Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van longretinoïde-bevattende cellen door celsortering

849 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68205

⸱

11 april 2025

 ,  , 
1Department of Animal Sciences, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Undergraduate Program in Biochemistry, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers, The State University of New Jersey, 3Rutgers Center for Lipid Research, 4Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease

In dit artikel

Samenvatting

Het hieronder beschreven protocol is een eenvoudige en effectieve manier om retinoïde-bevattende cellen te isoleren uit zeer heterogene longcelpopulaties door gebruik te maken van specifieke retinoïde autofluorescentie en door gebruik te maken van fluorescerend-geactiveerde celsortering.

Samenvatting

Retinoïden (vitamine A en zijn metabolieten) zijn een essentieel lipidebestanddeel van de alveolaire micro-omgeving en een celtypespecifiek retinoïdemetabolisme is vereist om de functionele gezondheid van de zich ontwikkelende en volwassen longen te behouden. Longcellen maken gebruik van specifieke routes, waardoor circulerende retinoïden efficiënt uit het bloed kunnen worden opgenomen als retinol (ROH), gevolgd door intracellulaire stapsgewijze omzetting van ROH in de transcriptioneel actieve retinoïdesoorten, all-trans-retinoïnezuur (ATRA). ATRA-gemedieerde (of retinoïde-gemedieerde) signalering is cruciaal voor het reguleren van longalveolarisatie, productie van oppervlakteactieve stoffen, angiogenese, permeabiliteit en immuniteit. Belangrijk is dat specifieke longcellen, waaronder fibroblasten, retinoïden kunnen accumuleren in de vorm van retinylesters (RE), die kunnen worden opgeslagen of verder kunnen worden gemobiliseerd als ROH voor overdracht naar de naburige cellen wanneer dat nodig is. Longretinoïde-bevattende cellen kunnen worden geïsoleerd en verzameld uit de eencellige suspensie van verteerde longen door gebruik te maken van retinoïde autofluorescentie (de emissie bij 455 nm bij excitatie bij 350 nm) en door gebruik te maken van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Aanvullende celspecifieke in vivo labeling van longcellen met rood fluorescerend eiwit maakt het mogelijk om specifieke retinoïde-bevattende longcelpopulaties te isoleren en te verzamelen. De verzamelde cellen kunnen direct worden geanalyseerd of gekweekt voor verdere analyses van celmorfologie, genexpressie en respons op farmacologische manipulaties. Deze techniek van isolatie en toepassing is belangrijk voor diermodelstudies van longgezondheid en longbeschadiging om een dieper inzicht te krijgen in cellulaire aspecten van het retinoïde metabolisme in de longen en lipide-gemedieerde cellulaire communicatie.

Inleiding

Retinoïden (vitamine A en zijn metabolieten) zijn een essentiële lipidecomponent van de alveolaire micro-omgeving, en celtypespecifiek retinoïdemetabolisme en signalering zijn nodig om de functionele gezondheid van de zich ontwikkelende en volwassen longte behouden 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14. Longcellen maken gebruik van specifieke routes, waardoor circulerende retinoïden uit het bloed efficiënt kunnen worden opgenomen als retinol (ROH)15,16,17,18,19, gevolgd door intracellulaire stapsgewijze omzetting van ROH in de transcriptioneel actieve retinoïde soort, all-trans-retinoïnezuur (ATRA)20. ATRA-gemedieerde (of retinoïde-gemedieerde) signalering wordt bereikt door ATRA-interactie met zijn drie verschillende verwante nucleaire hormoonreceptoren, retinoïnezuurreceptoren (RARα, RARβ en RARγ21,22), en is cruciaal voor het reguleren van longalveolarisatie 23,24,25,26,27,28,29, productie van oppervlakteactieve stoffen30,31,32,33,34,35, angiogenese36, permeabiliteit37 en immuniteit 38,39,40. Belangrijk is dat specifieke longcellen, vooral longfibroblasten, retinoïden kunnen accumuleren in de vorm van retinylesters (RE), die kunnen worden opgeslagen of verder kunnen worden gemobiliseerd als ROH voor overdracht naar de naburige cellen wanneer dat nodig is1.

De complexiteit van het retinoïde metabolisme en de signalering, evenals de cellulaire complexiteit van de long, maken studies gericht op het onderzoeken van het retinoïde metabolisme in de long in vivo uitdagend. We hebben een eenvoudig en robuust protocol geschetst voor het isoleren van retinoïde-bevattende cellen (Figuur 1) uit zeer heterogene longcelpopulaties door gebruik te maken van specifieke retinoïde autofluorescentie (de emissie bij 455 nm bij excitatie bij 350 nm) en door gebruik te maken van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Het protocol vereist geen aanvullende cellabeling, behalve voor levensvatbaarheidskleuring als het doel van het onderzoek is om primaire levende longcellen te isoleren en te karakteriseren op basis van hun vermogen om retinoïden op te slaan. Dit verkort de voorbereidingstijd voor het sorteren van cellen aanzienlijk, elimineert de noodzaak van extra kleuring en maakt het mogelijk om hoge opbrengsten van levensvatbare primaire cellen te isoleren. Als het doel van het onderzoek echter is om specifieke longcelpopulaties (fibroblasten, endotheel-, epitheel- of immuuncellen) te isoleren en te karakteriseren, kan aanvullende celsortering worden uitgevoerd na het labelen van de gesorteerde retinoïde-bevattende cellen met celspecifieke antilichamen.

Retinoïde autofluorescentie is in gepubliceerde onderzoeken gebruikt om de identiteit van retinoïde-bevattende cellen vast te stellen en/of om de overvloed van deze cellen in de lever 41,42,43,44, pancreas 45,46, nieren41,47 en long41 te kwantificeren. Bovendien rapporteerden verschillende onderzoeksgroepen het gebruik van retinoïdefluorescentie om te isoleren door FACS en primaire retinoïde-bevattende cellen te bestuderen uit levende weefsels, waaronder lever 44,48,49,50,51,52,53 en long 1. In het huidige protocol laten we zien hoe specifieke celpopulaties in vivo kunnen worden gelabeld voordat retinoïde-bevattende cellen worden geïsoleerd met behulp van tdTomato (rood fluorescerend eiwit). De spectrale kenmerken van tdTomato (de emissie bij 581 nm bij excitatie bij 554 nm54) en helderheid interfereren niet met de autofluorescentie van retinoïden en maken het daarom gemakkelijk om celspecificiteit te bereiken tijdens het sorteren. Gezien de cruciale rol van compromisloos retinoïdemetabolisme en signalering binnen de normale alveolaire micro-omgeving1, is de beschreven techniek van longcelisolatie een nuttig hulpmiddel in diermodelstudies van longgezondheid en ziekte om een dieper inzicht te krijgen in cellulaire aspecten van retinoïdemetabolisme in de longen en lipide-gemedieerde cellulaire communicatie in vivo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle beschreven procedures en experimenten met muizen werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Rutgers University (IACUC ID: PROTO202200111) volgens de criteria die zijn uiteengezet in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, opgesteld door de National Academy of Sciences55.

1. Overwegingen en voorbereidingen voor het experiment

  1. Veeteelt en manipulaties
    OPMERKING: Drie maanden oude (10-12 weken oude) mannelijke en vrouwelijke muizen kunnen in de onderzoeken worden gebruikt. Lecithine:retinol acyltransferase-deficiënte muizen (Lrat-deficiënt, Lrat-/- muizen56) op een C57BL/6J genetische achtergrond en op dezelfde leeftijd gematchte nestgenoten (wildtype, Lrat+/+ muizen) werden gebruikt in de beschreven experimenten. Muizen die het tdTomato-gen tot expressie brengen in fibroblasten (F-tdT-muizen) werden gegenereerd door muizen te kruisen met een tdTomato-reportercassette (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, Jackson Lab stam #007914) met Col1a2-CreER muizen (B6. Cg-Tg (Col1a2-Cre / ERT, -ALPP) 7Cpd / 2J, Jackson Lab stam # 029567).
    1. Gebruik het muismodel dat Cre tot expressie brengt, een van de vele beschikbare opties om de doelcelpopulatie in vivo te labelen.
      OPMERKING: Afhankelijk van de keuze van de doelcel, Cre-expressie, de efficiëntie van Cre-gemedieerde recombinatie en celspecificiteit, kunnen de onderzoekers elk betrouwbaar muismodel met Cre-expressie gebruiken.
    2. Gebruik tdTomato-transgenexpressie (bij behandeling met tamoxifen zoals hieronder beschreven) om Col1a2+ -fibroblasten te labelen, gevolgd door hun isolatie uit eencellige suspensies van de verteerde long, zoals hieronder beschreven.
  2. Cre-gemedieerde recombinatie en transgenactivering in vivo
    1. Induceer Cre-expressie bij F-tdT-muizen door middel van intraperitoneale (IP) injectie van 2 mg tamoxifen eenmaal per 24 uur gedurende in totaal 5 opeenvolgende dagen.
    2. Ontsmet de injectieplaats met 70% ethanol voorafgaand aan de injectie. Gebruik de muizen voor experimenten 1 maand na de laatste tamoxifen-injectie.
    3. Controleer de effectiviteit van Cre-recombinatie voorafgaand aan de sorteerexperimenten. Bevestig de effectieve Cre-recombinatie en tdTomato-expressie door de doelcelpopulatie van longfibroblasten te isoleren van de met tamoxifen behandelde F-tdT-muizen met behulp van anti-Pdgfrα magnetische kralen en magnetisch geactiveerde celsortering (MACS).
  3. Bereiding van oplossingen van kunststof en glaswerk
    OPMERKING: Aseptische technieken moeten worden gevolgd voor de hieronder beschreven procedures. De procedures met betrekking tot oplossingspreparaten, weefselvertering en celisolatie moeten onder de laminaire kap worden uitgevoerd. Oplossingen moeten worden gesteriliseerd door filtratie met behulp van een filter van 0,2 μm; Chirurgisch gereedschap en laboratoriumartikelen moeten worden gesteriliseerd door middel van autoclaveren.
    1. Bereid onder de laminaire kap Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), calcium- en magnesiumvrij (HBSS zonder Ca2+/Mg2+, bevattende 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 4,2 mM NaHCO3, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 5,6 mM D-Glucose) voor de longperfusie (5 ml per muis). Steriliseer de oplossing met behulp van een filter van 0,2 μm en vul de spuit met de oplossing.
    2. Bereid onder de laminaire kap Hanks' uitgebalanceerde zoutoplossing met calcium- en magnesium (HBSS met Ca2+/Mg2+, bevattende 1,3 mM CaCl2, 0,5 MgCl2·6H2O, 0,4 mM MgSO4·7H2O, 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 4,2 mM NaHCO3, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 5,6 mM D-Glucose), bevattende 0,3 mg/ml type IV collagenase en 1 mg/ml dispase voor de longperfusie (10 ml per muis). Steriliseer de oplossing met behulp van een filter van 0,2 μm en vul de spuit met de oplossing.
    3. Bereid HBSS onder de laminaire kap met Ca2+/Mg2+, met 0,3 mg/ml type IV collagenase, 1 mg/ml dispase en 5 mg/ml DNase I voor longspijsvertering (10 ml per muis). Steriliseer de oplossing met behulp van een filter van 0,2 μm en vul de spuit met de oplossing.
    4. Vul onder de laminaire kap een celkweekschaaltje (35 mm 10 mm, één schaaltje per verzamelde long van één muis) met 2 ml steriel HBSS met Ca2+/Mg2+. Zet de schaal(tjes) met HBSS met Ca2+/Mg2+ op ijs.

2. Longperfusie, spijsvertering en verzameling van eencellige suspensie

  1. Verdoof de muis door een anesthesiecocktail toe te dienen met 10 mg/ml ketamine en 2 mg/ml xylazine in een dosis van 0,01 ml/g lichaamsgewicht via IP-injectie.
  2. Zorg ervoor dat de muis zich in een diepe staat van bewusteloosheid bevindt door een teenknijpreactie te beoordelen. Verwijder het losse haar en zichtbaar vuil/puin van de operatieplaats, knip de operatieplaats vast en veeg deze schoon met 70% alcohol voor desinfectie.
  3. Open met steriel chirurgisch gereedschap de buik- en borstholte. Snijd de ribben en het middenrif door om de longen en het hart bloot te leggen.
    OPMERKING: Dit zorgt voor een onmiddellijke dood, aangezien de thoracotomie de ademhaling zal stoppen terwijl de muis onder narcose is; Indien correct uitgevoerd, duurt dit deel van de procedure tot 3 minuten vanaf het begin van de procedure tot de thoracotomie, gevolgd door de dood van het dier.
  4. Snijd de inferieure vena cava door en breng een absorberend kussentje aan om het vrijgekomen bloed op te nemen.
  5. Perfuseer de longen in situ via de rechterventrikel van het hart met behulp van een spuit van 10 ml met een naald van 25 G X 1" gevuld met 5 ml steriele HBSS zonder Ca2+/Mg2+. Als de perfusie succesvol is, wordt het longweefsel wit.
  6. Doordrenk de longen in situ met behulp van een spuit van 10 ml met een naald van 25 G X 1" gevuld met 10 ml steriele HBSS met Ca2+/Mg2+, bevattende type IV collagenase (0,3 mg/ml) en dispase (1 mg/ml).
  7. Verwijder de longen en breng ze over in een celkweekschaaltje (35 mm x 10 mm) met 2 ml steriele HBSS met Ca2+/Mg2+.
  8. Spoel onder de laminaire kap de longen en hak ze in kleine stukjes met behulp van een steriel chirurgisch mesje (#20, past op handvat #4). Breng de gehakte long over in een buisje van 15 ml door de eerste 5 ml HBSS met Ca2+/Mg2+ met 0,3 mg/ml type IV collagenase, 1 mg/ml dispase en 5 mg/ml DNase I toe te voegen aan het gehakte weefsel en dit over te brengen met behulp van een serologische pipet van 10 ml. Verzamel en breng de resterende gehakte weefselresiduen over door de celkweekschaal te wassen met de resterende 5 ml HBSS met Ca2+/Mg2+ met 0,3 mg/ml type IV collagenase, 1 mg/ml dispase en 5 mg/ml DNase I.
  9. Incubeer het gehakte longweefsel in HBSS met Ca2+/Mg2+ met 0,3 mg/ml type IV collagenase, 1 mg/ml dispase en 5 mg/ml DNase I op een roterende schudder die gedurende 45 minuten op 37 °C wordt gehouden. Op elk van de drie intervallen van 15 minuten, onder de laminaire kap, passeer het gehakte weefsel 10 keer door een serologische pipet van 10 ml om de cellen beter te dissociëren.
  10. Laat de resulterende celsuspensie door een zeef van 100 μm lopen om afzonderlijke cellen te verzamelen in een buis van 50 ml met 20 ml beeldvormingsoplossing met koude levende cellen (fysiologische zoutoplossing met 20 mM HEPES, pH 7,4) die minder dan 5% foetaal runderserum (FBS) bevat. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 500 g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  11. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de celpellet in 1 ml lyseringsbuffer voor rode bloedcellen en laat de buis 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) staan om erytrocyten te elimineren. Voeg 20 ml beeldvormingsoplossing voor koude levende cellen toe die minder dan 5% FBS bevat. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 500 g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  12. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de celpellet in 20 ml beeldvormingsoplossing met koude levende cellen die minder dan 5% FBS bevat. Laat de resulterende celsuspensie door een zeef van 40 μm lopen om afzonderlijke cellen te verzamelen in een buis van 50 ml met 20 ml beeldvormingsoplossing voor koude levende cellen die minder dan 5% FBS bevat. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 500 g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  13. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de celpellet in 10 ml beeldvormingsoplossing met koude levende cellen die minder dan 5% FBS bevat. Tel de cellen en pas de celconcentratie aan op ~5-10 x 106 cellen/ml.

3. Isolatie van retinoïde-bevattende longcellen met behulp van Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

  1. Neem een hoeveelheid celsuspensie en zet deze opzij om te worden gebruikt als een niet-gekleurde poortcontrole. Voeg de levensvatbare kleurstof SYTOX Green toe aan de resterende celsuspensie (verdunning 1:1000, eindconcentratie 30 nM).
  2. Leid de celsuspensies door het filter dat is bevestigd aan de polystyreen 5 ml (12 x 75 mm) opvangbuis.
  3. Ga verder met FACS-celisolatie door levende, individuele retinoïde-bevattende cellen te sorteren op basis van hun emissie bij 455 nm. Voer sequentiële singletdiscriminatie uit met behulp van een plot voor voorwaartse verstrooiing (voorwaartse verstrooiingshoogte/FSC-H versus voorwaarts verstrooiingsgebied/FSC-A). Sluit dode cellen uit op basis van verstrooiingskenmerken (zijverstrooiing) en kleuring met SYTOX Green.
  4. Poort, sorteer en verzamel enkele, levende, retinoïde-bevattende cellen met behulp van emissie bij 455 nm bij excitatie bij 350 nm.
    OPMERKING: Met behulp van de beschreven procedure kunnen ongeveer 5.105 retinoïde-bevattende longcellen worden verzameld uit één muizenlong.
  5. Voer FACS-gegevensanalyse uit met behulp van flowcytometriesoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Isolatie van longretinoïde-bevattende cellen
Muizenlongmuizen (van Lrat+/+ en Lrat-/-) muizen werden enzymatisch verteerd en eencellige suspensies werden bereid en onderworpen aan FACS volgens de hierboven beschreven procedure. Celsortering en gegevensverzameling werden uitgevoerd op een Cytek Aurora™ Cell Sorter System dat wordt beheerd door SpectroFlo CS-softwareversie 1.3.0 met behu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het vermogen van vitamine A-detectie in menselijke en dierlijke weefsels en de histologische visualisatie ervan met behulp van fluorescentiemicroscopie werd voor het eerst gerapporteerd al in de jaren 194059,60. Het fenomeen van retinoïde autofluorescentie werd vervolgens met succes toegepast op studies gericht op het lokaliseren van hoge concentraties vitamine A in weefsels in vitro61 en het kara...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de National Institutes of Health / National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH / NHLBI) R01 HL171112 (tot I.S.), een carrièreontwikkelingsprijs (tot I.S.) van het Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease, gefinancierd door de National Institutes of Health / National Institute of Environmental Health Sciences (NIH / NIEHS) P30 ES005022, en startfondsen van Rutgers, The State University of New Jersey (naar I.S.). De auteurs willen graag de medewerkers van de Immune Monitoring and Flow Cytometry Shared Resource van het Rutgers Cancer Institute (gedeeltelijk ondersteund met financiering van de NCI-CCSG P30CA072770-5920) bedanken voor hun bijdragen aan het werk dat in dit manuscript wordt gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mL serologische pipetteAvantor/VWR76452-284
100 µm zeef Greiner Bio-One542000
15 mL falconbuisCorning352099
40 µm zeef Greiner Bio-One542040
50 mL falconbuisCorning352070
Celkweefbakje, 35 mm ´ 10 mmCorning430165
CelsorteermediumGibcoA59688DJ
Collageenase type IV Worthington Biochemical CorporationLS004188 
Cytek Aurora Cel Sorter Systeem Cytek Biosciences
Dispase IISigma-AldrichD4693
DNase ISigma-AldrichDN25
Falcon 5-ml polypropyleen ronde bodembuis, 12 mm ´ 75 mmCorning352063
Falcon 5-ml polystyreen ronde bodembuis met celstrainerdop, 12 mm ´ 75 mmCorning352235
FlowJo software Becton Dickinsonflow cytometrie software
HBSS met Ca2+/Mg2+Gibco14925-092
HBSS zonder Ca2+/Mg2+Gibco14175-095
Nalgene Rapid-Flow steriele wegwerpbare flesbovendekfiltersThermoFisher595-3320
Rode cel lyse bufferSigma-AldrichR7757
SpectroFlo CS software Cytek BiosciencesVersie 1.3.0 
Chirurgische ontwerp Royaltek roestvrijstalen chirurgische scalpelbladenFisher Scientific22-079-683
SYTOX Green dode celkleurstofInvitrogenS34860
TamoxifenSigma-AldrichT2859

Referenties

  1. Shmarakov, I. O., et al. Retinoids stored locally in the lung are required to attenuate the severity of acute lung injury in male mice. Nat Commun. 14 (1), 851(2023).
  2. Bogue, C. W., Jacobs, H. C., Dynia, D. W., Wilson, C. M., Gross, I. Retinoic acid increases surfactant protein mRNA in fetal rat lung in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 271 (5), L862-L868 (1996).
  3. Ng-Blichfeldt, J. -P., et al. Retinoic acid signaling balances adult distal lung epithelial progenitor cell growth and differentiation. EBioMedicine. 36, 461-474 (2018).
  4. Chen, F., et al. Prenatal retinoid deficiency leads to airway hyperresponsiveness in adult mice. J Clin Invest. 124 (2), 801-811 (2014).
  5. Esteban-Pretel, G., Marin, M. P., Renau-Piqueras, J., Barber, T., Timoneda, J. Vitamin A deficiency alters rat lung alveolar basement membrane: reversibility by retinoic acid. J Nutr Biochem. 21 (3), 227-236 (2010).
  6. Massaro, G. D., Massaro, D. Postnatal treatment with retinoic acid increases the number of pulmonary alveoli in rats. Am J Physiol. 270 (2 Pt 1), L305-L310 (1996).
  7. Hind, M., Maden, M. Retinoic acid induces alveolar regeneration in the adult mouse lung. Eur Respir J. 23 (1), 20-27 (2004).
  8. Belloni, P. N., Garvin, L., Mao, C. P., Bailey-Healy, I., Leaffer, D. Effects of all-trans-retinoic acid in promoting alveolar repair. Chest. 117 (5 Suppl 1), 235S-241S (2000).
  9. Veness-Meehan, K. A., Bottone, F. G. Jr, Stiles, A. D. Effects of retinoic acid on airspace development and lung collagen in hyperoxia-exposed newborn rats. Pediatr Res. 48 (4), 434-444 (2000).
  10. Cho, S. J., George, C. L., Snyder, J. M., Acarregui, M. J. Retinoic acid and erythropoietin maintain alveolar development in mice treated with an angiogenesis inhibitor. Am J Respir Cell Mol Biol. 33 (6), 622-628 (2005).
  11. Massaro, G. D., Massaro, D. Retinoic acid treatment abrogates elastase-induced pulmonary emphysema in rats. Nat Med. 3 (6), 675-677 (1997).
  12. Stinchcombe, S. V., Maden, M. Retinoic acid induced alveolar regeneration: critical differences in strain sensitivity. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (2), 185-191 (2008).
  13. Fraslon, C., Bourbon, J. R. Retinoids control surfactant phospholipid biosynthesis in fetal rat lung. Am J Physiol. 266 (6 Pt 1), L705-L712 (1994).
  14. Zachman, R. D. Role of vitamin A in lung development. J Nutr. 125 (6 Suppl), 1634s-1638s (1995).
  15. van Bennekum, A. M., et al. Lipoprotein lipase expression level influences tissue clearance of chylomicron retinyl ester. J Lipid Res. 40 (3), 565-574 (1999).
  16. Blaner, W. S., et al. Lipoprotein lipase hydrolysis of retinyl ester: possible implications for retinoid uptake by cells. J Biol Chem. 269 (24), 16559-16565 (1994).
  17. Trites, M. J., Febbraio, M., Clugston, R. D. Absence of CD36 alters systemic vitamin A homeostasis. Sci Rep. 10 (1), 20386(2020).
  18. Wassef, L., Quadro, L. Uptake of dietary retinoids at the maternal-fetal barrier: in vivo evidence for the role of lipoprotein lipase and alternative pathways. J Biol Chem. 286 (37), 32198-32207 (2011).
  19. Spiegler, E., Kim, Y. -K., Wassef, L., Shete, V., Quadro, L. Maternal-fetal transfer and metabolism of vitamin A and its precursor β-carotene in the developing tissues. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1821 (1), 88-98 (2012).
  20. Kedishvili, N. Y. Enzymology of retinoic acid biosynthesis and degradation. J Lipid Res. 54 (7), 1744-1760 (2013).
  21. Channabasappa, S., Caldwell, S., Kanthan, R., Singh, B. Retinoid receptors are expressed in mouse and human lungs. Anat Rec. 305 (9), 2281-2289 (2022).
  22. Kimura, Y., et al. Retinoid receptors in the developing human lung. Clin Sci (Lond). 103 (6), 613-621 (2002).
  23. Yang, L., Naltner, A., Yan, C. Overexpression of dominant negative retinoic acid receptor alpha causes alveolar abnormality in transgenic neonatal lungs. Endocrinology. 144 (7), 3004-3011 (2003).
  24. Snyder, J. M., et al. Alveolarization in retinoic acid receptor-beta-deficient mice. Pediatr Res. 57 (3), 384-391 (2005).
  25. Gao, R. -w, et al. Retinoic acid promotes primary fetal alveolar epithelial type II cell proliferation and differentiation to alveolar epithelial type I cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (5), 479-487 (2015).
  26. Dirami, G., et al. Lung retinol storing cells synthesize and secrete retinoic acid, an inducer of alveolus formation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (2), L249-L256 (2004).
  27. Massaro, G. D., Massaro, D., Chambon, P. Retinoic acid receptor-alpha regulates pulmonary alveolus formation in mice after, but not during, perinatal period. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 284 (2), L431-L433 (2003).
  28. Massaro, G. D., et al. Retinoic acid receptor-beta: an endogenous inhibitor of the perinatal formation of pulmonary alveoli. Physiol Genomics. 4 (1), 51-57 (2000).
  29. McGowan, S., et al. Mice bearing deletions of retinoic acid receptors demonstrate reduced lung elastin and alveolar numbers. Am J Respir Cell Mol Biol. 23 (2), 162-167 (2000).
  30. Yan, C., et al. Retinoic acid-receptor activation of SP-B gene transcription in respiratory epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 275 (2), L239-L246 (1998).
  31. Ghaffari, M., Whitsett, J. A., Yan, C. Inhibition of hSP-B promoter in respiratory epithelial cells by a dominant negative retinoic acid receptor. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 276 (3), L398-L404 (1999).
  32. Yang, L., et al. Synergy between signal transducer and activator of transcription 3 and retinoic acid receptor-α in regulation of the surfactant protein b gene in the lung. Mol Endocrinol. 18 (6), 1520-1532 (2004).
  33. Metzler, M. D., Snyder, J. M. Retinoic acid differentially regulates expression of surfactant-associated proteins in human fetal lung. Endocrinology. 133 (5), 1990-1998 (1993).
  34. George, T. N., Snyder, J. M. Regulation of surfactant protein gene expression by retinoic acid metabolites. Pediatr Res. 41 (5), 692-701 (1997).
  35. Naltner, A., Ghaffari, M., Whitsett, J. A., Yan, C. Retinoic acid stimulation of the human surfactant protein B promoter is thyroid transcription factor 1 site-dependent. J Biol Chem. 275 (1), 56-62 (2000).
  36. Ng-Blichfeldt, J. P., et al. Deficient retinoid-driven angiogenesis may contribute to failure of adult human lung regeneration in emphysema. Thorax. 72 (6), 510-521 (2017).
  37. Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cell Signal. 65, 109421(2020).
  38. Mamidi, S., Hofer, T. P., Hoffmann, R., Ziegler-Heitbrock, L., Frankenberger, M. All-trans retinoic acid up-regulates prostaglandin-e synthase expression in human macrophages. Immunobiology. 217 (6), 593-600 (2012).
  39. Hashimoto, S., et al. Retinoic acid differentially regulates interleukin-1beta and interleukin-1 receptor antagonist production by human alveolar macrophages. Leuk Res. 22 (11), 1057-1061 (1998).
  40. Li, S., Lei, Y., Lei, J., Li, H. Alltrans retinoic acid promotes macrophage phagocytosis and decreases inflammation via inhibiting CD14/TLR4 in acute lung injury. Mol Med Rep. 24 (6), (2021).
  41. Nagy, N. E., et al. Storage of vitamin A in extrahepatic stellate cells in normal rats. J Lipid Res. 38 (4), 645-658 (1997).
  42. Thompson, K. C., et al. Primary rat and mouse hepatic stellate cells express the macrophage inhibitor cytokine interleukin-10 during the course of activation in vitro. Hepatology. 28 (6), 1518-1524 (1998).
  43. Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (3), 232-240 (2000).
  44. D'Ambrosio, D. N., et al. Distinct populations of hepatic stellate cells in the mouse liver have different capacities for retinoid and lipid storage. PLoS One. 6 (9), e24993(2011).
  45. Apte, M. V., et al. Periacinar stellate shaped cells in rat pancreas: identification, isolation, and culture. Gut. 43 (1), 128-133 (1998).
  46. Kim, N., et al. Formation of vitamin A lipid droplets in pancreatic stellate cells requires albumin. Gut. 58 (10), 1382-1390 (2009).
  47. Kida, Y., et al. Characterization of vitamin A-storing cells in mouse fibrous kidneys using Cygb/STAP as a marker of activated stellate cells. Arch Histol Cytol. 70 (2), 95-106 (2007).
  48. Ogawa, T., et al. Identification of vitamin A-free cells in a stellate cell-enriched fraction of normal rat liver as myofibroblasts. Histochem Cell Biol. 127 (2), 161-174 (2007).
  49. Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
  50. Bartneck, M., et al. Isolation and time lapse microscopy of highly pure hepatic stellate cells. Anal Cell Pathol (Amst). , (2015).
  51. Balaphas, A., et al. Optimized isolation and characterization of C57BL/6 mouse hepatic stellate cells. Cells. 11 (9), (2022).
  52. Kubota, H., Yao, H. L., Reid, L. M. Identification and characterization of vitamin A-storing cells in fetal liver: implications for functional importance of hepatic stellate cells in liver development and hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2339-2349 (2007).
  53. Larsen, A. K., et al. Autofluorescence in freshly isolated adult human liver sinusoidal cells. Eur J Histochem. 65 (4), (2021).
  54. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  55. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , The National Academies Press. Washington DC. (2011).
  56. O'Byrne, S. M., et al. Retinoid absorption and storage is impaired in mice lacking lecithin: retinol acyltransferase (LRAT). J Biol Chem. 280 (42), 35647-35657 (2005).
  57. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  58. McGowan, S. E. The lipofibroblast: more than a lipid-storage depot. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 316 (5), L869-L871 (2019).
  59. Meyer, K. A., Popper, H., Ragins, A. B. Histologic distribution of vitamin A in biopsy specimens of the liver. Arch Surg. 43 (3), 376-385 (1941).
  60. Popper, H. L. Histological demonstration of vitamin A in rats by means of fluorescence microscopy. Proc Soc Exp Biol Med. 43, 133-136 (1940).
  61. Van Exan, R. J., Hardy, M. H. Localization of vitamin A by autofluorescence during induced metaplastic changes in cultures of skin. In Vitro. 15 (8), 631-640 (1979).
  62. Schweigert, F. J., Siegling, C., Tzimas, G., Seeger, J., Nau, H. Distribution of endogenous retinoids, retinoid binding proteins (RBP, CRABPI) and nuclear retinoid X receptor beta (RXRbeta) in the porcine embryo. Reprod Nutr Dev. 42 (4), 285-294 (2002).
  63. Wake, K. Perisinusoidal stellate cells (fat-storing cells, interstitial cells, lipocytes), their related structure in and around the liver sinusoids, and vitamin A-storing cells in extrahepatic organs. Int Rev Cytol. 66, 303-353 (1980).
  64. Senoo, H., Kojima, N., Sato, M. Vitamin A-storing cells (stellate cells). Vitam Horm. 75, 131-159 (2007).
  65. Senoo, H., et al. Hepatic stellate cell (vitamin A-storing cell) and its relative--past, present and future. Cell Biol Int. 34 (12), 1247-1272 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

longretino decellenretino de autofluorescentiefluorescentie geactiveerde cel sorteringisolatie van longcellenretino destoffwisselingflowcytometrieretinolesterslongfibroblastensingle cell suspensie
Isolatie van longretinoïde-bevattende cellen door celsortering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.