vitrificatiemethode voor spatels met een minimaal volume voor routinematige cryopreservatie van schapen- en muisembryo's, met behulp van het Spatel Montevideo (MVD)-apparaat6. Aanvankelijk gebruikten we de langzame bevriezingsmethode7 , maar al snel gingen we over op vitrificatie. Om een eenvoudiger en ruimtebesparender apparaat voor de LN2 dewar te creëren, hebben we de zelfgemaakte spatel van Tsang en Chow (2009)8, die in een cryobuis is gestoken, aangepast om de Spatel MVD te ontwikkelen die is afgedicht met een rietje van 0,5 ml (zie materiaaltabel). De spatel is voorzien van een gel-loader-punt (zie Materiaaltabel), waar een platform van ongeveer 1 mm² wordt gevormd door de punt voorzichtig te smelten met een fijne tang, waardoor een bloembladachtige plaat ontstaat voor het laden van de embryo's. Dit platform biedt plaats aan maximaal 40 muizenembryo's in een kleine vitrificatiedruppel. Een identificatieplugstang (zie Materiaaltabel) wordt in het open uiteinde van de gel-loader-tip gestoken.
Het doel van deze methode is om embryo's te verglaasen op een eenvoudige, snelle en goedkope manier die bovendien ruimte bespaart in de stikstofdewar. Dit systeem wordt al vele jaren met succes gebruikt en biedt uitstekende overlevingspercentages van embryo's (~97%) en reproductieve resultaten, met name in muizenembryo's. Omdat Spatel MVD in het laboratorium wordt bereid, is het een goedkope methode in vergelijking met commerciële apparaten9. Bovendien bespaart het ruimte in de stikstofdewar in vergelijking met het gebruik van cryobuizen 8,10.
Figuur 1: Vergelijking van de twee belangrijkste technieken die worden gebruikt voor cryopreservatie van embryo's. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Crispo et al.1. Gemaakt in BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dieren die werden gebruikt om muizenembryo's te verkrijgen, werden gehuisvest en behandeld volgens de nationale wet 18.611 en de internationale richtlijnen voor dierenverzorging11. Het experimentele protocol (vergunningsnummer #007-18) werd op het juiste moment goedgekeurd door het Institut Pasteur de Montevideo Animal Care and Use Committee (schriftelijke toestemming werd gegeven). Experimentele protocollen voor eicellen/embryo's van schapen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care Committee Fundación IRAUy (protocol #001-2017), in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen12 en werden uitgevoerd in overeenstemming met de internationale richtlijnen voor dierenverzorging11.
1. Verglazing (Figuur 2)
- Spatel MVD voorbereiding
- Kort de punt van de gellader in (zie Materiaaltabel) door de eerste 10 mm en de puntkegel af te snijden.
OPMERKING: Dit zorgt voor een kortere, rechte punt, waardoor de uiteindelijke afdichting met het rietje van 0.5 ml wordt vergemakkelijkt (zie materiaaltabel). - Houd het uiteinde van de gel-loader-punt vast met de #5-tang van de horlogemaker (zie materiaaltabel) op ongeveer 1,0 cm van de punt. Plaats de punt voorzichtig in de vlam van een bunsenbrander (zie materiaaltabel) en houd deze 8-10 s vast om een bloembladachtig platform van ongeveer 1 mm2 te vormen.
- Haal van de vlam en houd deze 5 s stevig vast met de tang.
- Controleer met een stereomicroscoop (zie Materiaaltabel) of het bloembladachtige platform (~ 1 mm2) is gevormd en de distale rand is afgedicht.
OPMERKING: Het platform moet aan het distale uiteinde gesloten zijn om LN2-infiltratie tijdens vitrificatie te voorkomen. Zorg ervoor dat het platform schoon is en vrij van plastic draden. Als het te klein is of draden heeft, knipt u de punt af en herhaalt u de procedure. - Herhaal de stappen 1.1.1-1.1.4 om het benodigde aantal spatels voor te bereiden (1 spatel = maximaal 40 muizenembryo's).
- Steriliseer de spatels met behulp van ultraviolette (UV) stralen of ethyleenoxide en bewaar ze in een steriele buis of doos.
- Op de dag van de vitrificatie haalt u de spatels op en hanteert u ze aan de andere kant van het platform. Steek een identificatiestaaf (zie Materiaaltabel) in elke spatel en plaats deze op de basis van de stereomicroscoop. Label de staaf met een permanente marker of een sticker die bestand is tegen vloeibare stikstof.
NOTITIE: Vermijd altijd het aanraken van het platform bij het hanteren van de spatels. De totale lengte van het complete apparaat (spatel + rietje van 0,5 ml + identificatiestaafje) mag niet meer bedragen dan 1 cm van de lengte van de beker.
- Kort de punt van de gellader in (zie Materiaaltabel) door de eerste 10 mm en de puntkegel af te snijden.
- Bereiding van vitrificatieoplossingen
- Bereid de FS-oplossing voor: Los 1,5 g dichtheidsgradiëntmedium (zie materiaaltabel) en 0,85 g sucrose (zie materiaaltabel) op in 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; zie materiaaltabel). Verwarm in een kokend waterbad tot het volledig is opgelost en steriliseer vervolgens met een filter van 0.22 μm (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Deze oplossing kan maximaal 6 maanden bij 4 °C worden bewaard. - Bereid de pre-vitrificatieoplossing (PV) voor: Meng op de dag van de vitrificatie 10% ethyleenglycol (zie materiaaltabel), 10% dimethylsulfoxide (zie materiaaltabel) en 80% M2-medium (zie materiaaltabel). Een totaal volume van 100 μL is nodig voor 5 spatels.
- Bereid de vitrificatieoplossing (V) voor: Combineer op de dag van de vitrificatie 15% ethyleenglycol, 15% dimethylsulfoxide, 10% M2-medium en 60% FS-oplossing. Een totaal volume van 100 μL is nodig voor 5 spatels.
- Bereid de FS-oplossing voor: Los 1,5 g dichtheidsgradiëntmedium (zie materiaaltabel) en 0,85 g sucrose (zie materiaaltabel) op in 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; zie materiaaltabel). Verwarm in een kokend waterbad tot het volledig is opgelost en steriliseer vervolgens met een filter van 0.22 μm (zie materiaaltabel).
- Embryo dehydratatie en vitrificatie proces
- Bereid LN2 voor: Giet LN2 in een geschikte container (bijv. een geïsoleerde polystyreencontainer van 10 cm x 30 cm x 20 cm) en plaats zoveel rietjes van 0.5 ml als spatels die moeten worden gebruikt.
OPMERKING: Om de visualisatie van het spatelplatform tijdens manipulatie onder LN2 te vergemakkelijken, wordt voorgesteld om een gekleurde, aan de onderkant geïsoleerde polystyreencontainer te gebruiken om een contrasteffect te creëren.
LET OP: Draag een geschikte veiligheidsbril en handschoenen (zie Materiaaltabel) bij het hanteren van LN2. - Oplossingen bereiden: Plaats op een plastic petrischaal van 100 mm (zie materiaaltabel) de volgende druppels: 100 μL M2, 20 μL PV-oplossing en 20 μL V-oplossing voor elke spatel.
- Verglaasde embryo's: Plaats de te vitrificeren embryo's in de M2-druppel. Behandel 30-40 embryo's per keer, incubeer ze 30 s in de PV-oplossing en laat ze vervolgens nog eens 30 s in de V-oplossing druppelen bij kamertemperatuur (RT).
- Gebruik een capillair van getrokken glas (zie Materiaaltabel) met een aspiratorbuis (zie Materiaaltabel). Laad het capillair voor met ten minste 1 μl van de betreffende oplossing voordat u de embryo's plaatst.
OPMERKING: Embryo's bevinden zich op verschillende hoogtes in de druppels, dus pas de stereomicroscoopmicrometer aan om ze te lokaliseren. Haal embryo's op uit elke druppel als er nog 10 s over is. Alle embryomanipulaties moeten onder de stereomicroscoop worden uitgevoerd. - Laad embryo's: Zuig de embryo's op met een minimale V-oplossing (bijv. ~ 0.1 μL) en plaats ze snel op het spatelplatform.
- Onderdompeling in LN2: Na het laden van de embryo's dompelt u het spatelplatform onmiddellijk onder in LN2 gedurende 5 s (houd de spatel met de hand vast, aan de staaf). Vervolgens, terwijl u de spatel in LN2-dampen houdt, sluit u deze af met een rietje van 0,5 ml met behulp van een lang roestvrijstalen pincet (zie materiaaltabel).
NOTITIE: Verwijder LN2 van het rietje voordat u het afdicht om uitzetting tijdens het opwarmen te voorkomen. Zorg ervoor dat de spatel en het rietje goed zijn uitgelijnd om contact tussen de embryodruppel en de strowand te voorkomen. Voor het gemak kunnen verzegelde spatels in de LN2-container blijven totdat alle spatels zijn geladen met embryo's, en indien nodig opnieuw worden bijgevuld met LN2 . - Herhaal de procedure: Herhaal stap 1.3.3 tot 1.3.7 voor elke groep embryo's, met behulp van een vers paar PV- en V-druppels.
- Opslag: Breng de spatels over naar bekers (zie Materiaaltabel) en vervolgens naar een LN2 opslagdewar (zie Materiaaltabel).
- Bereid LN2 voor: Giet LN2 in een geschikte container (bijv. een geïsoleerde polystyreencontainer van 10 cm x 30 cm x 20 cm) en plaats zoveel rietjes van 0.5 ml als spatels die moeten worden gebruikt.
Figuur 2: Schema van het vitrificatieproces met behulp van Spatel MVD. Zie de tekst voor meer details. Gemaakt in BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/x96y902. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Opwarming (Figuur 3)
- Voorbereiding van de oplossing
- Bereid een sucroseoplossing van 1 M voor en los 0,85 g sucrose op in 2,5 ml M2-medium. Steriliseer de oplossing met een filter van 0,22 μm.
OPMERKING: Deze oplossing kan worden bereid en bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 1 week. - Bereid 0,5 M en 0,25 M sacharoseoplossingen door de 1 M sacharoseoplossing te verdunnen met het juiste volume M2-medium.
- Houd de sucroseoplossingen op een hete plaat op 37 °C (zie Materiaaltabellen) totdat het opwarmen begint.
- Bereid een sucroseoplossing van 1 M voor en los 0,85 g sucrose op in 2,5 ml M2-medium. Steriliseer de oplossing met een filter van 0,22 μm.
- Voorbereiding warmhoudplaat
- Plaats op een plastic petrischaaltje van 100 mm de volgende druppels oplossing: een druppel van 500 μl van 0,5 ml sacharose, een druppel van 50 μl van 0,5 ml sacharose en een druppel van 50 μl van 0,25 miljoen sacharose voor elke op te warmen spatel. Doe drie druppels M2 medium (elk 100 μL) om te wassen.
- Opwarmen proces
OPMERKING: Het opwarmingsproces vindt plaats bij RT, bijv. 20-22 °C op de basis van een stereomicroscoop.- Haal de verzegelde spatels uit de dewar. Plaats ze in een geschikte container met LN2. Zie figuur 3.
- Plaats de warmhoudplaat op de stereomicroscoop. Houd een voor een de basis van de spatel vast met een roestvrijstalen pincet en trek met een gehandschoende hand de identificatiestaaf en vervolgens het rietje eruit. Dompel het platform met de embryo's snel in de 0,5 M sucrosedruppel van 500 μL.
- Zorg ervoor dat alle embryo's in de druppel zijn gevallen; Beweeg indien nodig de spatel voorzichtig om ze los te maken. Laad de embryo's in een capillair van getrokken glas, plaats ze in de druppel van 50 μL van 0,5 M sucrose-oplossing en incubeer gedurende 2 minuten.
- Plaats de embryo's in de druppel van 50 μL van 0,25 M sucrose-oplossing en incubeer nog 2 minuten.
OPMERKING: Voordat u de embryo's in elke oplossing plaatst, moet u het capillair voorladen met de te gebruiken oplossing. - Was ten slotte de embryo's drie keer in verschillende druppels M2-medium om de sucrose te verwijderen.
- Incubeer de embryo's onder omstandigheden die geschikt zijn voor elke soort gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
Figuur 3: Schema van het opwarmingsproces van de spatel MVD. Zie de tekst voor meer details. Gemaakt in BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/k91k191. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We gebruikten aanvankelijk de traditionele langzame invriesmethode op basis van propyleenglycoloplossingen, rietjes en vriesapparatuur met gecontroleerde snelheid7. Nadat we de vitrificatiemethode echter als een potentieel eenvoudigere en kosteneffectievere optie hadden beschouwd, hebben we een onderzoek uitgevoerd om de resultaten van traditioneel langzaam invriezen (SLF) versus Spatel MVD te vergelijken in 8-cellige in vivo afgeleide en 2-cellige in...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De Spatel MVD is een eenvoudig te monteren, goedkoop vitrificatieapparaat met een minimaal volume met een hoge embryo-bewaarcapaciteit en een optimale dewarbezetting van vloeibare stikstof. Deze methode heeft bewezen eenvoudig, snel en robuust te zijn. Gemiddeld hebben we niet alleen hoge embryoherstel- en overlevingspercentages van verglaasde embryo's bereikt (~90%), maar ook goede reproductieve resultaten bij het uitvoeren van embryotransfer bij muizen (~80% zwangerschapspercentage en ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Wij danken Alejo Menchaca voor zijn bijdrage aan de ontwikkeling van de Spatel MVD. GS ontving financiering van het Biotechnology Postgraduate Program - Facultad de Ciencias - Universidad de la República (https://webmasterbiotecnol.wixsite.com/biotec1) (Subsidienummer: GS 2437 347). GS, MNM en MC ontvingen financiering van FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur (https://focem.mercosur.int/es/) (Subsidienummer: COF 03/11). GS en MC zijn fellows van Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay. (https://www.anii.org.uy/). De financiers (Biotechnology Postgraduate Program - Facultad de Ciencias -Universidad de la República; FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur; Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay) speelde geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm filter | Sartorius | 16534 | Minisart spuitfilter 0.2 µL |
| 0.5 mL rietje | Minitube | 13408/0044 | French type medium paillette |
| Aspiratiebuismontage | Sigma | A5177 | |
| Bunsenbrander | Indulab | 7000134 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Ethyleenglycol | Sigma | 102466 | |
| Ficoll PM70 | Sigma | F2878 | Dichtheidsgradiëntmedium |
| Gel-laadtip | Eppendorf | 10411193 | |
| Glas capillair | Marienfeld | 2900000 | Microhematocriet capillairbuisje |
| Handschoenen voor LN2-verwerking | Tempshield | CE0338 | Cryohandschoenen |
| Schaaltjes | Minitube | 16913/1133 | |
| Bril voor LN2-verwerking | 3M | 40661-00000-10 | Anti-fog, anti-scratch coating |
| Hotplate | Labec | LA-SH-II-5B | Digitaal model |
| Identificatiestaaf | IMV technologies | 6326 | Niet steriel LG48 mm |
| Geiglasurende container | |||
| LN2-opslagvat | Taylor-Wharton | XT21-AI | Cryoscience |
| Lange roestvrijstalen pincet | Fine Science Tools | 11000-25 | |
| M2 | Sigma | M7167 | |
| PBS | Zelfgemaakt | Fosfaat gebufferde zoutoplossing. Meestal wordt 1 L geconcentreerd 5x-buffer bereid en vervolgens verdund tot 1x. Recept: 40 g natriumchloride, 1 g kaliumchloride, 7,2 g watervrij dinatriumfosfaat, 1,2 g monokaliumfosfaat. Voeg gedistilleerd water toe en steriliseer door autoclaven. | |
| Kunststof petrischaal | Falcon | 351029 | Niet TC-behandelde bacteriologische petrischaal |
| Stereomicroscoop | Olympus | SZ2-LGB | |
| Sucrose | Sigma | S1888 | |
| Horlogemaker #5 pincet | Fine Science Tools | 11254-20 |
Referenties
- Crispo, M., Meikle, M. N., Rülicke, T. Cryopreservation of Valuable Mouse and Rat Lines. Rodent Quality Control: Genes and Bugs. Laboratory Animal Science and Medicine. , Springer. Cham. (2024).
- Lloyd, K., Franklin, C., Lutz, C., Magnuson, T. Reproducibility: use mouse biobanks or lose them. Nature. 522 (7555), 151-153 (2015).
- Hart-Johnson, S., Mankelow, K. Archiving genetically altered animals: a review of cryopreservation and recovery methods for genome-edited animals. Lab Anim. 56 (1), 26-34 (2022).
- Shaw, J. M., Jones, G. M. Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos. Hum Reprod Update. 9 (6), 583-605 (2003).
- Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
- dos Santos Neto, P. C., et al. Cryotolerance of Day 2 or Day 6 in vitro produced ovine embryos after vitrification by Cryotop or Spatula methods. Cryobiology. 70 (1), 17-22 (2015).
- Renard, J. P., Babinet, C. High survival of mouse embryos after rapid freezing and thawing inside plastic straws with 1-2 propanediol as cryoprotectant. J Exp Zool. 230 (3), 443-448 (1984).
- Tsang, W. H., Chow, K. L. Mouse embryo cryopreservation utilizing a novel high-capacity vitrification spatula. Biotechniques. 46 (7), 550-552 (2009).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
- Nakao, K., Nakagata, N., Katsuki, M. Simple and efficient vitrification procedure for cryopreservation of mouse embryos. Exp Anim. 46 (3), 231-234 (1997).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- du Sert, N. P., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).
- Meikle, M. N., Schlapp, G., Menchaca, A., Crispo, M. Minimum volume Spatula MVD vitrification method improves embryo survival compared to traditional slow freezing, both for in vivo and in vitro produced mice embryos. Cryobiology. 84, 77-81 (2018).
- Momozawa, K., et al. Efficient vitrification of mouse embryos using the Kitasato Vitrification System as a novel vitrification device. Reprod Biol Endocrinol. 15 (1), 29(2017).
- Stringfellow, D. A., Givens, M. D. Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the use of Embryo Transfer Technology Emphasizing Sanitary Procedures. , International Embryo Transfer Society. (2010).
- Dos Santos-Neto, P. C., Cuadro, F., Barrera, N., Crispo, M., Menchaca, A. Embryo survival and birth rate after minimum volume vitrification or slow freezing of in vivo and in vitro produced ovine embryos. Cryobiology. 78, 8-14 (2017).
- Schlapp, G., Meikle, M. N., Pórfido, J. L., Menchaca, A., Crispo, M. Zygote cryobanking applied to CRISPR/Cas9 microinjection in mice. PLoS One. 19 (7), e0306617(2024).
- Kamoshita, M., et al. Recent advances of oocyte/embryo vitrification in mammals from rodents and large animals. Anim Sci J. 95 (1), e13931(2024).
- Qiu, J., et al. Equilibrium vitrification of mouse embryos using low concentrations of cryoprotectants. Cryobiology. 98, 127-133 (2021).
- Tsang, W. H., Chow, K. L. Cryopreservation of mammalian embryos: Advancement of putting life on hold. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 163-175 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
