Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo Toepassing van op TurboID gebaseerde nabijheidsetikettering in Drosophila melanogaster

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68193

⸱

13 juni 2025

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

In dit artikel

Samenvatting

In deze studie stellen we een gedetailleerd protocol op voor op TurboID gebaseerde nabijheidslabeling (PL) in de eierstok van D. melanogaster , dat stappen omvat van biotinesuppletie en eierstokdissectie tot validatie van transgenexpressie en verrijking van gebiotinyleerde peptiden voor massaspectrometrie.

Samenvatting

Nabijheidslabeling (PL) is een krachtige methode voor het in kaart brengen van eiwit-eiwitinteractienetwerken. Vooruitgang in het labelen van enzymen, met name TurboID, heeft het gebruik ervan in biologische systemen verbreed. TurboID is bijzonder voordelig voor in vivo toepassingen vanwege zijn robuustheid, niet-toxiciteit en gebruiksgemak. Dit enzym biotinyleert promiscue nabijgelegen biomoleculen, waaronder eiwitten en nucleïnezuren, binnen een bereik van ongeveer 10 nm in aanwezigheid van biotine. We hebben deze methode toegepast om het interactoom van courgette (Zuc) te onderzoeken, een sleutelfactor in de biogenese van piwi-interagerend RNA (piRNA) op het buitenste mitochondriale membraan (OMM) in kiembaancellen van de Drosophila melanogaster-eierstok . Door Zuc-TurboID tot expressie te brengen in geslachtscellen en aan te vullen met biotine, induceerden we de biotinylering van Zuc-proximale eiwitten. Massaspectrometrie-analyse na de verrijking van gebiotinyleerde peptiden identificeerde eiwitten in de nabijheid van Zuc, inclusief bekende interactoren in piRNA-biogenese. Interessant is dat we nieuwe interactoren van Zuc ontdekten die betrokken zijn bij het vouwen van eiwitten, membraanorganisatie en het transport van blaasjes.

Inleiding

Conventionele methoden voor het in kaart brengen van eiwit-eiwitinteractie (PPI), zoals affiniteitszuiveringsmassaspectrometrie (AP-MS) en gist-2-hybride (Y2H) systemen, slagen er vaak niet in om laag-abundantie, tijdelijk tot expressie gebrachte of membraangebonden eiwitten vast te leggen. Deze beperking komt voort uit hun onvermogen om de natuurlijke fysiologische omstandigheden van een levende cel te repliceren 1,2,3. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, is PL naar voren gekomen als een krachtige techniek voor het in kaart brengen van proteoom met hoge resolutie op suborganelniveau in vivo. PL maakt gebruik van de fusie van een promiscue enzym met aaseiwit, waardoor het enzym de vorming van kortlevende reactieve moleculen kan katalyseren1. Deze reactieve moleculen, zoals biotine, labelen covalent eiwitten binnen een paar nanometer van het fusie-eiwit4. Vervolgens worden gebiotinyleerde eiwitten geïsoleerd en geanalyseerd door middel van massaspectrometrie om grootschalige eiwitidentificatie te vergemakkelijken 5,6.

In de afgelopen jaren zijn verschillende promiscue enzymen ontwikkeld om PL-technieken vooruit te helpen. Twee veelgebruikte enzymen zijn Escherichia coli-afgeleide R118G mutant biotine-ligase (BioID) en van erwten afgeleid ascorbaatperoxidase-enzym 2 (APEX2). BioID zet biotine en ATP om in biotinyl-5'-adenylaat (bioAMP)1. Dit reactieve molecuul bindt zich covalent aan lysineresiduen van nabijgelegen eiwitten binnen ± straal van 10 nm. Een belangrijk voordeel van PL op basis van BioID is het gebruik van biotine. Het is een van nature voorkomend en niet-toxisch biomolecuul in levende organismen, wat een veilige in vivo etikettering mogelijk maakt6. BioID heeft echter beperkingen, waaronder een langzame labelkinetiek (18-24 uur) en de vereiste van hoge temperatuur (37 °C) voor optimale katalytische activiteit4. Deze eigenschappen kunnen de toepassing ervan bij het bestuderen van dynamische biologische processen belemmeren. Ondertussen katalyseert APEX2 de vorming van biotine-fenoxylradicalen in aanwezigheid van biotine-fenol en waterstofperoxide (H2O2)7. Deze radicalen reageren voornamelijk met de zijketen van elektronenrijke aminozuren zoals tyrosine en kunnen ook cysteïne, histidine en tryptofaan binden8. Het snelle labelvermogen van het peroxidase-enzym (< 1 min) is geschikt voor het vastleggen van dynamische en voorbijgaande PPI's9. Bovendien heeft het een groter detectiebereik (tot 20 nm) dan biotineligase. PL op basis van APEX2 heeft echter zijn nadelen, waaronder de vereiste van een giftig oxidatiemiddel, H2O2, en de lage permeabiliteit van biotinefenol, die de toepasbaarheid in vivobeperken 10.

In 2018 ontwikkelden Branon et al. een nieuw biotineligase genaamd TurboID, een 35 kD mutante versie van BirA (het biotineligase dat wordt aangetroffen in E. coli)4. Dit enzym bevat een mutatie op de R118-positie (R118S) samen met 15 andere mutaties ten opzichte van BirA. Het vertoont een tweevoudig hogere katalytische activiteit dan BioID. TurboID-geïnduceerde biotinylering in 10 minuten produceert proteomische gegevens met een omvang en specificiteit die vergelijkbaar is met 18 uur labeling door BioID. Bovendien vertoont het een uitstekende etiketteringsactiviteit bij 30 °C4. Daarom is TurboID meer geschikt voor toepassing in organismen zoals Drosophila of Caenorhabditis elegans, die gewoonlijk worden gekweekt bij respectievelijk 25 °C en 20 °C.

In deze studie streven we ernaar om op TurboID gebaseerde PL te gebruiken voor interactoomonderzoek in de eierstok van Drosophila. De hier beschreven protocollen worden gebruikt om het interactoom van Zuc in kiembaancellen in kaart te brengen. Zuc is een endonuclease gelokaliseerd op het buitenste mitochondriale membraan (OMM), dat de biogenese van piRNA's bemiddelt, kleine niet-coderende RNA's die cruciaal zijn voor het behoud van de genoomintegriteit 11,12,13. Door gebiotinyleerde eiwitten geïdentificeerd uit Zuc-TurboID-analyse te vergelijken met die van twee extra controles, NES-TurboID en Tom20-TurboID, hebben we verschillende Zuc-interagerende kandidaten gedefinieerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. PL bij volwassen vlieg

  1. Bereiding van biotine voedsel
    1. Bereid 1 M NaOH-oplossing door 10 M NaOH-bouillon te verdunnen in drievoudig gedestilleerd water (TDW). Bewaar het bij kamertemperatuur (RT). Bereid 1 M biotinestockoplossing door 0,0049 g biotinepoeder op te lossen in 20 ml TDW. Voeg 150-200 μL 1 M NaOH toe om de oplosbaarheid van biotine te verhogen. Vortex om de oplossing te homogeniseren. Bewaar biotine-stockoplossing bij 4 °C.
    2. Haal vliegenvoer uit de injectieflacon en zet het 2 minuten in de magnetron tot het gesmolten is.
      OPMERKING: Standaard vliegenvoer bevat 5% maïsmeel, 3% gist, 10% sucrose, 1% agar, 0,3% propionzuur en 0,3% methyl-4-hydroxybenzoaat13.
    3. Voeg biotinebouillon toe aan het gesmolten voedsel met een eindconcentratie van 100 μM en meng vervolgens door middel van vortexing. Doseer onmiddellijk 4,5 ml met biotine aangevuld voedsel in elke lege injectieflacon met behulp van een serologische pipet. Laat het voer 30 minuten afkoelen, plaats een wattenschijfje op de injectieflacon en bewaar het biotinevoer vervolgens bij 4 °C.
      OPMERKING: Biotine moet worden toegevoegd voordat het voedsel afkoelt en hard wordt.
  2. Biotine voeding
    1. Kruis de transgene vliegen die TurboID-fusie-eiwit tot overexpressie brengen met weefsel- of celspecifieke GAL4-vliegen 14,15,16. Als negatieve controle kruis je wildtype vliegen met GAL4-drivervliegen om ervoor te zorgen dat er geen biotinyleringsinductie is.
    2. Ongeveer 10 dagen na de oversteek beginnen nakomelingen uit te komen. Los droog gistpoeder op in TDW en roer tot een gladde pasta. Breng een laboratoriumlepel gistpasta aan op de wand van een nieuw flesje. Tik voorzichtig op het oude flesje met pas uitgekomen vliegen om de vliegen op de bodem te verzamelen. Keer de oude injectieflacon om op de nieuwe injectieflacon met gistpasta en zorg ervoor dat de randen van beide injectieflacons zijn uitgelijnd om te voorkomen dat vliegen ontsnappen.
    3. Tik die flesjes tegen elkaar aan om vliegen van de oude injectieflacon naar het onderste deel van de nieuwe flacon over te brengen. Zodra de vliegen zijn overgebracht, plaatst u de katoenen kappen stevig terug op zowel de nieuwe als de oude flesjes. Wacht 3 dagen. Gistpasta kan bij RT enkele dagen bewaard worden.
      OPMERKING: Het overbrengen van vliegen moet zo snel mogelijk gebeuren, omdat vliegen slechts tijdelijk worden verdoofd.
    4. Bereid 0,5% propionzuuroplossing door 250 μL propionzuurvoorraad te verdunnen in 50 ml TDW. Bewaar het bij RT.
    5. Bereid op de 3edag 100 μM biotine-werkoplossing door 1 M biotinevoorraad in TDW te verdunnen en voeg vervolgens 500 μL 0,5% propionzuur toe. Meng biotine werkoplossing met droog gistpoeder en roer tot het een pasta vormt. Voeg een laboratoriumlepel biotine-gistpasta toe aan de wand van de biotine-voedselfles. De biotine-gistpasta kan enkele dagen bij RT worden bewaard.
    6. Verdeel vliegen in twee groepen. Bewaar de ene groep ter controle in de normale voedselflacon en breng de andere groep over naar de biotine-voedselflacon (biotine-gistpasta toegevoegd) om de biotinylering te starten. Na 16 uur biotinylering worden de vliegen overgebracht naar een nieuwe normale voedselflacon.
      OPMERKING: We hebben eerder een biotine-voedingstest uitgevoerd gedurende 4 uur, 8 uur en 16 uur. Het biotinyleringssignaal was het sterkst na 16 uur voeren, dus kozen we dit tijdstip voor volgende experimenten.
  3. Drosophila eierstok collectie
    1. Doe vliegen in de CO2 vliegenmat, houd de vrouwtjes en gooi de mannetjes weg. Nadat de vliegen goed zijn verdoofd (niet meer bewegen), pipetteer 1 ml koud Grace's insectenmedium op de dissectieschaal.
    2. Neem een vlieg naar de dissectieschaal met behulp van een tang met fijne punt en laat deze onderdompelen in het medium. Houd de vliegenborstkas vast met een tang, pas op dat u het lichaam niet verplettert. Gebruik vervolgens een andere tang om voorzichtig de punt van de achterste buik te verwijderen (waar het genitaliëngedeelte zich bevindt).
    3. Gebruik de tang om de eierstokken langzaam uit te knijpen (beginnend vanaf de bovenbuik naar beneden).
    4. Zodra ze eruit zijn, verwijder je spiernetten en andere weefsels die de eierstokken omringen. Pas op dat u de eierstokken niet beschadigt.
    5. Breng schone eierstokken voorzichtig over in een buis van 1.7 ml met behulp van een tang; Houd de tube op ijs. Herhaal stap 1.3.2 - 1.3.4 voor de volgende vliegen.
    6. Draai de buis 30 s lang 30 s bij 4 °C op 3.500 x g naar beneden en gebruik vervolgens de micropipetpunten om het resterende medium te verwijderen. Pas op dat u de eierstokken niet aanraakt.
    7. Vries de buis in met vloeibare stikstof en bewaar de eierstokken vervolgens bij -80 °C. De eierstokmonsters zijn 1 jaar stabiel.

2. Transgenexpressie en detectie van gebiotinyleerd eiwit door middel van Western blot-assay

OPMERKING: Verzamel voor de western blot-test ongeveer vijf eierstokparen per monster.

  1. Weefsel lysis
    1. Ontdooi het bevroren eierstokweefsel. Voeg 50 μL RIPA lysisbuffer toe (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS), 0,5% natriumdeoxycholaat, 1% Triton X-100), aangevuld met 1x proteaseremmer (PI) cocktail en 1 mM Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF). Bewaar RIPA lysis buffer (zonder 1x PI cocktail en 1 mM PMSF) bij 4 °C.
      OPMERKING: PI-cocktail en PMSF mogen alleen vlak voor het experiment worden toegevoegd.
    2. Verstoor de eierstokken met behulp van een draagbare homogenisator in combinatie met een plastic stamper (1 min per buis). Een weefsellysisproces op ijs gedurende 10 minuten is nodig om volledige lysis te garanderen, gevolgd door homogenisatie.
    3. Centrifugeer bij 13.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om eiwitlysaat van puin te scheiden.
    4. Pipetteer helder eiwitlysaat in een nieuwe tube van 1,7 ml (vermijd het nemen van de lipidenlaag erop) en bewaar het lysaat vervolgens bij -20 °C tot verder gebruik.
  2. Meting van de eiwitconcentratie door middel van bicinchoninezuur (BCA)-assay
    1. Bereid bicinchoninezuur (BCA) werkreagens (WR) door reagens A en reagens B in een verhouding van 50:1 te mengen. Meng 1 μl lysaat of verdunde BSA-standaard met 200 μl WR in een plaat met 96 putjes (in duplicaten) en incubeer de plaat vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C.
      1. Bereken hoeveel WR nodig is met behulp van deze formule:
        (# standaarden + # samples) × (# replicates) × (WR volume per sample)
        Om een reeks eiwitstandaarden te maken, bereidt u verschillende verdunningen van 2 mg/ml runderserumalbumine (BSA) in RIPA-lysisbuffer (zonder PI-cocktail en PMSF) met eindconcentraties 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 en 2000 μg/ml.
    2. Meet de extinctie met behulp van een microplaatlezer bij een golflengte van 495 nm. Genereer een standaardcurve op basis van BSA-absorptiewaarden en bepaal vervolgens de eiwitconcentratie.
  3. Western blot-test
    1. Gel elektroforese
      1. Voeg 30-50 μg eiwitlysaat toe aan de 2x SDS-laadbuffer. Voeg TDW toe (indien nodig) om een uiteindelijke eiwitconcentratie van 2 μg/μl en 1x SDS-eindconcentratie te krijgen en kook het monster vervolgens gedurende 10 minuten bij 95 °C.
      2. Bereid de lopende buffer voor door 25 ml 20x MEPS-buffer te mengen met 500 ml TDW om 1x de concentratie van de lopende buffer te maken. Bewaar het bij RT.
      3. Spoel de putjes van de Bis-Tris-gel af met 1 ml loopbuffer (3x) en plaats vervolgens de Bis-Tris-gel in de elektroforesekamer. Vul de voorkant van de kamer met de nieuwe lopende buffer totdat alle putten onder water staan (± 250 ml). Vul de achterkant van de kamer met de gebruikte loopbuffer (de helft van het volume van de gebruikte nieuwe loopbuffer is voldoende).
      4. Laad het monster op de Bis-Tris-gel en gebruik 4 μL voorgekleurd eiwit ladder als marker. Voer elektroforese uit (200 V, 30 min). Verwijder de gel uit de cassette en spoel af met TDW.
    2. Membraan blotting
      1. Maak een overdrachtsbuffer door 20 ml overdrachtsbuffer (25x voorraad) en 50 ml methanol toe te voegen aan 430 ml TDW.
      2. Schik een sandwich bestaande uit blotting pads, filtreerpapier, gel en nitrocellulosemembraan in een blot-module. Voordat u een nieuwe laag stapelt, gebruikt u een roller om luchtbellen te verwijderen.
      3. Installeer de blot-module op de transferkamer en vul de kamer vervolgens met 500 ml transferbuffer. Breng eiwitten gedurende 1 uur over bij 175 mA.
        OPMERKING: De overdrachtsbuffer moet vóór het experiment vers worden bereid.
    3. Blokkeren
      1. Voeg 5 ml Tween20-bouillon toe aan 45 ml TDW om 10% Tween20-bouillonoplossing te maken. Los twee met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tabletten op in 400 ml TDW. Verwijder 4 ml oplossing en voeg vervolgens 4 ml 10% Tween20 toe (eindconcentratie 0,1%) om 1x PBST-oplossing te maken. Bewaar het bij RT.
      2. Verwijder het gedepte membraan uit de transferkamer en spoel vervolgens af met 1x PBST.
        OPMERKING: Als het membraan moet worden geïncubeerd met verschillende antilichamen, snijd het dan af met een schoon roestvrijstalen mes volgens de verwachte eiwitgroottes voordat u de blokkeringsstap uitvoert.
      3. Om genexpressies te controleren, gebruikt u 2% BSA in 1x PBST voor de blokkeringsstap (1 uur, RT). Maak een oplossing van 2% BSA door 1 g BSA toe te voegen aan 50 ml 1x PBST. Voor detecties van gebiotinyleerd eiwit moet de blokkering worden uitgevoerd met 3% BSA in 1x PBST ('s nachts, 4 °C). Los 1,5 g BSA-poeder op in 50 ml 1x PBST om een 3% BSA-oplossing te maken. Bewaar blokkeringsoplossingen bij 4 °C.
        OPMERKING: De gebruikte BSA verschilt van de BSA die wordt gebruikt in de BCA-test. BSA voor BCA-assay maakt deel uit van de BCA-kit.
    4. Incubatie van primaire antilichamen
      1. Verdun 1 μl α-V5 in 10 ml 2% BSA (1: 10.000) en 10 μl huishoudgen α-HSP90 in 2% BSA (1: 1.000). Voeg 2,7 μL streptavidine-mierikswortelperoxidaseconjugaat (SA-HRP) toe aan 9 ml 1x PBST-oplossing om 0,3 μg/ml SA-HRP-oplossing te maken.
      2. Om de genexpressie te controleren, incubeer het membraan met primair antilichaam een nacht bij 4 °C. Voor de detectie van gebiotinyleerde eiwitten moet het membraan gedurende 1 uur bij 4 °C worden geïncubeerd. Bewaar het primaire antilichaam terug bij 4 °C. Het kan meerdere keren worden gebruikt.
      3. Was het membraan met 1x PBST voor 3x bij RT gedurende 15 minuten elk.
    5. Incubatie van secundaire antilichamen
      1. Bereid een secundaire antilichaamoplossing door 2 μl geitenwerend anti-konijn of anti-muis IgG (mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd) toe te voegen aan 10 ml 2% BSA (1: 5.000).
        OPMERKING: Voor SA-HRP is een secundair antilichaam niet nodig. Ga direct door naar de visualisatiestap. Secundaire antilichamen moeten vóór het experiment vers worden verdund.
      2. Incubeer het membraan in secundaire antilichaamoplossing gedurende 40 minuten bij RT. Was het membraan met 1x PBST gedurende 3x bij RT gedurende elk 15 minuten.
    6. Eiwitdetectie met verbeterde chemiluminescentie (ECL) methode
      1. Meng 750 μL luminol en 750 μL HRP-oplossing (verhouding 1:1). Houd het membraan vochtig in de wasbuffer tijdens het bereiden van het mengsel.
        OPMERKING: Dit mengsel moet vóór het experiment vers worden bereid. Omdat de chemicaliën lichtgevoelig zijn, moet u ze uit de buurt van zonlicht of andere intense lichtbronnen houden (kortstondige blootstelling aan laboratoriumverlichting is prima).
      2. Dompel het membraan 30 s in de oplossing en plaats het vervolgens tussen transparante plastic vellen. Observeer gedepte eiwitbanden met een Chemidoc-instrument.

3. Transgenexpressie en lokalisatievalidatie door immunofluorescentiekleuring

OPMERKING: Om genexpressie en lokalisatie te controleren, ontleedt u ongeveer vijf eierstokparen per monster van 2 dagen oude vrouwtjes die worden gevoed met gistpasta. Jonge eierstokken bevatten voornamelijk vroege stadia van eikamers, die ideaal zijn voor immunofluorescentiekleuring vanwege de overvloed aan verpleegcellen (kiembaancellen) en hun relatief doorlaatbare membranen17. Late stadia van eierkamers zijn stijver en moeilijker te doordringen vanwege de vorming van het eierschaalcomplex, dat begint in fase 918. Ontleed voor de eiwitbiotinyleringstest ongeveer vijf eierstokparen per monster van vrouwtjes van 4 dagen oud die met biotine zijn gevoed, zoals beschreven in stap 1.2.

  1. Voorbereiding van het monster
    1. Houd het achterste deel van een ontlede eierstok op zijn plaats met een tang. Gebruik een andere tang om de eierstok voorzichtig uit elkaar te halen in individuele eierkamers. Werk voorzichtig om te voorkomen dat de eierkamers scheuren. Het isolatieprotocol voor de eierkamer werd in detail beschreven in19. Pipeteer de eierkamers voorzichtig in een tube van 1,7 ml en was vervolgens met 1 ml 1x PBS (RT). Knip de rand van de pipetpunten af voordat u gaat pipetteren om te voorkomen dat de eierkamers vast komen te zitten in de punten.
      OPMERKING: Gebruik eierkamers alleen in fase ≤ 9 (transparante). Gooi rijpe eicellen en eikamers in een laat stadium ≥ 10 weg. Door pipetteren gaan de eierkamers in de oplossing drijven. Laat daarom de eierkamers op de bodem bezinken (gedurende 5 minuten) voordat u doorgaat naar de volgende stappen.
  2. Fixatie
    1. Verdun 3,125 ml 16% formaldehyde (FA) voorraad in 6,875 ml 1x PBS om een 5% FA-oplossing te maken. Bewaar het bij RT.
      OPMERKING: FA is lichtgevoelig, dus houd het uit de buurt van licht.
    2. Pipetteer 1 ml 5% formaldehyde (FA) in de buis met eicellen. Plaats de buis op de multirotator en fixeer de eicellen vervolgens gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Vanaf de fixatie tot de stap van de nucleaire kleuring worden experimenten uitgevoerd op een multi-rotator met zachte rotatie.
    3. Bereid 0,5% Triton X-100 in 1x PBS (1x PBT) als wasoplossing door 10 ml 10% Triton X-100 bouillon toe te voegen aan 190 ml 1x PBS. Bewaar het bij RT.
    4. Spoel de vaste eierkamers 1x uit, gevolgd door 3x wassen op RT gedurende 10 min. Gebruik 1 ml 1x PBT voor zowel spoel- als wasstappen.
  3. Blokkeren
    1. Bereid 5% foetaal runderserum (FBS) door 250 μL FBS-bouillon toe te voegen aan 4,75 ml 1x PBT.
      OPMERKING: Deze oplossing moet vóór het experiment vers worden gemaakt.
    2. Voeg 1 ml 5% FBS toe aan de tube en voer de blokkeringsstap uit gedurende 1 uur bij RT. Spoel de eicellen 1x.
  4. Incubatie van primaire antilichamen
    1. Om de expressie en lokalisatie van transgen te controleren, verdunt u 2 μL α-V5 en 2 μL α-ATP5A of α-Tom20 (als mitochondriale marker) in 400 μL 1x PBT (verhouding 1:200).
      OPMERKING: Hoewel twee antilichamen samen kunnen worden gebruikt om één monster te kleuren, moeten hun gastheren verschillend zijn. Het is om overlappende binding van opeenvolgende secundaire antilichamen te voorkomen.
    2. Incubeer de eierkamers met 400 μl verdunde primaire antilichaamoplossing ('s nachts 4 °C).
      OPMERKING: Net als bij de Western blot-test kunnen primaire antilichamen meerdere keren worden gebruikt voor immunokleuring. Voordat u een antilichaamoplossing opbergt, moet u ervoor zorgen dat deze geen eierkamers bevat.
    3. Spoel de eierkamers 1x af, gevolgd door 3x wassen op RT gedurende 10 min.
  5. Incubatie van secundaire antilichamen
    1. Verdun 2 μL Geit α-Rb IgG Alexa Fluor 488 en 2 μL Geit α-M IgG Alexa Fluor 594 in 400 μL 1x PBT (verhouding 1:200). Incubeer de eierkamers met 400 μl verdunde secundaire antilichaamoplossing gedurende 2 uur bij RT. Voor de detectie van biotinylering voegt u 2 μL streptavidine-geconjugeerd Alexa Fluor 594 toe aan 1x PBT (verhouding 1:200) en incubeert u samen met een secundair antilichaam.
      OPMERKING: Bescherm vanaf deze stap het monster tegen licht. Secundaire antilichamen moeten vóór het experiment vers worden verdund. Meerdere secundaire antilichamen kunnen samen worden gebruikt, maar elk primair antilichaam moet worden toegewezen aan verschillende fluoroforen die ook afkomstig zijn van verschillende gastheren om overlappende signalen te voorkomen. 488 Geit α-Rb bindt bijvoorbeeld aan konijn α-V5. Wat betreft muis α-ATP5A, wordt 594 Geit α-M gebruikt als aanvullend secundair antilichaam. In het geval van detectie van biotinylering moet het gebruik van andere kleurstoffen met dezelfde golflengte als streptavidineconjugaat worden weggelaten.
    2. Spoel de eierkamers 1x af, gevolgd door 3x wassen op RT gedurende 10 min.
  6. Nucleaire kleuring
    1. Verdun 1 μL DAPI in 1 ml 1x PBS (verhouding 1:1.000). Incubeer de eierkamers met 1 ml verdunde DAPI-oplossing gedurende 5 minuten bij RT.
      OPMERKING: DAPI moet vóór het experiment vers worden verdund.
    2. Spoel de eierkamers 1x af, gevolgd door 3x wassen op RT gedurende 10 min.
      OPMERKING: Eierkamers kunnen een paar uur worden bewaard in 1x PBS-oplossing bij 4 °C voordat ze worden gemonteerd, maar het wordt aanbevolen om zo snel mogelijk verder te gaan.
  7. Schuif montage
    1. Reinig het glasplaatje met een pluisvrije tissue en noteer er vervolgens voorbeeldinformatie op. Haal 1x PBS uit de tube, maar laat een kleine hoeveelheid staan om uitdroging te voorkomen.
    2. Snijd de rand van de micropipetpunten af en pipetteer vervolgens voorzichtig de eierkamers op het glasplaatje. Gebruik een tang om de eierkamers voorzichtig over de glasplaat te verdelen en klonteren te voorkomen. Bekijk de objectglaasjes onder een microscoop (2x vergroting is voldoende) om ervoor te zorgen dat de eierkamers gelijkmatig verdeeld zijn.
    3. Verwijder de resterende PBS van de glasplaat met behulp van een micropipet. Pipetteer 15-30 μL antifade-oplossing (lichtgevoelig) op het glasplaatje en zorg ervoor dat het in contact komt met alle eierkamers.
    4. Gebruik een tang om de rand van het glaasje vast te houden en plaats het vervolgens op het glasplaatje (beginnend van de ene rand naar de andere) zodat het de eierkamers bedekt. Doe het langzaam om luchtbellen te voorkomen. Dep overtollige oplossing met pluisvrij weefsel en sluit vervolgens de randen van het dekglaasje af met nagellak. Laat de nagellak goed drogen (± 5 min).
    5. Maak de dia's foto's met een confocale microscoop. Bewaar glaasjes bij -20 °C.

4. Gebiotinyleerde peptideverrijking voor massaspectrometrie-analyse

OPMERKING: Er zijn ongeveer 3 mg eiwitten nodig voor het massaspectrometriemonster. Ontleed daarom ongeveer 100 eierstokparen om dat aantal te verkrijgen.

  1. Weefsel lysis
    1. Ontdooi het bevroren eierstokweefsel. Bereid ondertussen 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) door 1 TBS-tablet op te lossen in 500 ml TDW. Bewaar het bij RT. Bereid 2% SDS in 1x TBS als lysisbuffer door 4 ml 10% SDS-voorraad te verdunnen in 16 ml 1x TBS. Bewaar het bij RT.
    2. Voeg 500 μL 2% SDS in 1x TBS (aangevuld met 1x PI cocktail) toe aan de tube met eierstokken. Wacht enkele minuten totdat de cellen zijn gelyseerd en de oplossing plakkerig wordt.
    3. Pipetlysaat op een militube van 1 ml met adaptieve gefocusseerde akoestiek (AFA) vezel. Knip de pipetpunten af voor gebruik. Om een efficiënte sonicatie te garanderen, brengt u maximaal 500 μL lysaat per buis over.
    4. Voer sonicatie uit onder de volgende omstandigheden: piek invallend vermogen 75 W, inschakelduur 10%, cycli per burst 200, tijd 180 s, temperatuur 6 °C.
      OPMERKING: Als een monster meerdere keren aan sonicatie moet worden onderworpen, stel dan enkele intervallen tussen in om te voorkomen dat er overmatige warmte wordt gegenereerd.
  2. Aceton neerslag
    1. Verplaats het lysaat naar een tube met een lage binding van 5 ml en voeg vervolgens koude aceton toe aan de tube met 6x van het monstervolume. Voeg bijvoorbeeld 3 ml aceton toe aan 500 μl lysaat.
      OPMERKING: Aceton moet voor gebruik worden voorgekoeld bij -20 °C.
    2. Vortexbuis, laad deze in een multirotator en incubeer een nacht (± 16 uur) bij -20 °C.
      OPMERKING: Dit is een stoppunt, wat betekent dat het experiment na deze stap tijdelijk kan worden gepauzeerd.
    3. Pellet precipiteerde eiwitten bij 15.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi supernatant weg en draai de buis vervolgens naar beneden bij 4 °C.
    4. Voeg 2 ml van een mengseloplossing bestaande uit 90% koude aceton en 10% 1x TBS toe. Pipetteer in een op-en-neer beweging om de pellet en oplossing te mengen. Knip de pipetpunten af voor gebruik.
    5. Vortexbuis, laad deze vervolgens in de multirotator en incubeer gedurende 2 uur bij -20 °C.
    6. Pelleteiwitten op 15.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en draai de buis vervolgens naar beneden bij 4 °C. Open de tube en laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen.
      OPMERKING: Droog de pellet niet te lang, omdat deze later moeilijk opnieuw te suspenderen is.
    7. Bereid 500 mM ammoniumbicarbonaat (ABC) stockoplossing door 0,7906 g ABC op te lossen in 20 ml TDW. Maak 50 mM ABC-werkoplossing door 3 ml 500 mM ABC-voorraadoplossing te verdunnen in 27 ml TDW.
    8. Bereid 8 M ureumoplossing door 0,4805 g ureum toe te voegen aan 1 ml 50 ml ABC.
      OPMERKING: Ureumoplossing moet vóór het experiment vers worden bereid.
    9. Resuspendeer de eiwitkorrel in 500 μL 8 M ureum. Het volume van 8 M ureum kan worden verminderd om de eiwitconcentratie te verhogen.
    10. Breng geresuspendeerd eiwit over in een militube van 1 ml die AFA-vezel bevat en voer vervolgens sonicatie uit onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 4.1.4.
    11. Voer een BCA-test uit om de eiwitconcentratie te bepalen. Deze stap is een stoppunt. Bewaar het eiwitmonster bij 4 °C tot verder gebruik.
  3. Trypsine spijsvertering
    1. Meng 3 mg eiwitten met TDW (indien nodig) in een buisje van 5 ml met een lage binding tot een totaal van 500 μl oplossing.
    2. Denatureer eiwitten met behulp van een thermoblok bij 450 tpm gedurende 1 uur bij 37 °C.
    3. Voeg 5 μL 1 M DTT (opgelost in TDW) toe aan de buis om een eindconcentratie van 10 mM DTT te maken en reduceer vervolgens eiwitten met behulp van een thermoblok bij 450 tpm gedurende 1 uur bij 37 °C.
    4. Bereid 400 mM jodoacetamide door 0,0111 g jodoacetamide op te lossen in 150 μL ABC. Voeg 55 μL 400 mM jodoacetamide toe aan de buis (eindconcentratie 40 mM) en alkyleer vervolgens eiwitten met behulp van thermoblok bij 450 tpm gedurende 1 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: Jodoacetamide is lichtgevoelig en alle jodoacetamide-oplossingen moeten vóór het experiment vers worden bereid.
    5. Verdun het monster door 50 mM ABC-oplossing toe te voegen tot het totale volume 4 ml bereikt. Na verdunning is de ureumconcentratie in de oplossing ongeveer 1 M.
    6. Maak 1 M CaCl2 stockoplossing door 1,1098 g CaCl2 op te lossen in 10 ml TDW. Voeg 4 μL 1 M CaCl2 bouillon toe aan de buis om een eindconcentratie van 1 mM te maken en pipetteer vervolgens op en neer om de oplossing te homogeniseren.
    7. Bereid een 1 mg/ml trypsinestockoplossing door 0,001 g trypsine toe te voegen aan 1 ml ABC. Voeg 150 μL trypsine toe aan de tube (trypsine: monster = verhouding 1:20). Verteer eiwitten met behulp van een thermoblok bij 450 tpm gedurende 16 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: Trypsine moet vóór het experiment vers worden opgelost. Deze stap is een stoppunt. Bewaar verteerde peptiden bij 4 °C tot verder gebruik.
  4. Verrijking met gebiotinyleerde peptiden
    OPMERKING: Was- en elutiebuffers moeten vóór het experiment vers worden bereid.
    1. Bereid 2 M ureum in 1x TBS-oplossing door 1,2012 g ureum toe te voegen in 10 ml 1x TBS.
    2. Gebruik 150 μL streptavidine-geconjugeerde magnetische kralen per monster van 3 mg. Was de streptavidine korrels met 1 ml 2 M ureum in 1x TBS. Herhaal deze stap 4x. Plaats de tube na elke wasbeurt 1 minuut op een magnetisch rek en gooi vervolgens de wasbuffer weg.
      OPMERKING: Doorboor Streptavidin magnetische kralen worden aanbevolen omdat ze PEG-achtige achtergrondsignalen in massaspectrometrieresultaten minimaliseren.
    3. Pipetteer 1 ml verteerde peptiden in de kralenbevattende buis, meng voorzichtig en combineer het mengsel vervolgens met het resterende monster in een buis van 5 ml met een lage binding. Plaats de buis op een multirotator en incubeer gedurende 1 uur bij RT.
    4. Breng 1 ml van het mengsel over in een buis van 1,5 ml en plaats het 1 minuut op het magnetische rek. Gooi het bovenstaande weg. Herhaal deze stap totdat alle kralen zijn verzameld.
    5. Bereid 2 M ureum in 50 mM ABC door 0,7207 g ureum op te lossen in 6 ml 50 mM ABC. Was de parels 2x met 1 ml 2 M ureum in 50 mM en eenmaal met 1 ml TDW. Plaats de tube na elke wasbeurt 1 minuut op een magnetisch rek en gooi vervolgens de wasbuffer weg.
    6. Bereid 10% mierenzuurstockoplossing door 1 ml mierenzuur op te lossen in 9 ml TDW. Bereid de elutiebuffer voor die bestaat uit 80% acetonitril en 0,1% mierenzuur in TDW. Meng bijvoorbeeld 1,2 ml acetonitril, 15 μl 10% mierenzuurbouillon en 285 μl TDW om 1,5 ml elutiebuffer te maken.
      LET OP: Acetonitril en mierenzuur zijn schadelijk vanwege hun vluchtige eigenschappen, dus draag een masker en wees voorzichtig bij het hanteren ervan.
    7. Pipetteer 100 μL elutiebuffer in de buis, homogeniseer voorzichtig en elueer vervolgens peptiden met behulp van een thermoblok bij 300 tpm gedurende 5 minuten bij 60 °C. Plaats de buis na de elutie op een magnetisch rek en breng het eluaat over in een nieuwe buis van 1.5 ml. Vermijd het nemen van kralen bij het overbrengen van de eluaat. Herhaal deze stap 5x.
    8. Plaats de buis met 500 μL eluaat gedurende 5 minuten op een magnetisch rek en breng deze vervolgens over naar een nieuwe buis van 1.5 ml om ervoor te zorgen dat de kralen volledig worden verwijderd. De geëlueerde monsters kunnen vervolgens worden gedroogd en gebruikt voor massaspectrometrie-analyse.
    9. Voor meer informatie over LC-MS/MS-analyse van verrijkte peptidemonsters en MS-gegevensverwerking, zie Nguyen et al.20.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voorbeeldoutputs zijn weergegeven in Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4 werden eerder gepubliceerd door Nguyen et al.20. Figuur 1 illustreert de experimentele procedure van op TurboID gebaseerde PL in de eierstok van Drosophila. Eerst werd een construct gegenereerd dat Zu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier bieden we een uitgebreide procedure voor op TurboID gebaseerde nabijheidslabeling (PL) in de Drosophila-eierstok , ontwikkeld door uitgebreide probleemoplossing om verschillende uitdagingen te overwinnen. Een belangrijk probleem betrof genetische constructen, aangezien verschillende fusielay-outs de eiwitexpressie en biotinyleringsefficiëntie aanzienlijk beïnvloedden. NES-V5-TurboID vertoonde bijvoorbeeld een zwakkere expressie en biotinylering in vergelijking met andere tr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

We danken de laboratoriumleden voor hun discussies en hulp. Dit werk werd ondersteund door de National Research Foundation (NRF), gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (RS-2024-00345327 tot ML; RS-2023-00219563 naar ML).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichamen
Goat anti-mouse IgG (H+L) secundair antilichaam, HRPInvitrogen31430Analytische kwaliteit, gevoelig voor licht
Goat anti-rabbit IgG (H+L) sterk cross-adsorbeerd secundair antilichaam, alexa fluor plus 488InvitrogenA32731Analytische kwaliteit, gevoelig voor licht
Goat anti-rabbit IgG (H+L) secundair antilichaam, HRPInvitrogen31460Analytische kwaliteit, gevoelig voor licht
HSP90 antilichaam (konijn)Cell Signaling Technology4874Polyklonaal antilichaam
Pierce Streptavidin-eiwit, HRPThermo Fisher Scientific21126Analytische kwaliteit
Streptavidin, Alexa Fluor 594-conjugaatInvitrogenS11227Gevoelig voor licht, analytische kwaliteit
V5-tag antilichaam (muis)InvitrogenR960-25Monoklonaal antilichaam
V5-tag antilichaam (konijn) (D3H8Q)Cell Signaling Technology13202Monoklonaal antilichaam
VlieglijnenBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen/Beschrijving
pUASp Tom20 V5-TurboID/TM3Korea Drosophila Stock Center2373-2Vliegvoorraad
pUASp Zucchini V5-TurboID/CyoKorea Drosophila Stock Center2188Vliegvoorraad
pUASP_attB_V5-TurboID-NES/CyoKorea Drosophila Stock Center2635-4Vliegvoorraad
w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington Drosophila Stock Center7062Vliegvoorraad
Apparatuur en verbruiksartikelenBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen/Beschrijving
Analytische weegschaalMettler ToledoME2040,1 mg afleesbaarheid
Amersham Protran 0,45 NC nitrocellulose western blotting membranen (300 mm × 4 m)Cytiva10600002-
Axygen 1,7 mL MaxyClear Snaplock MicrocentrifugebuisCorningMCT-175-CCo-polymeer
BRAND Dekglas (22 mm x 22 mm)Sigma-AldrichBR470055Boroxisilicate glas
Bulk Pipette Tips (10 µL)Vertex4110N00Propyleen
Bulk Pipette Tips (1000 µL)Vertex4330N00Propyleen
Bulk Pipette Tips (200 µL)Vertex4230N00Propyleen
Celcultuurplaat (96-well)SPL300096Polystyreen, vlakbodemtype
Centrifuge (met 1,5-2 mL buisformaat rotor)Eppendorf5424 RVaste hoek, gekoeld
Centrifuge (met 5 mL buisformaat rotor)Eppendorf5425 RVaste hoek, gekoeld
Chemische lepel--Roestvrij staal
ChemiDoc BeeldvormingssysteemBiorad12003153Western blot beeldvormingssysteem
CO2 vliegpad--Anesthesiegebruik
CO2 tank & regelaar--Opgelet voor hogedrukgas & duizeligheid
Compacte incubatorJSRJSGI-10TOpgelet voor hoge temperatuur
Confocale laserscanningmicroscoopZeissLSM 710Opgelet voor intense laserstraal
Conische buis (15 mL)SPL50015Polypropyleen / Hoge dichtheidspolyethyleen 
Conische buis (50 mL)SPL50050Polypropyleen / Hoge dichtheidspolyethyleen 
Digitale weegschaal---
Digitale timer---
Dissectiebak--Silicium
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools11252-00Superfijne uiteinden, opgelet voor scherp object
DynaMag-2 magneetInvitrogen12321DVoor 1,5-2 mL formaat microcentrifugebuizen
Fisherbrand Superfrost Plus microscoopglazen (25 mm x 75 mm)Fisher Scientific12-550-15Opgelet voor scherp object
Vliegvoedselflessen (met papieren plug)Hansol TechFFB-21010-
Vliegvoedselbuisjes (met katoenen dop)Hansol TechFFV-11010-
Gefocuste ultrasoonapparaatCovarisM220Opgelet voor ultrasoongolf
GelmesInvitrogenEI9010Roestvrij staal met plastic handvat
Grade 3MM Chr blotting papier (46 cm × 57 cm)Cytiva3030-917Whatmann papier
Handhouder homogenisator en kunststof stamperKimble749540-0000Snoerloze motor
Heat blockFine PCRALB6400Opgelet voor hoge temperatuur
Lintvrij weefselYuhan-Kimberly41112-
Vloeibare stikstof--Opgelet voor bevriezing en brandwond
Microplate spectrofotometerAgilent TechnologiesEpochMonochromator-gebaseerde optiek
Microgolfoven--Opgelet voor hoge temperatuur
milliTUBE 1 mL AFA vezelCovarisPN 520135Glas
Mini gel tankThermo Fisher ScientificA25977Opgelet voor hoge temperatuur
NuPAGE Bis-tris mini-eiwitgels, 4–12%, 1

Referenties

  1. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).
  2. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by turboid. eLife. 8, e47864(2019).
  3. Qi, Y., Katagiri, F. Purification of low-abundance Arabidopsis plasma-membrane protein complexes and identification of candidate components. Plant J. 57 (5), 932-944 (2009).
  4. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with turboid. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  5. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  6. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  7. Quantitative Proteomics. , https://case.edu/medicine/nutrition/centers-and-collaborations/case-center-proteomics-and-bioinformatics/proteomics-and-small-molecule-mass-spectrometry-core/quantitative-proteomics (2025).
  8. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Meth. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  9. Ummethum, H., Hamperl, S. Proximity labeling techniques to study chromatin. Front Genet. 11, 450(2020).
  10. Han, S., Li, J., Ting, A. Y. Proximity labeling: Spatially resolved proteomic mapping for neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 50, 17-23 (2018).
  11. Nishimasu, H., et al. Structure and function of zucchini endoribonuclease in pirna biogenesis. Nature. 491 (7423), 284-287 (2012).
  12. Zamudio, N., et al. DNA methylation restrains transposons from adopting a chromatin signature permissive for meiotic recombination. Genes Dev. 29 (12), 1256-1270 (2015).
  13. Cha, S. J., et al. Therapeutic modulation of gsto activity rescues fus-associated neurotoxicity via deglutathionylation in als disease models. Dev Cell. 57 (6), 783-798.e8 (2022).
  14. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing Drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. J Undergrad Neurosci Educ. 11 (1), A139-A148 (2012).
  15. Feizy, N., et al. In vivo identification of Drosophila rhodopsin interaction partners by biotin proximity labeling. Sci Rep. 14 (1), 1986(1986).
  16. Zhang, B., Zhang, Y., Liu, J. L. Highly effective proximate labeling in Drosophila. G3. 11 (5), jkab077(2021).
  17. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  18. Waring, G. L. Morphogenesis of the eggshells in Drosophila. Int Rev Cytol. 198, 67-108 (2000).
  19. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), e3679(2012).
  20. Nguyen, T. T. M., et al. In vivo profiling of the zucchini proximal proteome in the Drosophila ovary. Development. 150 (4), dev201220(2023).
  21. Ahmadi, S., Winter, D. Identification of poly(ethylene glycol) and poly(ethylene glycol)-based detergents using peptide search engines. Anal Chem. 90 (11), 6594-6600 (2018).
  22. Zada, A., Khan, I., Zhang, M., Cheng, Y., Hu, X. Airid-based proximity labeling for protein-protein interaction in plants. J Vis Exp. (187), e64428(2022).
  23. Fang, B., et al. Lowering sample requirements to study tyrosine kinase signaling using phosphoproteomics with the tmt calibrator approach. Proteomics. 20 (24), 2000116(2020).
  24. Park, N., et al. One-stage tip method for tmt-based proteomic analysis of a minimal amount of cells. ACS Omega. 8 (22), 19741-19751 (2023).
  25. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. J Vis Exp. (159), e60728(2020).
  26. Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Res. 8, Faculty Rev-135 F1000(2019).
  27. Wei, X. F., Li, S., Hu, J. L. A turboid-based proximity labelling approach for identifying the DNA-binding proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102139(2023).
  28. Bosch, J. A., Chen, C. L., Perrimon, N. Proximity-dependent labeling methods for proteomic profiling in living cells: An update. WIREs Dev Biol. 10 (1), e392(2021).
  29. Rayaprolu, S., et al. Cell type-specific biotin labeling in vivo resolves regional neuronal and astrocyte proteomic differences in mouse brain. Nat Commun. 13, 2927(2022).
  30. Uckun, E., et al. In vivo profiling of the alk proximitome in the developing Drosophila brain. J Mol Biol. 433 (23), 167282(2021).
  31. Xiong, Z., et al. In vivo proteomic mapping through gfp-directed proximity-dependent biotin labelling in zebrafish. Elife. 10, e64631(2021).
  32. Holzer, E., Rumpf-Kienzl, C., Falk, S., Dammermann, A. A modified turboid approach identifies tissue-specific centriolar components in C. elegans. PLoS Genet. 18 (4), e1010150(2022).
  33. Artan, M., et al. Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling. J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).
  34. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity. Nat Comm. 10 (1), 3252(2019).
  35. Baumgartner, L., et al. The Drosophila zad zinc finger protein kipferl guides rhino to pirna clusters. eLife. 11, e80067(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

TurboID nabijheidslabelingmapping van eiwitinteractiesgebiotinyleerde peptidenmassaspectrometriekiemcelleneiwitvouwingmembraanorganisatievesikeltransportconfocale beeldvorming
In vivo Toepassing van op TurboID gebaseerde nabijheidsetikettering in Drosophila melanogaster
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.