Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Vergelijkende proteomische analyse van hele nier-, medulla- en corticale tubuli bij diabetische pathogenese van nierbeschadiging bij muizen

1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68177

⸱

2 mei 2025

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension and Proteomics Technology Center, Department of Medicine, University of Louisville School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor proteomische analyse van de hele nier, geïsoleerde corticale tubulus en medullaire proteomen. De studie vergelijkt ook regionale proteomen in een diabetisch muismodel en niet-diabetische muizen.

Samenvatting

Het definiëren van de opeenvolging van gebeurtenissen bij nierziekte is de hoeksteen van de klinische praktijk in de toolkit voor nefrologen. Weefselproteomische analyses zijn een belangrijke benadering voor het begrijpen van de fundamentele fysiologische en moleculaire processen van renale pathofysiologie. De methoden en protocollen die we hier presenteren, zullen de moleculaire dissectie van de nier mogelijk maken in elk specifiek interessegebied dat verband houdt met de gevolgen van de ziekte. Om de effecten van ziekte op specifieke nierregio's en -structuren met unieke functies te bepalen, zijn de doelen van dit protocol het demonstreren van vereenvoudigde niercompartimentalisatie bij muizen en isolatietechnieken van de niercorticale tubuli in combinatie met gestroomlijnde, labelvrije kwantitatieve proteomische workflows. Het combineren van deze methoden zal helpen bij de identificatie van verstoorde moleculaire patronen in de hele nier, medullaire compartimenten en corticale tubulusstructuren van de nieren, met als uiteindelijk en uiteindelijk doel eencellige proteomics in pathologische contexten. Het toepassen van deze methoden in vrijwel elk ziektemodel zal nuttig zijn bij het afbakenen van mechanismen van pathologie die verband houden met nierdisfunctie.

Inleiding

Chronische nierziekte (CKD) is een groot probleem in de moderne geneeskunde en bedraagt alleen al in de Verenigde Staten meer dan $ 86 miljard aan uitgaven voor gezondheidszorg1. Wereldwijd neemt de incidentie van CKD toe met de prevalentie van diabetes en de daarmee samenhangende niercomorbiditeiten. Bijna 14% van de Amerikaanse bevolking heeft CKD (USRDS 2024 jaarverslag). Bovendien is diabetische nefropathie een vorm van CKD en de belangrijkste oorzaak van nierziekte in het eindstadium (ESRD), en 60% van de ESRD-patiënten heeft diabetes 1,2,3. Diabetes beïnvloedt alle nierstructuren en celtypen van nefronen, de functionele eenheid van de nieren. Zoals te zien is in figuur 1, bevinden verschillende delen van nefronen zich in de niercortex- en medullaregio's. Het grootste deel van de nier bestaat uit tubuli. Disfunctie van de niertubuli en structurele laesies dragen aanzienlijk bij aan de ontwikkeling van diabetische nefropathie (DN), en deze veranderingen correleren goed met de snelheid waarmee de nierfunctie achteruitgaat 4,5,6,7,8. Vroeg in diabetes, als reactie op verhoogde glucose en de daarmee gepaard gaande natriumopname en de vraag naar membraantransporteiwitten in alle tubulisegmenten, ondergaan tubuli hypertrofie. Bij verhoogde microvasculaire beschadiging later bij diabetes vertonen tubuli atrofie en dilatatie, terwijl er sprake is van fibrose en expansie van het interstitium9. Eerdere studies van ons lab hebben veranderde proteomen en een overvloed aan stressresponseiwitten gevonden in corticale tubuli van diabetische muizen10,11. De medulla is belangrijk voor het reguleren van de urineconcentratie en disfunctie tijdens nieraandoeningen wordt geassocieerd met oxidatieve stress, waarbij diabetes leidt tot verminderde zuurstofspanning in dit deel van de nier als gevolg van een verhoogd zuurstofverbruik door metabolische activiteiten, verhoogde activiteit van membraantransporteiwitten en microvasculair letsel 12,13,14.

Het begrijpen van de gedetailleerde mechanismen van ontwikkeling en progressie van DN is een voortdurende inspanning die nieuwe en geïntegreerde benaderingen vereist die een beroep doen op modellering van ziekte en moleculaire profilering van signaalprocessen, adaptieve veranderingen in cellulaire eiwitdynamiek en nauwkeurige definitie van niercel- en weefselcomponenten die worden aangetast door letsel bij chronische aandoeningen. Proteomics, metabolomics en transcriptomics bieden de mogelijkheid om de moleculaire mechanismen van nierziekten analytisch te onderzoeken. Omics is een relatief nieuw vakgebied dat systeembiologische benaderingen gebruikt om een meer globaal begrip van biologische systemen te krijgen. Proteomics is de afgelopen decennia een krachtig Omics-hulpmiddel geweest in de nefrologie. Het onderzoek naar biomarkers is in de afgelopen 20 jaar uitgebreid, zoals blijkt uit de groei van publicaties, hoewel er veel werk nodig is om deze bevindingen volledig in de kliniek te implementeren15. Met de zeer verschillende tubulicelpopulaties en respectieve functionele rollen binnen de nierschors en het medulla, kan proteomische analyse van hele nieren unieke veranderingen maskeren die verband houden met specifieke structuren binnen deze verschillende regio's. Daarom zijn de doelen van deze studie het aantonen van de scheiding van de nierschors en het medulla, evenals de scheiding van corticale tubuli van glomeruli, gevolgd door gedetailleerde protocollen voor de bereiding van eiwitextracten uit geïsoleerde structuren voor state-of-the-art massaspectrometrie en bio-informaticaanalyses. Muismodellen van diabetische nefropathie spelen een belangrijke rol bij het definiëren van mechanismen van ziekteprogressie. Voor deze studie gebruikten we de OVE26 transgene muis, die diabetes type I met vroege aanvang ontwikkelt en kenmerken vertoont van DN in een vroeg en laat stadium bij mensen, waaronder 1) een vroege opkomst en latere afname van de glomerulaire filtratiesnelheid, 2) nierhypertrofie, 3) verdikking van het glomerulaire basaalmembraan en mesangiale expansie, 4) ernstige proteïnurie en 5) tubulo-interstitiële fibrose9, 16,17. Muizen van twee maanden oud werden gekozen om proteomische veranderingen in tubuluscompartimenten aan te tonen voorafgaand aan openlijke structurele laesies. Zoals eerder gerapporteerd en getoond in Figuur 2, vertonen 2 maanden oude OVE26-muizen glomerulaire mesangiale matrixexpansie (Figuur 2, groene pijl) en ernstige proteïnurie17, zonder openlijke histologische veranderingen in proximale tubuli (Figuur 2, gele pijl) bij jonge diabetische muizen. Hier presenteren we een gecombineerde kwantitatieve proteomics-benadering voor de karakterisering van de hele nier-, medulla- en corticale tubuli om de verschillen in het proteoom in elk compartiment met diabetes op te helderen en te illustreren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Studies met OVE26- en FVB-muizen werden goedgekeurd door de richtlijnen van de University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Transgene vrouwelijke OVE26 (diabeticus; Stam #:005564) en FVB (niet-diabeticus; achtergrondstam; Stam #:001800) muizen werden gekocht bij Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). De dieren werden in een licht/donkercyclus van 12 uur bij 25 °C gehouden en kregen vrije toegang tot water en voedsel. Alle onderzoeken werden uitgevoerd op muizen van 2 maanden oud.

1. Dierlijk model

  1. Nierisolatie
    1. Verdoof muizen door intraperitoneale toediening van 80 mg/kg ketamine en 12 mg/kg xylazine.
    2. Maak een incisie in de buik met een kleine chirurgische schaar en beweeg de darmen voorzichtig naar buiten en naar de zijkant van de muis met behulp van wattenstaafjes om de vena cava bloot te leggen.
    3. Maak een kleine snee in de vena cava boven de rechter nier.
    4. Verdren de muis door de linker hartkamer met 20 ml koude, met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: pH 7,4; 210 mg/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 726 mg/L Na2HPO4·7 uur2O) met behulp van een peristaltische pomp, met een snelheid van 10 ml/min.
      OPMERKING: Deze stap is niet vereist als de opname van bloedeiwitten en -cellen in nieren geen kritische factor is in stroomafwaartse analyses.
    5. Verwijder de nieren met een kleine chirurgische schaar. Verwijder overtollig vet van de buitenkant van de nieren. Weeg de nieren en leg ze in koude PBS op ijs.
    6. Verwijder de niercapsule.
    7. Plaats de nieren op een glazen plaat of petrischaal op ijs. Maak verschillende dwarse sneden door de nieren met behulp van een scheermesje (Figuur 3) om te eindigen met 3-4 plakjes tussen de bovenste en onderste polen van de nieren.
    8. Bewaar 1-2 middelste plakjes en de twee polen (omcirkelde nierplakjes in figuur 3) van elke nier opzij om als "hele nier"-monsters te dienen. Doe een portie in centrifugebuisjes van 1,5 ml en voeg ijskoude homogenisatiebuffer toe (10% glycerol, 50 mM HEPES, 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,1% NP40, 10 mM NaF, 0,25 mM NaVO3, 1x HALTS-proteaseremmer) bij ongeveer 10 μL/mg weefselmonster (gebaseerd op de geschatte massa nierschijfjes, afgeleid van het verworven niergewicht). Laat de tube op ijs liggen.
    9. Leg voor de rest van de middelste dwarse plakjes de plak plat en snijd voorzichtig de cortex (buitenste 1 mm) van elke plak weg met een scheermesje of scalpel (Figuur 3, schematische workflow). Houd de cortex gescheiden van de medulla-regio's voor het isolatieprotocol van de corticale tubuli (hieronder, stap 1.3).
    10. Plaats een deel van de ontlede medulla in centrifugebuisjes van 1,5 ml, voeg ijskoude homogenisatiebuffer toe zoals in stap 1.1.8 en laat de buis op ijs liggen.
    11. Vries alle resterende hele nier- en medullastukken die niet voor homogenisatie zijn gebruikt, in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C.
  2. U kunt ook alle gescheiden hele nier- en medullacompartimenten invriezen en bewaren zoals beschreven in stap 1.1.11. Verwijder ze op een later tijdstip uit de opslag om een homogenisatiebuffer toe te voegen zoals in stap 1.1.8.
  3. Isolatie van de corticale tubulus
    1. Hak de ontlede cortex in stukjes van 1-3 mm op een glasplaat of petrischaal met een scheermesje en vorm een pasta.
    2. Verwerk de gehakte cortex in 1 ml collageen type IA (1 mg/ml) gedurende 30 min, bij 37 °C, in een schommelwaterbad.
    3. Plaats een celzeef van 100 μm op een conische buis van 50 ml op ijs.
    4. Breng de verteerde corticale suspensie aan op de celzeef van 100 μm en druk voorzichtig door de zeef met behulp van de zuiger van een spuit van 10 ml. Was de bovenkant van de zeef met 1 ml PBS en de onderkant van de zeef met 1 ml PBS.
    5. Leid het filtraat in de buis van 50 ml door een extra zeef van 100 μm en was vervolgens de bovenkant van de zeef met 1 ml PBS.
    6. Laat het filtraat door een celzeef van 70 μm lopen die over een conische buis van 50 ml op ijs wordt geplaatst. Buisjes gaan door deze zeef in het filtraat (Glomeruli wordt vastgehouden op de 70 μm zeef). Was de zeef met 1 ml PBS.
    7. Centrifugeer het laatste filtraat op 120 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Gooi het overtollige PBS uit de buisvormige pellet.
    8. Controleer de zuiverheid van de corticale tubuli-pellet door visualisatie onder een microscoop, met behulp van een 10x objectief. Als meer dan 10% van de fractie glomeruli bevat, suspenis het filtraat dan opnieuw met 1 ml PBS en passeer het door een schone celzeef van 70 μm zonder de zeef verder te wassen.
    9. Verdeel de verrijkte tubulifractie over centrifugebuisjes van 1,5 ml en draai gedurende 2 minuten bij 4 °C bij 2000 × g . Gooi het bovenstaande weg.
    10. Voeg homogenisatiebuffer toe aan de tubulikorrel zoals bij de hele nier en het medulla (stappen 1.1.8 en 1.1.10).
  4. Weefselhomogenisatie/Eiwitextractie
    1. Homogeniseer elk monstertype in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml met behulp van een plastic stamper speciaal voor buisjes van 1,5 ml. Als de gehomogeniseerde suspensie te dik is, voeg dan indien nodig een extra homogenisatiebuffer toe.
    2. Laat de gehomogeniseerde suspensie 15 minuten op ijs liggen, gevolgd door sonicatie gedurende 5 minuten in een badsonicator (alleen aan/uit-schakelaar, geen instelbare instellingen op het apparaat), met water in het bad bij 25 °C. Laat de monsters 10 minuten op ijs liggen.
    3. Kort vortex (1000-1500 RPM) homogeneren, vervolgens 20 keer trituleren met een pipet en nog 15 minuten op ijs laten liggen.
    4. Tritureer de monsters verscheidene malen vóór het centrifugeren bij 13.000 g × gedurende 20 minuten bij 4 °C.
    5. Breng geklaarde eiwitextracten over in schone tubes.
    6. 30 μL geklaard extract voor eiwitschatting en monstervoorbereiding voor massaspectrometrie-analyse. Bewaar de rest van de monsters bij -80 °C.

2. Suspension-Trap mini spin kolom digestieprotocol

  1. Proteolytische digestie van eiwitten tot tryptische fragmenten voor proteomische analyses
  2. Verdun ~40-50 μg monster (bij ~2 μg/μL) in monsterlysisbuffer (10% w/v natriumdodecylsulfaat [SDS] in 100 mM triethylammoniumbicarbonaat (TEA-BC) pH 8,5, 40 mM tris (2-carboxyethyl)fosfine [TCEP]) tot een eindvolume van 46 μL.
  3. Reductie en alkylering van eiwitten
    1. Incubeer gedurende 30 minuten bij 65 °C (de uiteindelijke concentratie TCEP is 20 mM).
    2. Voeg 4 μL 0,5 M jodoacetamide toe aan water van vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) en incubeer bij kamertemperatuur (RT) in het donker gedurende 30 minuten (de uiteindelijke concentratie van jodoacetamide is 40 mM).
  4. Voeg 5 μL 12% w/w fosforzuur toe aan water van LC-MS-kwaliteit (verdun 141 μL 85% fosforzuur in 859 μL water voor 12% oplossing).
    1. Alternatief voor fosforzuur, gebruik trifluorazijnzuur of mierenzuur bij het uitvoeren van fosfopeptideverrijking18.
  5. Voeg 350 μL suspensie-trap bindingsbuffer toe (100 mM TEA-BC in 90% v/v methanol/10% v/v water pH 7,55).
  6. Voeg een monster toe aan de kolom met suspensie. Centrifugeer bij 4.000 × g gedurende 30 s bij RT in een rotor met een vaste hoek om elk volume door de kolom te laten gaan.
  7. Wassen met 4x 400 μL suspensie-trap bindingsbuffer. Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 30 s bij RT in een rotor met een vaste hoek om elke wasbeurt door de kolom te leiden.
    OPMERKING: Om te helpen bij het verwijderen van SDS, draait u de kolom in de rotor na elke wasbeurt 180°.
  8. Centrifugeer bij 4.000 g gedurende 1 minuut bij RT om de bindbuffer volledig te verwijderen (voorkomt druppelen tijdens de spijsvertering).
  9. Breng de suspensiekolom over in een schone opvangbuis.
  10. Voeg 2,5-5 μg trypsine toe in 125 μL van 50 mM TEA-BC pH 8,5 in water van LC-MS-kwaliteit (Trypsin Protease, MS-Grade). De uiteindelijke verhouding van trypsine tot het monster is 1:20 tot 1:10.
  11. Incubeer gedurende 2 uur bij 47 °C (draai de dop niet vast; een thermische mixer die op 0 RPM is ingesteld, heeft de voorkeur). Door met een naald een gat in de dop te prikken, kan worden voorkomen dat er druk wordt opgebouwd in de bovenste kamer van de suspensiepot (verhoogde druk zorgt ervoor dat trypsineoplossing door de kolom druppelt).
  12. Voeg 80 μL 50 mM TEA-BC pH 8,5 toe aan water van LC-MS kwaliteit. Centrifugeer bij 4.000 g bij RT gedurende 1 minuut in een rotor met een vaste hoek om elke digest door de kolom te leiden.
  13. Voeg 80 μL 0,2% v/v mierenzuur toe aan water van LC-MS kwaliteit. Centrifugeer bij 4.000 g gedurende 1 minuut bij RT in een rotor met een vaste hoek om te verzamelen met de digest uit stap 2.11.
  14. Voeg 80 μL 50% v/v acetonitril toe aan water van LC-MS kwaliteit. Centrifugeer bij 4.000 g bij RT gedurende 1 minuut in een rotor met een vaste hoek om te verzamelen met de digest uit stap 2.11.
  15. Bewaar de suspensifon eluaat bij -80 °C.
  16. Droog het monster in een vacuümconcentrator.
  17. Bewaar het gedroogde monster bij -80 °C.

3. Opruimen met hydrofiel-lipofiele balans (HLB) kolom

  1. Maak oplossingen A (2% v/v acetonitril/0,1% v/v mierenzuur) en B (80% v/v acetonitril/0,1% v/v mierenzuur).
  2. Los het monster op in 500 μl oplossing A.
  3. Plaats de kolom in een vacuümspruitstuk en oefen gasdruk uit met ~1-2 ml/min.
  4. Voeg 500 μL oplossing B toe aan de HLB-kolom en evacueer met 1-2 ml/min; Herhaal twee keer.
  5. Voeg 750 μL oplossing A toe aan de HLB-kolom en evacueer met 1-2 ml/min; Herhaal twee keer.
  6. Plaats een schone microbuis van 2 ml in het rek onder de HLB-kolom, vul het monster in 500 μl oplossing A en druk de gasdruk zoals hierboven; Leid de doorstroming een tweede keer in de kolom.
  7. Plaats de HLB-kolom boven de afvoerbuis, voeg 500 μL oplossing A toe en evacueer zoals hierboven; Herhaal twee keer.
  8. Plaats de kolom boven een schone microbuis van 2 ml, voeg 500 μl oplossing B toe en evacueer zoals hierboven; Herhaal twee keer.
  9. Vries het eluaat in bij -80 °C en droog het vervolgens in een vacuümconcentrator. Bewaar het gedroogde residu bij -80 °C.
  10. Los het residu op in 20 μl 2% v/v acetonitril/0,1% v/v mierenzuur voorafgaand aan de MS-analyse. Gebruik een spectrofotometer om de peptideconcentratie te schatten bij een absorptie van 205 nm.

4. Analyse van massaspectrometrie

  1. Eendimensionale omgekeerde fase vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS
    1. Injecteer een gelijke massa peptiden (~600 ng) op 1-dimensionale nano-LC en fractioneer deze op omgekeerde fase C18-kolommen.
    2. Elueer de peptiden rechtstreeks in de MS met een spuitspanning van 1,8 kV, waarbij een ionenoverdrachtsbuis op 250 °C wordt gehouden.
    3. Verkrijg de spectra in de gegevensafhankelijke top 20-ionenmodus waarbij het meest intense MS/MS-fragment uit de analysewachtrij wordt verwijderd om de diepte van ionenmapping op ionen met een lagere abundantie te verbeteren.

5. Data-analyse en bio-informatica

  1. Procedures voor gegevensverwerking
    1. Na spectrale toewijzing en peptide- en eiwitidentificatie in PEAKS 12.0 (LC-MS/MS-data-analysesoftware), dient u de lijsten met eiwitten in voor analyse in MetaboAnalyst 6.0 (metabolomics-gegevensanalyseplatform) met behulp van de single-factor statistische analysebenadering (https://www.metaboanalyst.ca/).
    2. Gebruik LC-MS/MS-gegevensanalysesoftware om spectra te zoeken en te filteren met behulp van strikte false discovery rate (FDR)-criteria (1% eiwit en peptide) tegen de door muizen beoordeelde FASTA-database.
      OPMERKING: Alternatieve zoekprogramma's die direct beschikbaar zijn, zijn onder meer Maxquant, Proteome Discoverer en andere veelgebruikte opties.
    3. Specificeer carbamidomethylering van cysteïne als een vaste wijziging. Specificeer oxidatie van methionine als een variabele wijziging.
    4. Converteer de lijsten naar CSV-indeling (Comma Separated Values) en groep-/voorbeeldlabels die aan elke kolom en rij zijn toegewezen. Dit formaat is flexibel in het metabolomics data-analyseplatform.
    5. Waardeer de ontbrekende waarden met behulp van de 1/5 minimumwaarderegel voor ontbrekende variabelen.
    6. Filter de gegevens om zeer variabele waarden uit te sluiten met behulp van het interkwartielbereik, waarbij een afwijking van 40% wordt gebruikt voor de afkapping.
    7. Normaliseer de waarden naar mediane intensiteit, log10 getransformeerd en gemiddelde gecentreerd voor schaling. Gebruik andere normalisatiebenaderingen en houd er rekening mee dat de resultaten kunnen variëren.
    8. Voer T-tests uit op een ongepaarde manier met een p-waarde afkapwaarde < 0,05. Voer in dit stadium meerdere testcorrecties uit.
      OPMERKING: In dit onderzoek is deze correctie niet uitgevoerd voor de representatieve dataset voor gegevenspresentatiedoeleinden.
    9. Geef vulkaangrafieken aan voor 1,5-voudige verandering (FC) en p < 0,05.
    10. Genereer heatmaps en voer gedeeltelijke kleinste kwadratenanalyse (PLSDA) en statistische (variabele van belang van projectie [VIP]) analyse van de steekproefgroepen uit.
    11. Potentiële kandidaten voor follow-up zijn ofwel robuust genoeg om 1,5 FC en p-val < 0,05 of VIP > 1,0 te verduisteren, zoals aangegeven in de PLSDA-analyse.
    12. Genereer Venn-diagrammen om verschillen in het proteoom van de hele nier, tubulus en medulla bij OVE26-muizen te illustreren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Over het algemeen waren de totale eiwitidentificaties van elk monstertype: 1) hele nier (1438), 2) medulla (2145) en corticale tubuli (1859). Na gegevensverwerking in MetaboAnalyst 6.0, gegevensfiltering en imputatie, werden uiteindelijk geanalyseerde eiwitidentificaties voor elk niercompartiment: hele nier (455), medulla (997) en corticale tubuli (896). Figuur 4 toont globale proteomische veranderingen in de OVE26 diabetische muizennier. Labelvrije kwantita...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De methoden die in deze technische benadering worden gepresenteerd, zijn ontworpen om vergelijkende proteoomanalyse van verschillende delen van de nier te illustreren. Hier gebruikten we methoden voor het isoleren van medulla en corticale tubuli bij diabetische (OVE26) en controle- (FVB) muizen en voerden we 1-dimensionale LC-MS/MS- en bio-informaticaanalyse uit om basisverschillen in het proteoom in elk deel van de nier te illustreren, naast het proteoom van hele nieren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen onthullingen.

Dankbetuigingen

Het werk voor dit project werd gedeeltelijk ondersteund met fondsen voor MTB (NIH K01DK080951) en TDC (NephCure-Pediatric Nephrology Research Consortium NKI-2023-04) en het University of Louisville Kidney Disease Program en het Proteomics Technology Center (TDC, MTB).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collagenase type 1A Millipore SignalC9891
Exploris 480 Orbitrap Thermofisherhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539MS
Falcon Cell Strainer, 100 µmVWR21008-950
Falcon Cell Strainer, 70 µmVWR21008-952
Gibco PBS pH 7.4 Thermo1001023
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor CocktailVWRPI78440
IodoacetamideSigma AldrichI1149
MetaboAnalyst 6.0 MetaboAnalyst 6.0 https://www.metaboanalyst.ca/metabolomics data analysis platform
NanoDrop 2000 Thermofisherhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000
Oasis HLB column Waters186002034
PEAKS 12.0Bioinformatics Solutions IncLC-MS/MS data analysis software
Pestle for 1.5 mL MicrotubeFisher ScientificNC0782485
Suspension Trap (S-trap)ProtifiC02-micro-10
TCEPThermoFisher Scientific20490
TEABCSigma AldrichT7408
Trypsin Protease, MS-GradeThermoFisher Scientific90057
Ultrasonic CleanerCole-Parmer  Model 0884900
```

Referenties

  1. Ding, X., et al. Epidemiological patterns of chronic kidney disease attributed to type 2 diabetes from 1990-2019. Front Endocrinol. 15, 1383777(2024).
  2. Liu, W., et al. Global trends in the burden of chronic kidney disease attributable to type 2 diabetes: an age-period-cohort analysis. Diabetes Obes Metab. 26 (2), 602-610 (2024).
  3. Xie, D., et al. Global burden and influencing factors of chronic kidney disease due to type 2 diabetes in adults aged 20-59 years, 1990-2019. Sci Rep. 13 (1), 20234(2023).
  4. Giunti, S., Barit, D., Cooper, M. E. Mechanisms of diabetic nephropathy: role of hypertension. Hypertension. 48 (4), 519-526 (2006).
  5. Thomas, M. C., Burns, W. C., Cooper, M. E. Tubular changes in early diabetic nephropathy. Adv Chronic Kidney Dis. 12 (2), 177-186 (2005).
  6. Thomas, M. C., et al. Diabetic kidney disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15018(2015).
  7. Nath, K. A. Tubulointerstitial changes as a major determinant in the progression of renal damage. Am J Kidney Dis. 20 (1), 1-17 (1992).
  8. Bonventre, J. V. Can we target tubular damage to prevent renal function decline in diabetes. Semin Nephrol. 32 (5), 452-462 (2012).
  9. Powell, D. W., et al. Renal tubulointerstitial fibrosis in OVE26 type 1 diabetic mice. Nephron Exp Nephrol. 111 (1), e11-e19 (2008).
  10. Cummins, T. D., et al. Quantitative mass spectrometry of diabetic kidney tubules identifies GRAP as a novel regulator of TGF-beta signaling. Biochim Biophys Acta. (4), 653-661 (2010).
  11. Barati, M. T., et al. Differential expression of endoplasmic reticulumstress-response proteins in different renal tubule subtypes of OVE26 diabetic mice. Cell Stress Chaperones. 21 (1), 155-166 (2016).
  12. Zheleznova, N. N., et al. Mitochondrial proteomic analysis reveals deficiencies in oxygen utilization in medullary thick ascending limb of Henle in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 44 (17), 829-842 (2012).
  13. Nordquist, L., Palm, F. Diabetes-induced alterations in renal medullary microcirculation and metabolism. Curr Diabetes Rev. 3 (1), 53-65 (2007).
  14. dos Santos, E. A., Li, L. -P., Ji, L., Prasad, P. V. Early changes with diabetes in renal medullary hemodynamics as evaluated by fiberoptic probes and BOLD magnetic resonance imaging. Invest Radiol. 42 (3), 157-162 (2007).
  15. Cummins, T. D., et al. Quantitative Mass Spectrometry Normalization in UrineBiomarker Analysis in Nephrotic Syndrome. Glomerular Dis. (3), 121-131 (2022).
  16. Carlson, E. C., Audette, J. L., Klevay, L. M., Nguyen, H., Epstein, P. N. Ultrastructural and functional analyses of nephropathy in calmodulin-induced diabetic transgenic mice. Anat Rec. 247 (1), 9-19 (1997).
  17. Zheng, S., et al. Development of late-stage diabetic nephropathy in OVE26 diabetic mice. Diabetes. 53 (12), 3248-3257 (2004).
  18. Wang, F., Veth, T., Kuipers, M., Altelaar, M., Stecker, K. E. Optimized suspension trapping method for phosphoproteomics sample preparation. Anal Chem. 95 (25), 9471-9479 (2023).
  19. Mather, A., Pollock, C. Glucose handling by the kidney. Kidney Int Suppl. 120, S1-S6 (2011).
  20. Ross, B. D., Espinal, J., Silva, P. Glucose metabolism in renal tubular function. Kidney Int. 29 (1), 54-67 (1986).
  21. Roger, F., Martin, P. Y., Rousselot, M., Favre, H., Féraille, E. Cell shrinkage triggers the activation of mitogen-activated protein kinases by hypertonicity in the rat kidney medullary thick ascending limb of the Henle's loop: requirement of p38 kinase for the regulatory volume increase response. J Biol Chem. 274 (48), 34103-34110 (1999).
  22. Yang, J., Lane, P. H., Pollock, J. S., Carmines, P. K. PKC-dependent superoxide production by the renal medullary thick ascending limb from diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (5), F1220-F1228 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Nierproteomicadiabetische nierschadeisolatie van corticale tubulimergproteomicamassaspectrometrielabelvrije kwantitatieve proteomicamuiernierscompartimentensingle-cell proteomicaeiwitidentificatievolcano plot-analyse
Vergelijkende proteomische analyse van hele nier-, medulla- en corticale tubuli bij diabetische pathogenese van nierbeschadiging bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.