Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Frequentie en distributie van cross-overs in Caenorhabditis elegans Meiose door SNP-genotypering met behulp van real-time PCR

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68183

⸱

11 juli 2025

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een methode voor het meten van crossover-frequenties en -verdeling tijdens meiose in Caenorhabditis elegans. Genotypering van single-nucleotide polymorfisme met real-time PCR werd gebruikt om de oorsprong van de chromosomen te bepalen. De 4-punts mapping maakte het mogelijk om de crossover-verdelingen van de linkerarm-, midden- en rechterarmregio's van elk chromosoom te bepalen.

Samenvatting

Caenorhabditis elegans is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van meiose. Naast algemene voordelen, zoals een korte voortplantingscyclus, veel nakomelingen en een transparant lichaam voor beeldvorming, zijn er zes paren homologe holocentrische chromosomen. Er is een sterke crossover-interferentie en regulering van de crossover-distributie. Om de crossover-frequentie te meten, zijn zichtbare markermapping, snip-SNP-mapping en kwantificering van cytologische markers als voorlopers van crossover-vorming ontwikkeld. Hier introduceren we een aangepaste SNP-genotyperingsmethode om de crossover-frequentie en -verdeling in C. elegans-oögenese te meten. Deze methode kan de moeizame stappen van restrictievertering en gelelektroforese weglaten en het dubbelzinnige oordeel van niet-gesneden DNA-banden vermijden. Genotypering van single-nucleotide polymorfisme (SNP) wordt uitgevoerd met behulp van de Bristol/Hawaiian hybride stam. Het kruisen van hermafrodieten met mannetjes die myo-3p::GFP tot expressie brengen, stelt ons in staat om ons te concentreren op oögenese. Een enkel wormlysaat produceert voldoende DNA-sjabloon voor alle zes chromosomen. De 5' exonuclease-gebaseerde TaqMan-chemie en SNP-specifieke minor groove binder (MGB) sondes maken de nauwkeurige detectie van SNP mogelijk met een genotyperingssnelheid van ongeveer 97,7%. We gebruiken de nauwkeurige detectie van SNP's om de crossover-frequentie in C. elegans te meten. Deze methode kan ook worden toegepast om de crossover-frequentie te bepalen bij mannelijke of cross-over-defecte mutanten, evenals voor meer specifieke chromosomale intervallen.

Inleiding

Crossover-vorming tussen homologe chromosomen is essentieel voor een goede scheiding van chromosomen en ook voor het genereren van genetische diversiteit1. Fouten in de crossover-formatie veroorzaken aneuploïdie, wat kan leiden tot onvruchtbaarheid, miskraam en geboorteafwijkingen2. De crossover-frequentie varieert per chromosoomgebied, mutanttype, leeftijd en geslacht, wat de noodzaak onderstreept om de crossover-frequentie onder elk van deze omstandigheden nauwkeurig te meten 3,4,5. Het algemene doel van deze methode is om de crossover-frequentie van elk chromosomaal domein nauwkeurig te meten en daardoor de verdeling van crossovers over de gehele lengte van het C. elegans-chromosoom nauwkeurig te bepalen.

Traditioneel wordt tweepuntskartering met behulp van morfologische markers gebruikt om de crossover-frequentie 6,7,8,9,10 te meten. In C. elegans worden dumpy, korte, dikke lichaam (Dpy) en ongecoördineerde beweging (Unc) fenotypes vaak gebruikt om chromosoomkaarten te maken6. De voordelen van deze methode zijn de lage kosten en het vermogen om veel nakomelingen te analyseren. De nadelen van deze methoden zijn onder meer de beperking van het kiezen van de loci die van belang zijn en het onvermogen om dodelijke nakomelingen te gebruiken omdat hun fenotypes niet zichtbaar zijn. Om het ongemak van de locatiekeuze te ondervangen, zijn Tc1-transposons gebruikt als markers voor polymorfe sequentie-gelabelde sites (STS)11,12. Tc1's kunnen worden gedetecteerd met behulp van PCR en elektroforese. Terwijl de standaard Bristol N2-stam 30 exemplaren van de Tc1-transposon had, hadden de C. elegans-isolaten uit Bergerac in Frankrijk (RW7000 en DP13) 500 exemplaren van Tc1. Het aantal en de verdeling van Tc1-transposons variëren dus tussen isolaten, en dit wordt gebruikt om de chromosomen van het nageslacht van hybride wormen tussen isolaten te analyseren door middel van PCR. Vervolgens werden SNP's ook gebruikt om de crossover-frequentie en -verdeling te meten13,14. De SNP tussen de Bristol N2- en Hawaiiaanse CB4856-stammen verscheen elke 1,000 bp15,16. SNP's worden gedetecteerd als restrictiefragmentlengtepolymorfismen (RFLP) met behulp van PCR, restrictiedigestie en elektroforese. Onlangs zijn kleine insertie/deletie-sites (InDel) en SNP's tussen Bristol N2 en Hawaiian CB4856 voorgesteld als efficiëntere markers17. Het meten van de crossover-frequentie met behulp van Tc1, RFLP en InDel vereist echter arbeidsintensieve processen zoals PCR, restrictie-enzymbehandeling en elektroforese. Als niet elk proces wordt geoptimaliseerd in een grootschalige analyse, kunnen de resultaten verkeerd worden geïnterpreteerd vanwege factoren zoals de nauwkeurigheid van PCR, het type restrictie-enzym dat wordt gebruikt, de efficiëntie van DNA-splitsing en de helderheid en scheiding van banden tijdens elektroforese. De voorgestelde methode maakt daarentegen gebruik van SNP-genotypering door real-time PCR om nauwkeurige en nauwkeurige kwantificering mogelijk te maken.

Cross-overs zijn niet willekeurig verdeeld langs chromosomen. Bij C. elegans hebben enkelvoudige crossovers de neiging zich vaker in de armen te vormen en worden ze in het midden onderdrukt 3,5. Morfologische tweepuntskartering kan niet vaststellen waar cross-overs plaatsvinden buiten markergenen. Omgekeerd zorgt SNP-mapping voor een toename van markers en is aangetoond dat het de bepaling van het exacte gebied van een cross-over langs het hele chromosoom 5,14,18 vergemakkelijkt. In deze studie gebruikten we de chromosomale domeingrenzen voorgesteld door Rockman en Kruyglyak5 en selecteerden we vier SNP's voor analyse: aan beide uiteinden van het chromosoom en aan beide uiteinden van de centrum/armgrenzen.

Door gebruik te maken van de vorige methoden, hebben we een nauwkeurige en snelle SNP-detectiemethode voorgesteld door middel van real-time PCR met behulp van TaqMan, 5' nuclease19 om de cross-over tussen de linkerarm, middelste en rechterarm van elk chromosoom te meten. De voordelen van onze methode ten opzichte van alternatieve technologieën, in vergelijking met eerdere studies 20,21,22, zijn nauwkeurigheid en eenvoud. Deze methode is een qPCR-toegepaste cross-over analysemethode voor C. elegans en is zeer geschikt voor onderzoekers die meiose bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Eerste genetische kruising

  1. Bereid bijpassende platen voor die bestaan uit normale Nematoden Growth Medium (NGM) platen met een kleine OP50-vlek (~5 mm diameter) in de schaal van 35 mm.
  2. Voeg drie L4-hermafrodieten van de Bristol N2-stam (of mutanten met een Bristol-achtergrond) en negen jongvolwassen mannetjes van de Hawaiiaanse CB4856-stam toe aan een paringsplaat (Figuur 1A).
    OPMERKING: Om mutanten met een hoge embryonale letaliteit te analyseren, is het noodzakelijk om gebalanceerde mutanten met zowel Bristol- als Hawaiiaanse achtergronden in deze kruising te gebruiken. Om mutanten met een Hawaïaanse achtergrond te verkrijgen, moeten de Bristol-mutanten minstens zes keer worden gekruist met de Hawaïaanse stam totdat alle SNP-locaties van belang een Hawaïaanse achtergrond hebben. Als gevolg hiervan bevat de Hawaiiaanse mutant alleen Bristol-achtergrond in het gemuteerde gebied en het balancerchromosoom.
  3. Incubeer de plaat gedurende 1,5 dag bij 20 °C om de twee stammen te paren. Breng elke hermafrodiet over op een nieuwe individuele NGM-plaat met OP50.
  4. Plaats de platen 1 dag in een broedmachine van 20 °C zodat ze bevruchte eieren kunnen leggen. Breng elke hermafrodiet over op een nieuwe individuele NGM-plaat met OP50.
  5. Plaats de platen 1 dag in een broedmachine van 20 °C zodat de bevruchte eieren opnieuw kunnen worden gelegd. Verwijder de hermafrodieten. Bewaar de platen 0,5 - 1 dag in een incubator van 20 °C om de nakomelingen tot L4 te laten groeien.

2. Tweede kruis

  1. Kies zes gekruiste-L4-hermafrodieten (Bristol/Hawaiiaanse hybriden) en 12-15 ccIs4251[(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitochondriale GFP + dpy-20(+)] I (TTS24) Bristol mannetjes op een nieuwe paringsplaat (Figuur 1B).
    OPMERKING: De ccIs4251 ingebrachte stam is verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center en moet meer dan zes keer worden gekruist met de wildtype N2-stam.
  2. Bewaar de plaat 1,5 dag bij 20 °C in een broedmachine om te paren. Breng elke hermafrodiet over op een nieuwe NGM-plaat met OP50.
  3. Plaats de platen 1 dag in een broedmachine van 20 °C zodat ze bevruchte eieren kunnen leggen. Breng elke hermafrodiet over op een nieuwe individuele NGM-plaat met OP50.
  4. Bewaar de platen 1 dag in een broedmachine van 20 °C om ze opnieuw bevruchte eieren te laten leggen. Breng elke ouderlijke hermafrodiet over naar een PCR-buisje met 3 μL lysisbuffer om te controleren of de eerste kruising succesvol was.
  5. Controleer de genotypen van de ouders als een Bristol/Hawaiiaanse hybride door middel van PCR in een gebied van chromosoom V. Scheid de banden door 2,5% agarosegelelektroforese.
    1. In de SNP, WBVar01973670, is de lengte van het PCR-amplicon van het Bristol-genoom 220 bp en van het Hawaiiaanse genoom 196 bp. Als de PCR-resultaten aangeven dat de ouders Bristol-homozygoten zijn, is dit te wijten aan zelfbevruchting van de eerste kruising. Gebruik het nageslacht van deze wormen niet voor verdere analyse.

3. Bemonstering

  1. Bereid de lysisbuffer van de worm als volgt voor: 50 mM KCL, 10 mM Tris pH 8,2, 2,5 mM MgCl2, 0,45% IGEPAL CA-630 (NP-40), 0,45% Tween 20 en 0,01% gelatine. Steriliseer door filtratie en bewaar bij kamertemperatuur. Voeg onmiddellijk voor gebruik 3 μl 20 mg/ml proteïnase K (in H2O) toe aan 1 ml lysisbuffer en bewaar in aliquots bij -20 °C.
  2. Controleer de expressie van de GFP op de lichaamswandspier van de nakomelingen van de tweede kruising met een fluorescerende dissectiemicroscoop voordat de wormen aan individuele PCR-buisjes worden toegevoegd. De vergroting is 6,1-55x en de gebruikte golflengte is 440-460 nm.
  3. Kies een GFP-positieve enkelvoudige worm en voeg deze toe aan elk PCR-buisje met 3 μL wormlysisbuffer (Figuur 1C). Verzamel in totaal 360 (90 x 4 biologische replicaten) volwassen mannelijke gekruiste nakomelingen in elk van de 360 PCR-buisjes.
    OPMERKING: Om te voorkomen dat zelfbevruchte nakomelingen worden gekozen, moeten GFP-positieve wormen worden geselecteerd voor de bemonstering. Ongepaarde hermafrodieten jonger dan L4 zijn ook beschikbaar voor analyse van autosomen, maar omdat ze verschillende aantallen X-chromosomen hebben, moeten mannetjes en hermafrodieten worden geïdentificeerd nadat ze tot L4 zijn gegroeid en worden bemonsterd bij het analyseren van het X-chromosoom.
  4. Plaats de monsters gedurende 5 minuten in een vriezer van -80 °C. Monsters kunnen bij -80 °C worden bewaard totdat de lysis kan beginnen.
  5. Bij het analyseren van mutanten met een hoge embryonale letaliteit, verzamel de dode embryo's in plaats van levende larven om onbevooroordeelde resultaten te verkrijgen. Gebruik voor het verzamelen van embryo's een pipetpunt met 0,5 μL chitinaseoplossing (20 mg/ml chitinase, 50 mM NaCl, 70 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2). Verzamel embryo's binnen 4 uur na het leggen.
    OPMERKING: Dode embryo's die meer dan 4 uur geleden zijn gelegd, zijn ongeschikt voor PCR-analyse, waarschijnlijk vanwege de afbraak van genomisch DNA.

4. Monster lysis

  1. Stel de PCR-buisjes in de thermische cycler in op 60 °C gedurende 1 uur, gevolgd door 95 °C gedurende 15 minuten. Voeg 100 μL nucleasevrij water toe aan elke buis en meng goed.
  2. Bewaar monsters bij -20 °C totdat u begint met SNP-genotypering door real-time PCR.

5. SNP-genotypering

  1. Maak een mengsel als volgt (Figuur 2). Voeg in een tube van 1,5 ml 125 μL Master Mix, 6 μL SNP Genotyping Assay (40x), 280 μL gedestilleerd water (DW), Forward primer (450 nM), Reverse primer (450 nM), Probe 1 (100 nM), Probe 2 (100 nM) toe.
    OPMERKING: De sondes en primers staan vermeld in tabel 1.
  2. Meng grondig door meerdere keren te pipetteren om een gelijkmatige concentratie te garanderen. Voeg 4 μL van het mengsel toe aan elk putje van een PCR-plaat met 96 putjes op de steunbasis met een 12-kanaals micropipet.
  3. Voeg 1 μl lysaat met elk genomisch DNA toe aan elk putje en meng door meerdere keren te pipetteren.
  4. Bereid positieve controles voor, d.w.z. Bristol-homozygoten, Hawaiiaanse homozygoten en Bristol/Hawaiiaanse hybriden, en drie no-template-controles als negatieve controles (figuur 3A).
  5. Sluit de plaat af met een optische kleeffolie. Druk met een applicator op de film die scherpstelt op de randen van elk putje.
  6. Centrifugeer de plaat kort om de vloeistof op de bodem op te vangen en verwijder luchtbellen uit de vloeistof.
  7. Laad de plaat op het real-time PCR-instrument. Klik op de knop Nieuw experiment maken in de software.
  8. Stel in de instelling Eigenschappen Instrumenttype in op QuantStudio 1-systeem, Bloktype op Blok van 0,2 ml met 96 wells, Experimenteel type op Genotypering, Chemie op TaqMan-reagentia en de modus Uitvoeren op Snel.
  9. Stel in de instelling Methode het volume in op 5 μl (zorg ervoor dat het juiste reactievolume overeenkomt met de instelling), het aantal cycli op 40 cycli (standaard). Stel de temperatuur- en tijdinstellingen als volgt in: Pre-Read Stage bij 25 °C gedurende 30 s, Hold Stage (enzymactivering, hete start) bij 95 °C gedurende 20 s, PCR Stage bij 95 °C gedurende 1 s, 60 °C gedurende 20 s en Post-Read Stage bij 25 °C gedurende 30 s.
  10. Zorg er in de instelling Plaat voor dat de posities van de monsters en bedieningselementen overeenkomen met elke put op het softwarescherm.
  11. Sla het experiment op een USB-apparaat op, laad het in het realtime PCR-instrument en klik op de knop Uitvoeren .

6. Gegevensanalyse

  1. Sla de resultaten op een USB op en breng ze over naar een computer voor gegevensanalyse.
  2. Analyseer real-time delta Rn (dRn)-gegevens met behulp van de onderstaande formule, waarbij Rn (genormaliseerde reporter) het fluorescentiesignaal is van de reporterkleurstof, VIC en FAM, genormaliseerd door te delen door het fluorescentiesignaal van de passieve referentiekleurstof, ROX.
    dRn = Rn - basislijn
  3. Bekijk de plot van allelische discriminatie.
  4. Bevestig de scheiding van clusters (Figuur 3B). In de alleldiscriminatiegrafiek zijn Bristol-homozygoten gegroepeerd in de rechterbenedenhoek, Bristol/Hawaiiaanse hybriden zijn gegroepeerd in de rechterbovenhoek, Hawaiiaanse homozygoten zijn gegroepeerd in de linkerbovenhoek en negatieve controles zijn gegroepeerd in de linkerbenedenhoek. Gebruik de volgende kleurcodes:
    Rood: Bristol allel
    Blauw: Hawaiiaans allel
    Groen: Heterozygoot
    Zwart: Negatieve controle
  5. Exporteer de resultaten naar een spreadsheetbestand en verzamel de genotyperingsgegevens van alle vier de SNP-posities. Als er onbepaalde oproepen zijn op vier opeenvolgende posities, sluit dan de gegevens uit van de N-waarde. Gebruik 90 monsters per plaat voor analyse.
    1. Identificeer de crossovers als volgt: Als de SNP op positie #1 een Bristol/Hawaiiaanse hybride is, en posities #2-#4 allemaal Bristol-homozygoten zijn [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B] of positie #1 een Bristol-homozygoot is en positie #2-#4 allemaal Bristol/Hawaiiaanse hybriden zijn [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H], Deze resultaten duiden op een enkele cross-over tussen posities #1 en #2 (ergens op de linkerarm van het chromosoom). Evenzo, in het geval van [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B] of [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H], vindt een enkele cross-over plaats tussen #2 en #3 (ergens in het centrale gebied van het chromosoom), en in het geval van [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H], Een enkele cross-over vindt plaats tussen #3 en #4 (ergens op de rechterarm van het chromosoom).
      OPMERKING: Er zijn zes patronen van dubbele crossovers. Links en rechts: [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/B] en [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H], links en midden: [B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H], midden en rechts: [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H].

7. Statistische analyse

  1. Voer de waarden in de SPSS Statistics-software (IBM) in. Voor de vergelijking van de crossover-verdeling in de linkerarm, het centrale gebied en de rechterarm van de chromosomen, voegt u 82 chromosomen in met een cross-over in de linkerarm, 20 chromosomen met een cross-over in het centrale gebied en 68 chromosomen met een cross-over in de rechterarm.
  2. Voer ANOVA- en Bonferroni-correctie uit en bepaal de statistische significantie met behulp van een tweezijdige p-waarde. Voer zoveel vergelijkingen uit als nodig is, zoals linkerarm versus midden of WT versus mutant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben de vier SNP-plaatsen op chromosoom II in C. elegans gedetecteerd door middel van SNP-genotyperingstest om de crossover-vorming te kwantificeren per volledige lengte van het chromosoom, in de linkerarm, in het centrale gebied en in de rechterarm. De detectie van SNP's wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De mastermix bevat Taq DNA-polymerase, hittelabiel uracil-N-glycosylase (UNG), dNTP met dUTP en passieve referentie-ROX-kleurstof. Taq DNA-polymera...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier hebben we een methode geïntroduceerd voor het meten van de crossover-frequentie en -verdeling in C. elegans meiose op basis van SNP-genotypering van gekruiste nakomelingen van de Bristol/Hawaiiaanse hybride soorten. Terwijl de conventionele snip-SNP-methode (RFLP) gelelektroforese na PCR vereist en de detectie van DNA-banden een geldocumentatiesysteem vereist 14,18, vereist SNP-genotypering door de 5'-nucleasetest m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

De soorten werden vriendelijk ter beschikking gesteld door het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). We danken de leden van het Saito Laboratorium voor hun nuttige discussies over dit werk. Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant JP23K05868 aan TTS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
101-1000μl Pipette TipQSP111-N-Q
0.5mol/I-EDTA Solution (pH 8.0)Nacalai tesque14347-21
10mol/I-Sodium Hydroxide SolutionNacalai tesque94611-45
10X DreamTaq Green BufferThermo Fisher Scientific EP0713
10μL, Long Tip, GranduatedFUKAEKASEI, WATSON110-207C
200μL, Standard Tip, GraduatedFUKAEKASEI, WATSON110-705C
Agar PowderNacalai tesque01028-14
AgarosePH JapanPH108
Autoclave TOMY model ES-215 High Pressure Steam SterilizerTOMY SEIKOES-215
Bacto Peptone Enzymatic Digest of ProteinThermo Fisher Scientific 211677
Boric AcidNacalai tesque05215-05
Caenorhabditis elegans Bristol wild-type Caenorhabditis Genetics CenterN2
Caenorhabditis elegans Hawaiian wild-typeCaenorhabditis Genetics CenterCB4856
Calcium ChlorideNacalai tesque06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitochondrial GFP + dpy-20(+)] ISaito labTTS24originally from PD4251
CholesterolNacalai tesque08721-62
Custom TaqMan SNP Genotyping AssaysThermo Fisher Scientific 4332077
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BiolabsN04470
DigPrint Doc Tablet DP-T130zBio ToolsDP-T130z
di-Potassium HydrogenphosphateNacalai tesque28726-05
Dissecting MicroscopeNikonSMZ-745 C-DS
Dream Taq DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific EP0713
Ethidium Bromide SolutionNacalai tesque14631-94
Forward Primer for WBVar01973670IDT103988736atgtctcacccaaggttgaa
gelatinNacalai tesque166-31
Gilson PIPETMAN Classic PipetThermo Fisher Scientific 
IGEPAL CA-630Sigma-Aldrich18896
Magnesium Sulfate HeptahydrateNacalai tesque21003-75
MicroAmp Optical 96-Well Reacton PlateThermo Fisher Scientific N8010560
MicroAmp Optical Adhedive FilmThermo Fisher Scientific 4311971
MiniAmp  thermal cyclerThermo Fisher Scientific MiniAmp
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System, 7 x 10 cm trayBio-Rad Laboratories1704466
Nichipet EXIINichiryo00-NPX2-2
Nichipet EXII MULTINichiryo00-NPM-12VP
Pippete Mate NEONichiryo00-PMNEO
Potassium ChlorideNacalai tesque285-38
Potassium DihydrogenphosphateNacalai tesque28720-65
Proteinase KThermo Fisher Scientific EO0491
QuantStudio 1 Real-Time PCR System, 96-well, 0.2 mLThermo Fisher Scientific A40426
Quick-Load Purple 1kb Plus DNA LadderNew England BiolabsN0550S
Reverse Primer for WBVar01973670IDT103988737tggctactcctagtcactga
Sodium ChloridsNacalai tesque31319-45
TaqPath ProAmp Master MixThermo Fisher Scientific A30866
TC Dish 35, StandardSARSTEDT83.3900
Tris (hydroxymethyl) aminomethaneNacalai tesque35406-75
Trizma baseSigma-Aldrich T1503-1KG
Tween 20Yoneyama Reagent03706
WormStuff Worm PickGenesee Scientific59-AWP
WormStuff Worm Pick Tips(90/10% Pt/Ir, 30 Gauge)Genesee Scientific59-30PI36

Referenties

  1. Jones, G., Kleckner, N., Zickler, D. Meiosis through three centuries. Chromosoma. 133 (2), 93-115 (2024).
  2. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: Recombination and human aneuploidy. Prenat Diagn. 41 (5), 584-590 (2021).
  3. Barnes, T. M., Kohara, Y., Coulson, A., Hekimi, S. Meiotic recombination, noncoding DNA and genomic organization in caenorhabditis elegans. Genetics. 141 (1), 159-179 (1995).
  4. Lim, J. G., Stine, R. R., Yanowitz, J. L. Domain-specific regulation of recombination in Caenorhabditis elegans in response to temperature, age, and sex. Genetics. 180 (2), 715-726 (2008).
  5. Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5 (3), e1000419(2009).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Li, W., Yanowitz, J. L. Atm and atr influence meiotic crossover formation through antagonistic and overlapping functions in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 431-443 (2019).
  8. Rose, A. M., Baillie, D. L. The effect of temperature and parental age on recombination and nondisjunction in Caenorhabditis elegans. Genetics. 92 (2), 409-418 (1979).
  9. Villeneuve, A. M. A cis-acting locus that promotes crossing over between X chromosomes in Caenorhabditis elegans. Genetics. 136 (3), 887-902 (1994).
  10. Youds, J. L., et al. Rtel-1 enforces meiotic crossover interference and homeostasis. Science. 327 (5970), 1254-1258 (2010).
  11. Emmons, S. W., Yesner, L., Ruan, K. S., Katzenberg, D. Evidence for a transposon in Caenorhabditis elegans. Cell. 32 (1), 55-65 (1983).
  12. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131 (3), 609-624 (1992).
  13. Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. Chromosome-wide control of meiotic crossing over in C. elegans. Curr Biol. 13 (18), 1641-1647 (2003).
  14. Wicks, S. R., Yeh, R. T., Gish, W. R., Waterston, R. H., Plasterk, R. H. Rapid gene mapping in Caenorhabditis elegans using a high-density polymorphism map. Nat Genet. 28 (2), 160-164 (2001).
  15. Campos, T. L., Korhonen, P. K., Sternberg, P. W., Gasser, R. B., Young, N. D. Predicting gene essentiality in Caenorhabditis elegans by feature engineering and machine-learning. Comput Struct Biotechnol J. 18, 1093-1102 (2020).
  16. Fay, D., Bender, A. Snps: Introduction and two-point mapping. WormBook. , (2008).
  17. Hwang, H. Y., Wang, J. Fast genetic mapping using insertion-deletion polymorphisms in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 11 (1), 11017(2021).
  18. Davis, M. W., et al. Rapid single nucleotide polymorphism mapping in C. elegans. BMC Genomics. 6, 118(2005).
  19. Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
  20. Li, Q., et al. The tumor suppressor BRCA1-BARD1 complex localizes to the synaptonemal complex and regulates recombination under meiotic dysfunction in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 14 (11), e1007701(2018).
  21. Saito, T. T., Lui, D. Y., Kim, H. M., Meyer, K., Colaiacovo, M. P. Interplay between structure-specific endonucleases for crossover control during Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genet. 9 (7), e1003586(2013).
  22. Saito, T. T., Youds, J. L., Boulton, S. J., Colaiacovo, M. P. Caenorhabditis elegans him-18/slx-4 interacts with slx-1 and xpf-1 and maintains genomic integrity in the germline by processing recombination intermediates. PLoS Genet. 5 (11), e1000735(2009).
  23. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  24. Kutyavin, I. V., et al. 3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at pcr extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28 (2), 655-661 (2000).
  25. Hammarlund, M., Davis, M. W., Nguyen, H., Dayton, D., Jorgensen, E. M. Heterozygous insertions alter crossover distribution but allow crossover interference in Caenorhabditis elegans. Genetics. 171 (3), 1047-1056 (2005).
  26. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
  27. Meneely, P. M., Farago, A. F., Kauffman, T. M. Crossover distribution and high interference for both the X chromosome and an autosome during oogenesis and spermatogenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 162 (3), 1169-1177 (2002).
  28. Nabeshima, K., Villeneuve, A. M., Hillers, K. J. Chromosome-wide regulation of meiotic crossover formation in Caenorhabditis elegans requires properly assembled chromosome axes. Genetics. 168 (3), 1275-1292 (2004).
  29. Phillips, C. M., Dernburg, A. F. A family of zinc-finger proteins is required for chromosome-specific pairing and synapsis during meiosis in C. elegans. Dev Cell. 11 (6), 817-829 (2006).
  30. Mancera, E., Bourgon, R., Brozzi, A., Huber, W., Steinmetz, L. M. High-resolution mapping of meiotic crossovers and non-crossovers in yeast. Nature. 454 (7203), 479-485 (2008).
  31. Qi, J., et al. Characterization of meiotic crossovers and gene conversion by whole-genome sequencing in Saccharomyces cerevisiae. BMC Genomics. 10, 475(2009).
  32. Miller, D. E., et al. A whole-chromosome analysis of meiotic recombination in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2 (2), 249-260 (2012).
  33. Carlton, P. M., Farruggio, A. P., Dernburg, A. F. A link between meiotic prophase progression and crossover control. PLoS Genet. 2 (2), e12(2006).
  34. Tsai, C. J., et al. Meiotic crossover number and distribution are regulated by a dosage compensation protein that resembles a condensin subunit. Genes Dev. 22 (2), 194-211 (2008).
  35. Bhalla, N., Wynne, D. J., Jantsch, V., Dernburg, A. F. Zhp-3 acts at crossovers to couple meiotic recombination with synaptonemal complex disassembly and bivalent formation in C. elegans. PLoS Genet. 4 (10), e1000235(2008).
  36. Yokoo, R., et al. Cosa-1 reveals robust homeostasis and separable licensing and reinforcement steps governing meiotic crossovers. Cell. 149 (1), 75-87 (2012).
  37. Almanzar, D. E., et al. Meiotic DNA exchanges in C. elegans are promoted by proximity to the synaptonemal complex. Life Sci Alliance. 6 (4), e202301906(2023).
  38. De Los Santos, T., et al. The mus81/mms4 endonuclease acts independently of double-holliday junction resolution to promote a distinct subset of crossovers during meiosis in budding yeast. Genetics. 164 (1), 81-94 (2003).
  39. Saito, T. T., Colaiacovo, M. P. Regulation of crossover frequency and distribution during meiotic recombination. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 82, 223-234 (2017).
  40. Zalevsky, J., Macqueen, A. J., Duffy, J. B., Kemphues, K. J., Villeneuve, A. M. Crossing over during Caenorhabditis elegans meiosis requires a conserved mutS-based pathway that is partially dispensable in budding yeast. Genetics. 153 (3), 1271-1283 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Crossoverfrequentiemeiotische recombinatiechromosoommappingTaqMan-chemieanalyse van oogenesegenetische mutantencrossoverdistributie
Frequentie en distributie van cross-overs in Caenorhabditis elegans Meiose door SNP-genotypering met behulp van real-time PCR
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.