Isolatie en kweek van primaire cholangiocyten van muizen met polycysteuze leverziekte met behulp van een tweestaps spijsverteringsmethode

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde tweestaps spijsverteringsmethode voor het isoleren van primaire cholangiocyten met een hoge zuiverheid en hoge levensvatbaarheid van wildtype muizen en muizen met polycysteuze leverziekte.

Samenvatting

In dit protocol hebben we een tweestaps spijsverteringsmethode geoptimaliseerd om primaire cholangiocyten met een hoge zuiverheid en hoge levensvatbaarheid te isoleren van wildtype muizen en muizen met polycysteuze leverziekte (PLD). Na verdoving van de muizen werden de levers door de inferieure vena cava geperfundeerd met 50 ml oplossing A, gevolgd door 30 ml oplossing B bij 37 °C om het leverweefsel enzymatisch te verteren. Mechanische dissociatie, schudden en microdissectie werden uitgevoerd om aanhangende parenchymale cellen te verwijderen, waardoor een intacte galboom overbleef. De galboom werd vervolgens fijngehakt en verteerd door 60 minuten te schudden bij 37 °C. De resulterende eencellige suspensie werd verzameld met behulp van een celzeef van 70 μm. Cholangiocyten werden gezuiverd met behulp van immunomagnetische isolatie. De celsuspensie werd geïncubeerd met een anti-EpCAM-antilichaam onder rotatie gedurende 45 minuten bij 4 °C, gevolgd door de toevoeging van eiwit-G-korrels en verdere rotatie gedurende nog eens 45 minuten bij 4 °C. Na drie wasbeurten met PBS werden de cholangiocyten verzameld met behulp van een magnetische scheider. De gezuiverde primaire cholangiocyten werden geresuspendeerd in cholangiocytenkweekmedium en gezaaid op celkweekschalen bedekt met 1 mg/ml type I rattenstaartcollageen. De zuiverheid van de cholangiocyten werd bevestigd door immunokleuring voor de cholangiocyt-specifieke marker cytokeratine-19 (CK19). Hoewel deze studie zich richtte op het isoleren van primaire cholangiocyten uit wildtype en PLD-muizen, zijn we ervan overtuigd dat het protocol ook kan worden toegepast op andere muismodellen van de ziekte. Deze gedetailleerde tweestaps spijsverteringsmethode vergemakkelijkt in vitro studies van cholangiopathieën en de ontwikkeling van gerichte therapieën.

Inleiding

Cholangiocyten, de epitheelcellen die de intrahepatische galboom bekleden, vormen een monolaag en vormen ongeveer 3-5% van de totale celpopulatie van de lever¹. Deze cellen verbinden zich in de lever met elkaar om een complex driedimensionaal ductaal netwerk te creëren². Onder normale omstandigheden vervullen cholangiocyten vitale functies, waaronder secretie, absorptie, herstel van verwondingen en dienen ze als immuunbarrière, waardoor ze een cruciale rol spelen in de leverfysiologie en pathologie. Disfunctie van cholangiocyten kan echter leiden tot verschillende ziekten, waaronder PLZ, primaire scleroserende cholangitis, cholangiocarcinoom en cholestatische leverbeschadiging ^3,4,5.

Onder de aan cholangiopathie gerelateerde ziekten onderscheidt PLD zich als een erfelijke aandoening die wordt gekenmerkt door de vorming van talrijke met vloeistof gevulde cysten afkomstig van cholangiocyten. De progressieve vergroting van deze cysten vermindert de kwaliteit van leven van patiënten aanzienlijk⁶. De huidige behandelingsopties voor PLD blijven ontoereikend en bieden een beperkte werkzaamheid, terwijl ze vaak gepaard gaan met hoge recidiefpercentages en complicaties⁷. Dit benadrukt de dringende noodzaak om veilige en effectieve therapeutische strategieën te ontwikkelen om tegemoet te komen aan de onvervulde klinische eisen bij de behandeling van gepegyleerd liposoom.

Onderzoek naar de mechanismen van cholangiopathieën, waaronder PLZ, is aanzienlijk belemmerd door het gebrek aan geschikte cellijnen. Om deze beperking aan te pakken, is het gebruik van muismodellen en de isolatie van primaire cholangiocyten uit deze modellen voor in vitro experimenten van onschatbare waarde gebleken voor het blootleggen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan cholangiopathieën en het identificeren van mogelijke therapeutische strategieën.

In onze recente studie⁸ hebben we met succes een PLD-muismodel opgesteld met behulp van Pkd1 conditionele knock-out (KO) muizen. Levercysten werden al 1 maand na deletie van Pkd1 waargenomen en namen in de loop van de tijd geleidelijk in omvang toe. Hoewel protocollen voor het isoleren van cholangiocyten van ratten en mensen goed gedocumenteerd zijn ^9,10, blijft het isoleren van primaire cholangiocyten van muizen bijzonder uitdagend vanwege hun kleine formaat en de ingewikkelde architectuur van de poortader en het galsysteem. Bestaande methoden hebben te maken met aanzienlijke beperkingen, waaronder een lage celzuiverheid, slechte levensvatbaarheid, complexe procedures en hoge kosten^11,12.

Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol voor het isoleren van primaire cholangiocyten met een hoge zuiverheid uit muizen met behulp van een tweestaps spijsverteringsmethode. Deze geoptimaliseerde aanpak heeft tot doel in vitro-studies te ondersteunen, het onderzoek naar moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan cholangiopathieën te vergemakkelijken en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën te bevorderen.

Protocol

Alle muizenzorg en experimentele protocollen werden goedgekeurd door het ethisch comité van de Tianjin Medical University (doc. nr.: TMUa-MEC 2022016).

1. Voorbereiding van apparatuur en oplossingen

1. Steriliseer chirurgische instrumenten (scharen, tangen en scalpelhandvatten) door ten minste 1 dag voor celisolatie te autoclaveren.
2. Bereid ten minste 1 dag vóór de celisolatie het cholangiocytkweekmedium voor met behulp van de in tabel 1 vermelde reagentia. Steriliseer het cholangiocytenkweekmedium door het door een filter van 0,22 μm te filteren.
3. Bereid ten minste 1 dag voorafgaand aan de celisolatie Oplossing A en Oplossing B met behulp van de reagentia vermeld in Tabel 2 voor leverperfusie bij muizen. Steriliseer Oplossing A en Oplossing B door te autoclaveren of te filtreren door een filter van 0,22 μm en stel de pH in op 7,35 met behulp van steriel NaOH onder voorzichtig roeren.
   OPMERKING: Cholangiocyte Culture Medium, Oplossing A en Oplossing B kunnen minimaal een maand bij 4°C worden bewaard.
4. Voordat u met het experiment begint, voegt u collagenase II-poeder toe aan oplossing B en mengt u voorzichtig om een eindconcentratie van 0,5 mg/ml te bereiken. Verwarm zowel Oplossing A als Oplossing B voor gebruik voor in een waterbad van 37 °C.
5. Bereid direct voor aanvang van het experiment schaaltjes van 6 cm gevuld met steriele PBS en plaats ze op ijs om ze tijdens de procedure koud te houden.

2. Perfusie van de vertering van leverweefsel

1. Verdoof de muis met een overdosis isofluraaninhalatie. Plaats de verdoofde muis in rugligging en zet hem vast met plakband om de procedure te vergemakkelijken.
2. Open de buikholte van de muis na het steriliseren van de buik met 75% ethanol en leg vervolgens een schuifknoop rond de inferieure vena cava met behulp van een swaged naald. Spoel een intraveneuze katheter van 24 g met oplossing A met behulp van een spuit van 20 ml.
3. Breng de intraveneuze katheter in de inferieure vena cava onder de schuifknoop in, zet de schuifknoop vast en bevestig de katheter op zijn plaats met plakband.
4. Doordrenk de lever met 50 ml oplossing A door de inferieure vena cava met behulp van een spuit van 20 ml en snijd in de leverpoortader om de perfusieoplossing af te tappen. Houd de perfusiesnelheid op 10 ml/min.
5. Ga door met de perfusie met 30 ml oplossing B met collagenase II bij een debiet van 3,5 ml/min met behulp van een peristaltische pomp.
   OPMERKING: Deze stap is bedoeld voor de vertering van leverweefsel.
6. Verwijder het succesvol geperfundeerde leverweefsel en plaats het in een schaal van 6 cm gevuld met koude steriele PBS.

3. Isolatie van cholangiocyten

OPMERKING: Aangezien het aantal cholangiocyten bij normale muizen relatief laag is, wordt aanbevolen om voor de procedure een groep van 2-6 muizen te gebruiken. Voor muisziektemodellen met abnormale proliferatie van cholangiocyten, zoals PLD, zijn de cholangiocyten van een enkele muis echter voldoende. Tenzij anders aangegeven, moeten monsters en reagentia altijd op ijs worden bewaard en moeten alle procedures worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.

1. Dissocieer en schud het leverweefsel mechanisch met behulp van een gebogen tang. Voer vervolgens microdissectie uit onder een ontleedmicroscoop om aanhangende parenchymale cellen te verwijderen, zodat er een intacte galboom overblijft. Verwijder het galblaasweefsel voordat u doorgaat naar de volgende stap.
   Was de tissue 2x met PBS.
2. Hak de galboom fijn met een chirurgisch mesje en verteer deze in 3 ml digestieoplossing (tabel 3) per muis door te schudden (90 rpm) bij 37 °C gedurende 60 min. Piketeer het mengsel na 30 minuten voorzichtig met een pipetpunt om goed te mengen.
   OPMERKING: De spijsverteringsoplossing moet voor gebruik vers worden bereid.
3. Leid de celsuspensie door een celzeef van 70 μm. Gebruik de zuiger van een spuit van 5 ml of 10 ml om de celsuspensie voorzichtig door de zeef te drukken. Was de zeef met PBS.
4. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Was de cellen 3x met RPMI medium.
5. Centrifugeer opnieuw bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
6. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in 900 μl RPMI-medium dat 40 E/ml DNase I bevat. Voeg 2 μg anti-EpCAM-antilichaam toe en incubeer de suspensie op een rotator (20 rpm) bij 4 °C gedurende 45 min.
7. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
8. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen in 1 ml RPMI-medium met 40 E/ml DNase I. Was de eiwit-G-korrels voor met 1 ml RPMI-medium. Voeg 20 μL proteïne G-korrels toe aan de celsuspensie en incubeer met rotatie (20 rpm) bij 4 °C gedurende nog eens 45 minuten.
   OPMERKING: Het anti-EpCAM-antilichaam kan ook worden voorgeïncubeerd met Protein G-kralen om een kralen-antilichaamcomplex te creëren voordat de celsuspensie wordt geïntroduceerd.
9. Was de cellen 3x met PBS met behulp van een magnetische scheider.
10. Voer celtelling en cellevensvatbaarheidsbeoordeling uit met behulp van Trypan Blue-kleuring (0,04%, 3 min) op een hemocytometer.
    OPMERKING: Het is niet nodig om de kralen van de cholangiocyten te verwijderen, ze zullen op natuurlijke wijze loskomen zodra de kweek begint en zullen de celcultuur niet verstoren.

4. Cholangiocyten cultuur

OPMERKING: Bereid verse type I met rattenstaart collageen beklede celkweekschalen voor voorafgaand aan de cholangiocytenkweek. Koel alle reagentia voor op ijs.

1. Volg de instructies van de fabrikant en meng steriel ddH₂O, 10x PBS, 1 N NaOH en type I rattenstaartcollageen om een eindconcentratie van 1 mg/ml type I rattenstaartcollageen in 1x PBS te bereiken. Smeer de celkweekschaaltjes gelijkmatig in met het mengsel en plaats de schaaltjes in een incubator bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 30 minuten om het collageen te laten stollen.
2. Was de type I met rattenstaartcollageen beklede celkweekschaaltjes met voorverwarmde PBS.
3. Resuspendeer de cholangiocyten in het voorverwarmde cholangiocytkweekmedium. Zaai de celsuspensie op 1 mg/ml type I type I met rattenstaartcollageen beklede celkweekschaaltjes en incubeer bij 37 °C met 5% CO₂. Vervang het medium elke 2 dagen.

5. Passeren en cryopreservatie van cholangiocyten

1. Was cholangiocyten twee keer met PBS en incubeer de cellen vervolgens in 0,25% trypsine bij 37 °C gedurende 5-10 minuten.
2. Voeg een gelijk volume cholangiocyten Culture Medium toe om de trypsine te neutraliseren en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 500 x g .
3. Bereid type I met rattenstaart collageen beklede celkweekschaaltjes zoals beschreven in stap 4.1.
4. Volg stap 4.2 en 4.3.
5. Als cryopreservatie nodig is, suspendeer de cholangiocyten dan opnieuw in opslagmedium (9:1 FBS: DMSO) en bewaar ze in een vriezer van -80 °C of vloeibare stikstof. Ontdooi de cellen indien nodig voor toekomstig gebruik.

6. Validatie van cholangiocyten

OPMERKING: De zuiverheid van cholangiocyten werd beoordeeld door kleuring op cholangiocytmarker CK19.

1. Was de cholangiocyten 2x met PBS en fixeer de cellen vervolgens gedurende 15 minuten in 4% paraformaldehyde.
2. Was de cholangiocyten met PBS en permeabiliseer de cellen vervolgens met 1% Triton X-100 gedurende 8 minuten.
3. Was de cholangiocyten met PBS en blokkeer vervolgens de cellen in 5% BSA gedurende 1 uur.
4. Was de cholangiocyten met PBS en incubeer de cellen vervolgens een nacht bij 4 °C met het primaire antilichaam tegen CK19 (verdunning 1:12 met 2% BSA).
5. Was de cholangiocyten 2x met PBS en incubeer de cellen vervolgens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met ezel-anti-rat Alexa Fluor 488 secundair antilichaam (verdunning 1:1.000 met PBS).
6. Was de cholangiocyten met PBS, kleur ze gedurende 15 minuten met 4',6-diamidino-2-fenylindool en observeer ze onder een microscoop.

Resultaten

Het workflowdiagram voor het tweestapsverteringsproces dat wordt gebruikt om cholangiocyten te isoleren, wordt weergegeven in figuur 1. De hele procedure duurt ~5 uur. Eerst wordt de lever geperfundeerd met oplossing A via de inferieure vena cava om bloed te verwijderen, zoals blijkt uit het bleek worden van de lever. De lever wordt vervolgens geperfundeerd met oplossing B die collagenase II bevat om de weefselvertering op ga...

Discussie

Dit protocol biedt een gedetailleerde methode voor het isoleren van primaire cholangiocyten met een hoge zuiverheid van muizen met behulp van een verteringsproces in twee stappen, waardoor de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan cholangiopathieën kunnen worden bestudeerd. Verschillende cruciale stappen zijn essentieel om de succesvolle isolatie van cholangiocyten te garanderen.

De eerste cruciale stap is het zorgen voor een effectieve perfusie ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 μm filter	PALL	4612
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056
10 mL syringe	KONSMED	10 mL 1.2*30TWLB
20 mL syringe	KONSMED	20 mL 1.2*30TWLB
24 G intravenous catheter	WEGO	24GX19  mm/Y-G
3,3',5-triiodo-L-thyronine	Sigma	T5516	1.7 mg/mL stock
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
5 mL syringe	KONSMED	5 mL 0.7*30TWLB
6 cm dishes	Thermo Scientific	150462
70 µm cell strainer	Corning	352350
anti-CK19 antibody	DSHB	TROMA-III
anti-EpCAM antibody	DSHB	G8.8
BSA	Solarbio	A8020
CaCl2	Sangon Biotech	A501330	2 M stock
Chemically-defined lipid concentrate (100x)	Gibco	11905-031
Collagenase II	Worthington	LS004176
Collagenase XI	Sigma	C7657	3.2 mg/mL stock
Dexamethasone	Sigma	D1756	10 mg/mL stock
Dissecting Microscope	Leica	EZ4
DMEM/F12 (1:1)	VivaCell biosciences	C3130-0500
DMSO	Sigma	D2650
DNase I	Sigma	D4513	10 U/μL stock
Donkey anti-rat Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21208
EGTA	Solarbio	E8050	50 mM (PH = 8) stock
Epidermal growth factor (1 mg/mL)	Sigma	SRP3196
Ethanolamine	Sigma	E9508
Fetal Bovine Serum	VivaCell biosciences	C04001-500
Forskolin	Sigma	F3917	20 mM stock
Gentamicin/amphotericin solution (500x)	Gibco	R01510
Hemocytometer	QIUJING	XB.K.25.
HEPES	Sigma	H4034
Hyaluronidase	Sigma	H3506	10 mg/mL stock
Insulin-transferrin-selenium (100x)	Gibco	41400045
Isoflurane	RWD	R510-22-10
KCl	Sangon Biotech	A100395
L-Glutamine (200 mM)	Sigma	G7513
Magnetic separator	Promega	Z5342
MEM non-essential amino acids (100x)	Gibco	11140050
MEM vitamin solution (100x)	Gibco	11120052
MgCl2	Sangon Biotech	A100288	1.5 M stock
Na Pyruvate  (100 mM)	Gibco	11360070
Na2HPO4	Sangon Biotech	A600487
NaCl	Sangon Biotech	A610476
NaOH	Sangon Biotech	A620617	1 N stock
PBS	VivaCell biosciences	C3580-0500
PBS	Solarbio	P1010
Penicillin-Streptomycin (100x)	Gibco	15140-122
Peristaltic pump	BaodingRongbai	YZ1515PPS
Protein G beads	Invitrogen	10004D
Rotator	Kylin-Bell	QB-528
RPMI	VivaCell biosciences	C3010-0500
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T6522	10 mg/mL stock
Swaged needle	Jinhuan Medical	HM601
Triton X-100	Solarbio	T8200
Trypan blue	Sigma	T6146	10 mg/mL stock
Type I rat tail collagen	BD	354236