Method Article

Ontwikkeling van een op microfluïdica gebaseerde benadering voor het onderzoeken van de mechanica van microtubuli-polymeren

DOI:

10.3791/68185

⸱

May 30th, 2025

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft het ontwerp en de fabricage van een microfluïdisch apparaat dat geschikt is voor het onderzoeken van de mechanica van microtubuli-polymeren. De synthese van microfabricage, geautomatiseerde stroomregeling en computationele modelleringstechnieken maakt een flexibel systeem mogelijk dat bij uitstek geschikt is om het cellulaire cytoskelet in vitro te onderzoeken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we het ontwerp en de fabricage van een microfluïdisch apparaat dat is ontwikkeld voor het onderzoek naar de mechanica van microtubuli-polymeren. Het ontwerp maakt gebruik van de intrinsieke voordelen van op polydimethylsiloxaan (PDMS) gebaseerde microfluïdische apparaten en introduceert verschillende functies om een robuuste en aanpasbare experimentele aanpak met hoge doorvoer mogelijk te maken. Het ontwikkelde apparaat bevat redundante mogelijkheden voor het opvangen van bellen om het optreden van schadelijke luchtbellen te voorkomen. Bovendien werkt het apparaat samen met een geautomatiseerd debietcontrolesysteem om handmatige interventie te verminderen en analyses met een hoge doorvoer mogelijk te maken. Commerciële simulatiesoftware wordt gebruikt om het vloeistoftransport met behulp van dit systeem beter te ontwikkelen en te begrijpen. Ten slotte demonstreren we de mogelijkheid om meerdere experimenten tegelijk uit te voeren binnen een enkel apparaat door microtubuli-extensies te laten groeien met verschillende fluorescerende labels in verschillende secties van het apparaat. Over het algemeen kan dit microfluïdische stroomsysteem worden gebruikt om de mechanica van microtubuli-polymeren te onderzoeken en biedt het verbeteringen in het experimentele ontwerp voor bredere in vitro-onderzoeken naar microtubuli. De synthese van microfabricage, geautomatiseerde stroomregeling en computationele modelleringsbenaderingen maakt een flexibel systeem mogelijk dat bij uitstek geschikt is voor het in vitro onderzoeken van het cellulaire cytoskelet.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microfluïdica maakt een nauwkeurige regeling mogelijk van minuscule vloeistofvolumes, vaak minder dan één microliter, door het ingewikkelde ontwerp en de fabricage van vloeistofstroomkanalen 1,2. De kleinschaligheid van microfluïdische apparaten leidt tot unieke technische fenomenen. Het Reynoldsgetal - een dimensieloze maat voor de verhouding tussen traagheids- en viskeuze krachten in de vloeistofstroom - is namelijk klein, meestal in de orde van O(10) of lager in microfluïdica, wat het belang van viskeuze krachten in microfluïdische apparaten onderstreept. Bovendien laat het Péclet-getal, dat convectief transport vergelijkt met diffuus transport, zien dat convectief transport over het algemeen verwaarloosbaar is in microfluïdica 3,4,5. Dit diffusie-aangedreven, laminaire stromingsregime in microfluïdica is voordelig, omdat het parallelle experimenten op een enkel apparaat ondersteunt door nauwkeurige vloeistofgradiënten te behouden.

Fotolithografie blijft de primaire methode voor het vervaardigen van microfluïdische apparaten 6,7,8. In het kort omvat dit proces het maken van een 'master' geëtste sjabloon van het microfluïdische ontwerp (Figuur 1). Een lichtgevoelig substraat wordt voorbereid en een fotomasker met een microfluïdisch ontwerp stelt selectief gebieden met fotoresist bloot aan ultraviolette straling. Latere etsmethoden ontwikkelen het substraat, waardoor een reliëf van het ontwerp ontstaat. Polydimethylsiloxaan (PDMS) wordt vaak gegoten en uitgehard op de master. Het uitgeharde PDMS, dat de negatieve kenmerken van het ontwerp overneemt, wordt vervolgens uit de master verwijderd en op een glazen dekglaasje gebonden. Dit hele fabricageproces duurt doorgaans 1-2 dagen, waardoor snelle ontwerpiteraties en de productie van meerdere apparaten mogelijk zijn. Gedetailleerde beoordelingen van zachte lithografie en microfabricageprocessen zijn beschikbaar in andere referenties 1,2,3,10,11,12,13.

figure-introduction-1
Figuur 1: Overzichten van het traditionele fotolithografieproces en het microfabricageproces. (A) Traditioneel fotolithografieproces en (B) microfabricageproces. Afhankelijk van de toepassing en de gewenste fotoresist-eigenschappen kan een negatieve of een positieve fotoresist worden gebruikt, ook al leveren ze dezelfde ontwerpmaster op. Eigenschappen zoals de gewenste hoogte van het kenmerk of de fotoresist-smelttemperatuur helpen bij het bepalen van het juiste fotoresist-type. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Rogers (2022)14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het gebruik van microfluïdica heeft de mogelijkheden in veel onderzoeksgebieden uitgebreid, met de meest recente impact in de biologische wetenschappen. Gezien de kleinschaligheid maakt microfluïdica het mogelijk om beperkte, waardevolle hulpbronnen zoals cellen of eiwitten nauwkeurig te beheren. Nog belangrijker is de afstembaarheid van microfluïdische systemen om fysiologische omstandigheden na te bootsen, zoals veranderingen in de stijfheid van het substraat, de uitoefening van kracht op een monster en zelfs de integratie van elektrische stroom. Bovendien biedt het gebruik van microfluïdica de mogelijkheid om meerdere reagentia parallel te manipuleren en om snel prototypes te maken en systeemontwerpen iteratief te verfijnen. Deze functies maken de miniaturisatie van volledige laboratoriumworkflows op één apparaat mogelijk, gewoonlijk een "lab-on-a-chip" genoemd1,6,9,15,16,17,18,19.

Een van de celbiologische toepassingen van microfluïdica is het onderzoek naar microtubuli-polymeren. Microtubuli zijn een essentieel onderdeel van het cytoskelet van de cel en spelen een cruciale rol in processen zoals celdeling en intracellulair vrachtvervoer 20,21. Als het meest stijve element van het cytoskelet vertonen microtubuli een elastische modulus die vergelijkbaar is met die van plexiglas 22,23. Hun robuuste mechanische eigenschappen zijn cruciaal voor verschillende cellulaire functies, waaronder bijvoorbeeld samentrekking van cardiomyocyten, waarbij ze cyclisch buigen en ontspannen tijdens de systolische en diastolische fasen van het hart24. Microfluïdische apparaten zijn eerder gebruikt om de eigenschappen van microtubuli en hun hogere-ordestructuren in vitro te onderzoeken. Microfluïdica is inderdaad gebruikt om de polymerisatiedynamiek van microtubuli, microtubuli-microtubuli-interacties en de effecten van microtubuli-geassocieerde eiwitten op de mechanische eigenschappen van microtubuli te onderzoeken 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41.

Hoewel de introductie van microfluïdica in het microtubuli-veld veel opwindende ontdekkingen heeft opgeleverd, ligt er nog steeds ruimte voor verbetering in de aanpassing van deze apparaten voor onderzoek naar microtubuli. In dit werk gaan we in op twee specifieke beperkingen die blijven bestaan bij het bestuderen van microtubuli in microfluïdische apparaten: het potentieel voor de vorming van luchtbellen in het apparaat, meestal geïntroduceerd door handmatige manipulatie van microfluïdische apparaten, en de onderbenutting van high-throughput assays. Ten eerste kunnen handmatige manipulaties, zoals het aansluiten en loskoppelen van slangen, luchtbelvorming in kanalen veroorzaken. De vorming van luchtbellen in een flowcel is catastrofaal, omdat luchtbellen eiwitten kunnen denatureren, microtubuli-polymeren kunnen afschuiven en celculturen nadelig kunnen beïnvloeden42,43. Bovendien resulteren scherpe hoeken en schuine hoeken in het apparaat in een niet-uniforme bevochtiging van het oppervlak, waardoor de kans op luchtmeevoering toeneemt. Er zijn tal van technieken ontwikkeld om de vorming, persistentie en impact van luchtbellen te verminderen; Het gebruik van methoden om bubbels te beperken is echter niet universeel 42,43,44,45,46. Bovendien, hoewel een van de grote voordelen van het gebruik van microfluïdica de mogelijkheid is om met high-throughput te experimenteren, is microfluïdica nog niet gebruikt om onderzoek naar microtubuli op te schalen. Microfluïdische apparaten kunnen worden ontworpen om meerdere experimentele omstandigheden parallel op hetzelfde apparaat te testen. Vloeistofgradiënten kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om de stroom van verschillende microtubuli-geassocieerde eiwitten of geneesmiddelen te sturen, waardoor ze gericht kunnen worden afgeleverd aan specifieke regio's van gepartitioneerde microtubuli binnen hetzelfde apparaat.

Hier hebben we iteratief een microfluïdisch apparaat ontworpen dat deze beperkingen aanpakt. We bieden het stapsgewijze protocol voor de fabricage van het apparaat, waardoor een breder publiek microfluïdische technologie kan gebruiken in hun onderzoek naar microtubuli. Dit apparaatontwerp bevat functies voor het opvangen van bubbels en maakt gebruik van een geautomatiseerd stroomcontrolesysteem om handmatige interventie te verminderen, terwijl het ook gradiënten van oplossingen in het apparaat mogelijk maakt voor analyses met een hoge doorvoer. Samenvattend kan de ontwikkeling van dit microfluïdische ontwerp een breder onderzoek en begrip van de mechanica van microtubuli vergemakkelijken, terwijl het waardevolle verbeteringen biedt aan experimentele ontwerpen in het bredere onderzoeksveld van microtubuli.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Het werk dat in dit deel van het protocol wordt beschreven, werd uitgevoerd in de kernklasse 100 cleanroom van het Vanderbilt Institute of Nanoscale Science and Engineering (VINSE). Een gecontroleerde cleanroom met de juiste omkleding en UV-gefilterde verlichting is gewenst om schade aan het apparaat als gevolg van vochtigheid/omgevingslicht te voorkomen en om verontreiniging van deeltjes te voorkomen. Alle manipulaties op siliciumwafers moeten worden uitgevoerd met de gepolijste kant van de siliciumwafer naar boven. Gebruik een pincet bij het manipuleren van wafers en minimaliseer het aanraken van de oppervlakken van de wafer om krassen te voorkomen. Bewaar wafels in petrischaaltjes met de deksel afgedekt tijdens transport en aan het einde van elke dag, tenzij anders aangegeven.

1. Fotolithografie (6 - 8 uur)

  1. Reinig een 3" siliciumwafer 5 minuten onder vacuüm (idealiter vacuümdruk < 5 × 10-5 torr) met behulp van zuurstof (O2) of schone droge lucht (CDA) plasma.
  2. Centreer de siliciumwafer op een spin coater voor afzetting van de fotoresist.
  3. Breng ~1-2 ml SPR 220 7.0 fotoresist aan op het midden van de siliciumwafel.
    LET OP: Hanteer fotoresist met handschoenen en oogbescherming en gooi deze weg volgens fabrikant-/locatiespecifieke protocollen.
  4. Spin-coat de fotoresist op de siliciumwafer tot de gewenste dikte op basis van de spincurves van de fabrikant. Genereer ~13 μm dikke lagen door 30 s lang met 1000 RPM te draaien. Reinig later de resterende fotoresist op de spin coater met aceton en gooi deze weg volgens locatiespecifieke protocollen.
    OPMERKING: Als de wafer na het centrifugeren niet gelijkmatig is gecoat met fotoresist, herhaalt u de stappen 1.2-1.4. Een niet-uniforme coating kan te wijten zijn aan een niet-gecentreerde wafer op de spin coater, het gebruik van te weinig fotoresist en/of het niet afzetten van de fotoresist op het midden van de wafer.
  5. Terwijl u zo min mogelijk van de fotoresist op de wafer aanraakt, brengt u de siliciumwafer over naar een hete plaat die is ingesteld op 70 °C.
  6. Incubeer de siliciumwafel op de hete plaat en verhoog de temperatuur elke 3-5 minuten met 10 °C totdat de temperatuur 115 °C bereikt.
  7. Draai de kookplaat uit en laat de siliciumwafel afkoelen tot de temperatuur lager is dan 65 °C.
    OPMERKING: De verwarmings- en afkoelstappen worden langzaam uitgevoerd om thermisch barsten van de fotoresist te voorkomen, wat gebruikelijk is bij deze dikte. Als er thermische scheuren optreden, kunnen deze meestal worden verholpen door de siliciumwafer opnieuw te verwarmen en de afkoelingssnelheid te vertragen.
  8. Breng met een tang de afgekoelde siliciumwafer over naar een maskeraligner en laad zowel de siliciumwafer als een bijbehorend fotomasker in de maskeraligner volgens de fabrikant/locatiespecifieke protocollen.
    OPMERKING: Fotomaskers zijn vervaardigd door een externe partij met behulp van een gespecificeerd ontwerp, dat is gemaakt met AutoCAD. Zie aanvullend bestand 1 voor de weergave van het maskerontwerp.
  9. Stel de siliciumwafer gedurende een bepaalde tijd bloot aan ultraviolette (UV) straling (op basis van het vermogen van de UV-lamp) volgens de fabrikant/locatiespecifieke protocollen. De gewenste energie voor deze toepassing is ~400 mJ/cm2, en bereken de belichtingstijd met de formule: figure-protocol-1.
  10. Verwijder na blootstelling de siliconenwafel van de maskeruitlijner en laat de fotoresist 4 uur rehydrateren door luchtcirculatie. Zorg ervoor dat het deksel van het petrischaaltje eraf is gelaten om luchtcirculatie mogelijk te maken, maar plaats de schaal op een plek die waarschijnlijk niet wordt blootgesteld aan deeltjes.
    OPMERKING: Tijdens deze rehydratatietijd kan een pauze van 4 uur worden genomen, maar het wordt aanbevolen om de procedure op dezelfde dag voort te zetten.
  11. Breng na de rehydratatie van 4 uur de blootgestelde wafel over op een kookplaat die op 70 °C is ingesteld.
  12. Incubeer de siliciumwafel op de hete plaat en verhoog de temperatuur elke 3-5 minuten met 10 °C totdat de temperatuur 115 °C bereikt.
  13. Laat de wafer 10 minuten bij 115 °C incuberen.
  14. Creëer een isolerende 'afdekking' voor de blootgestelde wafel door een vel aluminiumfolie in de vorm van een petrischaaldeksel te vormen.
  15. Zet de kookplaat uit en dek de blootgestelde wafel af met het aluminiumfoliedeksel. Laat de wafel een nacht goed afkoelen.
    OPMERKING: Thermisch kraken van de fotoresist komt veel vaker voor tijdens de incubatiestap na de belichting, daarom wordt een langzame afkoeling 's nachts aanbevolen. Hiermee zijn de stappen voltooid die nodig zijn voor de eerste dag van de fabricage. Het wordt aanbevolen om de volgende dag door te gaan naar het volgende gedeelte.

2. Ontwikkeling (1 - 2 uur)

  1. Wanneer u klaar bent om de blootgestelde wafer te ontwikkelen, zorg dan voor een schone container en een geschikte fotoresist-ontwikkelaar. Hier wordt de MF-319-ontwikkelaar gebruikt met een speciale container.
    LET OP: Behandel de ontwikkelaar met handschoenen en oogbescherming, breng de bulkcontainer over naar een secundaire container en gooi deze weg volgens fabrikant-/locatiespecifieke protocollen.
  2. Giet voldoende ontwikkelaar in de container om de blootgestelde wafer volledig onder te dompelen (het werkelijke volume is afhankelijk van de container).
  3. Dompel de blootgestelde wafer onder in de ontwikkelaar en wacht tot alle ongewenste fotoresist is opgelost. Door de container voorzichtig rond te draaien/roeren, wordt de ontwikkeling bevorderd totdat er weinig tot geen resterende fotoresist zichtbaar is op de wafer, behalve het ontwerp van het apparaat.
    OPMERKING: Er kunnen meerdere vervangingen van de ontwikkelaarsoplossing nodig zijn om de ongewenste fotoresist volledig te verwijderen, afhankelijk van het volume van de gebruikte ontwikkelaarsoplossing.
  4. Verwijder de ontwikkelde wafer uit de ontwikkelingsoplossing en spoel beide zijden van de wafer voorzichtig gedurende 30 s af met gedeïoniseerd (DI) water.
  5. Droog de ontwikkelde wafer met stikstof (N2) gas.
  6. Bewaar de ontwikkelde wafel in een petrischaaltje in een droge, koele omgeving tot klaar voor verder gebruik. Wikkel de petrischaal in aluminiumfolie om degradatie van de fotoresist door blootstelling aan omgevingslicht te voorkomen.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen, maar is niet verplicht, om dezelfde dag door te gaan naar het volgende gedeelte.

3. Silanisatie (1 - 2 uur)

  1. Breng de siliciumwafel over naar een exsiccator
  2. Plaats een klein aluminium bakje (of een stuk aluminiumfolie gevouwen in de vorm van een bakje) in de exsiccatuur.
  3. Piket 1 druppel (~50 μL) trichloor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silaan in de aluminium container.
    LET OP: Behandel silaanoplossing met handschoenen en oogbescherming en gooi deze weg volgens fabrikant-/locatiespecifieke protocollen.
  4. Sluit de exsiccator en zet de stofzuiger aan.
  5. Laat uitdroging/silanisatie 1-2 uur plaatsvinden.
  6. Nadat de silanisatietijd is verstreken, schakelt u het vacuüm uit en haalt u de gesilaniseerde wafer op. Bewaar de gesilaniseerde wafel in een in aluminiumfolie verpakte petrischaal in een droge, koele omgeving tot hij klaar is voor verder gebruik.
    OPMERKING: Silanisatie moet mogelijk periodiek worden herhaald op de wafers en vaker op apparaten waar dunnere lagen PDMS worden gebruikt. Als PDMS-hechting wordt opgemerkt bij het verwijderen van het PDMS van de wafer, moet de wafer mogelijk opnieuw worden gesilaniseerd en dit gedeelte moet worden herhaald zodra alle PDMS van de wafer is verwijderd. Hiermee worden de stappen voltooid die nodig zijn voor het maken van masters voor microfluïdische apparaten. De masters zijn stabiel en volgende secties kunnen worden uitgevoerd wanneer dat gewenst is.

4. PDMS-afzetting (1 - 2 uur)

OPMERKING: Als er restant-PDMS op de master zit van een eerdere microfabricage, moet de resterende PDMS worden verwijderd voordat nieuwe PDMS wordt gedeponeerd.

  1. Weeg op een weegschaal in een container PDMS en bijbehorend verharder in een gewichtsverhouding van 10:1. Het totale benodigde gewicht is afhankelijk van de gewenste PDMS-dikte en de grootte van de petrischaal. Voor een petrischaal van 4" levert ~20 g PDMS en ~2 g verharder een dikte van 2-3 mm op.
    LET OP: Hanteer PDMS-oplossing met handschoenen en oogbescherming en gooi deze weg volgens fabrikant-/locatiespecifieke protocollen.
  2. Meng het PDMS en het uithardingsmiddel gedurende 5 minuten in de container met behulp van een plastic spatel of ander geschikt gereedschap.
  3. Breng de gemengde PDMS-container over naar een exsiccator om te ontgassen.
  4. Sluit de exsiccator en zet de stofzuiger aan. Er verschijnen luchtbellen in het PDMS.
  5. Laat uitdroging/ontgassing 30 minuten plaatsvinden. Afhankelijk van de hoeveelheid PDMS die wordt gebruikt en de vorm van de container, kan de werkelijke tijd variëren; een algemeen eindpunt is wanneer er weinig tot geen bubbels aanwezig zijn in het PDMS.
  6. Schakel na het ontgassen het vacuüm uit en haal de PDMS-container eruit.
  7. Giet de gemengde en ontgaste PDMS in een petrischaaltje op de master.
  8. Incubeer de master in de gesloten petrischaal bij 65 °C een nacht om PDMS volledig te laten uitharden.
    OPMERKING: Hiermee zijn de stappen voor PDMS-depositie voltooid. Het wordt aanbevolen om de PDMS een nacht in een incubator te laten uitharden. Het PDMS is dan stabiel, zodat volgende secties kunnen worden uitgevoerd wanneer dat gewenst is.

5. Montage van PDMS-apparaat (1 - 2 uur)

  1. Haal de master(s) van het apparaat op die PDMS hebben uitgehard, een pincet, een standaard biopsiepons van 1.5 mm met een handmatige zuiger en een scalpel/scheermesje.
    LET OP: Ga voorzichtig om met het mes en snijd nooit in de richting van uzelf of anderen. Een zelfoptrekbaar of veiligheidsmes wordt aanbevolen.
  2. Knip rond de functies van het apparaat rechthoekige stukken PDMS uit de layer master. Zorg ervoor dat elk stuk PDMS aan elke kant wat ruimte heeft, flankeer de apparaatfuncties om een goed hechtingscontact te vergemakkelijken en zorg ervoor dat elk stuk op zijn eigen 22 mm × 22 mm glazen dekglaasje past.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de onderkant van het PDMS (de kant met de kenmerken) niet aan te raken, dus pak het PDMS altijd aan de randen vast met een pincet. Plaats bovendien nooit de kant van het PDMS naar beneden op een oppervlak. Wanneer u het PDMS niet gebruikt, bewaart u het PDMS met de kant naar boven in een gesloten container totdat u het nodig hebt.
  3. Pons inlaat- en uitlaatgaten in de stukken PDMS met een schone perforator van 1,5 mm. Pons door het PDMS van het apparaat in een reservelaag opofferings-PDMS in plaats van in een hard oppervlak dat de perforator zou kunnen beschadigen.
  4. Haal een glazen dekglaasje van 22 mm × 22 mm op en maak het schoon met een bevochtigd doekje met isopropylalcohol (IPA).
  5. Reinig het dekglaasje van 22 mm × 22 mm gedurende 5 minuten onder vacuüm (druk < 0,5 Torr) met behulp van CDA-plasma. Hiermee worden alle vuil of organische coatings op het dekglaasje verwijderd.
  6. Veeg het 22 mm × 22 mm glazen dekglaasje en de zijkant van het PDMS af met een IPA-bevochtigd doekje.
  7. Plaats zowel de PDMS (met de kenmerkende kant naar boven) als de glazen dekstrip (dezelfde kant naar boven als eerder is gereinigd) in de plasmareiniger en reinig het plasma tegelijkertijd gedurende 30 s onder vacuüm (druk < 0,5 Torr) met behulp van CDA-plasma.
  8. Verwijder zowel het glazen dekglaasje als het PDMS-apparaat uit de plasmareiniger. Keer het PDMS om zodat de kant van het mechanisme naar beneden wijst en plaats het op het glazen dekglaasje. Let op de hechting en druk indien nodig lichtjes op het PDMS om een goed contact mogelijk te maken.
  9. Incubeer het gebonden dekglaasje gedurende 3 minuten in een gesloten petrischaaltje bij 65 °C om het verlijmen te vergemakkelijken.
    OPMERKING: Plasmabinding verandert de hydrofobiciteit van de glazen dekglaas, waardoor een hydrofiel oppervlak ontstaat. Door middel van anekdotisch bewijs is waargenomen dat de oorspronkelijke hydrofobe toestand van het dekglaasje terugkeert na ongeveer 2 dagen incubatie bij kamertemperatuur. Het wordt aanbevolen om gefabriceerde apparaten niet eerder dan 2 dagen na plasmabinding te gebruiken. Hiermee zijn de stappen van de microfabricage voltooid. De apparaten hebben geen vaste houdbaarheid, maar moeten op een koele, droge plaats worden bewaard wanneer ze niet in gebruik zijn.

6. Voorbereiding van het microfluïdische stroomkanaal (1 uur)

  1. Zet een geassembleerd microfluïdisch apparaat vast in een schone, op maat gemaakte trapadapter47.
  2. Pak een spuit, een Lour-lock-adapter en een passende adereindhuls, en een stuk transparante slang met een buitendiameter van 1,5 mm (ongeveer 15-20 cm lang). Sluit de slang via de adapter aan op de spuit.
  3. Sluit nog drie stukken slang aan op de uitgangen van het microfluïdische apparaat (deze slang hoeft geen specifieke lengte te hebben) en leid het andere uiteinde van deze slangen stroomafwaarts in een afvalflesje.
  4. Bereid met behulp van de spuit het microfluïdische apparaat voor door oplossingen te introduceren volgens de onderstaande stappen. De volgorde en het volume van de oplossingen zijn als volgt: 50 μl BRB80-bufferoplossing, 25 μl anti-rhodamine-antilichaamoplossing, 5 minuten wachten, 50 μl BRB80, 25 μl poloxameer 407 (F127), 15 minuten wachten en 50 μl BRB80. Zie Tabel 1 voor een voorbeeld.
    1. Zuig de oplossing van de bron in de slang.
      OPMERKING: Trek de oplossing niet helemaal in de spuit zelf. De oplossing mag alleen in de slang blijven.
    2. Druk de zuiger van de spuit voorzichtig naar beneden totdat er een klein druppeltje vloeistof aan het uiteinde van de slang aanwezig is. Dit voorkomt dat er lucht in het microfluïdische apparaat komt wanneer de slang is bevestigd.
    3. Bevestig de slang aan de inlaat van het microfluïdische apparaat.
    4. Druk de zuiger van de spuit langzaam naar beneden totdat de meeste, maar niet alle, oplossing door de slang is gestroomd. Door een kleine hoeveelheid vloeistof in de slang achter te laten, zorgt u ervoor dat er niet per ongeluk lucht door de slang wordt geperst. Observeer de slangen en microfluïdische kanalen tijdens deze overdrachten, op zoek naar eventuele bubbels.
      NOTITIE: Als er luchtbellen in de slang optreden, begin dan met het oplossen van problemen (probeer de luchtbel te verwijderen voordat deze het microfluïdische apparaat binnengaat door de slang los te koppelen net voordat de luchtbel arriveert en vervolgens de slang opnieuw te bevestigen nadat de luchtbel is gepasseerd, enz.).
    5. Herhaal de stappen 6.4.1-6.4.4 voor het volgende reagens totdat alle reagentia zijn doorgevlogen. Voor elk reagens is een nieuw stuk inlaatslang nodig om kruisbesmetting van bronreagentia te voorkomen. Zodra de laatste BRB80-wasbeurt is voltooid, staat het apparaat enkele minuten stabiel. Een druppel BRB80-oplossing op de inlaten voorkomt het uitdrogen van het apparaat.
  5. Bereid guanosine-5'-[(α,β)-methyleen]trifosfaat (GMPCPP)-gestabiliseerde microtubuli 'zaden' volgens standaardprotocollen (met een TTR-etiketteringsverhouding van ~25%)47,48.
  6. Bereid een beeldvormende bufferoplossing ('antifade') met een 2x werkende concentratie door de volgende reagentia in respectievelijke hoeveelheden (afhankelijk van de voorraadconcentraties) te combineren om de gespecificeerde eindconcentraties te verkrijgen: BRB80 aangevuld met 40 mM glucose, 40 μg/ml glucoseoxidase, 16 μg/ml catalase, 0,5 mg/ml caseïne, 50 mM kaliumchloride en 10 mM dithiothreitol (DTT). Deze beeldvormingsbuffer wordt gebruikt om de fotostabiliteit te verlengen. Zie Tabel 2 voor een voorbeeld.
  7. Verdun een deel van de 2x antifade-oplossing 1:1 in BRB80 om een 1x werkende oplossing van antifade te verkrijgen. Verwarm deze antifade tot kamertemperatuur (RT); De voorraad antifade-oplossing moet op ijs worden bewaard.
BevelenReagentiaVolume verdunningVolume wassenIncubatietijd
1BRB80N.V.T50 μLN.V.T
2Anti-rhodamine antilichaam1:50 in BRB80, goed mengen25 μL5 minuten
3BRB80N.V.T50 μLN.V.T
4Poloxamer 407 (F127)1% in BRB8025 μL15 minuten
5BRB80N.V.T50 μLN.V.T

Tabel 1: Volgorde van voorbereiding van de kanalen van het microfluïdische apparaat.

VolumeReagensConcentratie van aandelenUiteindelijke concentratie
16 μLD-glucose2 M80 mM
16 μLGlucose Oxidase2 mg/ml80 μg/ml
16 μLKatalase0,8 mg/ml32 μg/ml
14 μLCaseïne28 mg/ml0,16 mg/ml
8 μLDTT1 M20 mM
40 μLKaliumchloride1 M100 mM
290 μLBRB801xN.V.T
400 μLFINALE (2x werkconcentratie)

Tabel 2: Recept voor antifade-beeldvormingsoplossing (2x concentratie).

7.  Introductie van microtubuli-zaden in microfluïdisch (10 - 15 min)

  1. Sluit het microfluïdische apparaat aan op de microscoop.
    OPMERKING: Omdat de stabiliteit van de microtubuli temperatuurafhankelijk is, wordt aanbevolen om de beeldvormingsexperimenten uit te voeren bij 35 °C.
  2. Bevestig 10-15 cm nieuwe slang aan de spuit en zuig een gewenste verdunning van GMPCPP-gestabiliseerde microtubule-zaden in de buis.
    OPMERKING: Voor dit apparaat was ~10 nM GMPCPP-microtubule zaden de optimale concentratie.
  3. Druk de zuiger van de spuit voorzichtig naar beneden totdat er een klein druppeltje vloeistof aan het uiteinde van de slang aanwezig is. Dit voorkomt dat er lucht in het microfluïdische apparaat komt wanneer de slang is bevestigd.
  4. Bevestig de slang aan de inlaat van het microfluïdische apparaat.
  5. Druk de zuiger van de spuit langzaam naar beneden totdat de meeste, maar niet alle, oplossing door de slang is gestroomd. Door een kleine hoeveelheid vloeistof in de slang achter te laten, zorgt u ervoor dat er niet per ongeluk lucht door de slang wordt geperst.
  6. Maak de inlaatslang los van het microfluïdische apparaat en de spuit en bevestig een nieuw stuk slang aan de spuit.
  7. Trek BRB80 in de slang.
  8. Herhaal stap 7.3-7.6 om niet-gebonden microtubuli-zaden uit het apparaat te spoelen.
  9. Observeer de aanhechting van zaden aan het microfluïdische oppervlak met behulp van totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie. Het ideale aantal zaden in een enkel gezichtsveld is afhankelijk van de toepassing en de grootte van het gezichtsveld, maar over het algemeen is ~10-20 zaden per 80 μm × gezichtsveld van 80 μm optimaal. Herhaal stap 7.2-7.9 indien nodig totdat de gewenste zaaddichtheid is bereikt.
    OPMERKING: Voor het bewaken van de zaaddichtheid van microtubuli moet intermitterende blootstelling aan kort licht (100 ms) worden gebruikt, aangezien er nog geen antifade in de oplossing aanwezig is.
  10. Zodra de juiste gebonden zaaddichtheid is bereikt, bevestigt u een nieuw stuk inlaatslang aan de spuit.
  11. Zuig warme 1x antifade-oplossing in de slang en herhaal stap 7.3-7.6.
    OPMERKING: Met de antifade-oplossing die nu in het apparaat zit, is de fotostabiliteit aanzienlijk verbeterd en is het apparaat stabiel. Het wordt echter nog steeds aanbevolen om de blootstelling aan laserlicht te minimaliseren.

8. Microtubuli extensions kweken uit zaden (15 - 30 min)

  1. Combineer fluorescerend geëtiketteerde tubuline, niet-geëtiketteerde tubuline, 2x antifade-oplossing, guanosine-5'-trifosfaat (GTP) en BRB80 om een uiteindelijke oplossing te verkrijgen die 14 μM tubuline bevat met een fluorescerende labelverhouding van 7%, antifade bij een 1x werkende concentratie en 1 mM GTP.
    OPMERKING: Als u verschillende concentraties of verschillende etiketteringspercentages van tubuline gebruikt, moet het volume van elk reagens worden aangepast om de gewenste uiteindelijke concentratie en etiketteringsverhouding te bereiken. Bewaar de tubuline-oplossing op ijs tot ~30 s voor introductie, neem dan de oplossing van het ijs en verwarm deze met de hand tot RT. Dit zal helpen bij de polymerisatie van microtubuli-extensies, wat een temperatuurafhankelijk proces is. Polymerisatie van microtubuli moet inderdaad worden uitgevoerd bij 35 °C, terwijl alle andere experimentele stappen bij RT kunnen worden uitgevoerd.
  2. Bevestig 10-15 cm nieuwe slang aan de spuit en zuig de tubuline-oplossing in de slang.
  3. Druk de zuiger van de spuit voorzichtig naar beneden totdat er een klein druppeltje vloeistof aan het uiteinde van de slang aanwezig is. Dit voorkomt dat er lucht in het microfluïdische apparaat komt wanneer de slang is bevestigd.
  4. Bevestig de slang aan de inlaat van het microfluïdische apparaat.
  5. Druk de zuiger van de spuit langzaam naar beneden totdat de meeste, maar niet alle, oplossing door de slang is gestroomd. Door een kleine hoeveelheid vloeistof in de slang achter te laten, zorgt u ervoor dat er niet per ongeluk lucht door de slang wordt geperst. Maak de inlaatslang los van het microfluïdische apparaat.
  6. Beeld op de gewenste frequentie gedurende 10-15 minuten of totdat de extensions lang genoeg zijn om te buigen. Doorgaans wordt beeldvorming uitgevoerd bij 488 nm elke 5 s en 561 nm elke 60 s totdat de extensions ten minste 5-10 μm lang zijn (~15 min).
    OPMERKING: Bij deze concentratie tubuline kunnen de microtubuli stochastisch schakelen tussen perioden van polymerisatie en depolymerisatie; Dit is te verwachten, maar over het algemeen zullen de microtubuli-extensies49 verlengen.

9. Stabiliserende microtubuli-extensies (10-15 min)

  1. Combineer Taxol, 2x antifade-oplossing en BRB80 om een uiteindelijke oplossing te verkrijgen die 10 μM taxol en antifade bevat in een 1x werkende concentratie.
    OPMERKING: Bewaar de taxoloplossing op ijs tot ~30 s voor introductie, haal dan de oplossing van het ijs en verwarm deze met de hand tot RT. Dit voorkomt depolymerisatie van microtubuli-extensies, wat een temperatuurafhankelijk proces is.
  2. Bevestig 10-15 cm nieuwe slang aan de spuit en zuig taxoloplossing in de slang.
  3. Druk de zuiger van de spuit voorzichtig naar beneden totdat er een klein druppeltje vloeistof aan het uiteinde van de slang aanwezig is. Dit voorkomt dat er lucht in het microfluïdische apparaat komt wanneer de slang is bevestigd.
  4. Bevestig de slang aan de inlaat van het microfluïdische apparaat.
  5. Druk op de zuiger van de spuit totdat de meeste, maar niet alle, oplossing door de slang is gevlogen. Door een kleine hoeveelheid vloeistof in de slang achter te laten, zorgt u ervoor dat er niet per ongeluk lucht door de slang wordt geperst.
  6. Herhaal stap 9.2-9.5 twee keer snel achter elkaar. In dit geval kan hetzelfde stuk slang worden gebruikt.
    OPMERKING: Taxol bevordert de novo nucleatie van microtubuli uit tubuline in oplossing, en deze microtubuli kunnen op het oppervlak van het microfluïdische kanaal terechtkomen en de daaropvolgende beeldvorming/buiging verstoren. Daarom moet de taxoloplossing snel en in meerdere iteraties door het apparaat stromen om zo snel mogelijk zoveel mogelijk vrije tubuline uit het apparaat te verwijderen.
  7. Controleer of microtubuli die uit zaden zijn gekweekt, nog steeds aanwezig en gestabiliseerd zijn in het apparaat.

10. Buigen van gestabiliseerde microtubuli-extensies (10 - 15 min)

OPMERKING: Gestabiliseerde microtubuli-verlengingen kunnen nu worden gebogen met behulp van een flowcontroller. Hier werd een gereguleerd verdringingssysteem met positieve druk (Elveflow OB1 MK3+) gebruikt om de oplossing van een luchtdichte bronflacon door een flowmeter naar de microfluïdische vloeistof te laten stromen. Afhankelijk van de specifieke kenmerken van de beschikbare opstelling van de stroomregelaar, kunnen er wijzigingen worden aangebracht in de volgende stappen.

  1. Stel de stroomregelaar en bijbehorende apparatuur in volgens fabrikant-/locatiespecifieke protocollen, gebruik slangen om de bronflacon aan te sluiten op de inlaat van de debietmeter en de uitlaat van de debietmeter op de microfluïdische inlaat, maar bevestig de slang nog niet aan het microfluïdische apparaat.
  2. Breng ~200 μL van de 10 μM taxoloplossing in een bronflacon die kan worden aangesloten op de opstelling van de stroomregelaar. Deze opstelling maakt gebruik van Luer-lock-verbindingen om een luchtdichte afdichting te creëren.
  3. Schakel het debietregelsysteem in en vul de slang aan om eventuele lucht te verwijderen. Dit voorkomt dat er lucht in het microfluïdische apparaat komt wanneer de slang is bevestigd.
  4. Nadat de slang door de debietmeter is geprimed en er een klein druppeltje vloeistof aan het einde van de slang aanwezig is, schakelt u het debietregelsysteem uit.
  5. Sluit de slang aan op de inlaat van het microfluïdische apparaat. Gebruik een inlaat loodrecht op de inlaat die wordt gebruikt om de microtubuli-zaden te introduceren en laat de microtubuli-extensies groeien om orthogonaal te buigen.
  6. Buigverlengingen door de stroom te starten en te stoppen bij het gewenste debiet of druk. Een druk van 30 mbar is de standaard voor dit protocol met behulp van een oscillerende stroom met een periode van 5 s. Stel je de buiging gedurende deze tijd voor, meestal elke 0,1 s bij 488 nm en elke 10 s bij 561 nm.
    OPMERKING: Hiermee is de basisbuigtest van microtubuli voltooid. Alle apparatuur en reagentia kunnen worden gereinigd/verwijderd volgens fabrikant-/locatiespecifieke protocollen.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grondgedachte voor het ontwerp van microfluïdische apparaten
Het ontwerp van het microfluïdische apparaat in deze studie werd geleid door verschillende belangrijke kenmerken (Figuur 2), die voortbouwen op en verbeteren van het traditionele eenvoudige stroomcelontwerp. Merk op dat het microfluïdische apparaat een intern volume heeft van ~160 nL, aanzienlijk kleiner dan het ~10 μL-volume van meer traditionele stroomcellen47, waardoor een meer gecontroleerd gebruik van potentieel kostbare reagentia, zoals gezuiverde eiwitcomponenten, mogelijk is. Omdat de microfluïdische stroomregelaar twee regelkanalen bevat, werd het apparaat ontwikkeld in de veronderstelling dat slechts twee inlaat-/uitlaatpoorten op een bepaald moment drukregeling zouden hebben. Indien gewenst kunnen meer drukgestuurde kanalen worden geïmplementeerd.

figure-results-1
Figuur 2: Schema van het ontwerp van het microfluïdische apparaat. Rechthoekige markeringen aan de periferie zijn bedoeld als visuele hulp bij het zien van de periferie van de kanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De centrale, rechthoekige apparaatkamer dient als het belangrijkste beeldvormingsgebied waar microtubuli-zaden worden bevestigd en microtubuli-extensies van deze zaden worden gepolymeriseerd. De kamer wordt doorsneden door een stroomkanaal aan elke kant, met rechte kanalen langs de x-as die dienen als inlaat en uitlaat om een snelle uitwisseling van de reactieoplossing te vergemakkelijken. Het inlaatkanaal van Microtubule wordt ook gebruikt om microtubule-zaden in de kamer te brengen, waarbij laminaire stroming resulteert in de binding van het zaad aan het glasoppervlak langs de stroomrichting. In de loodrechte (y-as) richting vertakken de stroomkanalen zich in kleinere kanalen naar de kamer toe, vergelijkbaar met sommige van de vorige ontwerpen 25,28,36,39. De vertakkingsgeometrie is bijzonder geschikt voor het bestuderen van de mechanische eigenschappen van microtubuli. Door een oplossing in de centrale kamer te laten stromen vanuit een richting die loodrecht staat op de oriëntatie van de microtubuli-zaden, kunnen door stroming geïnduceerde buigkrachten onder bijna normale hoeken worden gebruikt. Bovendien maakt de opname van vertakkingsgeometrie met veel kleinere stroomkanalen een meer homogene krachtuitoefening over een groot gebied van de centrale kamer mogelijk, wat niet wordt bereikt door een eenvoudige eenkanaals stromingsgeometrie. Op deze manier kan het vertakkingsmotief, hoewel schijnbaar ingewikkelder, de algehele complexiteit verminderen bij het bepalen van de kracht die aan microtubuli wordt gegeven (Figuur 3). Dit ontwerp heeft ook meerdere symmetrielijnen, wat zorgt voor gebruiksgemak en de mogelijkheid om buiging vanuit verschillende richtingen te evalueren (bijv. boven versus onder).

figure-results-2
Figuur 3: Het opnemen van een vertakkingsmotief resulteert in een groot gebied met een vergelijkbare stroom. Simulaties van twee apparaatontwerpen onder steady-state flow: één zonder vertakkende kanalen (A) en één met vertakkende kanalen (B). Pijlen geven de lokale stroomrichting aan en zijn evenredig met de stroomgrootte. Oppervlaktekleuring geeft de middellijnsnelheid aan. Afbeeldingen aan de rechterkant tonen een ingezoomd gedeelte van het apparaat waar microtubuli (niet afgebeeld) die langs de x-as zijn georiënteerd, onderhevig zouden zijn aan buigkrachten van een vloeistof die in de bovenste poort en uit de onderste poort stroomt. Het opnemen van vertakkende kanalen vergroot het relatieve gebied dat onderhevig is aan vergelijkbare snelheidsvelden, terwijl het benodigde reagensvolume niet toeneemt. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Rogers (2022)14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het apparaat implementeert met name ook een reeks bellenvangers in de inlaat- en uitlaatstroomkanalen om te voorkomen dat luchtbellen de centrale beeldkamer binnendringen. We hebben er met name voor gekozen om reeksen micropilaren in het stroompad op te nemen om te voorkomen dat luchtbellen voorbij reizen als gevolg van oppervlaktespanning (Figuur 2)46. Om meevoering van lucht te voorkomen, hebben we de randen in het apparaat bovendien ontworpen als vloeiende rondingen, in plaats van schuine hoeken. Samen verminderen deze ontwerpkenmerken de kans op luchtbellen en verhogen ze de robuustheid van het apparaat.

Fabricage van microfluïdische apparaten
Het bepalen van de juiste parameters voor het maken van de apparaatmaster vereiste enige optimalisatie. Zoals eerder opgemerkt, is deze fotoresist zeer gevoelig voor belangrijke bedrijfsparameters zoals omgevingslicht en de snelheid van verwarming en koeling tijdens de fotolithografiestap50. Als de master bijvoorbeeld te snel werd afgekoeld na het verhitten, konden er thermische scheuren ontstaan in de fotoresist. Dit is ongewenst, omdat de scheuren de integriteit van het kanaal in gevaar kunnen brengen. Hoewel scheuren konden worden opgelost door de resist opnieuw te verwarmen tot een temperatuur in de buurt van de overgangstemperatuur (~115 °C), ontdekten we dat het de meest robuuste manier was om barsten te voorkomen door de master op de kookplaat te laten afkoelen. Bovendien kan overmatig omgevingslicht leiden tot onbedoelde blootstelling van de fotoresist, waardoor de resist wordt verzwakt en de functies van het apparaat zelf (die na ontwikkeling op de wafer moeten blijven) tijdens de ontwikkelingsstap gedeeltelijk worden verwijderd. Om deze reden raden we aan om de ontwikkelingsstap uit te voeren de dag na het bakken na blootstelling en de nachtelijke afkoelstappen in de omgeving. Bovendien, wanneer de master van het apparaat niet in gebruik is, raden we aan om deze op een donkere plaats te bewaren of in aluminiumfolie te wikkelen om degradatie na verloop van tijd te voorkomen. Toen deze parameters eenmaal waren bepaald, was het fotolithografieproces zeer herhaalbaar (Figuur 4).

Nadat de master was gemaakt, werd vloeibare PDMS bovenop de master gegoten, waardoor de PDMS kon uitharden en een negatieve afdruk van de kenmerken van de master kon creëren. We ontdekten dat het gieten van de PDMS op een dikte van 2-3 mm een gemakkelijke manipulatie van de apparaten mogelijk maakte; als het daarentegen werd gespincoat om een dikte in het μm-bereik te bereiken, was het PDMS vatbaar voor scheuren of zelfklevend, wat manipulatie bemoeilijkte. Bovendien zorgt een dikkere PDMS-laag ervoor dat de slang gemakkelijker kan worden aangesloten, omdat de slang in de inlaat-/uitlaatpoorten blijft zonder dat er een kit of klem nodig is.

Ten slotte, terwijl traditionele flowceltesten voor deze biologische toepassingen vaak gebruik maken van glazen dekglaasjes die vooraf zijn gereinigd met een Piranha-oplossing (waterstofperoxide en zwavelzuur) en vervolgens zijn gesilaniseerd, ontdekten we dat dekglaasjes die waren behandeld met een uitgebreide plasmareiniging en IPA-wassing geschikt waren voor onze doeleinden47. Andere toepassingen, zoals beeldvorming met één molecuul, kunnen een uitgebreidere behandeling van dekglas vereisen.

figure-results-3
Figuur 4: Fotolithografieproces. (A) Het masker met het gewenste ontwerp (masker gemaakt van chroom geëtst op glas). (B) Lichte scheuren van fotoresist op de siliciumwafer als gevolg van thermische spanning (pijlen markeren enkele scheuren). Deze scheuren strekken zich vaak uit over de hele wafer. (C) De ontwikkelde meester. (D) De microfluïdische opstelling op de microscoop. Afzonderlijke componenten zijn groen gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Microtubuli groei, stabilisatie en buigen
GMPCPP-gekweekte microtubuli-zaden dienen als kiemplaatsen voor microtubuli-extensies om te polymeriseren en zijn zelf enkele uren stabiel tegen depolymerisatie bij kamertemperatuur. De zaden werden met behulp van een anti-rhodamine antilichaam47 aan het glazen dekglaasje in het microfluïdische kanaal gebonden. Dynamische microtubuli-extensies werden vervolgens gekweekt in aanwezigheid van oplosbare tubuline (fluorescerend gelabeld maar niet gerhodamine-geconjugeerd) en GTP. Op deze manier werden de kiemvormingsplaatsen van het zaad aan het glazen dekglaasje bevestigd, maar de verlengstukken niet. Tijdens de groeiperiode van 15 minuten polymeriseerden en depolymeriseerden de extensies van microtubuli stochastisch, zoals verwacht vanwege hun intrinsieke dynamische instabiliteit49. Na deze groeiperiode werd een uitspoeling van 10 μM Taxol uitgevoerd om de resterende tubuline uit de oplossing te verwijderen en de gevormde microtubuli-extensies te stabiliseren. De stabilisatie is de sleutel, omdat de verlengingen van de microtubuli anders zouden depolymeriseren bij uitputting van de tubuline. Naast het binden en stabiliseren van microtubuli-polymeer, is ook aangetoond dat Taxol de mechanica van microtubuli-polymeren beïnvloedt en kromming kan veroorzaken in de anders lineaire microtubuli-extensies 51,52,53,54. De hier getoonde resultaten weerspiegelden deze waarnemingen; Het krullen van de microtubuli-extensies is echter ongewenst, omdat dit resulteert in ongelijke krachten die tijdens het buigen langs het rooster worden uitgeoefend. Daarom werden alleen microtubuli gebruikt die relatief recht bleven na stabilisatie voor buiganalyse. Als alternatief kan na de initiële groeiperiode een secundaire groeiperiode met een oplossing van tubuline en GMPCPP (in tegenstelling tot de initiële GTP) worden gebruikt om stabiele 'kappen' te creëren op de groeiende uiteinden van het microtubuli-rooster en depolymerisatie te voorkomen55.

Microtubuli werden vervolgens gebogen door in de bufferoplossing te stromen met behulp van het drukregelsysteem om een constante stroomopwaartse druk te handhaven (Figuur 5, Aanvullende Video 1). Op deze manier konden we de lokale stroming van de microtubuli benaderen. Door vloeistof van boven en uit de onderste apparaatpoort naar binnen te laten stromen, was het de bedoeling dat de oriëntatie van de stroom loodrecht op de zaairichting zou staan.

figure-results-4
Figuur 5: De microfluïdische opstelling kan worden gebruikt om gestabiliseerde microtubuli te buigen. Microtubuli in rusttoestand na stabilisatie met paclitaxel worden gebogen tijdens pulserende stroom. Een constante stroomopwaartse druk van 30 mbar drijft de stroming aan (pijl geeft de stroomrichting aan). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bepaling van het stromingsprofiel in het microfluïdische apparaat
De middellijnsnelheid in de microfluïdische kan computationeel worden gesimuleerd met behulp van COMSOL-software (simulatiesoftware, Figuur 6A). De microtubuli worden echter binnen ~100 nm van het oppervlak aan het glazen dekglaasje bevestigd voor TIRF-microscopie. Daarom is de snelheid die door de microtubuli wordt ervaren niet dezelfde als die voorspeld in de 2D-simulatie. Om de lokale stroming te benaderen die door de microtubuli wordt ervaren, hebben we de algemene Navier-Stokes-vergelijking gebruikt voor een niet-samendrukbare vloeistofstroom in één dimensie:

figure-results-5

Hier is z de hoogte van de microtubuli in het apparaat, h is de totale hoogte van het apparaat en vc is de middellijnsnelheid in het apparaat. Volgens de definitie van het systeem is de z-oorsprong het midden van het apparaat (Figuur 6B). Met behulp van deze definitie en een kanaalhoogte van 13 μm wordt de hoogte van de microtubuli benaderd als z = -6,4 μm. Het oplossen van deze vergelijking levert een schatting op voor de lokale vloeistofsnelheid die door de microtubuli wordt ervaren:

figure-results-6

figure-results-7
Afbeelding 6: Definiëren van het systeem voor vloeistofstroomanalyse van vloeistof die het apparaat binnenkomt via de bovenste poort en uitgaat via de onderste poort (poorten niet weergegeven). (A) Simulatie van het geschaalde middellijnsnelheidsveld zoals in afbeelding 3B. Ster geeft het interessegebied aan voor paneel B. (B) Dwarsdoorsnede van het apparaat. Het volledig ontwikkelde vloeistofstroomprofiel is in de y-richting met een middellijnsnelheid vc bij z = 0 en een antisliprandvoorwaarde bij de wanden. Merk op dat de pijlen in dit paneel niet op schaal zijn ten opzichte van het werkelijke snelheidsveld dat in paneel A wordt weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Rogers (2022)14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naast simulaties kan de vloeistofsnelheid worden geregeld met behulp van een stroomregelaar op basis van een volumestroomsnelheid in plaats van het handhaven van druk. Bovendien kan het lokale debiet in elk apparaat direct worden bepaald door fluorescerende kralen op te nemen en hun snelheid te bewaken, waardoor eventuele variabiliteit van monster tot monster wordt verminderd.

Computationele modellering en gradiëntdemonstraties
Ten slotte hebben we computationele simulaties uitgevoerd in combinatie met experimenten om de haalbaarheid van het gebruik van dit apparaat voor high-throughput experimenten aan te tonen. Naast de mogelijkheid om microtubuli in meerdere richtingen te buigen dankzij de symmetrie van het apparaat, toonden de simulaties aan dat het apparaat nauwkeurige gradiënten kan behouden, waardoor gelijktijdig onderzoek van meerdere experimentele omstandigheden mogelijk is (Figuur 7A). Voorlopige experimenten (methoden die niet expliciet worden vermeld als onderdeel van deze publicatie) met fluorescerende kleurstof in oplossing toonden consistentie aan met de computationele voorspellingen (Figuur 7B). Bovendien hebben we met succes de verdeling van verschillende eiwitten in verschillende delen van het apparaat gedemonstreerd door gelijktijdig microtubuli-extensies te laten groeien met verschillende fluorescerende labels (Figuur 8). Voor zover wij weten, is dit de eerste toepassing van high-throughput microfluïdica op microtubuli-onderzoeken. Deze functie van dit apparaat kan worden gebruikt om de tijd en hoeveelheden van de benodigde reagentia te verminderen en tegelijkertijd de experimentele robuustheid te verbeteren. Zo kunnen bijvoorbeeld de effecten van verschillende eiwitten of verschillende concentraties van individuele eiwitten op de mechanica en dynamica van microtubuli tegelijkertijd tegelijkertijd in één apparaat worden onderzocht.

figure-results-8
Figuur 7 : Gradiëntvorming. (A) Simulatie van een gradiënt van twee oplossingen die het apparaat binnenkomen bij dezelfde inlaatdruk (50 mbar) en concentratie (15 μM). Inlaatpoorten voor elke oplossing worden aangeduid met gekleurde pijlen (een oplossing in de bovenste poort en een andere oplossing in de rechterpoort), en de twee overige poorten dienen als stopcontacten. Heatmap toont het concentratieprofiel van de topoplossing. Steady state werd bereikt bij t = 5 s. (B) Experimentele generatie van een vergelijkbare gradiënt met behulp van fluorescerende kleurstof in oplossing in de bovenste poort en buffer in de rechterpoort. Afbeelding is een rasterlaag die wordt gemaakt door elk gezichtsveld (80 μm × 80 μm) aan elkaar te naaien om het hele apparaatgebied op te lossen. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Rogers (2022)14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 8: Aantonen van een eiwitgradiënt in het microfluïdische apparaat. AlexaFluor647 gelabelde tubuline (magenta) werd gevlogen in inlaat 1 en AlexaFluor488 gelabelde tubuline (groen) werd gevlogen in inlaat 2 van het apparaat met gelijke concentraties en stroomsnelheden. De stroom werd aan/uit geoscilleerd in stappen van 90 s om tubulinepolymerisatie van gestabiliseerde GMPCPP-zaden (rood) mogelijk te maken, terwijl het mengen werd geremd. (A) Grootschalige rasterlaag gemaakt door gezichtsvelden (80x80 μm) aan elkaar te naaien om de volledige lengte van het apparaat op te lossen. Letters geven de relatieve locatie van individuele gezichtsvelden in volgende panelen aan. Schaalbalk is 50 μm in X- en Y-positie. (B) Gezichtsveld nabij inlaat 1 van het apparaat, waar de verlengstukken voornamelijk bestaan uit tubuline met het label A647. (C) Gezichtsveld nabij het midden van het apparaat, waar extensies bestaan uit een mengsel van gelabelde tubulines, zoals voorspeld. (D) Gezichtsveld nabij de onderkant van het apparaat, waar de verlengstukken voornamelijk bestaan uit tubuline met het label A488. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een processtroomdiagram (PFD) voor de experimentele opstelling van de microfluïdica op een microscoop wordt weergegeven in aanvullende figuur 1.

Aanvullende figuur 1: Een processtroomdiagram (PFD) voor de experimentele opstelling van de microfluïdica op een microscoop. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 1. De microfluïdische opstelling kan worden gebruikt om gestabiliseerde microtubuli te buigen. Microtubuli in rusttoestand na stabilisatie met paclitaxel worden gebogen tijdens pulserende stroom. Een constante stroomopwaartse druk van 30 mbar drijft de stroming aan. Afspeelsnelheid video 10 fps. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Een CAD-bestand van het ontwerp van het microfluïdische masker. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het primaire doel van dit protocol was het ontwerpen en fabriceren van een microfluïdisch apparaat dat geschikt is voor het onderzoek van de mechanica van microtubuli in vitro. Het ontwerp was gebaseerd op de wens om de intrinsieke voordelen van PDMS-gebaseerde microfluïdische apparaten te benutten, terwijl het ook een combinatie van functies bevatte die robuuste en aanpasbare high-throughput-experimenten mogelijk zouden maken.

Dit doel is met succes bereikt, wat heeft geresulteerd in fabricageprotocollen en algemene richtlijnen die als basis kunnen dienen voor toekomstige gebruikers van dit systeem. De opname van redundante bellenvangers in het apparaat verkleint de kans op eiwitdenaturatie door de aanwezigheid van luchtbellen. Hoewel we nog steeds wat slangen in het apparaat moeten loskoppelen en opnieuw inpluggen, verkleinen deze bellenvangers de kans op experimenteel falen. Toekomstige verbeteringen aan de microfluïdische opstelling zouden de hoeveelheid handmatige manipulaties van slangen tijdens een experiment zelfs verder kunnen verminderen. Bovendien maakt de integratie van het microfluïdische apparaat met geautomatiseerde software voor debietregeling een aanzienlijke aanpassing van experimentele omstandigheden mogelijk, terwijl de kans op handmatige fouten wordt verkleind. We hebben de succesvolle prestaties van het apparaat aangetoond door het apparaat te fabriceren en vervolgens microtubuli-verlengingen in het apparaat te laten groeien, stabiliseren en buigen met behulp van automatische, controller-gereguleerde stroom. Door een gradiënt van verschillende fluorescerend gelabelde tubuline-oplossingen binnen hetzelfde apparaat vast te stellen, hebben we bovendien aangetoond dat meerdere omstandigheden tegelijkertijd in een enkel apparaat kunnen worden uitgevoerd. Met behulp van computationele modellerings- en analysetechnieken kan ons systeem de biomechanische eigenschappen van microtubuli onderzoeken en bepalen, zoals buigstijfheid 52,56,57,58,59.

Mogelijke toekomstige verbeteringen zouden een nog robuuster systeem en bijbehorende experimentele analyse mogelijk maken. Ten eerste waren de fotoresist-afzetting, belichting en bakken cruciale parameters die enige variabiliteit vertoonden. De relatief hoge functiegroottes van de SPR-fotoresist vereisten een zeer geleidelijke verwarming en afkoeling om thermische scheuren te voorkomen, die de apparaten zouden kunnen ruïneren. Hoewel er dunnere apparaten werden geprobeerd, ontdekten we problemen met de manipulatie van deze kleinere functiegroottes. Aandacht voor detail en geduld zijn cruciaal voor het repliceren van apparaten van deze dikte met SPR-fotoresist. Afhankelijk van de beschikbaarheid kunnen verschillende fotoresists worden gebruikt om dit probleem op te lossen.

Alles bij elkaar genomen maken het microfluïdische apparaat en het protocol hier een reeks experimentele opstellingen mogelijk met robuustere testmogelijkheden met hoge doorvoer dan eerdere flow-celtesten47. Bovendien kunnen experimenten worden geautomatiseerd met behulp van stroomregelaars om nauwkeurige stroomprofielen of concentratiegradiënten in het apparaat te behouden, waardoor de variabiliteit die inherent is aan handmatige gebruikers wordt verminderd. Toekomstige mogelijke toepassingen van deze opstelling zijn onder meer het onderzoeken van de effecten van microtubuli-geassocieerde eiwitten op de buigstijfheid, dynamiek, roosterbeschadiging en reparatie van microtubuli, evenals de biomechanische interacties van microtubuli en actinefilamenten 54,60,61,62,63,64,65,66,67,68 ,69,70. De integratie van microfabricage, geautomatiseerde stroomregeling en computationele modellerings- en analysetechnieken creëert een veelzijdig systeem dat geschikt is voor het bestuderen van het cellulaire cytoskelet in vitro.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten. De auteurs onthullen het gebruik van ChatGPT-4o OpenAI voor tekstrevisie en proeflezen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar voor de steun en middelen van het Vanderbilt Institute of Nanoscale Science and Engineering (VINSE), waar een deel van dit onderzoek werd uitgevoerd. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door een NIH NIGMS-subsidie aan M. Zanic (R35 GM1192552) en NSF ID 2018661-subsidie aan M. Zanic. M. Rogers ontving steun van de NIH T32 GM08320 grant en een VINSE pilot funding award. L. Richardson wordt ondersteund door de NSF GRFP Grant No. 1937963. De auteurs willen ook Dr. Alice Leach, David Schaffer, Dr. Christina McGahan en het hele Zanic-lab bedanken voor hun hulp en steun.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.6 mL microcentrifuge tubes (clear)Any brandLow retention type is preferred
1.5 mL microcentrifuge tubes (clear)Any brandLow retention type is preferred
1.5 mm standard biopsy punchIntegra LifeSciences33-31A-P/25
100x/1.49 numerical aperture TIRF objectiveNikon
22 x 22 mm glass coverslipsThorLabsCG15CH
3" single side polished silicon wafersUniversity Wafer447
4" Petri dishAny brand
450 µL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear TubeBeckman Coulter, Inc.345843Referred to as 'airfuge tube' in the protocol
488-, 561, and 640-nm solid state lasersNikon
A-95 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter, Inc.347595
AcetoneAny brand
Airfuge Air-Driven UltracentrifugeBeckman Coulter, Inc.347854Referred to as 'airfuge' in the protocol
Alexa Fluor 488 Microscale Protein Labeling KitThermo Fisher ScientificA30006
Aluminum foilAny brand
Andor iXon Ultra EM-CCDNikon
Andor NEO sCMOSNikon
AutoCADAutodeskGeneric versions can be used
Bovine brain unlabeled tubulin (purified)N/AMade in house, but can be purchased
CaseinMilliporeSigmaC7078
CatalaseMilliporeSigmaC9322
Clean Dry Air (CDA) (pressurized gas)Any brand
Compressed air supplyAny brandConnects to the microfluidic flow controller
COMSOL Multiphysics softwareCOMSOL, Inc.
Custom brass stage adapterN/AMade in house to fit our 22 mm x 22 mm coverslips onto the microscope
De-ionized waterAny brand
DessicatorAny brand
D-glucoseMilliporeSigmaG7528
Dithiothreitol (DTT)MilliporeSigmaD0632
EGTAMilliporeSigma324626
Elveflow Smart Interface (ESI) softwareElveflow
Flangeless PFA fittings with ETFE ¼”-28 to 1/16” outer diameter ferrules Darwin MicrofluidicsCIL-XP-245XUsed to connect the tubing from the micrewtube source vials to the flow sensor via the pressurized reservoir rack
Fluiwell 4-Channel 2 mL Low PressureFluigent14002001Used to connect the flow control system to the the micrewtubes. Also refered to as 'pressurized reservoir rack'
Fume hoodAny brand
Glucose oxidaseMilliporeSigmaG6125
GMPCPPJena BioscienceNU-405L
Guanosine triphosphate (GTP)MilliporeSigmaG8877
Hot plateAny brand
HS-625 high-speed emission filter wheelFinger Lakes Instrumentation
ImageJ softwareN/AOpen access
IncubatorAny brand
Isopropyl alcoholAny brand
Karl Suss MA-6 mask alignerSUSS MicroTec
Magnesium chlorideMilliporeSigma1.05833
MATLAB softwareMathWorks
MEGAPOSIT SPR 220 7.0 photoresistDow, Inc.
Microfluidic Fittings 6-40 to 1/4"-28 Adapters KitDarwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Used to connect the tubing from the micrewtube source vials to the flow sensor via the pressurized reservoir rack (Fluiwell rack)
Microfluidic Fittings Female Luer Lock Adapter KitDarwin MicrofluidicsLVF-KFI-04Used to connect the syringe to the tubing
Microfluidic flow controllerElveflowOB1 MK3+
Microfluidic flow sensorElveflowMFS3This flow sensor range is 0-80 μL 
MICROPOSIT MF-319 developerDow, Inc.
MicroscopeNikonEclipse Ti
NIS-Elements softwareNikon
Nitrogen (pressurized gas)Any brand
Objective heaterTokai Hit
One-Piece Fingertight 10-32 Coned Fitting for 1/16" OD Tubing Darwin MicrofluidicsCIL-F-120XUsed to connect the syringe to the tubing
Paclitaxol (Taxol)Tocris Bioscience1097
Photolithography masksN/AMade by an external party using our designs
PIPESThermo Fisher Scientific172615000
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-32G
Plasma flowmeter systemHarrick PlasmaPDC-FMGIntegrates with plasma cleaner to enable flow control of pressurized gas
Plastic bulb pipetAny brand
Pluoronic F-127MilliporeSigmaP2443Referred to as 'poloxomer 407' in the protocol
Potassium chlorideResearch Products InternationalP41000
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon .020 IDThermo Fisher Scientific50-206-8921Refered to as '1.5 mm tubing' and 'tubing' in the protocol
ScalpelAny brand
Spin coaterCost Effective Equipment, LLC.200xThis model may be discontinued
Standard pipets and tip setsAny brand
Standard plastic syringeAny brandWe used a 10 mL Luer-slip syringe
Sylgard 184 silicone elastomer kitDow, Inc.Referred to as 'PDMS' and 'curing agent' in the protocol
T339 Micrewtube with Lip Seal and Flat Screw CapMedline Industried, LP.T339Referred to as 'source vial' in the protocol. We used both 0.5 mL and 1.5 mL sizes
TAMRA, SE; 5-(and-6)-Carboxytetramethylrhodamine, Succinimidyl EsterInvitrogenC1171Referred to as 'TTR' in the protocol
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaneMilliporeSigma448931
Trion Phantom RIE ICP Trion Technology, Inc.This plasma cleaner is only used in Step 1.1 of the protocol. Another plasma cleaner, like the one used for PDMS bonding, can be used instead; we just prefer the much lower vacuum achievable by this system for cleaning the silicon wafer
TRITC Polyclonal AntibodyThermo Fisher ScientificA6397Referred to as 'anti-rhodamine antibody' in the protocol
TweezersAny brand
Vacuum pumpAny brand

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).">Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  2. Flexible methods for microfluidics. Phys Today. 54 (6), 42(2001).">Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Phys Today. 54 (6), 42(2001).
  3. Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale. Rev Mod Phys. 77, 977(2005).">Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale. Rev Mod Phys. 77, 977(2005).
  4. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu Rev Biomed Eng. 4, 261-286 (2002).">Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu Rev Biomed Eng. 4, 261-286 (2002).
  5. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. Electrophoresis. 23 (20), 3461-3473 (2010).">Ng, J. M. K., Stroock, A. D., Whitesides, G. M. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. Electrophoresis. 23 (20), 3461-3473 (2010).
  6. Five Short Stories on The History of Microfluidics. , https://www.elveflow.com/microfluidic-reviews/general-microfluidics/history-of-microfluidics/ (2025).">Dellaquila, A. Five Short Stories on The History of Microfluidics. , https://www.elveflow.com/microfluidic-reviews/general-microfluidics/history-of-microfluidics/ (2025).
  7. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).">Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  8. Lab-on-a-chip: Microfluidics in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 210-218 (2006).">Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: Microfluidics in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 210-218 (2006).
  9. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (8), 620-632 (2012).">Neužil, P., Giselbrecht, S., Länge, K., Huang, T. J., Manz, A. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (8), 620-632 (2012).
  10. Miniaturized total chemical analysis systems: a novel concept for chemical sensing. Sens Actuators B: Chem. 1 (1-6), 244-248 (1990).">Manz, A., Graber, N., Widmer, H. M. Miniaturized total chemical analysis systems: a novel concept for chemical sensing. Sens Actuators B: Chem. 1 (1-6), 244-248 (1990).
  11. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).">Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  12. Microfluidics: Honey, I shrunk the lab. Nature. 418 (6897), 474-475 (2002).">Knight, J. Microfluidics: Honey, I shrunk the lab. Nature. 418 (6897), 474-475 (2002).
  13. Photolithographic fabrication techniques for transistors which are an integral part of a printed circuit. Nall, J. R., Lathrop, J. W. 1957 International Electron Devices Meeting, Washington, DC, USA, , (1957).
  14. The design and fabrication of a two-layer microfluidic device for studying microtubules in vitro [Master's Thesis]. , Vanderbilt University. Nashville, TN. (2022).">Rogers, M. The design and fabrication of a two-layer microfluidic device for studying microtubules in vitro [Master's Thesis]. , Vanderbilt University. Nashville, TN. (2022).
  15. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2015).">Lee, J. B., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2015).
  16. Soft lithography for microfluidics: A Review. Biochip J. 2 (1), 1-11 (2008).">Kim, P., et al. Soft lithography for microfluidics: A Review. Biochip J. 2 (1), 1-11 (2008).
  17. Recent Advances in Mechanical Engineering. , Springer. Singapore. 235-245 (2020).">Venkatesan, S. u, Jerald, J., Asokan, P., Prabakaran, R. A Comprehensive Review on Microfluidics Technology and its Applications. Recent Advances in Mechanical Engineering. , Springer. Singapore. 235-245 (2020).
  18. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. , Humana Press. New Jersey. (2006).">Minteer, S. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. , Humana Press. New Jersey. (2006).
  19. Microfluidics and Nanofluidics Handbook: Fabrication, Implementation, and Applications. , Taylor and Francis Group. Florida. (2016).">Mitra, S. K., Chakraborty, S. Microfluidics and Nanofluidics Handbook: Fabrication, Implementation, and Applications. , Taylor and Francis Group. Florida. (2016).
  20. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York. (2014).">Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York. (2014).
  21. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Springer. Heidelberg. (2001).">Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Springer. Heidelberg. (2001).
  22. Mechanics of microtubules. J Biomech. 43 (1), 23-30 (2010).">Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. J Biomech. 43 (1), 23-30 (2010).
  23. Chapter 19: Mechanical Response of Cytoskeletal Networks. Methods Cell Biol. 89, 487-519 (2008).">Gardel, M. L., Kasza, K. E., Brangwynne, C. P., Liu, J., Weitz, D. A. Chapter 19: Mechanical Response of Cytoskeletal Networks. Methods Cell Biol. 89, 487-519 (2008).
  24. The microtubule cytoskeleton in cardiac mechanics and heart failure. Nat Rev Cardiol. 19 (6), 364-378 (2022).">Caporizzo, M. A., Prosser, B. L. The microtubule cytoskeleton in cardiac mechanics and heart failure. Nat Rev Cardiol. 19 (6), 364-378 (2022).
  25. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nat Mater. 14 (11), 1156-1163 (2015).">Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nat Mater. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  26. A microfluidic device for in situ fixation and super-resolved mechanosensation studies of primary cilia. Biomicrofluidics. 13 (1), 014105(2019).">Chu, S. H., et al. A microfluidic device for in situ fixation and super-resolved mechanosensation studies of primary cilia. Biomicrofluidics. 13 (1), 014105(2019).
  27. Microtubule growth rates are sensitive to global and local changes in microtubule plus-end density. Curr Biol. 30 (15), 3016-3023 (2020).">Geisterfer, Z. M., Zhu, D. Y., Mitchison, T. J., Oakey, J., Gatlin, J. C. Microtubule growth rates are sensitive to global and local changes in microtubule plus-end density. Curr Biol. 30 (15), 3016-3023 (2020).
  28. Lattice defects induce microtubule self-renewal. Nat Phys. 15 (8), 830-838 (2019).">Schaedel, L., et al. Lattice defects induce microtubule self-renewal. Nat Phys. 15 (8), 830-838 (2019).
  29. CLASP mediates microtubule repair by restricting lattice damage and regulating tubulin incorporation. Curr Biol. 30 (11), 2175-2183 (2020).">Aher, A., et al. CLASP mediates microtubule repair by restricting lattice damage and regulating tubulin incorporation. Curr Biol. 30 (11), 2175-2183 (2020).
  30. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. ELife. 5, e13470(2016).">Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. ELife. 5, e13470(2016).
  31. Micropattern-guided assembly of overlapping pairs of dynamic microtubules. Methods Enzymol. 540, 339-360 (2014).">Fourniol, F. J., et al. Micropattern-guided assembly of overlapping pairs of dynamic microtubules. Methods Enzymol. 540, 339-360 (2014).
  32. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. J Vis Exp. (114), e54278(2016).">Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. J Vis Exp. (114), e54278(2016).
  33. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Mol Biol Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).">Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Mol Biol Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  34. Mechanisms underlying the active self-assembly of microtubule rings and spools. Biomacromolecules. 17 (3), 1048-1056 (2016).">VanDelinder, V., Brener, S., Bachand, G. D. Mechanisms underlying the active self-assembly of microtubule rings and spools. Biomacromolecules. 17 (3), 1048-1056 (2016).
  35. bioRxiv. , (2019).">Roth, S., Gârlea, I. C., Vleugel, M., Mulder, B. M., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in cell-like confinement. bioRxiv. , (2019).
  36. Microtubules acquire resistance from mechanical breakage through intralumenal acetylation. Science. 356 (6335), 328-332 (2017).">Xu, Z., et al. Microtubules acquire resistance from mechanical breakage through intralumenal acetylation. Science. 356 (6335), 328-332 (2017).
  37. Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology. ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).">Fanalista, F., et al. Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology. ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).
  38. A fast microfluidic temperature control device for studying microtubule dynamics in fission yeast. Methods Cell Biol. 97, 185-201 (2010).">Velve-Casquillas, G., Costa, J., Carlier-Grynkorn, F., Mayeux, A., Tran, P. T. A fast microfluidic temperature control device for studying microtubule dynamics in fission yeast. Methods Cell Biol. 97, 185-201 (2010).
  39. Tubulin acetylation protects long-lived microtubules against mechanical ageing. Nat Cell Biol. 19 (4), 391-398 (2017).">Portran, D., Schaedel, L., Xu, Z., Théry, M., Nachury, M. V. Tubulin acetylation protects long-lived microtubules against mechanical ageing. Nat Cell Biol. 19 (4), 391-398 (2017).
  40. Microtubule transport, concentration and alignment in enclosed microfluidic channels. Biomed Microdevices. 9 (2), 175-184 (2007).">Huang, Y. M., Uppalapati, M., Hancock, W. O., Jackson, T. N. Microtubule transport, concentration and alignment in enclosed microfluidic channels. Biomed Microdevices. 9 (2), 175-184 (2007).
  41. Methods in Bioengineering: Microfabrication and Microfluidics. , Artech House Publishers. Boston, MA. (2009).">Uppalapati, M., Huang, Y., Shastry, S., Jackson, T. N., Hancock, W. O. Microtubule Motors in Microfluidics. Methods in Bioengineering: Microfabrication and Microfluidics. , Artech House Publishers. Boston, MA. (2009).
  42. Prevention of air bubble formation in a microfluidic perfusion cell culture system using a microscale bubble trap. Biomed Microdevices. 11 (4), 731-738 (2009).">Sung, J. H., Shuler, M. L. Prevention of air bubble formation in a microfluidic perfusion cell culture system using a microscale bubble trap. Biomed Microdevices. 11 (4), 731-738 (2009).
  43. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).">Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).
  44. Circumventing air bubbles in microfluidic systems and quantitative continuous-flow PCR applications. Anal Bioanal Chem. 386 (5), 1327-1333 (2006).">Nakayama, T., et al. Circumventing air bubbles in microfluidic systems and quantitative continuous-flow PCR applications. Anal Bioanal Chem. 386 (5), 1327-1333 (2006).
  45. Lateral degassing method for disposable film-chip microfluidic devices. Membranes. 11 (5), 316(2021).">Park, S., Cho, H., Kim, J., Han, K. -H. Lateral degassing method for disposable film-chip microfluidic devices. Membranes. 11 (5), 316(2021).
  46. Nip the bubble in the bud: A guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19 (14), 2296-2314 (2019).">Pereiro, I., Fomitcheva Khartchenko, A., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: A guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19 (14), 2296-2314 (2019).
  47. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biol. 95, 221-245 (2010).">Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
  48. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: Information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Mol Biol Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).">Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: Information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Mol Biol Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  49. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).">Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  50. Comparative analysis of fabrication methods for achieving rounded microchannels in PDMS. J Micromech Microeng. 26 (11), 115013(2016).">Bartlett, N. W., Wood, R. J. Comparative analysis of fabrication methods for achieving rounded microchannels in PDMS. J Micromech Microeng. 26 (11), 115013(2016).
  51. Taxol®: The first microtubule stabilizing agent. Int J Mol Sci. 18 (8), 1733(2017).">Yang, C. P. H., Horwitz, S. B. Taxol®: The first microtubule stabilizing agent. Int J Mol Sci. 18 (8), 1733(2017).
  52. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. J Cell Biol. 120 (4), 923-934 (1993).">Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. J Cell Biol. 120 (4), 923-934 (1993).
  53. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics. Biophys J. 89 (5), 2911-2926 (2005).">VanBuren, V., Cassimeris, L., Odde, D. J. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics. Biophys J. 89 (5), 2911-2926 (2005).
  54. Taxol-induced flexibility of microtubules and its reversal by MAP-2 and Tau. J Biol Chem. 268 (10), 6847-6850 (1993).">Dye, R. B., Fink, S. P., Williams, R. C. Taxol-induced flexibility of microtubules and its reversal by MAP-2 and Tau. J Biol Chem. 268 (10), 6847-6850 (1993).
  55. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4 (12), 1053-1061 (1994).">Drechsel, D. N., Kirschnert, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4 (12), 1053-1061 (1994).
  56. Measurement of the persistence length of cytoskeletal filaments using curvature distributions. Biophys J. 121 (10), 1813-1822 (2022).">Wisanpitayakorn, P., Mickolajczyk, K. J., Hancock, W. O., Vidali, L., Tüzel, E. Measurement of the persistence length of cytoskeletal filaments using curvature distributions. Biophys J. 121 (10), 1813-1822 (2022).
  57. Rigidity of microtubules is increased by stabilizing agents. J Cell Biol. 130 (4), 909-917 (1995).">Mickey, B., Howard, J. Rigidity of microtubules is increased by stabilizing agents. J Cell Biol. 130 (4), 909-917 (1995).
  58. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophys J. 93 (1), 346-359 (2007).">Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophys J. 93 (1), 346-359 (2007).
  59. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. J Biol Chem. 269 (18), 13353-13360 (1994).">Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. J Biol Chem. 269 (18), 13353-13360 (1994).
  60. Flexural rigidity of microtubules measured with the use of optical tweezers. J Cell Sci. 109 (Pt 2), 509-516 (1996).">Felgner, H., Frank, R., Schliwa, M. Flexural rigidity of microtubules measured with the use of optical tweezers. J Cell Sci. 109 (Pt 2), 509-516 (1996).
  61. Domains of neuronal microtubule-associated proteins and flexural rigidity of microtubules. J Cell Biol. 138 (5), 1067-1075 (1997).">Felgner, H., et al. Domains of neuronal microtubule-associated proteins and flexural rigidity of microtubules. J Cell Biol. 138 (5), 1067-1075 (1997).
  62. Effects of three microtubule-associated proteins (MAP2, MAP4, and Tau) on microtubules' physical properties and neurite morphology. Sci Rep. 13, 8870(2023).">Nishida, K., et al. Effects of three microtubule-associated proteins (MAP2, MAP4, and Tau) on microtubules' physical properties and neurite morphology. Sci Rep. 13, 8870(2023).
  63. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).">Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  64. Microtubule dynamics: An interplay of biochemistry and mechanics. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (7), 451-463 (2018).">Brouhard, G. J., Rice, L. M. Microtubule dynamics: An interplay of biochemistry and mechanics. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (7), 451-463 (2018).
  65. More is different: Reconstituting complexity in microtubule regulation. J Biol Chem. 299 (12), 105398(2023).">Lawrence, E. J., Chatterjee, S., Zanic, M. More is different: Reconstituting complexity in microtubule regulation. J Biol Chem. 299 (12), 105398(2023).
  66. Dynamics and mechanics of the microtubule plus end. Nature. 422 (6933), 753-758 (2003).">Howard, J., Hyman, A. A. Dynamics and mechanics of the microtubule plus end. Nature. 422 (6933), 753-758 (2003).
  67. Regulation of the microtubule network; the shaft matters. Curr Opin Syst Biol. 34, 100457(2023).">Mehidi, A., Aumeier, C. Regulation of the microtubule network; the shaft matters. Curr Opin Syst Biol. 34, 100457(2023).
  68. Causes, costs and consequences of kinesin motors communicating through the microtubule lattice. J Cell Sci. 136 (5), jcs260735(2023).">Verhey, K. J., Ohi, R. Causes, costs and consequences of kinesin motors communicating through the microtubule lattice. J Cell Sci. 136 (5), jcs260735(2023).
  69. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (1), 38-54 (2019).">Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (1), 38-54 (2019).
  70. Microtubule self-repair. Curr Opin Cell Biol. 68, 144-154 (2021).">Théry, M., Blanchoin, L. Microtubule self-repair. Curr Opin Cell Biol. 68, 144-154 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DeviceMicrotubule MechanicsPDMS MicrofluidicsMicrotubule PolymerHigh Throughput AssayPlasma CleaningPhotoresist DepositionComputational ModelingFlow Control SystemFluorescent Labeling

Related Articles