Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Wijdverbreide transductie van neocorticale neuronen van muizen door subarachnoïdale injectie van AAV2

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68235

⸱

23 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, 2Faculty of Biology and Biotechnology, National Research University High School of Economics

In dit artikel

Samenvatting

Er wordt een nieuwe techniek beschreven voor wijdverbreide toediening van adeno-geassocieerd virus waarbij gebruik wordt gemaakt van infusie van subarachnoïdaal virus. Deze methode zorgt niet alleen voor wijdverspreide transductie van neocorticale neuronen van muizen in oppervlakkige lagen, maar resulteert ook in selectieve expressie van het transgen in laag vijf piramidale neuronen, zelfs bij gebruik van een niet-selectieve promotor.

Samenvatting

Recombinante adeno-geassocieerde virussen zijn een flexibel en krachtig hulpmiddel voor de afgifte en expressie van verschillende genen die van belang zijn in veel gebieden van de experimentele biologie, met name in de neurowetenschappen. De meest populaire methode om de expressie van een gewenst transgen in een bepaald hersengebied te stimuleren, is door een AAV-vector rechtstreeks in het hersenparenchym te injecteren. Deze methode staat echter geen wijdverbreide neuronale transductie toe die nodig is voor sommige in vivo experimenten. In dit artikel presenteren we een nieuwe techniek voor wijdverspreide genexpressie in de neocortex van muizen op basis van virale infusie in de subarachnoïdale ruimte van de hersenen. Deze neuronale labelingsmethode zorgt niet alleen voor wijdverspreide transductie van neuronen in oppervlakkige neocorticale lagen van volwassen muizen, maar resulteert ook in expressie van het transgen in een grote populatie van laag vijf piramidale neuronen met een hoge specificiteit, zelfs bij gebruik van een sterke niet-selectieve promotor zoals CAG. Omdat celtransductie bovendien op aanzienlijke afstand van de injectieplaats plaatsvindt, kan deze methode helpen hersenweefsel te behouden voor latere optische of elektrofysiologische opnames van neuronale activiteit.

Inleiding

Het brein van zoogdieren bestaat uit vele remmende, prikkelende en modulerende cellen die met elkaar zijn verbonden in circuits door biljoenen synapsen1. Een van de centrale uitdagingen van de neurowetenschappen is het decoderen van de rol van verschillende celtypen in de organisatie en functie van hersencircuits en gedrag. Het manipuleren van genetisch gedefinieerde cellen in de hersenen vereist methoden om transgenen te introduceren en tot expressie te brengen. Virale genafgiftesystemen zijn verreweg de meest effectieve en eenvoudige methode voor genafgifte in het centrale zenuwstelsel2. Virale afgiftesystemen zijn gebaseerd op replicerende virussen (adenovirussen, adeno-geassocieerde virussen (AAV's), lentivirussen en retrovirussen) die het vermogen hebben om genetische informatie in een gastheercel af te leveren 2,3.

Op AAV gebaseerde vectoren zijn nu een van de meest gebruikte hulpmiddelen geworden voor de afgifte van gewenste transgenen aan cellen in de hersenen, zowel voor fundamenteel neurowetenschappelijk onderzoek als voor de ontwikkeling van gentherapie voor neurologische aandoeningen. In vergelijking met andere virussen bezitten AAV's met replicatie-defecten veel eigenschappen die ze tot ideale vectoren voor deze doeleinden maken. Het meest opvallende is dat AAV-vectoren efficiënt niet-delende (terminaal gedifferentieerde) cellen zoals neuronen en gliacellen transduceren, wat resulteert in hoge niveaus van transgenexpressie in vivo2. De vectoren kunnen gemakkelijk worden geproduceerd met een hoge functionele titer die geschikt is voor in vivo gebruik 3,4,5. Belangrijk is dat adeno-geassocieerde virus-gemedieerde genafgifte in vivo geen histopathologische veranderingen en vectorgerelateerde toxiciteit veroorzaakt6. In tegenstelling tot adenovirale vectoren, wekt in vivo toediening van AAV-vectoren in diermodellen meestal geen immuunresponsen van de gastheer op tegen getransduceerde cellen, waardoor stabiele transgenexpressie in het hersenparenchym gedurende langere tijd mogelijk is 2,7,8.

Een andere reden voor de populariteit van AAV-vectoren is het brede scala aan AAV-serotypen met unieke weefsel- en celtypetropismen 9,10,11,12,13,14. Verschillende capside-eiwitten die tot expressie worden gebracht door verschillende AAV-serotypen resulteren in het gebruik van verschillende receptoren op het celoppervlak voor celinvoer en dus specifieke tropismen10,14.

AAV-tropisme wordt niet alleen bepaald door capside-eiwitten, maar ook door vele andere factoren14. Het is aangetoond dat AAV-serotypen 1, 2, 6, 7, 8 en 9 zowel neuronen als astrocyten transduceerden in de primaire cultuur15,16, maar een sterk neuronaal tropisme vertoonden na intraparenchymale herseninjectie17,18. De methode die wordt gebruikt voor de voorbereiding van AAV-vectoren kan ook het tropisme van zenuwcellen beïnvloeden, zelfs voor hetzelfde serotype. CsCl-gezuiverd AAV8 bezat bijvoorbeeld een sterk astrogliaal tropisme na intraparenchymale herseninjectie, terwijl jodixanol-gezuiverd AAV8, geïnjecteerd onder identieke omstandigheden, alleen neuronen transduceerde19. AAV-tropisme kan ook worden beïnvloed door de geïnjecteerde dosis en volume14. rAAV2/1 met hoge titer transduceerde bijvoorbeeld efficiënt zowel corticale excitatoire als remmende neuronen, maar het gebruik van lagere titers bracht een sterke voorkeur voor transductie van corticale remmende neuronen aanhet licht 20.

Het is dus niet mogelijk om een robuuste celtypespecificiteit te bereiken die uitsluitend op het capside-serotype is gebaseerd. Celtype-specifieke promotors kunnen worden gebruikt om het brede natuurlijke tropisme van de AAV-capside te overwinnen. Humaan synapsine I wordt bijvoorbeeld gebruikt voor het richten op neuronen21, de CaMKII-promotor kan transgenexpressie stimuleren in glutamaterge excitatoire neuronen met hoge specificiteit20, de ppHcrt-promotor richt zich op neuronen die hypocretine (HCRT) tot expressie brengen in de laterale hypothalamus22, de PRSx8-promotor richt zich op noradrenerge en adrenerge neuronen die dopamine bèta-hydroxylase23 tot expressie brengen, en de GFAP-promotor kan astrocytspecifieke expressie stimuleren24. Sommige celspecifieke promotors hebben echter een zwakke transcriptieactiviteit en kunnen niet voldoende niveaus van transgenexpressie aansturen25. Bovendien behouden de korte promotors die in AAV-virale vectoren passen vaak geen celtypespecificiteit 1,26. Er is bijvoorbeeld aangetoond dat een CaMKII-construct ook remmende neuronen12 transduceerde.

Naast celtypespecificiteit (tropisme) is een ander belangrijk kenmerk van AAV's de transductie-efficiëntie. De verschillende AAV-serotypen hebben verschillende diffusie-eigenschappen. AAV2 en vier virale vectoren diffunderen minder gemakkelijk door het hersenparenchym en mediëren daarom transductie over een kleiner gebied17,27. De meest voorkomende neuronale transductie wordt waargenomen bij AAV-serotypen 1, 9 en rh.10 11,17,18,19,28.

De meest populaire methode om de expressie van een gewenst transgen in een bepaald hersengebied te stimuleren, is door de AAV-vector rechtstreeks in het interessegebied van de hersenen (parenchym) te injecteren3. Na intraparenchymale injectie transduceren zelfs AAV-serotypen met een effectievere diffusie door de hersenen doorgaans alleen een lokaal gebied rond de injectieplaats 12. Bovendien is intraparenchymale injectie een invasieve procedure en leidt het tot weefselbeschadiging grenzend aan het interessegebied. Deze methode van virusinjectie is dus ongeschikt voor sommige experimentele taken. Uitgebreide labeling van cellen is bijvoorbeeld zeer wenselijk in experimenten die gericht zijn op het bestuderen van corticale neuronfuncties bij vrij bewegende dieren, ook met behulp van één- of twee-fotonmicroscopie 29,30,31,32.

Hier beschrijven we een nieuwe adeno-geassocieerde virusinjectietechniek die subarachnoïdale virusinfusie gebruikt om wijdverspreide transductie van neocorticale neuronen bij volwassen muizen te bieden en hersenweefsel te bewaren voor daaropvolgende optische of elektrofysiologische opnames van neuronale activiteit. Deze methode zorgde niet alleen voor wijdverspreide transductie van neuronen in oppervlakkige neocorticale lagen, maar resulteerde ook in expressie van het transgen in een grote populatie van laag vijf piramidale neuronen met een hoge specificiteit, zelfs bij gebruik van een sterke niet-selectieve promotor zoals CAG.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Experimenten werden uitgevoerd op volwassen C57Black/6-muizen van 2-4 maanden oud, van beide geslachten (Pushchino Breeding Center, tak van het Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry van RAS). Muizen werden gehuisvest in een vivarium met temperatuurregeling (22 °C ± 2 °C, 12 uur licht/donker-cyclus, lichten aan om 08.00 uur) met voedsel en water ad libitum. Alle experimentele procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen en Richtlijn 2010/63/EU voor dierproeven. Het onderzoeksprotocol is goedgekeurd door de Ethische Commissie van de IHNA RAS (protocol N1 vanaf 01.02.2022). Er werd alles aan gedaan om dierenleed tot een minimum te beperken en de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen.

1. Voorbereiding op een operatie

  1. Steriliseer alle chirurgische instrumenten voor het begin van de operatie. Reinig het operatiegebied met 70% ethanol.
  2. Controleer het isofluraangehalte in het anesthesiesysteem en vul het indien nodig bij. Leg een schone papieren handdoek op de bodem van de inductiekamer.
  3. Plaats een verwarmingskussen op het stereotactische frame. Bedek de pad met een schone papieren handdoek.
  4. Maak een fles met 2% bleekmiddel klaar om micropipetpunten, buisjes, wattenstaafjes en andere items die in contact komen met het virus te verzamelen.
  5. Haal een hoeveelheid AAV uit de vriezer van -80 °C en leg deze op ijs om te ontdooien.

2. Voorbereiding van de spuit

  1. Reinig een Hamilton-microspuit van 5 μL met een stompe RN-naald van 33 G. Zuig 70% ethanol aan en doseer vervolgens. Herhaal 3x met verse ethanol. Spoel de spuit af met gedestilleerd water om het overtollige ethanol te verwijderen. Herhaal 3x.
  2. Haal de zuiger eruit en vul het vat met vaselineolie door de flens met behulp van een insulinespuit. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de microspuit zitten.
    OPMERKING: Ingesloten lucht is samendrukbaar en beïnvloedt de nauwkeurigheid en precisie van de spuit.
  3. Plaats de zuiger terug in de microspuit en laat een druppel olie lopen. Plaats de spuit in de stereotactische injector zodat de schaal zichtbaar is voor het controleren van de hoeveelheid toegediende oplossing.

3. Voorbereiding van muizen voor een operatie

  1. Weeg een muis. Plaats de muis in de anesthesie-inductiekamer die is aangesloten op het isofluraan. Zet de isofluraanverdamper aan op 5% en stel het debiet in op 250 ml/min. Een adequate diepte van anesthesie wordt bereikt binnen 5 tot 7 minuten.
  2. Om het chirurgische niveau van anesthesie te verifiëren, controleert u op de afwezigheid van kloppen en terugtrekkingsreflex tijdens een pijnlijke kneep van de achterpoot en de afwezigheid van knipperen bij oogcontact.
  3. Schakel de uitstroomklep van de verdamper van de inductiekamer naar het stereotactische masker. Verlaag het isofluraan tot 1,8%-2,0% en stel het debiet in op basis van het gewicht van de muis (70-90 ml/min voor muizen met een gewicht tussen 25 en 35 g).
  4. Haal de muis uit de inductiekamer en plaats deze in het stereotactische apparaat op een verwarmingskussen (37 °C) om onderkoeling tijdens chirurgische anesthesie te voorkomen. Plaats de voortanden in de tandstang en monteer vervolgens het dierenmasker.
  5. Plaats het dier voorzichtig op de oorstangen. De juiste positie van het hoofd in het stereotactische apparaat maakt verticale maar niet zijwaartse beweging van het hoofd mogelijk. Zorg ervoor dat de positionering van het dier geen ongemak veroorzaakt. Bewaak de diepte van de anesthesie, de ademhaling van de dieren en de lichaamstemperatuur zorgvuldig tijdens de operatie.
  6. Scheer het hoofd van de ogen tot achter de oren. Reinig het geschoren oppervlak van het hoofd door af te strijken met 70% ethanol, gevolgd door een wattenstaafje met een 5% alcoholoplossing van jodium.
  7. Breng oogheelkundige gel aan om uitdroging van de ogen te voorkomen. Breng 4% lidocaïneoplossing topisch en dexamethason (0,02 ml bij 4 mg/ml) subcutaan aan om operatiegerelateerde pijn te voorkomen en de mogelijke ontstekingsreactie te verminderen.
  8. Maak met een steriel scalpelmes en een schaar een 4-5 mm lange incisie langs de middellijn van het hoofd om de hoofdhuid te openen. Begin met een kleine incisie tussen de oren en breid deze vervolgens uit met een schaar om schade aan de schedel te voorkomen.
  9. Veeg het oppervlak van de schedel af met een kleine hoeveelheid 3% waterstofperoxide om de stereotactische oriëntatiepunten te visualiseren: bregma en lambda. Stop de reactie onmiddellijk met 0,9% NaCl zoutoplossing. Schraap weefsels op de schedel weg met een botschraper.
  10. Monteer de vooraf voorbereide gemotoriseerde injector met de Hamilton-spuit op de stereotactische arm. Richt een chirurgische lichtbron op de blootgestelde schedel en richt de microscoop op de bregma.
  11. Kijk door de microscoop en manipuleer de arm van het stereotactische apparaat om de bovenkant van de naald direct boven de bregma te centreren.
  12. Lijn met de punt van de naald de bregma en lambda horizontaal uit en beweeg vervolgens de arm terug naar bregma en noteer de coördinaten. Gebruik deze bregma-coördinaten en de atlascoördinaten van het interessegebied om de relatieve coördinaten van het doelgebied te berekenen.
  13. Verplaats de naald naar het beoogde gebied. Laat de naald zakken bij de nieuwe coördinaten en markeer deze positie. Selecteer de plaats voor virale micro-injectie in de nabijheid van het doelgebied en houd rekening met de verspreiding van het virus.
    OPMERKING: Dit voorkomt beschadiging van het weefsel in het interessegebied. We hebben de volgende coördinaten gebruikt voor het interessegebied: AP-3.4, ML -2.0 en voor virale micro-injectie: AP-2.0, ML -1.4. De bovenstaande coördinaten zijn optimaal als primaire visuele cortexneuronen moeten worden geïnfecteerd.
  14. Vermijd indien mogelijk gebieden met grote bloedvaten. Onder een chirurgische microscoop, heldere, koude lichtverlichting en onderdompeling in 0,9% NaCl-zoutoplossing zouden grote bloedvaten in de schedel en op het hersenoppervlak zichtbaar moeten worden.

4. Virus injectie

  1. Neem een steriele tandboor (0,5 - 0,8 mm in diameter). Bekijk het oppervlak van de schedel door de chirurgische microscoop en boor een kleine craniotomie handmatig (met de hand) of met behulp van een microboor. Zorg ervoor dat u geen overmatige druk op de schedel uitoefent.
  2. Beweeg de arm uit de weg om schade aan de injectiespuitnaald tijdens het boren van de craniotomie (gat) te voorkomen. Breng 0,9% NaCl zoutoplossing onderdompeling aan en pauzeer met tussenpozen om te voorkomen dat het bot wordt verwarmd en de dura mater wordt beschadigd. Gebruik perslucht om botstof weg te blazen.
    OPMERKING: De volgende soorten hardmetalen boren zijn geschikt: peervormig (bij voorkeur), afgeronde cilinder en rond.
    1. Zorg er bij het dunnen van het bot met de boor voor dat het dunner worden over de hele omtrek gelijkmatig is. Dit maakt het gemakkelijker om het bot te verwijderen zonder de dura mater te beschadigen. Gebruik hiervoor eerst een boor met een ronde punt en vervolgens een boor met een platte punt. Houd de boor loodrecht op het bot; Anders wordt de ene kant dunner dan de andere.
      OPMERKING: Bovendien, hoe kleiner de grootte van de boor en hoe kleiner de uitgevoerde craniotomie, hoe complexer de manipulatie zal zijn. Het wordt aanbevolen om een craniotomie met een kleinere diameter (0,5-0,6 mm) uit te voeren wanneer het dier verder wordt gebruikt voor in vivo werk. Als u van plan bent de hersenen van het dier te gebruiken voor ex vivo werk, is een grotere craniotomiediameter acceptabel om de procedure te vereenvoudigen.
  3. Wanneer het uitgedunde bot zacht en transparant is, stop dan met boren. Wanneer zich een voldoende grote inkeping in het bot vormt, stop dan regelmatig de rotatie en controleer de dikte van het bot. Het verschijnen van scheuren in het bot geeft aan dat dunner worden voldoende is.
  4. Baad het gat met steriele zoutoplossing en verwijder vervolgens de overtollige zoutoplossing met een wattenstaafje. Verwijder de resterende laag bot met een naald van 27G met een haakvormige punt en/of met een pincet met fijne punt. Vermijd beschadiging van de dura.
  5. Bedek het oppervlak van de schedel met een steriel stuk keukenpapier bevochtigd met zoutoplossing. Leg een stuk schone, transparante film op het oppervlak van de muizenschedel boven het papier.
  6. Beweeg de stereotactische arm naar achteren en plaats de naald van de microspuit direct boven de film. Doseer de overtollige olie tot een volume van 2 μL is bereikt.
    OPMERKING: Het uiteindelijke volume van de olie kan variëren afhankelijk van het volume van de microspuit. We gebruikten een 5 μL 75-RN Hamilton microspuit.
  7. Pipetteer een hoeveelheid virus die gelijk is aan het geïnjecteerde volume + 2 μl op een stuk transparante folie.
  8. Kijk door de chirurgische microscoop en laat de arm naar beneden zakken totdat de punt van de naald zich in het midden van de druppel van het virus bevindt. Laad het virus in de microspuit met behulp van een gemotoriseerde injector. Gooi de punt van de micropipet en de transparante film weg in de fles met 2% bleekmiddel.
  9. Verwijder het met zoutoplossing bevochtigde papier van het oppervlak van de schedel en droog de schedel af met een wattenstaafje. Gebruik de stereotactische arm om de naald boven de inbrengplaats te plaatsen.
  10. Doseer een druppel van het virus om ervoor te zorgen dat de naald niet verstopt raakt. Maak een kleine spleet in de dura met een naald van 30 G met een haakvormige punt.
    OPMERKING: Het is belangrijk om een zo klein mogelijke spleet in de dura mater te maken, zodat de naald naar binnen kan gaan zonder een opening tussen de naald en de dura mater te laten, waaruit het virus zou kunnen lekken.
  11. Laat de naald van de spuit zakken tot aan de dura en maak de juiste berekeningen voor de diepte. Schat de corticale diepte van de insertie ten opzichte van het punt waarop de naald voor het eerst het oppervlak van de cortex raakte.
  12. Steek de naaldpunt langzaam in de cortex tot een diepte van 300 μm. Wacht 2-3 minuten om de dura aan de naald te laten hechten en trek de naald dan langzaam terug tot een diepte van 200 μm. Wacht nog 2-3 minuten om het hersenweefsel te laten bezinken. Dit heeft tot gevolg dat de naald de dura omhoog trekt, waardoor een subdurale ruimte ontstaat waar het virus zich kan verspreiden.
    OPMERKING: Gebruik een naald van 33 G of een naald van minder G om schade aan de corticale darm tot een minimum te beperken. Houd er rekening mee dat hoe kleiner de binnendiameter van de punt is, hoe groter de kans is dat weefselterugstroming deze verstopt. Het is belangrijk om een botte naald te gebruiken in plaats van afgeschuind, omdat een botte naald een meer gecontroleerde druppel virale oplossing verdrijft.
    1. Als de naald niet door de dura mater gaat wanneer deze wordt verlaagd tot 150-200 μm en in plaats daarvan buigt, stop dan met zakken. Til de naald op en maak een iets grotere incisie in de dura mater, probeer dan de naald opnieuw te laten zakken.
    2. Als hersenvocht actief uit de incisie begint te lekken terwijl de naald wordt neergelaten, wacht dan tot het niet meer lekt; Anders is het moeilijk om de naald die door de dura gaat onder controle te houden. Dep het overtollige hersenvocht af met een weefseltip. Zodra de vloeistof stopt met stromen, tilt u de naald op en probeert u het opnieuw.
  13. Begin met het injecteren van de virale suspensie met een snelheid van 0,06 μl/min terwijl u het afgegeven volume controleert. Injecteer 1 μL virus. Injecteer het virus op een enkele diepte om de verzegeling tussen de naald en het cortexweefsel niet te verbreken.
    1. Probleemoplossing: Aan het begin van de injectie kan het virus terugstromen naar het hersenoppervlak. Stop met injecteren, wacht 2-3 minuten en ga dan door met de virusinjectie. Herhaal deze acties (stappen) totdat de terugstroom van het virus stopt. Virus en hersenvocht blijven aan de naald plakken en voorkomen terugstroming.
    2. Een andere manier om de terugstroming van het virus te stoppen, is door een kleine hoeveelheid agarose op het oppervlak van de cortex te doen. Het onderdrukt de pulsatie van de cortex en helpt ook om de naald af te dichten. Maar zorg ervoor dat de pipet niet verstopt raakt door de agarose.
    3. Aangezien de naald mogelijk niet volledig door de dura mater gaat wanneer deze wordt neergelaten, maar slechts gedeeltelijk, kan het zijn dat één kant van de naald niet strak tegen de dura past, wat terugstroming van het virus kan veroorzaken. Trek in dit geval de naald langzaam terug uit het weefsel en probeer deze opnieuw te laten zakken.
  14. Zodra de infusie is voltooid, houdt u de naald nog 10 minuten op de doellocatie. Hierdoor kan het virus zich buiten de injectieplaats verspreiden. Trek de naald langzaam uit de hersenen om te voorkomen dat het virus terug uit de naald stroomt.
  15. Zodra het terugtrekken van de naald is voltooid, controleert u of deze niet verstopt is door een kleine druppel virus af te geven. Sluit de incisie in de huid met behulp van 5-0 resorbeerbare of niet-resorbeerbare hechtingen.

5. Postoperatieve zorg

  1. Breng na het sluiten van de incisie plaatselijk antibacteriële zalf aan. Injecteer een mengsel van zoutoplossing (5 ml/kg) en 5% glucose (5 ml/kg) subcutaan om uitdroging te voorkomen en het herstel na anesthesie te vergemakkelijken. Injecteer ketoprofen intramusculair (2,5 mg/kg) om pijn te verminderen.
  2. Plaats het dier in een schone kooi op een verwarmingskussen en houd het in de gaten totdat het herstelt van de anesthesie. Nadat de muis reactief is, plaatst u het dier in zijn huiskooi.

6. Histologie

  1. Niet eerder dan 21 dagen na virusinjectie verdooft u muizen diep met isofluraan zoals beschreven in stap 3.
  2. Maak met een smalle schaar een incisie in de middellijn (10 -15 mm) langs het thoracale gebied en leg de borstholte bloot. Haal het middenrif voorzichtig uit elkaar en open de kist met een schaar.
  3. Steek een naald van 22G 1 1/2 in de linkerventrikel en maak met een schaar een incisie in de rechterboezem. Verfuseer met 50 ml voorgekoelde 100 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door 100 ml voorgekoelde 10% gebufferde formaline.
  4. Extraheer voorzichtig het hele muizenbrein. Maak hiervoor met een schaar een sagittale incisie langs het midden van de hoofdhuid. Verwijder vervolgens het schedelbot stuk voor stuk met behulp van een bottang met platte punten, beginnend bij de kruising van de sagittale en lambdoïde hechtingen en naar voren werkend naar het neusbot. Wanneer de hersenen worden blootgesteld, snijdt u de bulbus olfactorius door, haalt u de hersenen eruit met een gebogen spatel en laat u deze in een tube van 50 ml vallen met 10% gebufferde formaline.
  5. Repareer de hersenen 's nachts. Monteer het hersenweefsel op een metalen platform van een Vibratome met behulp van weefsellijm. Snijd frontale secties met een dikte van 50 μm met behulp van koolstofstalen messen.

7. Immunokleuring

  1. Dag 1
    1. Was de plakjes hersenen 3x gedurende 5 minuten elk met 1x PBS met 0,3% Triton X-100 (PBS-T). Incubeer de secties in PBS-T gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    2. Blokkeer niet-specifieke binding gedurende 1 uur bij RT met behulp van een blokkerende buffer bestaande uit 5% normaal geitenserum (NGS) en 0,3% Triton X-100 in 1x PBS.
    3. Incubeer de coupes een nacht bij 4 °C met primaire antilichamen tegen parvalbumine of calbindin verdund 1:500 in de blokkeerbuffer (5% NGS en 0,3% Triton X-100 in 1x PBS).
  2. Dag 2
    1. Was de secties 3x gedurende 10 minuten in PBS-T. Incubeer in het donker gedurende 2 uur bij RT met secundaire antilichamen (Geit anti-Konijn IgG (H+L) Cross-Adsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 546) verdund 1:500 in de blokkeerbuffer (5% NGS en 0,3% Triton X-100 in 1x PBS).
    2. Was de secties 3x gedurende 5 minuten elk in 1x PBS. Breng hersenschijfjes over op glazen dia's met behulp van een zachte borstel.
    3. Voeg onmiddellijk 0,1 ml antifade-montagemedium toe aan elke sectie. Dek de plakjes af met een dekglaasje van 22 mm x 50 mm.
    4. Configureer de confocale microscoop op een vergroting van 20x of 60x (A/1.4, olie). Gebruik lasers met een golflengte van 488 nm en 594 nm om meerkanaalsbeelden van de interessegebieden te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In een pilotreeks experimenten gebruikten we de traditionele intracorticale injectiemethode om laag vijf piramidale neuronen in de neocortex van de muis te transduceren door AAV2 die het snelle channelrhodopsine (oChIEF) -gen draagt dat is gefuseerd met EGFP fluorescerend eiwit onder de CaMKII-promotor. In overeenstemming met het karakteristieke kenmerk van AAV212 verkregen we een relatief klein infectiegebied, niet meer dan 1 mm breed (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben een nieuwe methode ontwikkeld voor het transduceren van neocorticale neuronen van muizen door een suspensie van AAV2-virale deeltjes in de subarachnoïdale ruimte van de hersenen te injecteren. Dit zorgt voor een wijdverbreide virusverspreiding, bijna viervoudig groter dan het geïnfecteerde weefselvolume wanneer dezelfde hoeveelheid virus rechtstreeks in het hersenparenchym wordt geïnjecteerd.

Injectie van virusvectoren rechtstreeks in het hersenvocht...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Het werk werd uitgevoerd met financiële steun van de Russian Science Foundation, subsidie 20-15-00398P.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
10 µL Gastight Syringe Model 1701 RN (5 uL 75 RN Hamilton microsyringe)Hamilton CompanyPart/REF # 7634-01, Hamilton of cat nr. HAM7634-01, Merck
33 G RN needle, point style 3Hamilton CompanyPart/REF # 7803-05, Hamilton
Binocular MicroscopeNikon of MicromedModel MC-4 ZOOM
Cerna-based laser scanning confocal microscopeThorLabs
Cold light sourceRWDModel 76312
Leica VT1000 S Vibrating blade microtomeLeica Biosystems76001-014
Low-Flow Anesthesia System with starter kitKent Scientific Corporation13-005-111 (Model SomnoSuite)
Mechanical Pipette 0.1 – 2.5 µL Eppendorf Research plusEppendorf3123000012
Mechanical Pipette 10 – 100 µL Eppendorf Research plusEppendorf3123000047
Mice ShaverRWDModel CP-5200
Microdrill with drill bits (0.5 mm, round)RWD78001, 78040
or Desctop Digital Stereotaxic Instrument, Mouse anesthesia Mask, Mouse ear bars (60 Deg)RWDModels 68027, 68665, 68306
Air CompressorBambiBB8
Single Channel Manual Pipette 0.5-10 µLRAINN17008649
Small Animal Stereotaxic InstrumentKOPFModel 962
Stereotaxic InjectorStoelting10-000-004
Surgical Instruments (Tools)
30 G dental needle (Ni-pro)Biodent Co. Ltd.Om de dura te spleet
Bone scraperFine Science Tools10075-16
Bone pliersFine Science Tools16025-14Om het craniale bot te verwijderen
Curved spatulaeMozhaisk Medical Supplies FactoryOm de hersenen uit de hersenpan te verwijderen
Dental burDRENDEL + ZWEILINGVoor craniotomie; Vorm: peervormig/cilinder met ronde uiteinden/rond; Tip Diameter: 0,55-0,8 mm diameter
Needle holder (Halsey Micro Needle Holder)Fine Science Tools12500-12
Polypropylene Surgical Suture of Surgical Suture Vicryl (5-0, absorbable)Walter Products (Ethicon)S139044 (W9442)
Scalpel handle (#3) with scalpel blades (#11)Fine Science Tools10003-12, 10011-00
Scissors (Extra Narrow Scissors)Fine Science Tools14088-10om de huid te snijden
Scissors (Fine Scissors)Fine Science Tools14094-11om de hechting te snijden
Surgical suture PROLENE (Polyproptlene)Ethicon (Johnson & Johnson)
Tweezers (Forceps #5)Fine Science Tools11252-20
Tweezers (Polished Inox Forceps)Fine Science Tools11210-20
Disposables
1 mL insulin syringeSITEKMEDOm vaseline olie in een microsyringe te laden, om medicijnen toe te dienen
Cell Culture PlateSPL Life Science
Cotton swabs
Cover GlassesFisher Scientific12-545E
Insulin syringe needle (27 G)SITEKMEDOm puin uit een gat te verwijderen (craniotomy)
Lint-free wipes CLEANWIPERNetLink
Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Paper towelsLuscan
ParafilmStatLabSTLPM996
Sterile Surgical GlovesDermagrip
Sterile Syringe Filter (0.2 μm)Corning431229
Drugs/Chemicals (Reagents)
10% buffered formalin of 4% paraformaldehydeThermo Scientific ChemicalsJ61899.AK
Alcohol solution of iodine (5%))Renewal
Antibiotic ointment Baneocin (bacitracin + neomycin)SandozAntibacterieel middel voor uitwendig gebruik
Aqua PolymountPoly-sciences18606-20
Carbomer Eye Gel Vidisic (Ophthalmic gel)BAUSCH+LOMB (Santen)
Carboxylate-Modified FluoSphere Microspheres (red)Thermo Fisher ScientificF-8801
Dexamethasone (4 mg/mL)Ellara (KRKA)Synthetisch glucocorticoïd
Distilled H2O
Ethanol (70%)
Flexoprofen 2.5% (Ketoprofen)VICNonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs)
Glucose solution 5%Solopharm
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA-11010
IsofluraneKarizoo
lidocaine solution (2 % / 4%)Solopharm
Normal Goat Serum (NGS)Abcamab7481
Phosphate Buffered Saline (PBS)Eco-servis
Rabbit Anti-Parvalbumin AntibodyMerck MilliporeAB15736
Rabbit Recombinant Monoclonal anti-Calbindin antibodyAbcamab108404
Saline (0.9% NaCl in H2O)Solopharm
Triton X-100Sigma-Aldrich50-178-1844
Vaseline oilGenel

Referenties

  1. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
  2. Sena-Esteves, M., Gao, G. Introducing Genes into Mammalian Cells: Viral Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (8), (2020).
  3. Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene Therapy with Viral Vectors. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 43 (1), 413-439 (2003).
  4. Paterna, J. C., Feldon, J., Büeler, H. Transduction profiles of recombinant adeno-associated virus vectors derived from serotypes 2 and 5 in the nigrostriatal system of rats. J Virol. 78 (13), 6808-6817 (2004).
  5. Monahan, P. E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus vectors for gene therapy: more pros than cons. Mol Med Today. 6 (11), 433-440 (2000).
  6. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21 (4), 583-593 (2008).
  7. Jooss, K., Chirmule, N. Immunity to adenovirus and adeno-associated viral vectors: implications for gene therapy. Gene Ther. 10 (11), 955-963 (2003).
  8. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L. 3rd, Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  9. Gao, G., Vandenberghe, L., Wilson, J. New Recombinant Serotypes of AAV Vectors. Curr Gene Ther. 5 (3), 285-297 (2005).
  10. Büning, H., Perabo, L., Coutelle, O., Quadt-Humme, S., Hallek, M. Recent developments in adeno-associated virus vector technology. J Gene Med. 10 (7), 717-733 (2008).
  11. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PloS One. 8 (9), e76310-e76310 (2013).
  12. Watakabe, A., et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neurosci Res. 93, 144-157 (2015).
  13. de Solis, C. A., et al. Adeno-associated viral serotypes differentially transduce inhibitory neurons within the rat amygdala. Brain Res. 1672, 148-162 (2017).
  14. Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV Tropism in the Nervous System with Natural and Engineered Capsids. Meth Mol Biol. 1382, 133-149 (2016).
  15. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
  16. Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
  17. Burger, C., et al. Recombinant AAV Viral Vectors Pseudotyped with Viral Capsids from Serotypes 1, 2, and 5 Display Differential Efficiency and Cell Tropism after Delivery to Different Regions of the Central Nervous System. Mol Ther. 10 (2), 302-317 (2004).
  18. Cearley, C. N., Wolfe, J. H. Transduction characteristics of adeno-associated virus vectors expressing cap serotypes 7, 8, 9, and Rh10 in the mouse brain. Mol Ther. 13 (3), 528-537 (2006).
  19. Klein, R. L., Dayton, R. D., Tatom, J. B., Henderson, K. M., Henning, P. P. AAV8, 9, Rh10, Rh43 vector gene transfer in the rat brain: effects of serotype, promoter and purification method. Mol Ther. 16 (1), 89-96 (2008).
  20. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  21. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  22. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  23. Abbott, S. B. G., et al. Photostimulation of retrotrapezoid nucleus phox2b-expressing neurons in vivo produces long-lasting activation of breathing in rats. J Neurosci. 29 (18), 5806-5819 (2009).
  24. Lawlor, P. A., Bland, R. J., Mouravlev, A., Young, D., During, M. J. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Mol Ther. 17 (10), 1692-1702 (2009).
  25. Adamantidis, A. R., Zhang, F., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetics: Opsins and Optical Interfaces in Neuroscience. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (8), (2014).
  26. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat Protoc. 5 (3), 439-456 (2010).
  27. Passini, M. A., Watson, D. J., Wolfe, J. H. Gene Delivery to the Mouse Brain with Adeno-Associated Virus. Methods Mol Biol. 246, 225-236 (2004).
  28. Davidson, B. L., et al. Recombinant adeno-associated virus type 2, 4, and 5 vectors: Transduction of variant cell types and regions in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci. 97 (7), 3428-3432 (2000).
  29. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  30. Harris, K. D., Shepherd, G. M. G. The neocortical circuit: themes and variations. Nat Neurosci. 18 (2), 170-181 (2015).
  31. Carrillo-Reid, L., Yang, W., Kang Miller, J., Peterka, D. S., Yuste, R. Imaging and Optically Manipulating Neuronal Ensembles. Ann Rev Biophy. 46 (1), 271-293 (2017).
  32. Smirnov, I. V., et al. Plasticity of Response Properties of Mouse Visual Cortex Neurons Induced by Optogenetic Tetanization In Vivo. Curr Issues Mol Biol. 46 (4), 3294-3312 (2024).
  33. Snyder, B. R., et al. Comparison of Adeno-Associated Viral Vector Serotypes for Spinal Cord and Motor Neuron Gene Delivery. Human Gene Ther. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  34. Schuster, D. J., et al. Biodistribution of adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vector after intrathecal and intravenous delivery in mouse. Front Neuroanat. 8, 42(2014).
  35. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral Strategies for Targeting the Central and Peripheral Nervous Systems. Ann Rev Neurosci. 41 (1), 323-348 (2018).
  36. Lo, W. D., et al. Adeno-Associated Virus-Mediated Gene Transfer to the Brain: Duration and Modulation of Expression. Human Gene Ther. 10 (2), 201-213 (1999).
  37. Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., McCown, T. J., Ju de Samulski, R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
  38. Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 55-73 (2009).
  39. Daci, R., Flotte, T. R. Delivery of Adeno-Associated Virus Vectors to the Central Nervous System for Correction of Single Gene Disorders. Int J Mol Sci. 25 (2), 1050(2024).
  40. Dasgupta, K., Jeong, J. Developmental biology of the meninges. Genesis. 57 (5), e23288-e23288 (2019).
  41. Mestre, H., Mori, Y., Nedergaard, M. The Brain's Glymphatic System: Current Controversies. Trends Neurosci. 43 (7), 458-466 (2020).
  42. Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
  43. Hordeaux, J., et al. Long-term neurologic and cardiac correction by intrathecal gene therapy in Pompe disease. Acta Neuropathol Comm. 5 (1), 66(2017).
  44. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
  45. Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood-brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. Mol Ther. 19 (8), 1440-1448 (2011).
  46. Radhiyanti, P. T., Konno, A., Matsuzaki, Y., Hirai, H. Comparative study of neuron-specific promoters in mouse brain transduced by intravenously administered AAV-PHP.eB. Neurosci Lett. 756, 135956(2021).
  47. Li, X., et al. Skin suturing and cortical surface viral infusion improves imaging of neuronal ensemble activity with head-mounted miniature microscopes. J Neurosci Meth. 291, 238-248 (2017).
  48. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nat Comm. 10 (1), 4174(2019).
  49. Thomson, A. M. Neocortical layer 6, a review. Front Neuroanat. 4, 13(2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

AAV2 transductieneocortex van de muisneuronale labelingaflevering van virale vectorenpiramidale neuronenstereotaxische injectiecorticale lagengenexpressiefluorescentie labeling
Wijdverbreide transductie van neocorticale neuronen van muizen door subarachnoïdale injectie van AAV2
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.