Isolatie en kweek van primaire cholangiocyten van muizen met polycysteuze leverziekte met behulp van een tweestaps spijsverteringsmethode

Rongjie Ji; Bo Qing; Jiayuan Chen; Zhigang Zhao; Lirong Zhang

doi:10.3791/68202

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en kweek van primaire cholangiocyten van muizen met polycysteuze leverziekte met behulp van een tweestaps spijsverteringsmethode

970 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68202

⸱

16 mei 2025

Rongjie Ji¹ , Bo Qing² , Jiayuan Chen² , Zhigang Zhao¹ , Lirong Zhang²

¹Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, ²The Province and Ministry Co-sponsored Collaborative Innovation Center for Medical Epigenetics, Key Laboratory of Immune Microenvironment and Disease (Ministry of Education), State Key Laboratory of Experimental Hematology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde tweestaps spijsverteringsmethode voor het isoleren van primaire cholangiocyten met een hoge zuiverheid en hoge levensvatbaarheid van wildtype muizen en muizen met polycysteuze leverziekte.

Samenvatting

In dit protocol hebben we een tweestaps spijsverteringsmethode geoptimaliseerd om primaire cholangiocyten met een hoge zuiverheid en hoge levensvatbaarheid te isoleren van wildtype muizen en muizen met polycysteuze leverziekte (PLD). Na verdoving van de muizen werden de levers door de inferieure vena cava geperfundeerd met 50 ml oplossing A, gevolgd door 30 ml oplossing B bij 37 °C om het leverweefsel enzymatisch te verteren. Mechanische dissociatie, schudden en microdissectie werden uitgevoerd om aanhangende parenchymale cellen te verwijderen, waardoor een intacte galboom overbleef. De galboom werd vervolgens fijngehakt en verteerd door 60 minuten te schudden bij 37 °C. De resulterende eencellige suspensie werd verzameld met behulp van een celzeef van 70 μm. Cholangiocyten werden gezuiverd met behulp van immunomagnetische isolatie. De celsuspensie werd geïncubeerd met een anti-EpCAM-antilichaam onder rotatie gedurende 45 minuten bij 4 °C, gevolgd door de toevoeging van eiwit-G-korrels en verdere rotatie gedurende nog eens 45 minuten bij 4 °C. Na drie wasbeurten met PBS werden de cholangiocyten verzameld met behulp van een magnetische scheider. De gezuiverde primaire cholangiocyten werden geresuspendeerd in cholangiocytenkweekmedium en gezaaid op celkweekschalen bedekt met 1 mg/ml type I rattenstaartcollageen. De zuiverheid van de cholangiocyten werd bevestigd door immunokleuring voor de cholangiocyt-specifieke marker cytokeratine-19 (CK19). Hoewel deze studie zich richtte op het isoleren van primaire cholangiocyten uit wildtype en PLD-muizen, zijn we ervan overtuigd dat het protocol ook kan worden toegepast op andere muismodellen van de ziekte. Deze gedetailleerde tweestaps spijsverteringsmethode vergemakkelijkt in vitro studies van cholangiopathieën en de ontwikkeling van gerichte therapieën.

Inleiding

Cholangiocyten, de epitheelcellen die de intrahepatische galboom bekleden, vormen een monolaag en vormen ongeveer 3-5% van de totale celpopulatie van de lever¹. Deze cellen verbinden zich in de lever met elkaar om een complex driedimensionaal ductaal netwerk te creëren². Onder normale omstandigheden vervullen cholangiocyten vitale functies, waaronder secretie, absorptie, herstel van verwondingen en dienen ze als immuunbarrière, waardoor ze een cruciale rol spelen in de leverfysiologie en pathologie. Disfunctie van cholangiocyten kan echter leiden tot verschillende ziekten, waaronder PLZ,....