Methodenartikel

Verbeterde genafgifte en -expressie met behulp van intraossale injectie van chitosan-nanodeeltjes ingekapselde adeninebase-editorplasmiden

DOI:

10.3791/68181

⸱

16 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gentherapiebenadering die ABE-gecoate chitosan rechtstreeks in het beenmerg toedient door middel van intraossale injectie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De afgifte van exogene plasmiden aan proefdieren is cruciaal in biomedisch onderzoek, waaronder het onderzoek naar genfuncties, het ophelderen van ziektemechanismen en de beoordeling van de werkzaamheid van geneesmiddelen. Nochtans, is de transfectieefficiency van de huidige methode vrij laag, en de introductie van plasmiden voor genexpressie op lange termijn kan door het immuunsysteem worden beïnvloed. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een nieuwe methode ontwikkeld en onderzocht die chitosan gebruikt om adenine-base editor (ABE)-plasmiden in te kapselen en het complex vervolgens rechtstreeks aan het beenmerg van muizen af te leveren door middel van intraossale injectie. In deze studie hebben we, om ons te richten op het CaMK II δ-gen , dat nauw verwant is aan osteoclastdifferentiatie, chitosan gebruikt om ABE CaMK II δ plasmiden in te kapselen. We injecteerden de plasmidelading rechtstreeks in de beenmergholte door middel van intraossale injectie. De resultaten toonden een hoge in vivo bewerkingsefficiëntie van 14,27% op de A1-locus en 10,69% op de A2-locus bij ontvangende muizen. Deze nieuwe strategie is niet alleen bijzonder geschikt voor ziekten die worden veroorzaakt door een abnormale osteoclastfunctie, maar biedt ook een aanzienlijk potentieel voor het bevorderen van het gebied van gentherapie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gentherapie is naar voren gekomen als een veelbelovende benadering op het gebied van biomedisch onderzoek 1,2. Het biedt het potentieel om een verscheidenheid aan aandoeningen te behandelen door vreemde plasmiden in proefdieren te introduceren om de expressie van specifieke genen te moduleren en hun therapeutische effecten te bestuderen. Conventionele toedieningsmethoden hebben echter enkele problemen ondervonden die hun effectiviteit en veiligheid beperken3. De zorgen omvatten lage transfectieefficiency, hoge biologische schade, en lage genuitdrukkingsefficiency. Daarom is het noodzakelijk om een nieuwe toedieningsmethode voor gentherapie vast te stellen die deze beperkingen kan overwinnen.

Chitosan is een natuurlijk polysacharide met een goede biologische afbreekbaarheid en biocompatibiliteit 4,5,6, waardoor het gemakkelijk kan worden afgebroken in dierlichamen zonder ernstige biologische toxiciteit te veroorzaken. Het wordt veel gebruikt bij de toediening van geneesmiddelen vanwege de hoge inbeddingssnelheid van geneesmiddelen 7,8, verbeterde toedieningsefficiëntie en verminderde schade aan dieren.

ABE-technologie voor het bewerken van genen, die directe conversie van basenparen van AT naar GC mogelijk maakt, is veelbelovend in genetisch en medisch onderzoek. Vergeleken met de huidige reguliere genbewerkingstechnologie, kan ABE-technologie een nauwkeurige enkelvoudige base-mutatie bereiken, waardoor het bewerken van niet-doel-DNA-sequenties wordt verminderd, off-target-effecten worden verminderd 9,10 en leiden tot nul DNA-dubbelstrengsbreuken11, wat het risico op genbewerking aanzienlijk vermindert12. ABE-technologie is ook zeer biocompatibel en is meer geschikt voor onderzoek naar de behandeling van ziekten.

Staartaderinjectie is een veelgebruikte methode die wordt gebruikt voor in vivo toediening van plasmiden, vooral bij gentherapie. Het doelgen voor deze studie is CaMK II δ, dat nauw verwant is aan osteoclastdifferentiatie13,14. Het gebruik van intraossale injectie in plaats van de staartader zorgt ervoor dat het bewerkte plasmide de osteoclasten rechtstreeks in het beenmerg kan binnendringen. Deze directe overdracht naar het beenmerg verhoogt de efficiëntie en stabiliteit van genexpressie, wat gunstig is voor de behandeling van ziekten die verband houden met osteoclastdisfunctie.

Hier presenteren we een nieuwe methode waarbij het ABE-plasmide wordt ingekapseld met chitosan en het complex vervolgens rechtstreeks in muizen wordt ingebracht door middel van intraossale injectie. Door deze methode hopen we de weg vrij te maken voor effectievere gentherapiebehandelingen voor vreemde plasmiden die organismen binnendringen, met name ziekten die verband houden met osteoclastdisfunctie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de Diergezondheidscommissie van de Universiteit van Anhui voor het gebruik en de verzorging van dieren. In deze studie werd ABE genereus geschonken door professor Tian Chi (Shanghai University of Science and Technology, Shanghai, China; Figuur 1D).

1. ABE-plasmideconstructie

  1. Ontwerp gRNA met de sequentie TCCATGATGCACAGACAGGA waarbij PAM wordt gepresenteerd door GAC.
  2. Volgens de primerlijstgids van het bedrijf, voegt u de primer toe aan het overeenkomstige volume van ddH2O om een concentratie van 100 μM te bereiken. Schud en meng vervolgens grondig om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Bereid voor de gloeireactie een oplossing van 10 μM door 10 μL van de basisprimeroplossing toe te voegen aan de nieuwe microcentrifugebuis, 90 μL ddH2O, en meng goed.
  3. Voeg 5 μL stroomopwaartse primer, 5 μL nageschakelde primer en 40 μL ddH2O toe aan een microcentrifugebuis. Om de gloeireactie te vergemakkelijken, dompelt u de buis 5 minuten onder in een bak gevuld met kokend water. Zorg ervoor dat het waterniveau de opening van de buis niet bereikt om te voorkomen dat er water binnendringt en de primers vervuilt. Koel af tot kamertemperatuur om de gloeireactie te voltooien.
  4. Voeg 2 μg pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP (figuur 1D), 1 μl ESP3I, 4 μl buffer en 33 μl ddH2O toe aan een microcentrifugebuis en laat gedurende 45 minuten reageren in een waterbad met constante temperatuur bij 37 °C.
  5. Voer agarosegelelektroforese uit. Bereid een 1% agarosegel met een gewicht van 0,5 g agarose en giet deze in een glazen fles. Voeg 50 ml 1x TAE-buffer toe aan de glazen fles en schud om het agarosepoeder op te lossen. Verwarm 2 minuten in de magnetron tot het volledig gesmolten is. Voeg 5 μL YeaRed Nucleic Acid Gel Stain toe, meng grondig en giet in de gelvorm; Nadat de gel is gestold, begint u met het toevoegen van de monsters.
    OPMERKING: Gebruik voor de bereiding van 1xTAE de reagentia die in tabel 1 worden vermeld.
  6. Voeg 1x TAE toe aan de elektroforesetank en plaats het geconfigureerde agarosegelblok, dat moet worden ondergedompeld in TAE. Voeg 5 μL 1x laadbuffer toe aan het digestieproduct uit stap 1.4 en meng. Voeg het monster toe aan de gel. Voeg daarnaast ook 6 μL marker toe aan de gel.
  7. Laat het elektroforeseprogramma gedurende 35 minuten draaien op een constante spanning van 110 V. Bepaal na elektroforese de positie van de band in het monster volgens de markering en snijd de gelstrip af met een schoon mes voor gelherstel.
  8. Voer de gelherstelbewerking uit volgens de instructies van de gel maxi-zuiveringskit. Stel een waterbad in op 50 °C. Voeg het overeenkomstige volume PN-oplossing toe aan de tube met de gesneden gel volgens de kit. Prik met een pipetpunt in de gel om het oplossen te vergemakkelijken en doe het vervolgens in het waterbad. Schud de tube af en toe en observeer het oplosproces totdat het gelblok volledig is opgelost.
  9. Neem een spinkolom, CA3, uit de set. Voeg 500 μL BL-oplossing uit de kit toe aan de spinkolom en centrifugeer deze gedurende 1 minuut op 2.000 x g om de kolom in evenwicht te brengen. Verwijder na het centrifugeren de afvalvloeistof op de bodem van de opvangbuis en plaats de adsorptiekolom terug in de opvangbuis.
  10. Ga door met centrifugeren op 2.000 x g gedurende 1 min. Gooi de afvalvloeistof op de bodem van de centrifugebuis weg, voeg 600 μL PN-oplossing toe en centrifugeer 2.000 x g gedurende 30 s; Gooi de afvalvloeistof weer weg. Herhaal de handeling en gooi de afvalvloeistof opnieuw weg.
  11. Vervang na het centrifugeren de opvangbuis van 2 ml door een nieuwe buis van 1.5 ml. Open het deksel en laat 30 minuten drogen op een geventileerde plaats om de ethanol volledig te verwijderen. Voeg vervolgens de voorverwarmde 40 μL ddH2O toe, centrifugeer en elueer het benodigde DNA.
    OPMERKING: PN moet worden toegevoegd met watervrije ethanol volgens de instructies. Het gebruik van voorverwarmd water kan de opbrengst verhogen.
  12. Voeg 7 μL gloeiproduct uit stap 1.3, 3 μL gelherstelproduct uit stap 1.11, 1 μL T4 DNA-ligase, 2 μL 10x T4 Ligasebuffer en 7 μL ddH2O toe aan een microcentrifugebuis en bewaar een nacht bij 16 °C om het ligatieproduct te verkrijgen.
  13. Voeg 10 μL ligatieproduct en 70 μL DH5α toe in een microcentrifugebuis op ijs gedurende 30 min. Stel het waterbad in op 42 °C. Na het ijsbad zet u de buis 90 s in het waterbad en daarna weer 2 minuten op ijs.
  14. Voeg 600 μL Luria-Bertani (LB) vloeibaar medium toe aan de buis en schud gedurende 30 minuten op een shaker. Bestraal tegelijkertijd een LB solid medium plaat gedurende 30 minuten in een laminaire flowkast. Verdeel na de incubatie 100 μL van de oplossing gelijkmatig over de plaat. Plaats de plaat na het coaten ondersteboven in een bacteriebroeder van 37 °C voor kweek.
    OPMERKING: DH5α wordt gewoonlijk bewaard bij -80 °C. LB vast medium wordt bereid met behulp van de reagentia vermeld in tabel 2. LB vloeibaar medium wordt bereid met behulp van de in tabel 3 vermelde reagentia.
  15. Selecteer een enkele kolonie en breid de bacteriekolonie 14 uur uit op een vers bord. Neem een centrifugebuis van 50 ml, voeg 50 ml LB vloeibaar medium toe, voeg 50 μl ampicilline toe in een verhouding van 1:1000 en meng goed. Verdeel dit in nieuwe buisjes van 15 ml per buisje.
  16. Controleer de kweekplaat op ronde witte volken met een goede groei. Selecteer deze met een pipet van 10 μL en breng ze over naar het LB-medium. Kweek dit gedurende 12 uur in een shaker en stuur dit monster vervolgens op voor sequencing.
  17. Vergelijk de sequentieresultaten met het doel-gRNA om de stam met de overeenkomende sequentie, Camk II δ-sgRNA, als de doelstam te identificeren en extraheer vervolgens het plasmide.
  18. Voer plasmide-extractie uit volgens de instructies van de mini-plasmidekit. Voeg 500 μL BL toe aan de adsorptiekolom CP3, centrifugeer gedurende 1 minuut bij 2.000 x g en gooi de afvalvloeistof weg. Plaats de adsorptiekolom terug in de opvangbuis. Voeg 500 μL bacteriële oplossing toe en centrifugeer gedurende 10 minuten op 4.000 x g .
  19. Verzamel de doorstroom. Centrifugeer opnieuw en voeg na het verwijderen van het supernatant 250 μL P1 toe aan de centrifugebuis met bacteriële precipitatie en breng het vervolgens over naar een microcentrifugebuis en vortex. Voeg 250 μL P2 toe en keer voorzichtig om voor 6x-8x. Voeg 350 μL P3 toe en keer opnieuw voorzichtig om voor 6x-8x. Er verschijnt een wit vlokkig neerslag.
  20. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2.000 x g. Breng het bovenstaande over naar een nieuwe adsorptiekolom CP3, centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 30 s en verwijder de afvalvloeistof. Voeg 600 μL PW toe, centrifugeer opnieuw bij 2.000 x g gedurende 30 s en verwijder de afvalvloeistof. Voeg opnieuw 600 μL PW toe, centrifugeer op 2.000 x g gedurende 30 s en verwijder de afvalvloeistof.
  21. Plaats de adsorptiekolom in de opvangbuis en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 2.000 x g om resterende PW te verwijderen. Plaats vervolgens de adsorptiekolom in een schone microcentrifugebuis, laat deze 30 minuten drogen en voeg 35 μL voorverwarmde ddH2O toe aan het midden van de adsorptiefilm en bewaar het resulterende product vervolgens bij -20 °C voor latere tests.
    OPMERKING: PW moet worden toegevoegd met watervrije ethanol volgens de instructies. Het gebruik van voorverwarmd water kan de opbrengst verhogen.

2. Extractie van mergcellen

  1. Selecteer KM-muizen van 8-9 weken oud, mannelijk en met een gewicht van ongeveer 30 g. Bevestig de muizen in de linkerhand met het hoofd naar beneden en injecteer 150 μL 1% Pentobarbital-natrium vanaf de zijkant van de buik met een spuit met de rechterhand. Bevestig de anesthesie door in de teen te knijpen.
  2. Voer cervicale dislocatie van muizen uit, verwijder het scheenbeen met een chirurgische schaar en een pincet en verwijder het omringende overtollige spierweefsel. Week het verwijderde scheenbeen in PBS en was, zodat er alleen schone botten overblijven.
  3. Neem 1 ml PBS in een spuit om beenmergcellen van het ene uiteinde van het scheenbeen te spoelen tot het bot wit is.
  4. Vang de celsuspensie op en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 x g bij 4 °C. Na het verwijderen van het supernatant, lyseer de rode bloedcellen met 500 μL lysaat van rode bloedcellen. Voeg na 1 minuut 1 ml scheidingsbuffer toe om het lysaat van de rode bloedcellen te beëindigen. Na 5 minuten centrifugeren bij 800 x g bij 4 °C verwijder je het bovenstaande en leg je de cellen op ijs voor later gebruik.
    OPMERKING: Als de rode bloedcellen volledig zijn gelyseerd, slaan de cellen neer en zijn er geen rode bloedcellen zichtbaar. Als de rode bloedcellen nog steeds te zien zijn, kunnen ze opnieuw worden gelyseerd, maar de incubatietijd mag niet te lang zijn om schade aan andere cellen te voorkomen.

3. De transfectie van Chitosan

  1. Chitosanpreparaat: Weeg 4 mg chitosan af en los op in 20 ml 0,2 mg/ml azijnzuuroplossing. Stel de pH in op 5,5 met 10 M NaOH. Neem 500 μL van deze oplossing en voeg deze toe aan individuele microcentrifugebuisjes.
  2. Voeg 2 μg, 3 μg, 4 μg en 5 μg ABE-plasmiden toe aan afzonderlijke buisjes en los ze op in 500 μL 30 mM Na2SO4. Meng 500 μL chitosanoplossing en 500 μL van het plasmide.
  3. Incubeer ze in een waterbad bij 50-55 °C gedurende 15 minuten. Nadat u de twee oplossingen goed hebt gemengd, vortex gedurende 15-30 s en laat u 30 minuten staan.
  4. Chitosan-karakterisering: Analyseer de diameters en zèta-potentialen van Chitosan met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS), waarbij de concentratie chitosan op 0,1 mg/ml wordt gehouden in ddH2O. Voer elk monster 3x uit.
  5. Giet monsters van 0,1 mg/ml op een siliciumchip. Voeg 20 μl van de geresuspendeerde monsters toe aan roosters met 200 mazen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Kleur de roosters 3 minuten in met 2% fosfotenzuur en verwijder de resterende vloeistof met filtreerpapier. Observeer met een transmissie-elektronenmicroscoop.
  6. Efficiëntie van het inkapselen van nanodeeltjes: Filter het bovenstaande met een filter van 0,1 μm om de niet-neergeslagen deeltjes te verwijderen. Upload het plasmide en meet de concentratie met een spectrofotometer bij 260 nm. De berekende efficiëntie van ABE-plasmide en gRNA-plasmide waren respectievelijk 84% ± 0,37% en 85% ± 0,53%.
  7. Injecteer 100 μL chitosan ingebed met plasmide in muizen via de beenmergholte (stap 5). Isoleer na 7 dagen injectie de beenmergcellen en lyseer de rode bloedcellen zoals beschreven in stap 2.
  8. Voeg 2 ml serumbevattend DMEM-medium toe aan celkweekplaten met 6 putjes en voeg de beenmergcellen (ongeveer 1 x 106) toe die zijn gesuspendeerd in 500 μl serumbevattend DMEM-medium. Meet de fluorescentie-intensiteit onder een fluorescentiemicroscoop. CaMK II δ-sgRNA-plasmide heeft TagRFP rode fluorescentie wanneer het wordt geëxciteerd bij 580 nm (Figuur 2B).
    OPMERKING: DMEM-medium dat serum bevat, wordt bereid met behulp van de in tabel 4 vermelde reagentia.

4. Flowcytometrie

  1. Bereid verschillende doseringen ABE-plasmiden voor: 2 μg, 3 μg, 4 μg en 5 μg, en lever af aan ontvangende muizen zoals beschreven in stap 3. Isoleer na 7 dagen de beenmergcellen van de muizen zoals beschreven in stap 3.
  2. Verzamel de beenmergcellen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 x g bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg en lyseer de rode bloedcellen met 500 μL lysaat van rode bloedcellen. Beëindig na 1 minuut de reactie met 1 ml scheidingsbuffer en tel het aantal cellen met een cellenteller.
  3. Breng 1 x 106 cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis en centrifugeer met 800 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Na het verwijderen van het supernatant, suspendeert u de cellen opnieuw met 500 μL PBS en brengt u ze over in een flowbuis. Meet de efficiëntie door middel van flowcytometrie. Bereid een flowcytometriecontrolegroep voor zoals beschreven in stap 2.
    OPMERKING: Celresten en dode cellen met de lagere FSC-signalen en die zich in de linkerbenedenhoek van het FSC versus SSC-spreidingsdiagram bevinden (minder dan 400) zijn uitgesloten (Figuur 3). Omdat de plasmiden TagRFP rode fluorescentie hebben, kunnen ze worden uitgezocht.

5. Injectie in de beenmergholte

  1. Selecteer KM mannelijke muizen van 8 tot 9 weken oud, met een gewicht van ongeveer 30 g. Verdoof ze met een intraperitoneale injectie van 150 μL 1% Pentobarbital-natrium (stap 2.1). Bevestig de diepte van de anesthesie door in de teen te knijpen.
  2. Bevestig de verdoofde muis in rugligging op de operatietafel en bevestig de voorste poot van de muis met tape.
  3. Desinfecteer het achterste scheenbeen van muizen met een alcoholdoekje. Vul het te injecteren plasmide in een spuit van 1 ml met een naald van 26 G. Verwijder luchtbellen en bereid je voor op injectie.
  4. Raak het scheenbeen van de muis aan en houd het scheenbeen van de muis vast met je vingers. Bepaal de positie van de injectienaald zodat de scheenbeenschacht vanaf het scheenbeenplateau bij het kniegewricht van de muis wordt gepenetreerd. Draai de injectienaald evenwijdig aan het scheenbeen, steek in de beenmergholte en injecteer langzaam (ongeveer 3 s) om de schade aan de muizen te minimaliseren.
  5. Trek na de injectie de naald langzaam naar buiten (ongeveer 3 s) en gebruik onmiddellijk een alcoholdoekje om het bloeden te stoppen en de prikplaats te desinfecteren.
  6. Plaats de muizen voorzichtig in een warme omgeving (20-26 °C), wacht tot de muizen hersteld zijn van de narcose en observeer hun herstel.

6. Sanger-sequencing

  1. Verzamel na 7 dagen injectie beenmergcellen van muizen zoals beschreven in stap 2 en isoleer genomisch DNA met behulp van een extractiekit. Verzamel de cellen door 1 minuut te centrifugeren op 2.000 x g . Gooi het supernatant weg, voeg 200 μL GA-oplossing toe en tril met een vortexmixer. Voeg 20 μL proteïnase K en 200 μL GB toe, meng en plaats vervolgens 10 minuten in een waterbad van 70 °C.
  2. Voeg na de incubatie 200 μl watervrije ethanol toe, schud gedurende 15 s en doe vervolgens de gemengde vloeistof in de ondersteunende adsorptiekolom. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 2.500 x g, gooi de afvalvloeistof op de bodem van de buis weg en voeg 500 μL GD-oplossing toe. Centrifugeer en gooi de afvalvloeistof weg, was de pellet 2x met PW en droog hem ten slotte door hem te elueren met 40 μL zuiver water.
    OPMERKING: PW moet worden toegevoegd met watervrije ethanol volgens de instructies.
  3. Amplificeer het doelgen CaMKIIδ door PCR met de voorwaartse primersequentie gctaaggtgataaatgtggcact en de omgekeerde primersequentie van ctagtgtgcgggccagattc. Bereid de PCR-reactie voor door 25 μL 2x buffer, 1 μL dNTP Mix, 2 μL forward primer, 2 μL reverse primer, 1 μL DNA Polymerase, 2 μL template DNA en 17 μL ddH2O toe te voegen. Voer het volgende PCR-programma uit: 95 °C gedurende 3 min, 95 °C gedurende 15 s, 53,7 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 60 s, 12 °C voor warmtebehoud.
  4. Bereid na PCR een agarosegel van 1% voor en voer agarosegelelektroforese uit bij 110 V gedurende 35 minuten (stap 1.5, stap 1.6). Snijd het doelgelgebied na elektroforese en stuur het op voor Sanger-sequencing (Figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro plasmiden werden in muizen geïnjecteerd door middel van intraossale injectie (Figuur 1A). De gemiddelde deeltjesgrootte van de nanodeeltjes was ongeveer 202,9 nm, de potentiaal was 2,77 mV en de PDI was 0,22 (Figuur 1B). Figuur 1C toont de oppervlaktevorm van de nanodeeltjes die door elektronenmicroscopie als bolvormig zijn waargenomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor biomedisch onderzoek is de uitdaging bij het toedienen van exogene plasmiden aan dieren het verbeteren van de efficiëntie van de toediening en genexpressie en tegelijkertijd het minimaliseren van schade aan dieren om het gewenste therapeutische effect te bereiken15,16. We presenteren een nieuwe methode voor intraossale injectie van chitosan-gemedieerde ABE-plasmidetoediening in de beenmergcellen van ontvangende muizen. Deze ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Natural Science Foundation van de provincie Anhui (2208085MC74, 2208085MC51) en de Scientific Research Foundation van het ministerie van Onderwijs van de provincie Anhui, China (KJ2021A0055).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 ml PCR Tubes, Flat capLABSELECT PT-02-C
1 mL syringeAnhui Jiangnan medical equipment Co., LTD/
1% Pentobarbital sodium//
1.5 ml Microcentrifuge TubesLABSELECTMCT-001-150
10 × DNA Loading BufferVazymeP022-01
10X T4 DNA Ligase Buffer 1 mlTaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,LTD2011A
1250 μl Pipette Tip 102.1mmLABSELECTT-001-1250
200 μl Pipette Tips 50.55mmLABSELECT T-001-200
2x Phanta Max BufferaVazymeP505-d1
4 ? centrifugeThermo Fisher75002425
50 ml Centrifuge tubeLABSELECTT-012-50
6-well Cell Culture PlatesLABSELECT11110
AgarSangon BiotechA505255-0250
AmpAbiowell/
ChitosanSangon BiotechA600614-0500
Constant temperature culture shakerShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LTDZWY-200D
Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificCountess II/II FL
Countess Cell Counting Chamber Slides and Holder, disposableThermo Fisher ScientificC10228
CutSmart BufferNew England BiolabsB7204SVIAL
DH5αGeneral BiosystemsCS01010
DMEMgibcoC11995500BT
dNTP MixVazymeP505-d1
Esp3I enzymeNEBiolabsR0734S
Ethylenediaminetetraacetic acidVETEC (sigma-aldrich)V900106
Fetal bovine serumOriCellFBSAD-01011-500
Flow cytometerBD FACSCalibur342975
Flow tubeBeyotime BiotechnologyFFC005-1bag
Fluorescence microscopeLeica427019
gel maxi purification kitTIANGENDP210
Genomic DNA extraction kitTIANGENDP304
Glacial acetic acidChina National Pharmaceutical Group Corporation10000218
GoldBand DL2,000 DNA MarkerYESEN10501ES60
Ice machineshanghaizhengqiaoBNS-30laboratory reserved
ImunoSep BufferPrecision Biomedicals Co.,LTD604050
Megafuge 8 Small Benchtop Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75004250
MEMLife Technology11140050
NanoDrop 2000 Thermo Fisher Scientific, USA
NaOHSIGAMS5881-500G
PBSXiGeneXG3650
PCMV-SPRY-ABE8E vector//
pcr amplification apparatusThermo FisherAKC96300441
Penicillin/Streptomycin SolarbioP1400
peptoneSangon BiotechA505247-0500
Phanta Max Super-Fidelity DNA PolymeraseVazymeP505-d1
Red cell lysateBeyotimeC3702
Sodium chlorideChina National Pharmaceutical Group Corporation10019318
Sodium sulfatealaddinS433911
T-001-10 10μl Pipette Tips 31.65mmLABSELECT T-001-10
T4 DNA LigaseTaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,LTD2011A
TrisBioFroxx1115KG001
tryptoneSangon BiotechA505250-0500
vortex mixersigmaZ258423
Water bathshanghaiyihengDK-80
YeaRed Nucleic Acid Gel StainYESEN10203ES76
Yeast extractBBIA610961-0500
Zetasizer NanoMalvern PanalyticalZetasizer Nano ZS
β-mercaptoethanol Sigma444203

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ikawa, Y., et al. Gene therapy of hemoglobinopathies: Progress and future challenges. Hum Mol Genet. 28 (R1), R24-R30 (2019).
  2. Ginn, S. L., Mandwie, M., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2023-an update. J Gene Med. 26 (8), e3721(2024).
  3. Chen, J., Wang, K., Wu, J., Tian, H., Chen, X. Polycations for gene delivery: Dilemmas and solutions. Bioconjug Chem. 30 (2), 338-349 (2019).
  4. Tong, H., et al. Progress and prospects of chitosan and its derivatives as non-viral gene vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 9 (6), 495-502 (2009).
  5. Alizadeh, L., Zarebkohan, A., Salehi, R., Ajjoolabady, A., Rahmati-Yamchi, M. Chitosan-based nanotherapeutics for ovarian cancer treatment. J Drug Target. 27 (8), 839-852 (2019).
  6. Dimassi, S., Tabary, N., Chai, F., Blanchemain, N., Martel, B. Sulfonated and sulfated chitosan derivatives for biomedical applications: A review. Carbohydr Polym. 202, 382-396 (2018).
  7. Maity, S., Mukhopadhyay, P., Kundu, P. P., Chakraborti, A. S. Alginate coated chitosan core-shell nanoparticles for efficient oral delivery of naringenin in diabetic animals-an in vitro and in vivo approach. Carbohydr Polym. 170, 124-132 (2017).
  8. Abnoos, M., et al. Chitosan-alginate nano-carrier for transdermal delivery of pirfenidone in idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Biol Macromol. 118 (Pt A), 1319-1325 (2018).
  9. Lee, H. K., Smith, H. E., Liu, C., Willi, M., Hennighausen, L. Cytosine base editor 4 but not adenine base editor generates off-target mutations in mouse embryos. Commun Biol. 3 (1), 19(2020).
  10. Lee, S. N., Jang, H. S., Woo, J. S. Heterologous expression and purification of a CRISPR-cas9-based adenine base editor. Methods Mol Biol. 2606, 123-133 (2023).
  11. Tang, J., Lee, T., Sun, T. Single-nucleotide editing: From principle, optimization to application. Hum Mutat. 40 (12), 2171-2183 (2019).
  12. Newby, G. A., et al. Base editing of hematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 595 (7866), 295-302 (2021).
  13. Lu, D. Z., et al. Camkii(δ) regulates osteoclastogenesis through erk, jnk, and p38 mapks and creb signalling pathway. Mol Cell Endocrinol. 508, 110791(2020).
  14. Sato, K., et al. Regulation of osteoclast differentiation and function by the camk-creb pathway. Nat Med. 12 (12), 1410-1416 (2006).
  15. Li, X., et al. Viral vector-based gene therapy. Int J Mol Sci. 24 (9), 7736(2023).
  16. Gonçalves, G. A. R., Paiva, R. M. A. Gene therapy: Advances, challenges and perspectives. Einstein. 15 (3), 369-375 (2017).
  17. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV in clinical trials. Curr Gene Ther. 11 (4), 321-330 (2011).
  18. Mingozzi, F., et al. Cd8(+) t-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med. 13 (4), 419-422 (2007).
  19. Dong, L., Li, Y., Cong, H., Yu, B., Shen, Y. A review of chitosan in gene therapy: Developments and challenges. Carbohydr Polym. 324, 121562(2024).
  20. Rizeq, B. R., Younes, N. N., Rasool, K., Nasrallah, G. K. Synthesis, bioapplications, and toxicity evaluation of chitosan-based nanoparticles. Int J Mol Sci. 20 (22), 5776(2019).
  21. Mansouri, S., et al. Chitosan-DNA nanoparticles as non-viral vectors in gene therapy: Strategies to improve transfection efficacy. Eur J Pharm Biopharm. 57 (1), 1-8 (2004).
  22. Zhou, C., et al. Off-target rna mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature. 571 (7764), 275-278 (2019).
  23. Betzler, B. K., Chee, Y. J. Bin Abd Razak, H.R. Intraosseous injections are safe and effective in knee osteoarthritis: A systematic review. Arthrosc Sports Med Rehabil. 3 (5), e1557-e1567 (2021).
  24. Lin, Y. W., Aplan, P. D. Leukemic transformation. Cancer Biol Ther. 3 (1), 13-20 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Plasmidtransfectiebeenmergcellenosteoclastfunctieflowcytometriedynamische lichtverstrooiingeffici ntie van genbewerking

Gerelateerde artikelen