Een real-time interactief systeem voor het bestuderen van confronterend achtervolgingsgedrag bij knaagdieren

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om roofzuchtig achtervolgingsgedrag in een muismodel te detecteren en te kwantificeren. Dit platform biedt een nieuw onderzoeksparadigma voor het bestuderen van de dynamiek en neurale mechanismen van roofzuchtig achtervolgingsgedrag bij muizen en zal een gestandaardiseerd platform bieden voor het bestuderen van achtervolgingsgedrag.

Samenvatting

Roofzuchtig achtervolgingsgedrag omvat een reeks belangrijke fysiologische processen, zoals voortbeweging, leren en besluitvorming die cruciaal zijn voor het succes van een dier bij het vangen van prooien. Er zijn echter weinig methoden en systemen voor het bestuderen van roofzuchtig achtervolgingsgedrag in het laboratorium, vooral bij muizen, een veelgebruikt zoogdiermodel. De belangrijkste factoren die dit onderzoek beperken, zijn de oncontroleerbaarheid van levende prooien (bijv. krekels) en de uitdaging om experimentele standaarden te harmoniseren. Het doel van deze studie was om een interactief platform te ontwikkelen om roofzuchtig achtervolgingsgedrag bij muizen op een robotachtig aas te detecteren en te kwantificeren. Het platform maakt gebruik van computervisie om de relatieve posities van de muis en het robotaas in realtime te volgen om de bewegingspatronen van het robotaas te programmeren, en de interactieve tweedimensionale schuifregelaars regelen magnetisch de beweging van het robotaas om een gesloten lussysteem te bereiken. Het robotaas is in staat om naderende hongerige muizen in realtime te ontwijken en de ontsnappingssnelheid en -richting kunnen worden aangepast om het roofzuchtige achtervolgingsproces in verschillende contexten na te bootsen. Na een korte periode van training zonder toezicht (minder dan twee weken) waren de muizen in staat om de predatietaak met een relatief hoog rendement (minder dan 15 s) uit te voeren. Door kinematische parameters zoals snelheid en trajecten van het robotaas en de muizen te registreren, konden we het achtervolgingsproces onder verschillende omstandigheden kwantificeren. Concluderend biedt deze methode een nieuw paradigma voor de studie van roofzuchtig gedrag en kan worden gebruikt om de dynamiek en neurale mechanismen van roofzuchtig achtervolgingsgedrag verder te onderzoeken.

Inleiding

De achtervolging van prooien door roofdieren is niet alleen een levendige demonstratie van de strijd om te overleven, maar ook een belangrijke motor van de evolutie van soorten, het behoud van het ecologische evenwicht en de energiestroom in de natuur ^1,2. Voor roofdieren is de activiteit van het achtervolgen van prooien een geavanceerde onderneming waarbij een verscheidenheid aan fysiologische processen betrokken is. Deze processen omvatten de motiverende toestanden die het roofdier ertoe aanzetten om te jagen³, de perceptuele vaardigheden die het in staat stellen prooien te detecteren en te volgen ^4,5,6, de besluitvormingsvaardigheden die het verloop van de jacht bepalen⁷, de locomotorische functie die de fysieke achtervolging mogelijk maakt ^8,9 en de leermechanismen die jachtstrategieën in de loop van de tijd verfijnen ^{10, 11}. okt. Daarom heeft roofzuchtige achtervolging de afgelopen jaren veel aandacht gekregen als een belangrijk en complex gedragsmodel.

Als een veelgebruikt zoogdiermodel in het laboratorium, is gedocumenteerd dat muizen op krekels jagen, zowel in hun natuurlijke habitat als in laboratoriumstudies¹². De diversiteit en de oncontroleerbaarheid van levende prooien bij het kwantificeren van roofzuchtig achtervolgingsgedrag beperkt echter de reproduceerbaarheid van experimenten en de uitwisseling van vergelijkingen tussen verschillende laboratoria¹³. Ten eerste kunnen krekelstammen verschillen tussen laboratoria, wat resulteert in verschillen in prooikenmerken die het achtervolgingsgedrag kunnen beïnvloeden. Ten tweede hebben individuele krekels unieke kenmerken die de uitkomst van roofzuchtige interacties kunnen beïnvloeden¹⁴. De ontsnappingssnelheid van elke krekel kan bijvoorbeeld anders zijn, wat leidt tot variabiliteit in de achtervolgingsdynamiek. Bovendien kunnen sommige krekels een korte waarschuwingsafstand hebben, wat kan leiden tot een gebrek aan achtervolgingsproces, omdat het roofdier mogelijk niet de kans heeft om de achtervolging in te zetten. Ten slotte kunnen sommige krekels defensief, agressief gedrag vertonen wanneer ze gestrest zijn, wat de interpretatie van experimentele gegevens bemoeilijkt¹⁵. Het is moeilijk om te bepalen of veranderingen in het gedrag van roofdieren te wijten zijn aan de verdedigingsstrategieën van de prooi of inherent zijn aan de gedragspatronen van het roofdier. Deze vage grens tussen prooiverdediging en roofdierstrategieën voegt een extra laag complexiteit toe aan de studie van roofzuchtige achtervolging.

Onderzoekers erkennen deze beperkingen en hebben zich tot kunstmatige prooien gewend als een middel om experimentele omstandigheden te beheersen en te standaardiseren^16,17. Van zeven knaagdiersoorten, waaronder muizen, is aangetoond dat ze significant roofzuchtig gedrag vertonen ten opzichte van kunstmatige prooien¹³. Daarom kan een controleerbaar robotaas haalbaar zijn bij de studie van roofzuchtig achtervolgingsgedrag. Door verschillende kunstmatige prooien te ontwerpen, kunnen onderzoekers een niveau van controle uitoefenen over experimentele omstandigheden, wat niet mogelijk is met levende prooien^18,19. Bovendien heeft een klein aantal eerdere studies kunstmatig bestuurde robotvissen of prooien gebruikt om schoolgedrag en predatie bij vissen te bestuderen 15,17,19. Deze studies hebben de waarde van robotsystemen benadrukt bij het leveren van consistente, herhaalbare en manipuleerbare stimuli voor experimenteel onderzoek, maar ondanks deze vooruitgang ontbreekt het op het gebied van knaagdiergedrag, met name bij muizen, aan een speciaal platform voor het detecteren en kwantificeren van roofzuchtig achtervolgingsgedrag met behulp van robotaas.

Op basis van de bovenstaande redenen hebben we een open-source real-time interactief platform ontworpen om roofzuchtig achtervolgingsgedrag bij muizen te bestuderen. Het robotaas in het platform kan in realtime uit de muizen ontsnappen en het robotaas is zeer controleerbaar, zodat we verschillende ontsnappingsrichtingen of snelheden kunnen instellen om verschillende predatiescenario's te simuleren. Een Python-programma op de computer werd gebruikt om de bewegingsparameters van de robotprooi te genereren, die werd gecombineerd met een STM32-microcontroller om de servomotoren aan te drijven en de beweging van de robotlokvogel te besturen. Het modulaire hardwaresysteem kan in realtime worden aangepast aan de specifieke laboratoriumomgeving en het softwaresysteem kan de moeilijkheidsgraad van het systeem en de indicatoren aanpassen om het onderzoeksdoel beter te dienen volgens de experimentele behoeften. Het lichtgewicht systeem zorgt voor een aanzienlijke verkorting van de verwerkingstijd van de computer, wat essentieel is voor de effectiviteit van het systeem en de draagbaarheid verbetert. Het platform ondersteunt de volgende technische kenmerken: Flexibele en controleerbare kunstmatige prooi voor gemakkelijke herhaling en modellering; maximale simulatie van het jachtproces in een natuurlijke omgeving; real-time interactie en lage systeemlatentie; de schaalbaarheid van hardware en software en de schaalbaarheid; kosteneffectiviteit en gebruiksgemak. Met behulp van dit platform hebben we muizen met succes getraind om roofzuchtige taken uit te voeren onder verschillende omstandigheden en hebben we parameters zoals traject, snelheid en relatieve afstand tijdens roofzuchtige achtervolging kunnen kwantificeren. Het platform biedt een snelle methode voor het opzetten van een paradigma voor roofzuchtige achtervolging om de neurale mechanismen achter roofzuchtige achtervolging verder te onderzoeken.

Protocol

Volwassen C57BL/6J-muizen (mannetje, 6-8 weken oud) worden geleverd door het Army Medical University Laboratory Animal Center. Alle experimentele procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor dierenwelzijn en zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Army Medical University (nr. AMUWEC20210251). Muizen worden gehuisvest onder temperatuurgecontroleerde omstandigheden (22-25°C) met een omgekeerde licht/donker-cyclus van 12 uur (lichten aan 20:00-8:00 uur) en vrije toegang tot voedsel en water.

1. Hardwarevoorbereiding voor real-time interactief platform

1. Monteer een webcam op een dwarsbalk boven het hele platform om de posities van de muis en het robotaas in de arena eronder in realtime te volgen en de beelden naar de computer te sturen (Figuur 1A).
2. Ontwerp een grote ronde arena (800 mm diameter, 300 mm hoogte) bestaande uit een vierkant acrylpaneel aan de onderkant en een acrylbuis als rand. Plaats gelijkmatig verdeelde vier pictogrammen (vierkant, driehoek, cirkel en kruis) op de binnenmuren van de arena om als visuele aanwijzingen te dienen (Figuur 1B).
   OPMERKING: De binnenwand van de acrylbuis en het oppervlak van de vierkante acrylplaat moeten worden bedekt met een ondoorzichtige sticker.
3. Gebruik een ronde neodymium magneet (40 mm diameter, 10 mm hoogte, krekels zijn ongeveer 2-4 cm lang ^4,22) met voerpellets (5 × 0,2 mg) als robotaas. Bevestig een blauwe sticker op het oppervlak van de magneet voor identificatie en locatie.
4. Monteer een tweedimensionale schuifregelaar (met een effectieve verplaatsing van 1000 mm) onder de arena. Installeer een andere neodymiummagneet op de drager als trekmagneet om het robotaas magnetisch en op afstand te trekken.
5. Drijf de trekmagneet aan door servomotoren die worden aangestuurd door een STM32-bord en een schakelcircuit. Door de snelheids-richtingsmodus te gebruiken om een servomotor aan te drijven (75 mm per 16.000 pulsen), codeert de frequentie van de PWM-golf op de uitgangspoort op het STM32-bord de snelheid, en de hoge of lage niveaus (3.3 V of 0 V) coderen de voorwaartse of achterwaartse richting (Figuur 1C).
   OPMERKING: Het schakelcircuit wordt weergegeven in aanvullende afbeelding 1, die alleen het aansluitschema voor snelheid en richtingssignaal toont dat nodig is voor de beweging van de ene schuif en de besturing van de andere schuif op dezelfde manier. De massadraden in de twee schuifbesturingscircuits kunnen met elkaar worden verbonden.

2. Softwareontwerp voor een interactief platform in realtime

1. Gebruik het hoofdprogramma om de relatieve positie van de muis en het robotaas te detecteren en om het bewegingssignaal van het robotaas door te geven aan de STM32-microcontroller (Figuur 1D).
2. Wanneer de computer beelden van de webcam ontvangt, verwerk je de frames in de Python-omgeving.
3. Converteer elk frame van het RGB-kleurmodel naar het HSV-kleurmodel met behulp van de OpenCV^20-module (cv2.cvtColor).
   OPMERKING: Aangezien muizen nachtelijke verzamelaars zijn en voor de stabiliteit van de identificatie, moeten de experimenten worden uitgevoerd onder omstandigheden van lage en stabiele verlichting, waarbij consistente lichtomstandigheden in de arena worden gegarandeerd en gedeeltelijke schaduwen worden vermeden. De verlichting in dit experiment was ongeveer 95 lux.
4. Verkrijg maskerafbeeldingen van de muis en het robotaas op basis van hun kleurbereik in respectievelijk het HSV-kleurmodel (cv2.inRange).
5. Pas mediaanfiltering toe op de maskerafbeelding om de contouren van de muis en het robotaas duidelijker en stabieler te maken (cv2.medianBlur).
6. Verkrijg de contourinformatie van de muis en het robotaas met behulp van de contourdetectiefunctie (cv2.findContours) en zoek vervolgens een minimale rechthoek die het contourgebied kan bedekken. Gebruik de middelste coördinaten van deze rechthoek als de positie van respectievelijk de muis en het robotaas en sla ze op als TXT-bestanden.
7. Bereken op basis van de positie-informatie van de muis en het robotaas in elk frame de snelheid van de muis en de relatieve afstand tot het robotaas en sla deze parameters op als TXT-bestanden.
   OPMERKING: Rekening houdend met de tijdskosten van berekeningen met betrekking tot beeldverwerking, is de werkelijke verwerkingssnelheid van het script ongeveer 41 fps, wat betekent dat het systeem muis- en robotaasbewegingen in ongeveer 24 ms kan detecteren. De systeemvertraging tussen het verzenden van een bewegingscommando en het detecteren van beweging is 59,4 ± 7,3 ms (n = 8), dus de vertraging tussen de muisbeweging en de prooibeweging die door de muis wordt geactiveerd is ongeveer 83 ms (krekels hebben een reactietijd van minder dan 250 ms²²).
8. Afhankelijk van de relatieve afstand tussen de muis en het robotaas en hun respectievelijke posities in de arena, bepaal je de ontsnappingsstrategie van het robotaas 21,22,23.
   OPMERKING: Als de muis zich relatief ver van het robotaas bevindt (>250 mm), wordt aangenomen dat het robotaas zich in een veilige zone bevindt. Stel dat de muis dicht genoeg bij het robotaas is (<80 mm, aangezien de relatieve afstand bij deze methode wordt bepaald op basis van het midden van de muis en het robotkunstaas, hebben we deze drempelafstand aangepast op basis van de lichaamslengte van de muis, ongeveer 11 cm, en de diameter van het kunstaas, 4 cm). In dat geval wordt het als een succesvolle vangst beschouwd en zal het robotaas stoppen, waardoor de muis de voedselpellets erop kan consumeren (Figuur 2A). In de rechtlijnige ontsnappingsstrategie, als het aas zich in het midden van de arena bevindt (afstand tot de grens >75 mm), wat aangeeft dat er voldoende ruimte is in alle ontsnappingsrichtingen, zal het bewegen in de richting waarin de muis naar zichzelf toe beweegt. Integendeel, als het aas zich dicht bij de muur van de arena bevindt, zoals aangegeven door de omgeving (afstand tot de grens ≤75 mm), wat betekent dat er onvoldoende ruimte is voor continue beweging, zal het een bocht van 90° maken naar de kant met een grotere afstand tot de arenagrens (meer beschikbare ruimte, Figuur 2B). In de turn-based ontsnappingsstrategie zal het robotaas 90° naar de kant draaien met meer ruimte om te ontsnappen, beoordeeld met tussenpozen van 0,5 s (Figuur 2C).
9. Laat na het bepalen van de escape-strategie het Python-script de snelheids- en richtingssignalen afzonderlijk coderen en via de seriële poort (ser.port = 'COM3') naar de STM32 sturen met een bitrate van 115200.
   OPMERKING: Scripts in STM32 worden gecompileerd in een C-omgeving. Wanneer het snelheidssignaal wordt ontvangen, wordt het omgezet in een PWM-golf van de overeenkomstige frequentie door de frequentieverdeler en output van de kristaloscillator (STM32-kristalfrequentie is 72000000). Na ontvangst van het richtingssignaal wordt het digitale signaal omgezet door de spanning van de uitgangspoort (0 of 3,3 V) omhoog of omlaag te trekken.
10. Gebruik de seriële poortbrander om een gecompileerd C-programma op de STM32 te branden.
11. Gebruik het resetprogramma om het robotaas naar het midden van de arena te verplaatsen.
    OPMERKING: Door de positie van het robotaas in de arena te detecteren, wordt het robotaas continu naar de middenpositie (5 cm/s) gedreven, en wanneer een afstand van <20 mm tot de middenpositie wordt gedetecteerd, wordt het geacht het midden van de arena te hebben bereikt en stopt het met bewegen. Voer het resetprogramma uit voordat u het hoofdprogramma uitvoert.

3. Gewenning (Figuur 2D)

1. Zet de muis 12 uur vast om het lichaamsgewicht van het dier te verminderen tot 90-95% van normaal, met vrije toegang tot water gedurende deze periode.
2. Voer eerst het resetprogramma uit om het robotaas naar het midden van de arena te verplaatsen en isoleer vervolgens de hongerige muis aan de rand van de arena met een schot.
3. Stel het opslagpad van het bestand en de bewegingssnelheid van het robotaas (5 cm/s) in het hoofdprogramma in. Klik vervolgens op Uitvoeren en kijk in het pop-upvideovenster of de muis- en robotlokvogels stabiel worden herkend.
4. Verwijder het schot en start de timer om het roofzuchtige gedrag van de muis gedurende 20 minuten te observeren, waarbij de tijd wordt geregistreerd waarop de muis voor het eerst een voedselpellet uit het robotaas pakt. Als de muis dit niet doet, stop dan het aas en plaats het naast de muis om te voeren.
5. Breng de muis terug naar zijn kooi en wacht een herstelperiode van 24 uur met vrije toegang tot voedsel en water. Herhaal vervolgens de gewenning. Als er geen significant verschil is in de tijd tot het eerste ophalen van het voer tussen twee opeenvolgende proeven binnen dezelfde groep dieren, moet worden aangenomen dat de gewenning volledig is. Deze periode duurt meestal 3-5 proeven.
6. Maak na elke gewenning de arena goed schoon met 75% alcohol en water.

4. Predatietaak (Figuur 2D)

1. Begin direct na de gewenning met de predatietaak.
2. Zet de muis 12 uur vast om het lichaamsgewicht van het dier te verminderen tot 90-95% van normaal, met vrije toegang tot water gedurende deze periode.
3. Voer eerst een resetprogramma uit om het robotaas naar het midden van de arena te verplaatsen en isoleer vervolgens de hongerige muis aan de rand van de arena met een schot.
4. Stel het opslagpad van het bestand en de bewegingssnelheid van het robotaas in (0-60 cm/s, verschillende snelheden kunnen worden ingesteld afhankelijk van experimentele behoeften) in het hoofdprogramma. Klik vervolgens op Uitvoeren en kijk in het pop-upvideovenster of de muis en het robotaas stabiel worden gedetecteerd.
5. Verwijder het schot en start de timer om het roofzuchtige gedrag van de muis gedurende 60 s te observeren.
   1. Als de muis het robotaas binnen 60 s met succes vangt, sluit u het hoofdprogramma en laat u de muis alle voedselpellets eten voordat hij wordt teruggebracht naar de kooi.
   2. Als de muis het robotaas niet binnen 60 s vangt, laat de muis dan direct terug in de kooi zonder enige beloning of straf.
6. Voer 4 uur later een tweede ronde van predatietaken uit, waarbij u de stappen 4.3-4.5 herhaalt.
7. Geef de muis een herstelperiode van 24 uur met vrije toegang tot voedsel en water. Herhaal vervolgens de predatietaak. Als meer dan 80% van de muizen minder dan 15 s doorbrengt in twee opeenvolgende proeven, worden de muizen beschouwd als bekwame roofdieren.
8. Maak na elke predatietaak de arena goed schoon met 75% alcohol en water.

Resultaten

Om aan een roofdier te ontsnappen, maakt een prooi vaak gebruik van flexibele en variabele ontsnappingsstrategieën, zoals het veranderen van ontsnappingssnelheden of vluchten in onvoorspelbare richtingen 21,22,23. In deze studie wordt het bewegingspatroon van het robotaas flexibel gecontroleerd in snelheid en richting, zodat we zowel de ontsnappingsrichting als de snelheid van het robotaas kunne...

Discussie

In dit protocol gebruiken we, om real-time controle met lage systeemlatentie te bereiken, OpnenCV, een lichtgewicht en efficiënte computervisiebibliotheek en een kleurenmodel om de posities van de muizen en de robotlokvogel te identificeren. Dit vereist dat de verlichting in de arena relatief stabiel is en dat de schaduwen in de arena zoveel mogelijk worden vermeden om de detectie van de zwarte muizen niet te verstoren. Om een relatief stabiele contourdetectie te verkrijgen, leggen we vo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acrylic cylinder	SENTAI	PMMA	Diameter 800 mm Hoogte 300 mm Dikte 8 mm
Anti-vibratie tafel	VEOO	Op maat gemaakt	Lengte 1500 mm Breedte 1500 mm Hoogte 750 mm
Camera	JIERUIWEITONG	HF868SS	Pixelgrootte 3 µm ´ 3 µm 480P: 120 fps
Cameraondersteuningskader	RUITU	Op maat gemaakt	Maximale breedte 3300 mm Maximale hoogte 2600 mm
Circuit board	WXRKDZ	Op maat gemaakt	Lengte 60 mm Breedte 40 mm Afstand tussen gaten 2,54 mm
Computer	DELL	Precision 5820 Tower	Inter(R) Xeon(R) W-2155 CPU NVIDIA GeForce RTX 2080Ti
DuPont-lijn	TELESKY	Op maat gemaakt	30 cm
Voederkorrels	Bio-serve	F07595	20 mg
Platformondersteuningskader	HENGDONG	OB3030	Lengte 1600 mm Hoogte 900 mm Breedte 800 mm
Geregeld voedingssysteem	ZHAOXIN	PS-3005D	Uitgangsspanning: 0-30 V Uitgangsstroom: 0-3 A
Ronde magnetische blok	YPE	YPE-230213-5	Diameter 40 mm Dikte 10 mm
Servomotorbestuurder	FEREME	FCS860P	0,1 kw-5,5 kw SVPWM 220 VAC+10% ~-15% RS-485
Schuifrail	JUXIANG	JX45	Lengte 1000 mm Breedte 1000 mm
Vierkante acrylplaat	SENTAI	PMMA	Lengte 800 mm Breedte 800 mm Dikte 10 mm
Vierkante magnetische blok	RUITONG	N35	Lengte 100 mm Breedte 50 mm Dikte 20 mm
Stm32	ZHENGDIANYUANZI	F103	STM32F103ZET6 72 MHz klok
Transistor	Semtech	C118536	2N2222A, NPN