Enzymatische modificatie en beoordeling van flowcytometrie van door het gistoppervlak weergegeven eiwitten

Samenvatting

Hier introduceren we een protocol voor het gebruik van substraten met gistoppervlak voor enzymatische modificatietests. Het platform werd gedemonstreerd met behulp van de analyse van de defosforyleringsactiviteit van tyrosinefosfatase SHP-2 tegen een van zijn substraten als een representatieve enzymatische modificatietest.

Samenvatting

Gistoppervlakteweergave is een genotype-fenotype-koppelingsstrategie die high-throughput screening van de eiwitfunctie mogelijk maakt. Traditioneel wordt de weergave van het gistoppervlak toegepast op de evolutie van nieuwe bindende eiwitten, waarbij flowcytometrie wordt gebruikt om de bindingssterkte te beoordelen en te sorteren. Onlangs is er een groeiende belangstelling voor het toepassen van gistoppervlakteweergave voor het screenen van enzymatische modificatie van substraatvarianten, met additieve (bijv. fosforylering) of subtractieve (bijv. proteolyse) modificaties die een fenotype opleveren dat leesbaar is door flowcytometrie. Dergelijke modificaties worden regelmatig toegepast met behulp van intracellulaire co-lokalisatie, maar het vermogen om extracellulaire enzymatische modificatie van weergegeven substraten te bereiken, zou veel meer reacties voor onderzoek kunnen openen. Hier beschrijven we technieken voor het ontwerpen en toepassen van screeningstesten voor extracellulaire enzymatische modificatie op kandidaat-substraten die op het gistoppervlak worden weergegeven en de daaropvolgende evaluatie met behulp van flowcytometrie-analyse. We bieden deze protocollen aan in de context van fosfatasen die gistsubstraten defosforyleren die gefosforyleerde tyrosineresiduen bevatten en geven commentaar op hoe dit toegepaste raamwerk kan worden aangepast voor het ontwikkelen van screeningstesten voor andere enzym-substraatparen.

Inleiding

Het begrip van de interacties tussen enzymen en hun doelwitten is een steeds interessanter onderzoeksgebied geworden vanwege de noodzaak ervan voor de biologische karakterisering van de routes die cellulaire homeostase en ziekteontwikkeling beheersen ^1,2. Enzymen zijn verantwoordelijk voor de katalyse van veel van de reacties die het biologische leven in stand houden, het beheersen van noodzakelijke routes zoals cellulair metabolisme ^3,4, signalering⁵ en zelfs fundamentele processen zoals genoomherstel ^6,7. Vanwege hun rol in deze processen spelen hun interacties ook een rol bij de ontwikkeling van veel ziekten, aangezien afwijkingen in hun activiteit ernstige ontregeling van de celactiviteit kunnen veroorzaken, waardoor apoptose of proliferatie van schadelijke kankercellen kan ontstaan². De studie van enzymatische activiteit heeft belangrijke toepassingen gehad bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën ^8,9, waarvoor tests nodig zijn die zijn afgestemd op elke specifieke enzym-substraatinteractie¹⁰. Er zijn meerdere enzymatische assays opgesteld als standaardprotocollen voor de evaluatie en karakterisering van deze interacties. Assays die zijn ontwikkeld om enzymatische interacties te analyseren, worden geclassificeerd in detectietests die de binding voor activering/remming bewaken¹¹ of assays die substraatmodificatie door enzymen monitoren¹².

Een belangrijke rol van enzymen is het reguleren van celgedrag. Signaaltransductie, de intracellulaire respons van een cel op een extracellulaire trigger¹³, is verantwoordelijk voor de overleving en functionaliteit van cellen. Celproliferatie, differentiatie en vele andere functionele processen hebben allemaal betrekking op signaalroutes met enzymatische interacties die ze beheersen ^14,15. Enzymen katalyseren posttranslationele modificaties, die vaak de enorme signaalnetwerken moduleren die verantwoordelijk zijn voor de correcte overdracht van extracellulaire berichten¹⁶. Eiwitfosforylering is de meest voorkomende posttranslationele modificatie, alomtegenwoordig in celsignalering en meerdere andere cellulaire routes. Bijgevolg zijn eiwitkinasen naar voren gekomen als een aanzienlijk deel van potentiële therapeutische doelwitten vanwege hun cruciale regulerende rol¹⁷. Fosfatasen zijn de natuurlijke modulerende moleculen voor op fosfaat gebaseerde celsignaleringscomplexen^18,19, die het vermogen hebben om fosfaatresiduen uit hun doeleiwitten te verwijderen²⁰. In het afgelopen decennium zijn fosfatasen een belangrijk therapeutisch doelwit geworden voor de behandeling van kanker²¹ en ontstekingsziekten²² op basis van hun betrokkenheid bij de regulatie van stroomafwaartse signaalroutes in meerdere celtypen. Samen zorgen eiwitkinasen en fosfatasen voor een breed scala aan interacties, die kunnen worden bestudeerd door de ontwikkeling van specifieke enzymatische testprotocollen.

Weergave van het gistoppervlak is gebruikt als een hulpmiddel voor de karakterisering en evaluatie van enzymatische activiteit ^23,24. Het biedt een high-throughput platform voor de screening van posttranslationele modificatieprocessen in combinatie met endoplasmatisch reticulum-sekwestratiestrategieën^25,26. Hierdoor kunnen kinase-substraatparen worden gelokaliseerd en vastgehouden in het endoplasmatisch reticulum door binding aan KDEL-receptoren²⁷, waar fosforylering van het substraat met verhoogde snelheden kan plaatsvinden vanwege de nabijheid tussen kinasen en hun doelen. De KDEL-receptorbinding wordt gemedieerd door een C-terminale FEHDEL-endoplasmatisch reticulum-retentiesequentie waarvan is aangetoond dat deze een sterker retentievermogen heeft dan andere HDEL-sequenties^25,28. Het gefosforyleerde substraat wordt vervolgens verankerd aan het gistoppervlak voor verdere evaluatie door middel van flowcytometrie²⁹. Momenteel zijn er geen generaliseerbare protocollen opgesteld voor de enzymatische modificatie van substraten die op het gistoppervlak worden weergegeven. We breiden de capaciteiten van de weergave van gistoppervlakken uit door gebruik te maken van de extracellulair tot expressie gebrachte gefosforyleerde substraatvarianten en deze te modificeren door middel van defosforylering door hun bekende fosfatase. Flowcytometrie-analyse biedt vervolgens een platform voor de fenotypische evaluatie van de bovengenoemde substraten door het meten van veranderingen in de fosforyleringsmediaan als gevolg van de incubatie met de bekende fosfatase. Dit biedt een aanpasbare methode voor posttranslationele modificatie van oppervlakte-weergegeven eiwitten, terwijl het ook een methode biedt voor enzymatische modificatie-analyse van interacties bij gebruik van het gistoppervlakteweergaveplatform.

We presenteren technieken voor de ontwikkeling en toepassing van een enzymatische modificatietest die de introductie van een kinase-substraatinteractie in het gistoppervlakteweergaveplatform beschrijft, de co-incubatie van het tot expressie gebrachte gefosforyleerde substraat met een recombinante fosfatase, en de daaropvolgende analyse van de defosforyleringsactiviteit door middel van flowcytometrie. In dit rapport wordt dit bereikt door het cytoplasmatische domein van CD28 te co-lokaliseren met lymfocytenkinase (LCK) in het gist-endoplasmatisch reticulum, gevolgd door weergave van de gefosforyleerde CD28 op het gistoppervlak en daaropvolgende defosforylering door Src-homologie regio 2 domeinbevattende fosfatase-2 (SHP-2). Een pan-antifosfotyrosine-antilichaam (in deze studie 4G10), dat gefosforyleerde tyrosineresiduen detecteert in een breed scala aan peptidesequenties, wordt gebruikt voor het kwantificeren van het fosforyleringsniveau als functie van de fosfatasebehandeling. Het gedetailleerde proces biedt een generaliseerbare benadering voor het onderzoeken van enzym-substraatinteracties; Een prospectieve manier om enzymen en substraten op gezuiverde wijze te bestuderen.

Protocol

1. Celgroei van gist met plasmide en inductie van eiwitexpressie

1. Bereid volgens het in tabel 1 beschreven recept de media voor die nodig zijn voor de groei van niet-plasmidebevattende gist (YPD), plasmidebevattende gistcelgroei (SD-CAA) en de inductie van eiwitexpressie (SRG-CAA) en SD-CAA-platen.
2. Transformeer gist display plasmide-DNA dat het kinase-substraatpaar bevat in EBY-100 gistcellen via de op lithiumkation gebaseerde methode^30,31, die vaak wordt gebruikt voor gebruik in gisttransformatiekits van verschillende fabrikanten.
   OPMERKING: Elektroporatie³² of andere voorkeurstechnieken voor de transformatie van gistplasmide kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het plasmideconstruct dat wordt getransformeerd.
3. Bereid een kweekbuis van 14 ml voor met 10 ml YPD-media. Inoculeer EBY-100-cellen en kweek in een schudbroedmachine bij 30 °C, 300 tpm totdat de cultuur een optische dichtheid (OD_{600 nm}) van 0,8-1,0 bereikt (8 x 10⁶- 1 x 10⁷ cellen/ml).
   OPMERKING: OD_600nm wordt gemeten door het bereiden van 3 ml monstercuvetten met 1:10 verdunningen van gistculturen in hun respectievelijke media en 3 ml lege cuvetten die de media bevatten die worden gebruikt voor monsterverdunningen. Het OD_{600nm-programma} op de spectrofotometer wordt gebruikt om eerst de lege cuvet te meten en vervolgens elke monstercuvet door de overeenkomstige verdunning in te stellen die voor elk monster is voorbereid. 1 OD_600nm komt overeen met 1 × 10⁷ gist/ml.
4. Oogst de cellen door de cultuur gedurende 3 minuten op 1.000 x g te centrifugeren en te wassen met de 1e^wasoplossing die in de gisttransformatiekit zit, of TE (10 mM Tris-HCl en 1,0 mM EDTA)³¹.
5. Pellet de cellen opnieuw op 1.000 x g gedurende 3 minuten en suspendeer in 1 ml van de transformatiebuffer die in de gisttransformatiekit zit, of steriel water. De cellen moeten worden verdeeld in aliquots van 50 μl en kunnen maximaal 6 maanden bij -80 °C worden bewaard.
6. Voor plasmidetransformatie wordt één aliquoot per plasmide bereid en ontdooid op ijs, waarna 0,5-1,5 μg plasmide-DNA met het gistweergaveconstruct rechtstreeks aan de cellen wordt toegevoegd. 0,5 ml van de transformatieoplossing in de gisttransformatiekit wordt toegevoegd, of 0,5 ml van een steriele 50% polyethyleenglycol en 0,1 M LiOAc-oplossing³¹. Combineer het mengsel van cellen, plasmide-DNA en transformatieoplossing grondig door te pipetteren.
7. Incubeer het transformatiemengsel statisch gedurende 30-60 minuten bij 30 °C, het vortexmengsel met tussenpozen van 15 minuten. Oogst cellen door te centrifugeren bij 1.000 × g gedurende 3 minuten.
8. Bereid een kweekbuis van 14 ml voor met 4,5 ml SD-CAA-media. Resuspendeer de cellen die het gewenste plasmide bevatten in 500 μl SD-CAA en inoculeer de bereide 4,5 ml.
9. Zorg ervoor dat de agar niet wordt doorboord, verdeel 50 μl van de 5 ml geënte cultuur over een SD-CAA-plaat en incubeer statisch bij 30 °C gedurende 48 uur om de transformatie-efficiëntie te bepalen.
10. Incubeer de 5 ml SD-CAA-celcultuur in een schudbroedmachine bij 30 °C, 300 tpm gedurende ten minste 18 uur. Bewaak de optische dichtheid (OD_600nm) na 16 uur en 20 uur. Zodra het monster is gegroeid tot een voldoende optische dichtheid van maximaal 6, centrifugeert u de cultuur gedurende 3 minuten bij 2.500 × g. Gooi het bovenstaande weg zonder de gistkorrel te verstoren.
11. Resuspendeer de gistpellet in SRG-CAA tot een uiteindelijke OD_600nm minder dan 1 (<1 × 10⁷ gist/ml).
12. Incubeer de gistcultuur in een schudbroedmachine bij 30 °C bij 300 tpm gedurende ten minste 8 uur maar niet langer dan 24 uur.
    OPMERKING: De inductie van eiwitexpressie in gistcellen kan variëren van 20-37 °C. 30 °C is geschikt voor de synthese van kinase/substraatparen^29,33, maar kan worden aangepast indien dit nodig wordt geacht voor de specifieke eiwitten die worden bestudeerd.
13. Meet OD_600nm om de celdichtheid te bepalen.
    OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gestopt door de gistculturen bij 4 °C te bewaren.

2. Biotinylering van 4G10 anti-fosfotyrosine-antilichaam

1. Resuspendeer een injectieflacon van 2 mg PEG4-NHS-Biotine tot een eindconcentratie van 5 mM door 680 μl steriel PBS toe te voegen.
   OPMERKING: Resuspendatie van PEG4-NHS-Biotine moet vers worden gedaan onmiddellijk voordat de biotinyleringsreactie wordt uitgevoerd. NHS hydrolyseert in waterige oplossing. Het gebruik van steriele PBS en injectieflacons is belangrijk voor de bereiding van reagentia voor langdurige opslag en voor gebruik in celgebaseerde assays om eventuele effecten van contaminanten op de levensvatbaarheid van reagentia of de gevoelige assays die worden uitgevoerd, te beperken.
2. Voeg op basis van de antilichaamconcentratie van 4G10 100 μg antilichaam toe aan een steriele injectieflacon van 1,7 ml.
3. Voeg 1 μl van de bereide 5 mM PEG4-NHS-Biotine uit stap 2.1 toe aan de injectieflacon met het 100 μg 4G10-antilichaam om een molaire verhouding van biotine tot antilichaam van 7,5:1 te bereiken. Pipetteer het mengsel voorzichtig om de reactie te homogeniseren.
4. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur met constante rotatie gedurende ten minste 2 uur.
5. Volg het protocol van de fabrikant voor centrifuge-ontziltingskolommen van 0,5 ml om de buffer van het gebiotinyleerde 4G10 (B-4G10) om te wisselen naar PBS.
   OPMERKING: Ontziltingskolommen met een molecuulgewichtgrens (MWCO) van 7 kDa worden vaak gebruikt voor biotinylering van antilichamen om niet-gereageerde biotine en andere kleine moleculen te kunnen verwijderen met behoud van het grotere antilichaam.
6. Verdun het B-4G10-antilichaam tot een eindconcentratie van 1 μM in PBSA (PBS met 1 g/L runderserumalbumine). Verdeel het B-4G10-antilichaam in kleinere volumes om herhaalde vries-/dooicycli te voorkomen.
   OPMERKING: Gebiotinyleerde antilichamen kunnen tot 3 maanden bij 4 °C worden bewaard voor dagelijks gebruik zonder noemenswaardige efficiëntie te verliezen. Bewaar de rest van de niet in gebruik zijnde aliquots maximaal 2 jaar bij -20 °C.

3. Defosforylering van substraten die tot expressie komen op het oppervlak van de gistcel

1. Bereid de 2x werkende bufferoplossing voor zoals eerder beschreven in de literatuur³⁴.
   OPMERKING: 2x wordt aanbevolen om de meting van de benodigde ingrediënten te vergemakkelijken.
2. Bereid de werkbuffer voor de monsters voor in een injectieflacon van 1,7 ml door de 2x bufferoplossing bereid in stap 3.1 1:2 te verdunnen in gedeïoniseerd water.
   OPMERKING: Het totale reactievolume voor elk monster is 20 μL en elk monster heeft ergens tussen de 10 μL en 18 μL werkbuffer nodig. Bereid voldoende werkbuffer voor voor alle monsters of controles.
3. Etiketteer volgens de aanbevolen monsterbereiding zoals beschreven in tabel 2 de injectieflacons van 1,7 ml met de bijbehorende controle- of monsternaam.
4. Bereken op basis van de OD_600nm gemeten in stap 1.9 het kweekvolume dat nodig is om twee miljoen (2 × 10⁶) gistcellen terug te winnen uit de overeenkomstige gistcultuur voor elk monster.
5. Voeg het in de vorige stap berekende volume gistcultuur toe aan de injectieflacon van 1,7 ml voor elk monster.
6. Centrifugeer de injectieflacon gedurende 1 minuut bij 4.500 × g. Verwijder het bovenstaande voorzichtig met een micropipet en gooi het weg als biologisch gevaarlijk afval.
7. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 1 ml PBSA en herhaal stap 3.6.
   OPMERKING: Het is belangrijk om zoveel mogelijk overtollig middel te verwijderen zonder de gepelleteerde cellen te verstoren.
8. Bereken op basis van de voorraadconcentratie het volume recombinant humaan SHP-2 dat nodig is om een eindconcentratie van 1.000 nM te hebben in een totaal reactievolume van 20 μL.
   OPMERKING: Recombinant SHP-2 moet in kleine hoeveelheden worden verdeeld, zodat het eiwit dat in elke test wordt gebruikt, niet meer dan twee vries-dooicycli heeft doorlopen. SHP-2 die overblijft van een aliquot nadat alle monsters zijn voorbereid voor een test, moet worden weggegooid.
   Voorraadconcentraties van recombinante enzymen kunnen variëren, afhankelijk van het lotnummer. Recombinant SHP-2 wordt gewoonlijk geformuleerd in een voorraadconcentratie van 0,2-0,4 mg/ml. Voor een voorraadconcentratie van 0,324 mg/ml SHP-2 komt dit overeen met een voorraadconcentratie van 4,696 μM (SHP-2 heeft een molecuulgewicht van 69 kDa). 4,26 μL van de SHP-2 voorraad in een 20 μL reactie resulteert in een uiteindelijke reactieconcentratie van 1.000 nM SHP-2.
9. Voeg 7,7 mg DTT toe aan 10 ml gedeïoniseerd water bereid in een conische 15 ml om een 5 ml DTT-oplossing te creëren. Als de beperkingen van de apparatuur het moeilijk maken om milligrammen te wegen, voeg dan 0,77 g DTT toe aan 10 ml gedeïoniseerd water en voer vervolgens een verdunning van 100x uit om de 5 mM DTT-oplossing te maken die voor de test wordt gebruikt.
   OPMERKING: De DTT-oplossing kan worden bereid in voorraadoplossingen met een hogere concentratie die moeten worden verdund tot 5 mM als het niet mogelijk is om hoeveelheden op milligramschaal te meten met behulp van de beschikbare apparatuur. DTT-oplossing moet vers worden bereid voorafgaand aan de celresuspensie in een werkbuffer vanwege de neiging tot hydrolyseren, waardoor het gedurende lange perioden onstabiel wordt wanneer het wordt verdund in water.
10. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in de in stap 3.2 voorbereide werkbuffer zodat het uiteindelijke reactievolume in elk monster of elke controle 20 μl bedraagt.
    OPMERKING: De hoeveelheid toegevoegde werkbuffer moet worden berekend op basis van de hoeveelheid DTT (2 μL) en SHP-2 (berekend in stap 3.8) die in elk monster zal zitten.
11. Voeg aan elk monster of elke controle 2 μl van de 5 mM DTT-oplossing die in stap 3.9 is bereid, toe voor een uiteindelijke reactieconcentratie van 0,5 mM DTT.
12. Voeg het in stap 3.8 berekende volume SHP-2 toe aan elk monster voor een eindvolume van 20 μl en meng voorzichtig met behulp van een micropipet.
13. Wikkel de deksels van de monsterinjectieflacon in parafilm om lekkage of kruisbesmetting te voorkomen.
14. Incubeer de monsters gedurende 2 uur bij 37 °C op een rotor met een constante snelheid.
15. Verwijder monsters uit de rotor en stop de reactie door 1 ml PBSA aan elk monster toe te voegen.
16. Herhaal stap 3.6.

4. Cellabeling en flowcytometrie-analyse van gedefosforyleerde substraten

1. Resuspendeer de monsters uit stap 3.16 in een mengsel van 20 μl van de overeenkomstige primaire reagentia zoals beschreven in tabel 2. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Alle gebruikte reagensconcentraties zijn berekend als hoger dan het aantal eiwitten dat tot expressie komt op het oppervlak van gistcellen. De berekening gaat uit van de expressie van 10.000 eiwitten/cel uit alle 2 x 10⁶ gisten in een monster³⁵, terwijl routinematig slechts ~50% van hen dat doet. Tabel 3 toont de verhouding overtollige etiketteringsreagens voor elk van de reagentia uitgedrukt in tabel 2, als volgt berekend:
   
2. Centrifugeer de monsters bij 4.500 × g gedurende 1 minuut en gooi het bovenstaande weg als biologisch gevaarlijk afval.
3. Was de cellen eenmaal door ze opnieuw te suspenderen in 1 ml PBSA. Herhaal stap 4.2.
4. Resuspendeer de monsters in een mengsel van 20 μl van de overeenkomstige secundaire reagentia zoals beschreven in tabel 2. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij afwezigheid van licht.
5. Herhaal stap 4.2.
6. Herhaal stap 4.3.
7. Resuspendeer de gewassen monsters in 300-500 μL PBSA en breng ze over in polystyreenbuisjes van 5 ml om onmiddellijk te analyseren met behulp van een geschikte flowcytometer.
   OPMERKING: Als monsters moeten worden vervoerd, bewaar ze dan op nat ijs. Het wordt niet aanbevolen, maar monsters kunnen maximaal 2 uur bij 4 °C worden bewaard als natte pellets.
8. Nadat u de cytometer hebt opgestart en voorbereid voor een nieuw experiment, klikt u op de knop Nieuw experiment in het menu Bestand , geeft u het experiment een naam en klikt u op Opslaan om ervoor te zorgen dat de verkregen gegevens worden opgeslagen in het gewenste bestandspad.
9. Selecteer het dot-plot-pictogram in de bovenste werkbalk om twee of meer dot-plots te maken voor elk voorbeeld dat moet worden uitgevoerd. Selecteer voor een van de puntdiagrammen de naam van de X-as om het FSC-A-kanaal weer te geven en de naam van de Y-as om het SSC-A-kanaal weer te geven. Deze grafiek toont de Side Scatter - Area versus Forward Scatter - Area en wordt gebruikt om gistcellen te gaten voor verdere analyse.
10. Selecteer op een andere dot-plot de naam van de X-as om het kanaal weer te geven waarin het secundaire reagens dat gericht is op het primaire anti-epitoop-tag-antilichaam fluoresceert. Selecteer de naam van de Y-as om het kanaal weer te geven waarin het secundaire reagens van streptavidine fluoresceert. Deze grafiek toont alleen de gebeurtenissen die zijn afgeschermd van de zij- versus voorwaartse spreidingsgrafiek als gistcellen en wordt gebruikt om tyrosinefosforylering op de Y-as en substraatoppervlakte-expressie op de X-as weer te geven.
    OPMERKING: Het secundaire reagens gericht op het primaire anti-epitoop-tag-antilichaam fluoresceert in het FITC (AF-488)-kanaal en het secundaire streptavidine-reagens fluoresceert in dit voorbeeld in het AF-647-kanaal. De gebruikte kanalen kunnen variëren, afhankelijk van de primaire en secundaire reagentia die tijdens het etiketteren worden gebruikt.
11. Plaats elk monsterbuisje in de buishouder van de cytometer en selecteer Uitvoeren voor de cytometer om te beginnen met het laden van het monster en het verzamelen van gegevens. Pas indien nodig gebeurtenissen aan die moeten worden weergegeven, gebeurtenissen die moeten worden opgenomen, tijd die moet worden opgenomen en samplestroomsnelheid.
12. Definieer een poort rond de gezonde gistcellen in de SSC-A versus FSC-A-plot die in stap 4.9 is gemaakt. Figuur 1 illustreert een beschrijvende weergave van de toe te passen poortstrategie.
    OPMERKING: Op de SSC-A versus FSC-A-plot zijn 100.000 gebeurtenissen om weer te geven en 50.000 gebeurtenissen om op te nemen binnen de gedefinieerde gistpoort een goede richtlijn om voldoende gegevens te visualiseren en te verzamelen voor verdere analyse. Strengere poortstrategieën om te selecteren voor singletgist kunnen worden toegepast op basis van een plot van Forward Scatter-Height versus Forward Scatter-Area, zoals onlangs gerapporteerd³⁶. De poortstrategie die in figuur 1 wordt getoond, komt overeen met een minder strikte aanpak, inclusief singlet en wat doubletgist door middel van scatter gating.
13. Registreer de fluorescentie van alle controlemonsters met behulp van een flowcytometrie-analysator. Controlemonsters worden routinematig eerst verzameld om te helpen bij het definiëren van een poortstrategie, zoals hieronder beschreven in stap 4.14.
14. Definieer een poortstrategie voor uw perceel die in stap 4.10 is gemaakt voordat u de behandelde monsters analyseert. Figuur 1 illustreert een beschrijvende weergave van de toe te passen poortstrategie.
15. Registreer de fluorescentie van gedefosforyleerde monsters met behulp van de flowcytometer en de poortstrategie zoals gedefinieerd in de stappen 4.12 en 4.14.
16. Analyseer flowcytometriegegevens die zijn verkregen met behulp van flowcytometrie-analysesoftware.
17. Evalueer de defosforylering door de mediaan van de Y-as te meten en te vergelijken van cellen die eiwit tot expressie brengen op hun oppervlak en de basisfosforylering van niet-displaycellen tussen monsters en controles. Bereken het procentuele mediane fosforyleringsverschil als volgt:
    

Resultaten

Flowcytometrieanalyse van een individuele replicaat van ons modelsysteem geïncubeerd gedurende 2 uur zonder (Figuur 1A) en met (Figuur 1B) 1.000 nM SHP-2 onthult een mediaan fosforyleringsverschil van 63,6%, dat wordt gedefinieerd als de verhouding van de Y-as mediaan (fosforylering) van alle aan het oppervlak getoonde gebeurtenissen minus het basislijn fosforyleringssignaal gedefinieerd als de Y-as mediaan van de niet-weergegev...

Discussie

Het gepresenteerde protocol maakt de analyse van enzymatische interacties mogelijk met behulp van de extracellulaire weergave van eiwitten op het gistoppervlak. Door endoplasmatisch reticulum-sekwestratie op te nemen in het gebruikte plasmide aan het oppervlak, wordt het vermogen geïntroduceerd om specifieke interacties tussen enzymen en posttranslationeel gemodificeerde substraten extracellulair te analyseren vanwege de intracellulaire interacties die kunnen worden ontworpen om plaats t...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 L Media Bottles	Corning	06-414-1D
1.7/2.0 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 µL SureOne Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-438
1000 µL SureOne Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-408
12 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes	Greiner	07-000-212
3 mL platic Cuvettes	BRAND	759076D
300 µL SureOne Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-411
5 mL Serological Pipettes	Fisher Scientific	13-678-11D
Acid Casein (Casamino Acids)	Fisher Scientific	BP-1424-500
Analytical Balance	Mettler Toledo	30243397
Bacteriological Petri Dish	Corning	Falcon 351008
Biosafety Cabinets	Labconco	Logic Class II, Type A2  302310102
Biospectrometer	Eppendorf	Kinetic 6136000010
Bovine Serum Albumin	Fisher bioreagents	BP1600-100
Citric Acid	Fisher Scientific	A940-500
CytoFLEX Flow Cytometry Analyzer	Beckam Coulter	Cytoflex C09745	CytExpert software
Dextrose	Fisher Scientific	D16-1
Dithiothreitol	Fisher bioreagents	BP172-5
Donkey anti-goat FITC	Invitrogen	A16000
EDTA	Alfa Aesar	H56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-Biotin	Thermo Scientific	A39259
Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit	Zymo Research	T2001
Galactose	Fisher Scientific	BP656-500
General Purpose Refrigerator	Marvel Scientific	MS24RAS4RW
Goat anti-myc tag antibody	Bethyl	A190-104A
Mictrotube Centrifuge	Eppendorf	5425 R 5406000313
Mini Low Temperature Refrigerated Incubator	Fisher Scientific	15-015-2632
Mouse anti-phosphotyrosine antibody 4G10	BioXcell	BE0194
Parafilm M	Bemis	M PM999
Phosphate Buffered Saline	Fisher bioreagents	BP399-500
Pipette Controller	Eppendorf	easypet 3 4430000018
Raffinose	Thermo Scientific	J21060-36
Recombinant human Active SHP-2 Protein	R&D Systems	1894-SH
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5910 R
Saccharomyces cerevisiae yeast surface display strain EBY 100	ATCC	MYA-4941
Shaker Incubator	Eppendorf	M1335-0002 New Brunswick Innova 42
Single Channel Pipette Set	Eppendorf	05-403-151
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S671-500
Sodium Citrate Dihydrate	Fisher Scientific	S279-500
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate	Fisher Scientific	S373-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Fisher Scientific	S468-500
Streptavidin Alexa Fluor 647	Invitrogen	S32357
Top Loading Balance	Mettler Toledo
Tris hydrochloride	EMD Millipore	648317-100GM
Tube revolver rotator	Fisher Scientific	11-676-341
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12B
Yeast Nitrogen Base	BD Difco	291940
Zeba Spin Desalting Columns	Thermo Scientific	89883