Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genetische transformatie gemedieerd door Agrobacterium tumefaciens in Solanum nigrum

908 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68212

⸱

24 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Agriculture and Life Science, Liaocheng University

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel geeft een gedetailleerd protocol van de genetische transformatiemethode die door Agrobacterium tumefaciens wordt gemedieerd om transgeen Solanum nigrum te produceren.

Samenvatting

Solanum nigrumis een weesnachtschadefamilie van aardappel en tomaat, en het verse fruit is een voedzame en heerlijke bes. De hele plant van S. nigrum kan als medicijn worden gebruikt. De wilde S. nigrum herbergt echter enkele ongewenste eigenschappen. Gelukkig bieden genetische manipulatietechnieken, met name genbewerkingstechnologieën zoals CRISPR/Cas9, waardevolle kansen om S. nigrum snel te verbeteren door deze tekortkomingen aan te pakken. In de meeste planten wordt plantverbetering door middel van genbewerkingstechnologie bereikt door Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde genetische transformatie. In dit artikel hebben we de genetische transformatieprotocollen beschreven die worden gemedieerd door A. tumefaciens in S. nigrum. De zaadlobben en hypocotylen van S. nigrum-zaailingen werden gebruikt als explantaten voor genetische transformatie. Omdat S. nigrum resistent is tegen kanamycine, werd het DsRed-gen gebruikt als een visuele marker om transgene planten te identificeren. De genetische transformatie van S. nigrum kan efficiënt worden voltooid volgens deze operatieprotocollen. De detectie van T1-transgene planten kan direct worden geïdentificeerd aan de hand van het feit of ze rode fluorescentie uitzenden, zonder dat PCR-identificatie nodig is.

Inleiding

Solanum nigrum (bekend als zwarte nachtschade, 2n = 6x = 72) is een nachtschadefamilie van aardappel en tomaat1. De vrucht is een bolvormige bes die na rijping zwart wordt. De verse vrucht is een voedzame en heerlijke bes. De hele plant van S. nigrum kan worden gebruikt als medicijn, met de effecten van het verspreiden van bloedstasis, het verminderen van zwelling, het opruimen van warmte en ontgiften. S. nigrum synthetiseert twee verschillende klassen van gespecialiseerde metabolieten van een veel voorkomende cholesterolvoorloper: steroïde saponinen in de bladeren en steroïde glycoalkaloïden (SGA's) in de bessen. Uttroside B, een steroïde saponine afgeleid van S. nigrum, is onlangs goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration als weesgeneesmiddel voor de behandeling van hepatocellulair carcinoom2. De knock-out van het GAME15-gen in S. nigrum resulteerde in planten zonder zowel saponinen als steroïde alkaloïden, en onthulde ook dat steroïde saponinen ernstige plagen van landbouwinsecten bestrijden2. Polyfenolen in S. nigrum verminderen het gewicht en lichaamsvet door de adipocyten en het lipidenmetabolisme te beïnvloeden3. S. nigrum kan cadmium verrijken en wordt gebruikt als modelplant voor het bestuderen van cadmiumverrijking 4,5. S. nigrum is een niet-gedomesticeerde plant en de onderzoeksbasis is relatief zwak. Het is inspirerend dat het onderzoek naar S. nigrum de laatste jaren gestaag toeneemt. Het genoom van de hexaploïde S. nigrum is onlangs samengesteld, en S. nigrum zou kunnen zijn geëvolueerd uit zijn diploïde Solanum americanum (2n = 2x = 24)6,7. Daarom is S. nigrum een plant die zowel medicinale als eetbare waarde bezit. Onderzoek naar S. nigrum draagt niet alleen bij aan een beter begrip van de mogelijke toepassingen ervan bij de behandeling van ziekten bij de mens, maar biedt ook waardevolle inzichten in de verbetering van de landbouwproductie. Het opzetten van een genetisch transformatiesysteem in S. nigrum is dus de basis voor genetische verbetering door middel van transgene en genbewerkingstechnologie.

Er zijn verschillende rapporten die zich richten op de Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde genetische transformatie van S. nigrum 8,9,10,1 1. In ons eerdere werk hebben we een A. tumefaciens LBA4404-gemedieerd genetisch transformatiesysteem voor S. nigrum opgezet en AcMYB110 getransformeerd in S. nigrum, waardoor nieuwe kiemplasma's van S. nigrum met een verhoogd anthocyaninegehalte1 werden verkregen. Transgene en gen-bewerkte S. nigrum-planten werden verkregen met A. tumefaciens EHA105-gemedieerde genetische transformatie10. Verschillende fluorescerende eiwitten hebben groene, rode, gele, oranje en blauwe fluorescentie-emissies en worden veel gebruikt bij het aangeven van cellulaire levensactiviteiten12. In het genetische transformatieproces van planten worden rood fluorescerende genen vaak gebruikt als reportergens om genetisch gemodificeerde gebeurtenissen te onderscheiden van niet-genetisch gemodificeerde gebeurtenissen13. Het gebruik van het DsRed-gen als reportergen maakt het mogelijk om gemakkelijk onderscheid te maken tussen transgene gebeurtenissen, terwijl het gebruik van de R2R3-MYB-transcriptiefactor als reportergen kan worden beïnvloed door het genotype van de planten14. Bij transgene nakomelingen kunnen transgene planten ook gemakkelijk worden onderscheiden van niet-transgene planten met behulp van optische instrumenten (bijv. fluorescentiemicroscopen of beeldvormingssystemen), waardoor identificatie op basis van PCR niet nodig is. Door het fluorescerende eiwitreporter-gen te integreren met CRISPR-genbewerkingstechnologie, werden de vruchtbaarheidsgenen in maïs nauwkeurig verwijderd, wat resulteerde in de oprichting van een nucleaire steriele lijn en een gecontroleerde nucleaire steriele onderhoudslijn15. De zelfbestuiving en vruchtzetting van instandhoudende planten zal 1:1 nakomelingen opleveren van instandhoudende en steriele lijnen. Op basis van verschillende lichtgevende eigenschappen kan een niet-destructieve sortering van onderhouds- en steriele lijnzaden worden bereikt door visuele of machineherkenning15. Het gebruik van het fluorescerende eiwitgen als reportergen vereenvoudigt dus de identificatie van transgene zaden of planten zonder dat PCR-analyse nodig is. Dit is een belangrijk voordeel op het gebied van genetische transformatie. Deze methode heeft tot doel het protocol van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde genetische transformatie in S. nigrum te beschrijven, met behulp van het rood fluorescerende gen, DsRed, als reportergen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Aseptische teelt van zaailingen

OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd op een superschone bank.

  1. Verzamel wilde zaden van S. nigrum in Liaocheng City, China, en noem ze Snlc1. Neem 50 wilde zaden van S. nigrum en doe ze in een centrifugebuis van 2 ml. Na 30 minuten weken in 1 ml 5% gibberelline gooi je de gibberelline-oplossing weg.
  2. Voeg 1 ml 75% ethanol toe, schud gedurende 1 minuut en gooi de ethanol weg.
  3. Voeg 1 ml 2% natriumhypochlorietoplossing toe en desinfecteer het oppervlak van de zaden gedurende 10 minuten. Schud de centrifugebuis grondig om het zaadoppervlak te steriliseren. Gooi na 10 minuten het natriumhypochloriet weg.
  4. Was de zaden 5x met gesteriliseerd water om achtergebleven natriumhypochloriet te verwijderen. Plaats de zaden in petrischaaltjes met een diameter van 90 mm met 1/2 MS vast medium. Kweek de platen in een plantengroeikamer onder een fotoperiode van 16 uur licht/8 uur donker bij 25 °C (Figuur 1A).

2. Cultuur van A. tumefaciens LBA4404

  1. Transformeer de binaire vector pRed130516 met een rood fluorescerend gen, DsRed2, in A. tumefaciens LBA4404 door elektroporatie met MicroPulser met parameters: Spanning 1800 V, Capaciteit 25 μF, Weerstand 200 Ω, Cuvet 1 mm. Kweek de bacteriën op vast LB-medium met 50 mg/l kanamycine en 50 mg/l rifampicine bij 28 °C gedurende 48 uur.
  2. Pak een kloon van LBA4404 met pRed1305 en kweek deze in 1 ml vloeibaar LB-medium met 50 mg/l kanamycine en 50 mg/l rifampicine in een centrifugebuis van 15 ml in een tafelconcentrator met 180 rpm bij 28 °C gedurende 12 uur.
  3. Voeg 50 ml vloeibare LB met hetzelfde antibioticum toe aan 1 ml bacteriële oplossing en kweek vervolgens gedurende 6 uur in een tafelconcentrator met 200 tpm bij 28 °C.
  4. Stop met kweken als de OD600 van het bacteriekweekmedium 0,4 is en centrifugeer de bacterieoplossing vervolgens 10 minuten bij 2200 x g bij 25 °C.
  5. Resuspendeer de gecentrifugeerde bacteriën met infectieoplossing (IS: M519 4,43 g/L, sucrose 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, AS, 100 μmol/L, pH 5,8) en pas de concentratie van de bacteriële oplossing aan op OD600= 0,6 met een spectrofotometer.

3. Explantatie-infectie met A. tumefaciens

OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd op een superschone bank.

  1. Kweek de zaden gedurende 7 dagen totdat de zaadlobben van de zaailingen zich hebben ontvouwd (Figuur 1B). Snijd de twee zaadlobben en het hypocotyl met een lengte van ongeveer 1 cm van de zaailingen af met een gesteriliseerd, scherp scalpel in een kweekschaaltje met filterpapier bevochtigd met bacteriële IS en gooi de primaire wortels weg. Wees voorzichtig bij het gebruik van een scalpel.
  2. Laat de explantaten 30 minuten in de infectieoplossing trekken. Plaats de explantaten op droog filtreerpapier zodat de bacteriële oplossing op het oppervlak van het explantaat kan worden opgenomen.
  3. Plaats de explantaten in een vast medium (0,7% Agar; Figuur 1C). Plaats de explantaten in een plantengroeikamer zonder licht bij 19 °C en kweek gedurende 3 dagen.

4. Differentiatie van explantaten

OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd op een superschone bank.

  1. Pak de explantaten bij 19 °C op uit de plantengroeikamer. Was de explantaten 5x met gesteriliseerd water en leg de explantaten op droog, gesteriliseerd filtreerpapier.
  2. Plaats de explantaten in scheutdifferentiatiemedium (SD: M519 4,43 g/L, sucrose 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5 mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L Agar, pH 5,8) en kweek bij 25 °C gedurende 4 weken (Figuur 1D,E).
  3. Snijd de eelt/knoppen van explantaten die rode fluorescentie vertonen af onder het groene excitatielicht van een draagbare fluorescentielamp met behulp van een scalpel, breng ze vervolgens over naar een nieuw SD-medium en ga verder met kweken gedurende 4 weken bij 25 °C (Figuur 1F,G).

5. Beworteling en verplanten

  1. Snijd de knoppen met rode fluorescentie af met een draagbare fluorescentielamp, breng ze over naar het wortelmedium (RM: M519 4,43 g/L, sucrose 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5 mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L Agar, pH 5,8) en kweek ze gedurende 2-4 weken bij 25 °C om de wortelproductie te bevorderen.
  2. Verplant de zaailingen met rode fluorescentie en een wortellengte van meer dan 2 cm naar de grond (Figuur 1H-K). Verwijder voor het verplanten de agar met de hand van de wortels om overmatige groei van bacteriën in de wortels te voorkomen.

6. Testen van genetisch gemodificeerde T0-planten met PCR-amplificatie

  1. Extraheer het genomische DNA van een onafhankelijke transgene lijn met behulp van de Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) methode17.
  2. Amplificeer het DsRed-gen met primerset, RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAAC-3') en RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') met behulp van 10 ng genomisch DNA als sjabloon in een reactievolume van 15 μL met 7,5 μL 2x PCR Master Mix en 0,3 μL van elke primer (10 μmol/L). Het verwachte DNA-fragment was 393 bp. Onderwerp de PCR-producten aan 1% agarosegelelektroforese om te bepalen of het transgene planten zijn.

7. Identificatie van transgene planten in de T1-generatie met een fluorescentielamp

  1. Oogst de vrucht van T0 transgene planten van S. nigrum die volledig zwartpaars van kleur zijn geworden en knijp vervolgens de zaden in de vrucht met de hand uit. Laat de zaden op natuurlijke wijze ongeveer 1 week aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
  2. Kweek de gedroogde zaden in 1/2 MS medium volgens stap 1.1 t/m 1.4 van dit protocol en plaats ze 1 week in een plantengroeikamer. Onderscheid transgene zaailingen en niet-transgene zaailingen met een draagbare fluorescentielamp.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Genetische transformatie gemedieerd door Agrobacterium tumefaciens om transgene S. nigrum te produceren.
Na het infecteren van de zaadlobben en hypocotylen van S. nigrum zaailingen met A. tumefaciens, konden we bepalen of de Agrobacterium-infectie succesvol was omdat DsRed werd gebruikt als reportergen. Rode fluores...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tot nu toe zijn genetische transformatiemethoden voor S. nigrum, gemedieerd door A. tumefaciens, vastgesteld in verschillende laboratoria 8,9,10,11. De meeste van deze transformatiemethoden gebruiken kanamycine als selectiestof 8,9,10,11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Onderzoeksfonds van de Liaocheng Universiteit (318012028) en de Natural Science Foundation van de provincie Shandong (ZR2020MC034).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2X SanTaq PCR Master Mix (met blauwe kleurstof)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B532061De 2X SanTaq PCR Mix bevat MgCl?, dNTPs, Taq DNA Polymerase, PCR buffer, laadstof en PCR versterker.
6-BASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.C14819266Kunstmatige cytokininen
AgarTianjin Damao Chemical Reagent Partnership Enterprise (Limited Partnership)CAS NR:9002-18-0Soliden
ASSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K914BA0002Induceert efficiënte expressie van Agrobacterium
CarbSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Antibioticum
CefSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I526BA0010Antibioticum
gibberellineSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K514BA0009Bespoedigt de zaadkieming
kanamycineSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I614BA0013Antibioticum
LB-mediumSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113Laat de bacteriën groeien
MicroPulser (Gene Pulser Xcell)Bio-Rad, VS617BR1 06783Gene Pulser Xcell
MS vast mediumphytotech Co., Ltd., VSHCA0519228A Murashige & Skoog Basaal Medium met Vitaminen, M519
plastic doosLiaoSu, ChinaT909HPlantplantdoos
rifampicineSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.S180305Antibioticum
sucroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.CAS NR:57-50-1   Als koolstofbron
Tanon-5200Multi machineTanon Co., Ltd., China5200MultiVersnelde scheiding
wilde Solanum nigrumVerzameld in Liaocheng City
ZTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.J921BA0014Plantengroeiregulatoren

Referenties

  1. Wang, X., et al. Ectopic overexpression of AcMYB110 causes significantly increased content of anthocyanins in Solanum nigrum. Biologia plant. 67, 200-203 (2023).
  2. Boccia, M., et al. A scaffold protein manages the biosynthesis of steroidal defense metabolites in plants. Science. 386 (6728), 1366-1372 (2024).
  3. Peng, C. H., et al. Solanum nigrum polyphenols reduce body weight and body fat by affecting adipocyte and lipid metabolism. Food Funct. 11 (1), 483-492 (2020).
  4. Wang, J., et al. Influence of Cd toxicity on subcellular distribution, chemical forms, and physiological responses of cell wall components towards short-term Cd stress in Solanum nigrum. Environ Sci Pollution Res. 28 (11), 13955-13969 (2021).
  5. Wang, J., et al. Comparative cytology combined with transcriptomic and metabolomic analyses of Solanum nigrum L. in response to Cd toxicity. J Hazardous Mater. 423, 127168(2022).
  6. Lee, E. S., et al. Engineering homoeologs provide a fine scale for quantitative traits in polyploid. Plant Biotech J. 21 (12), 2458-2472 (2023).
  7. Lin, X., et al. Solanum americanum genome-assisted discovery of immune receptors that detect potato late blight pathogen effectors. Nat Genetics. 55 (9), 1579-1588 (2023).
  8. Bhattacharya, A., et al. Engineering gibberellin metabolism in Solanum nigrum L. by ectopic expression of gibberellin oxidase genes. Plant Cell Rep. 31 (5), 945-953 (2012).
  9. Chhon, S., Jeon, J., Kim, J., Park, S. U. Accumulation of Anthocyanins through Overexpression of AtPAP1 in Solanum nigrum Lin (Black Nightshade). Biomolecules. 10 (2), 277(2020).
  10. Park, S., et al. Rapid generation of transgenic and gene-edited Solanum nigrum plants using Agrobacterium-mediated transformation. Plant Biotech Rep. 14 (4), 497-504 (2020).
  11. Peng, W., et al. A convenient, reliable and directly visual selection marker for identifying transgenic lines of Solanum nigrum. Plant Cell Tiss Organ Cult. 152 (2), 369-375 (2023).
  12. Schlechter, R. O., et al. Chromatic Bacteria - A Broad Host-Range Plasmid and Chromosomal Insertion Toolbox for Fluorescent Protein Expression in Bacteria. Front Microbio. 9, 3052(2018).
  13. Hao, H., et al. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Lotus corniculatus using DsRed2 positive selection and vermiculite-based rooting method. Plant Cell Tiss Organ Cult. 156 (2), 58(2024).
  14. Fan, Y., et al. a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Meth. 16 (1), 94(2020).
  15. Qi, X., et al. Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology. Mol Plant. 13 (9), 1262-1269 (2020).
  16. Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell Tiss Organ Cult. 141 (1), 207-216 (2020).
  17. Schenk, J. J., Becklund, L. E., Carey, S. J., Fabre, P. P. What is the "modified" CTAB protocol? Characterizing modifications to the CTAB DNA extraction protocol. Appl Plant Sci. 11 (3), e11517(2023).
  18. Li, Q., et al. An Improved and Simplified Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation Protocol for Solanum nigrum with a Shorter Growth Time. Plants. 13 (15), 2015(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

GenbewerkingCRISPR Cas9PlantenverbeteringTransgene PlantenVisuele MarkerDsRed genRode Fluorescentie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.