Workflow met behulp van een cryogene samenvallende fluorescentie-, elektronen- en ionenbundelmicroscoop voor het gericht frezen van cellen

Samenvatting

Deze workflow maakt lamellenproductie mogelijk die gericht is op fluorescerend gelabelde biologische structuren die klein (<1 μm in axiale omvang) en zeldzaam (1 kopie per cel) zijn met behulp van een cryogeen tri-samenvallend beeldvormingsplatform. Dit platform integreert fluorescentiemicroscopie, gefocusseerd ionenbundelfrezen en scanning-elektronenmicroscopie op een enkele brandpuntspositie en maakt gelijktijdige fluorescentiemicroscopie tijdens het malen mogelijk.

Samenvatting

Cryogeen gefocusseerd ionenbundelfrezen met scanning-elektronenmicroscopie (CryoFIB-SEM) is de dominante benadering geworden voor het voorbereiden van sub-200 nm dikke lamellen van cellen voor cryogene elektronentomografie (CryoET). Onlangs is fluorescentiemicroscopie opgenomen in CryoFIB-SEM-systemen om de productie van lamellen naar fluorescerend gelabelde doelen te leiden. In de meeste implementaties hebben de optische beeldvormingssystemen en ionenbundels echter verschillende brandpuntsvlakken in verschillende delen van de vacuümkamer, die effectief functioneren als twee afzonderlijke microscopen. Deze configuratie vereist beeldregistratie tussen modaliteiten, die vaak niet de nauwkeurigheid heeft die nodig is om kleine, zeldzame structuren in situ betrouwbaar te targeten. We presenteren een workflow op basis van een op maat gemaakt driedimensionaal beeldvormingsplatform dat gelijktijdige fluorescentiebeeldvorming en gefocusseerd ionenbundelfrezen mogelijk maakt. Dit zorgt voor real-time fluorescentiefeedback die kan worden gebruikt om te bepalen wanneer het frezen moet worden beëindigd om fluorescerend gelabelde structuren van belang in de uiteindelijke lamel te behouden. Met behulp van deze aanpak richtten we ons op het microtubuli-organiserende centrum (MTOC) in verglaasde macrofagen en bereikten we een slagingspercentage van >60%, bevestigd door daaropvolgende cryogene elektronentomografie en correlatieve licht- en elektronenmicroscopie.

Inleiding

Cryogene elektronentomografie (CryoET) maakt visualisatie mogelijk van biologische monsters in een bijna-natuurlijke toestand met een macromoleculaire resolutie^van 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . De dikte van eukaryote cellen - vaak enkele microns - overschrijdt echter het gemiddelde vrije pad (~300 nm) van 300 kV-elektronen, waardoor de penetratiediepte van niet-verstrooide elektronen wordt beperkt en daardoor de bruikbare monsterdikte wordt beperkt. Om dit aan te pakken, kan een gefocusseerde ionenbundel (FIB) worden gebruikt om het grootste deel van de cryogeen geconserveerde cel te ablateren in een proces dat bekend staat als CryoFIB-frezen, waarbij lamellen worden geproduceerd die dun genoeg zijn voor CryoET-beeldvorming 12,13,14,15,16.

In eerder gerapporteerde workflows worden monsters eerst bewaard in verglaasd ijs via duikbevriezing 17,18,19 en vervolgens geladen in een instrument met dubbele bundel dat is uitgerust met zowel een CryoFIB- als een scanning-elektronenmicroscoop (SEM). SEM-beeldvorming kan worden gebruikt om subcellulaire kenmerken van belang te identificeren, zoals organellen en zelfs sommige eiwitachtige structuren^20,21. Deze informatie kan worden gebruikt om het CryoFIB-freesproces te sturen, waarbij het monster stapsgewijs wordt geablateerd met als doel een lamel van minder dan 200 nm dik te produceren die geschikt is voor CryoET 13,14,22. Deze aanpak brengt echter twee belangrijke uitdagingen met zich mee die in het huidige protocol worden aangepakt. Ten eerste is het vaak nodig om CryoET van specifieke eiwitachtige structuren te verkrijgen, maar de SEM kan schadelijk zijn en de meeste eiwitachtige structuren zijn niet waarneembaar door de SEM bij het afbeelden van ongekleurd biologisch materiaal. Hoe kan het frezen op een schadevrije manier nauwkeurig worden geleid naar specifieke subcellulaire gebieden of gebieden die specifieke biomoleculen bevatten? Ten tweede kan het, zelfs na de productie van dunne lamellen en de daaropvolgende CryoET, een uitdaging zijn om specifieke biomoleculen in de uiteindelijke reconstructies te identificeren vanwege onvoldoende resolutie, signaal-ruisverhouding en/of contrast die nodig zijn voor de ondubbelzinnige identificatie. Hoe kunnen de ruimtelijke posities van deze biomoleculen worden bepaald binnen cryo-ET-reconstructies?

Om beide uitdagingen aan te gaan, is het veld steeds meer overgestapt op fluorescentiemicroscopie. Genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten of exogene kleurstoffen die doeleiwitten binden, worden routinematig gebruikt om specifieke biomoleculen van belang te labelen ^5,23,24. Cryogene fluorescentiemicroscopie van verglaasde cellen die na het malen worden genomen, kan worden gecorreleerd met de resulterende tomogrammen. Deze benadering, bekend als cryogene correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CryoCLEM), is goed ingeburgerd en wordt veel gebruikt om specifieke eiwitten te lokaliseren binnen CryoET-reconstructies 5,12,23,24. Recente ontwikkelingen zijn onder meer het gebruik van fluorescerende biosensoren en superresolutiemethoden om aanvullende informatie en ruimtelijke precisie te verbeteren 25,26,27,28,29.

CryoCLEM is een manier om de tweede hierboven geïdentificeerde uitdaging te overwinnen, waardoor de locatie van specifieke eiwitten in de lamel kan worden bepaald. CryoCLEM doet echter niets voor de gebruiker als de uiteindelijke lamel niet de eiwitten bevat die van belang zijn. Gelukkig kan fluorescentiemicroscopie ook worden gebruikt om het frezen naar gelabelde interessegebieden te leiden. Hoewel fluorescerend geleid FIB-frezen een nieuwere ontwikkeling is dan CryoCLEM, zijn de eerste workflows ongeveer tien jaar geleden ontstaan¹², het is snel en wijdverbreid toegepast. De vroege protocollen vertrouwden op externe lichtmicroscopen om 2D- of 3D-fluorescentiedatasets te verkrijgen, die vervolgens werden geregistreerd op SEM- en ionenbundelbeelden nadat het monster naar de CryoFIB-SEM was overgebracht. Meer recentelijk zijn fluorescentiemicroscopen rechtstreeks geïntegreerd in CryoFIB-SEM-vacuümkamers. Deze integratie vermindert ijsverontreiniging tijdens het overbrengen en maakt het mogelijk om de uiteindelijke lamel gemakkelijker in beeld te brengen. Er zijn nu verschillende platforms ontwikkeld om fluorescentiemicroscopie te combineren met CryoFIB-SEM voor fluorescentiegeleid frezen. Deze hebben zich met succes gericht op organellen en grote eiwitcomplexen ^5,23,24. Op enkele uitzonderingen na³⁰ produceert het optische pad echter een apart brandvlak in een ander fysiek gebied van de vacuümkamer dan de FIB-SEM. Als gevolg hiervan is een nauwkeurige registratie tussen fluorescentie- en ionenbeelden nog steeds vereist om het frezen te sturen, net zoals vereist is bij het gebruik van stand-alone optische microscopen.

Dit registratieproces is gevoelig voor onnauwkeurigheid als gevolg van drie belangrijke factoren: mismatches in de brekingsindex (die schijnbare focale verschuivingen veroorzaken)^31,32, beweging van het monster tijdens het frezen en lokalisatiefouten. Verder wordt de registratie meestal ondersteund door fluorescerende fiducials ter grootte van een micron die zichtbaar zijn in zowel ionen- als optische modaliteiten en worden gebruikt als uitlijnpuntparen om transformaties tussen het ion en de optische beelden te berekenen. Deze kralen kunnen echter het fluorescentiesignaal van het monster verdoezelen of ermee concurreren, en hun lokalisatie en uitlijning over optische en ionenbeelden is traag en gebruikersintensief. Samen hebben deze beperkingen de routinematige targeting van kleine en zeldzame functies belemmerd. Hoewel het moeilijk is om een precieze limiet te definiëren voor de structuren die momenteel in dunne lamellen kunnen worden bewaard, worden op registratie gebaseerde benaderingen over het algemeen als ineffectief beschouwd voor het vastleggen van doelen met axiale afmetingen van minder dan één micron³³.

Hier rapporteren we het gebruik van een drievoudig samenvallend beeldvormingssysteem dat FIB-, SEM- en fluorescentiemicroscopie integreert op een enkele focale positie^34,35. Deze configuratie maakt eenvoudiger en nauwkeuriger fluorescentiegeleid frezen mogelijk in vergelijking met niet-samenvallende integraties, doordat het niet meer nodig is om optische en ionenbeelden te registreren. Onder ideale omstandigheden met een lage achtergrond en een hoog signaal kan een geleidingsnauwkeurigheid in de orde van grootte van 10 nm worden bereikt³⁶. Het maakt het ook mogelijk om tijdens het maalproces meerkleurige cryogene fluorescentiemicroscopiegegevens te verkrijgen, inclusief van de uiteindelijke dunne lamel, waardoor correlatieve analyse en lokalisatie van subdiffractie-beperkte doelen mogelijk is³⁵. Om dit te bereiken, gebruiken we een op maat gemaakte toolkit voor beeldtransformatie om deze fluorescentiebeelden nauwkeurig uit te lijnen met transmissie-elektronenmicroscopie met een lage vergroting om te bepalen waar CryoET moet worden verzameld, waardoor de gegevensverzameling wordt gestroomlijnd en het vastleggen van doelen in de uiteindelijke tomografische reconstructies wordt gegarandeerd.

Om het frezen te begeleiden, maken we gebruik van het vermogen van het systeem om veranderingen in fluorescentie-intensiteit in realtime te volgen. In plaats van te proberen optische en ionenbeelden op één lijn te brengen om ons doel te vinden, kijkt de gebruiker gewoon naar het fluorescerende signaal van het monster. Naarmate het frezen vordert, gedraagt de fluorescentie zich op een zeer karakteristieke manier: het wordt eerst helderder als de koolstofsteunfilm tussen het microscoopobjectief en het fluorescerend gelabelde monster wordt verwijderd, neemt vervolgens geleidelijk af als onscherp autofluorescerend materiaal wordt weggefreesd, en neemt ten slotte sterk af als de gelabelde structuur zelf gedeeltelijk wordt verwijderd. Dit real-time signaal bepaalt precies waar men zich in het freesproces bevindt en wanneer het frezen moet worden gestopt, zodat het doel van belang binnen de uiteindelijke lamel³⁷ behouden blijft. In het gedetailleerde protocol zullen we ook een meer geavanceerde benadering bespreken die oscillaties in fluorescentiehelderheid als gevolg van interferometrische effecten gebruikt om het frezen te geleiden naar objecten met een axiale omvang van <300 nm.

We demonstreren het nut van het platform door ons te richten op het microtubuli-organiserend centrum (MTOC)³⁸. De MTOC is een cruciaal organel dat betrokken is bij celdeling en differentiatie. In zoogdiercellen onthult fluorescentiemicroscopie van gelabelde tubuline de MTOC als een enkel fluorescerend punctum met een diameter van ongeveer 1 μm in levende cellen. Deze aanpak is gebruikt om de MTOC met hoge getrouwheid te lokaliseren voor dunne lamellen van verglaasde cellen. De gedetailleerde organisatie van microtubuli in het MTOC en hun interacties met andere organellen worden onthuld in latere tomografische reconstructies. Deze workflow maakt zeer nauwkeurige correlatieve fluorescentiemicroscopie en CryoFIB-SEM mogelijk zonder registratie, waardoor de invoer van gebruikers wordt verminderd en de toegang tot cellulaire structuren die voorheen onbetaalbaar klein waren, wordt uitgebreid om robuust vast te leggen met niet-samenvallende benaderingen.

Definities en beschrijving van het instrument
De geïntegreerde optische microscoop is in detail beschreven in Boltje et ^al.35, en meer details over het gebruik van de geïntegreerde microscoop zijn te vinden in een recent gepubliceerd protocol³⁴. Het objectief is van onderaf geïntegreerd en uitgerust met x-, y- en z-positioneringsmogelijkheden om uitlijning met het FIB-SEM-samenvallende punt mogelijk te maken. Het werkt momenteel met een 100x, 0,85 NA objectief met een dekglaasjescorrector. Optische beeldvorming wordt uitgevoerd door een dekglas, dat het objectief beschermt tegen gesputterd materiaal en bestraling van zowel de FIB als de SEM. Breedveldverlichting wordt verzorgd door een set LED's die meerdere zichtbare golflengten beslaan. Fluorescentiedetectie wordt bereikt met behulp van een sCMOS-detector. Er zijn drie gedefinieerde faseposities: laden: de fasepositie waar het monster wordt geladen; coating: de podiumpositie voor het coaten via het gasinjectiesysteem; 3-Beam: de stagepositie waarvoor alle drie de (FIB, SEM en optische) microscopen samen kunnen worden uitgelijnd.

Protocol

OPMERKING: Het drievoudige samenvallende systeem dat hier wordt gebruikt, is een op maat gemaakte cryogene fluorescentiebeeldvormingscomponent die is geïntegreerd in een in de handel verkrijgbaar FIB-SEM-systeem met dubbele bundel. Het principe en de volgorde van operaties kunnen in het algemeen worden aangepast aan toekomstige drievoudige samenvallende implementaties.

1. Instellen

1. Koel het systeem af tot cryogene temperatuur. Bewaak de temperatuur met behulp van twee sensoren: één op de monstertrap en de andere in de kamer. Houd de monsterfase ongeveer 20 °C warmer dan de kamer (bijv. fase bij ~-170 °C, kamer bij ~-190 °C) om ijsvorming op het monster te minimaliseren. Het koelproces duurt doorgaans ongeveer 1,5 uur.

2. Monster laden

1. Gebruik vloeibare stikstof om het overslagstation handmatig af te koelen zodra de systeemtemperatuur de cryogene temperatuur nadert (ongeveer -167,5 °C). De systeemtemperatuur wordt weergegeven in de linkerbovenhoek van de lichtmicroscopiesoftware.
2. Laad een geclipte Autogrid in de monstercassette die is ontworpen voor het cryogene lichtmicroscopiesysteem. De cassette bestaat uit een gelijmd dekstrookje en een afstandsstuk, met de Autogrid ertussen. Sluit de cassette door de ringschroef vast te draaien en plaats deze vervolgens in de gleuf op het overdrachtsstation³⁴.
3. Sluit het overdrachtsstation aan op het systeem en gebruik de interne kamercamera om de monstercassette naar de monstertafel te leiden.

3. Gasinjectiesysteem (GIS) voor monstercoating

1. Open de besturingssoftware voor lichtmicroscopie en verplaats de monsterfase van de positie Laden naar Coaten .
2. Plaats de GIS-naald met behulp van de FIB-SEM-besturingssoftware door op het sneeuwvlokpictogram te klikken. Kies bij GIS-besturing de optie GIS-naald invoegen.
3. Laat GIS-afzetting gedurende 30 s toe door de gasstroom te openen.
   OPMERKING: Dit varieert van 20 s tot 1 min, afhankelijk van het monstertype. Het doel van deze stap is om het monster voldoende te beschermen tijdens de daaropvolgende FIB-freesprocedure.
4. Trek de GIS-naald in en verplaats de monstertrap terug naar de vooraf gedefinieerde laadpositie .

4. Uitlijning van het systeem met drie balken

OPMERKING: Dit gedeelte is een bewerking van Wang³⁹.

1. Verplaats in de lichtmicroscopiesoftware de monsterfase van de laadpositie naar de vooraf gedefinieerde positie met 3 bundels .
2. Klik in de FIB-SEM-software op het venster linksboven en stel de SEM in op een vergroting van 100x.
3. Klik op het tabblad Uitlijning van de lichtmicroscopiesoftware op de functie Weergave om een SEM-atlas van het raster te verkrijgen. Deze atlasafbeelding maakt gebruik van vooraf ingestelde parameters.
4. Identificeer een vierkant gebied met gebroken koolstoffilm en dubbelklik erop om de voorbeeldfase naar die locatie te verplaatsen.
5. Keer terug naar de FIB-SEM-besturingssoftware en stel de SEM in op een hogere vergroting om scherp te stellen op het geselecteerde vierkante gebied, gecentreerd in het gezichtsveld.
6. Herhaal stap 4.4 en 4.5 indien nodig totdat de SEM is gericht op een herkenbaar patroon, zoals de scherpe rand van een gebroken koolstoffilm.
7. Schakel de fluorescentiemicroscoop in en pas de x-, y- en z-coördinaten aan zodat ze overeenkomen met de SEM-weergave.
8. Frees met de FIB een klein patroon, bijvoorbeeld een kleine rechthoek of cirkel.
9. Controleer of het patroon zichtbaar is in zowel de FIB- als de fluorescerende microscoopweergaven. Pas indien nodig de uitlijning aan door indien nodig de stappen 4.3-4.7 te volgen.
   OPMERKING: De uitlijning en registratie van de optische en ionenmicroscopen zijn voltooid.

5. Lokalisatie en frezen van doelen

OPMERKING: Dit gedeelte is een bewerking van Wang³⁹.

1. Ga verder naar het tabblad Lokalisatie in de lichtmicroscopiesoftware en stel fluorescerende kanalen in door de juiste excitatie- en filtercondities te activeren. Wijs elke fluorofoor toe als een afzonderlijk kanaal en voeg een extra kanaal toe voor doorgelaten licht (of helderveld).
2. Identificeer het gewenste doel door het LED-vermogen en de belichtingstijd voor elk fluorescerend kanaal af te stemmen. Gebruik ter referentie bij het afbeelden van SiR-tubuline een belichting van 1,2 s met een constant LED-vermogen van 30 mW.
   OPMERKING: Parameters kunnen variëren tussen fluoroforen. De optische intensiteit moet bij het monster onder ~25-50 W/^cm2 blijven. Een grotere intensiteit kan leiden tot aanzienlijke verhitting en devitrificatie van het monster^37,40.
3. Als u tevreden bent met de parameters, schaft u een voorfrees fluorescerende z-stack aan die door de axiale richting stapt. Markeer vervolgens het doel als een ROI.
4. Schakel over naar de FIB-SEM-software om een lamel te tekenen bij de ROI.
5. Voer ruw frezen uit om het grootste deel van het materiaal ongeveer 3 μm boven en onder de ROI te verwijderen. Houd ondertussen de fluorescentiemicroscoop aan tijdens het frezen om een afname van het fluorescerende signaal te controleren.
6. Verdun de ROI tot ~2 μm met behulp van de reinigingsdoorsnedemodus.
7. Open de op Python gebaseerde interferometrische toolkit vanaf de terminal om het fluorescerende signaal te controleren tijdens het verdunnen van de lamel (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)³⁶.
8. Volg voor het daaropvolgende frezen en polijsten een van de twee benaderingen die hieronder worden beschreven in stap 5.9 of 5.10 om direct te frezen op basis van de afmetingen van geselecteerde doelen.
   1. Axiale omvang van het doel > 300 nm
      OPMERKING: Hier zullen we een semi-destructieve benadering van direct frezen gebruiken.
      1. Selecteer in de Python-GUI het doel van interesse in de fluorescentiemicrofoto. De software begint automatisch met het uitzetten van de helderheid als functie van de tijd bij elk nieuw frame.
      2. Bewaak de fluorescentie-intensiteit via de Python-toolkit. Frees het monster van onderaf in de reinigingsdoorsnedemodus om eventueel achtergebleven steunfilmmateriaal te verwijderen, indien van toepassing.
         OPMERKING: Wanneer de steunfilm wordt verwijderd, moet een verbetering van de fluorescentie worden waargenomen.
      3. Gebruik snelle dalingen in fluorescentie-intensiteit - wat wijst op verlies van fluorescerend materiaal - als een aanwijzing voor wanneer u van freesrichting moet veranderen. Als er bijvoorbeeld van onder naar boven wordt gefreesd en er wordt een sterke afname van de fluorescentie waargenomen, stop dan met frezen en schakel over op frezen van boven naar beneden.
         OPMERKING: Als een structuur te snel wordt verwijderd, verlaagt u de freesstroom in de FIB-SEM-software om het verwijderen van het doel te vertragen.
   2. Axiale reikwijdte van het doel ≤ 300 nm
      OPMERKING: Hier gebruiken we het interferometrische effect om direct te frezen³⁶.
      1. Selecteer in de Python-GUI het doel van interesse in de fluorescentiemicrofoto. De software begint automatisch met het uitzetten van de helderheid als functie van de tijd bij elk nieuw frame.
      2. Begin met het frezen van boven naar beneden door een testdoel. Bewaak het randcontrast net voordat u door het doel freigt door de fluorescentie-intensiteit. Het fluorescentiedoel wordt continu aangepast aan een 2D Gaussiaan, waarbij de pasvorm wordt gebruikt om een geïntegreerde intensiteit te krijgen die vervolgens wordt uitgezet.
      3. Nadat het doel is doorgefreesd, past u de oscillaties in het intensiteitsspoor aan de volgende modelfunctie aan met behulp van de Python-GUI:
         
         Waarbij A de amplitude van de oscillatie is, λ de golflengte van de excitatie, k een dempende term die de coherentielengte van de lichtbron weergeeft, een fasefactor Φ, en d de afstand tot het object van opname is. Vanaf het testdoel kunnen alle termen binnen redelijke grenzen worden voorspeld, zodat de afstand, d, de enige vrije variabele is die wordt gebruikt om de gebruiker te vertellen waar het fluorescerende object zich bevindt ten opzichte van hun frezen. Zie Sica et al. voor meer details³⁶.
         OPMERKING: Voor volgende doelen zal de toolkit het intensiteitsspoor met dezelfde modelfunctie aanpassen en van boven naar beneden inschatten waar het frezen moet worden gestopt. Alle fittingen worden gelijktijdig met het frezen uitgevoerd. Het doel is om het frezen te stoppen wanneer het doel zich op een diepte bevindt die gelijk is aan de helft van de gewenste lamellendikte onder het bovenoppervlak.
      4. Nadat het top-down frezen is voltooid, voltooit u de lamel door van onder naar boven te frezen in de reinigingsdoorsnedemodus totdat de gewenste dikte is bereikt.
9. Maak een fluorescentieafbeelding na het frezen.

6. De correlatieve inzameling van de lichtmicroscopie en de hellingshoek

1. Nadat het monster naar CryoTEM is overgebracht, verzamelt u een atlasoverzicht van het raster met 182x om voldoende dekking van de hele roosters mogelijk te maken.
2. Verzamel bij een geschikte tussenliggende vergroting van 6.500x tot 11.000x een reeks montagebeelden van de laatste lamel bij een kanteling van 0°.
3. Lees de meerkanaals fluorescentiebeelden na het frezen en het projectiebeeld uit stap 6.2 in een op maat gemaakte projectieve transformatiesoftware voor ROI-registratie (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git).
4. Kies in totaal 8-10 paren referentiepunten om de projectieve beeldtransformatie nauwkeurig te berekenen.
   OPMERKING: Deze punten kunnen voor de hand liggende kenmerken zijn (bijv. lamellenranden, zichtbare ijsverontreiniging of open roostergaten) die aanwezig zijn in zowel optische helderveldmicroscopie als elektronenmicroscopie.

7. Collectie uit de tilt-serie met hoge vergroting

1. Gebruik deze overlappende afbeelding met fluorescentie- en transmissie-elektronenmicroscopie als referentie voor gebruikers om een beeldvormingsgebied te selecteren binnen de limiet van de cameraframegrootte voor verzameling uit de kantelserie met hoge vergroting.
2. Selecteer de vergroting en parameters van de tilt-reeks op basis van de biologische vraag.
   OPMERKING: Voor de demonstratie hebben we gegevens verzameld van 54° met stappen van 2° bij een pixelgrootte van 3,5 Å 41,42,43.

Resultaten

We hebben gedifferentieerde macrofaagcellen gelabeld met de tubulinemarker SiR-tubuline voordat ze werden ingevroren. Volgens het protocol identificeerden we de MTOC als een enkel fluorescerend punctum met een diameter van ~ 1 μm onder de fluorescentiemicroscoop (Figuur 1A). Bovendien zagen we fibrilachtige fluorescerende structuren die uitstralen van de MTOC naar de celperiferie, consistent met het microtubuli-netwerk (Figuur 1A). Stapsgewijze freessnapshots bij verschillende samplediktes worden weergegeven in Figuur 1B. Met name, toen de lamel een dikte van ongeveer 800 nm bereikte, loste het enkele MTOC-punctum op in twee aangrenzende spikkels, elk met een diameter van ongeveer 700 nm. Latere analyse bevestigde dat elke vlek overeenkwam met een individuele centriol.

Gelijktijdige beeldvorming en frezen stelden ons in staat om veranderingen in fluorescentie-intensiteit in realtime te volgen. We zagen met name een toename van de fluorescentie na het verwijderen van niet-fluorescerend bulkmateriaal en de absorberende steunfilm (Figuur 1B-D). Toen de lamel werd uitgedund van 2 μm tot 800 nm, nam de fluorescentie-intensiteit sterk af, wat de geleidelijke verwijdering van gelabelde structuren weerspiegelde. Deze daling zette zich voort toen de lamel verder werd uitgedund tot onder 200 nm (Figuur 1B-D). Het gecorreleerde fluorescentiebeeld en de elektronenmicroscopieatlas tonen aan dat onze workflow nauwkeurige targeting voor frezen mogelijk maakt (Figuur 2A). Gereconstrueerde tomogrammen en gesegmenteerde modellen laten zien dat de centriolen zijn samengesteld uit microtubuli-triolen, in overeenstemming met eerdere rapporten 42,43,44,45 (Figuur 2A,B). In gevallen waarin slechts één fluorescerende spikkel bewaard is gebleven in de uiteindelijke lamel, zien we een enkele centriol in het overeenkomstige tomogram (Figuur 2B).

Figuur 1: Workflow van tri-samenvallende CryoFM-FIB-SEM voor nauwkeurige lokalisatie van het microtubuli-organiserende centrum. (A) (links) Live cell microscopie en (rechts) CryoFM van de MTOC. Schaalbalk = 10 μm. (B) Stapsgewijze snapshots van CryoFM en CryoFIB voor gericht frezen. Close-up FM-weergave wordt aangegeven als gele stippelvakken. Centriolen zijn gemarkeerd als gele pijlen. Schaalbalk = 5 μm. (C) Fluorescentie-intensiteit van MTOC tijdens CryoFIB-frezen. (D) Fluorescentielijnprofiel over de MTOC genomen in verschillende stadia tijdens het CryoFIB-frezen. Afkortingen: CryoFM-FIB-SEM = Cryogene fluorescentiemicroscopie met gefocusseerde ionenbundelfrezen en scanning-elektronenmicroscopie; MTOC = microtubuli-organiserend centrum; ROI = interessegebied. Deze figuur is een bewerking van Wang³⁹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Moleculaire details van de MTOC onthuld door tri-samenvallende CryoFM-FIB-SEM-workflow. (A) Gecorreleerd FM-, EM- en segmentatiemodel van de MTOC. (a) FM-beeld na frezen. Dit is hetzelfde beeld van het laatste paneel van figuur 1B , gemarkeerd als 180 nm, maar geroteerd om overeen te komen met de CryoET-reconstructie en segmentatie. Schaalbalk = 5 μm; (b) Vergrote weergave van het onderbroken gebied in geel vanaf (a). c) Gecorreleerde FM- en TEM-projectie van het onderbroken gebied in cyaan zoals aangegeven in (2). Schaalbalk = 1 μm. (d) Gesegmenteerd model van tomografische reconstructie in het interessegebied (geel, centriol; groen, microtubuli). Schaal balk = 100 nm. (B) Representatieve FM-beelden en tomografische plakjes van twee verschillende lamellen met verschillende centrioloriëntaties. FM: Schaalbalk = 5 μm. Tomografische plak: Schaalbalk = 200 nm. Afkortingen: CryoFM-FIB-SEM = Cryogenic focused ion beam milling met scanning elektronenmicroscopie; MTOC = microtubuli-organiserend centrum; FM = fluorescentiemicroscopie; ET = elektronentransmissie; TEM = transmissie-elektronenmicroscopie. Deze figuur is een bewerking van Wang³⁹. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Onze resultaten benadrukken het nut van het tri-samenvallende beeldvormingsplatform, dat gelijktijdige fluorescentiebeeldvorming en frezen mogelijk maakt. Door gebruik te maken van deze feedback demonstreren we twee fluorescentiegeleide freesstrategieën - semi-destructief en interferometrisch - die de noodzaak vermijden van omslachtige en op registratie gebaseerde benaderingen die te maken hebben met fundamentele nauwkeurigheidsbeperkingen in verband met mismatch en beweging van de brekingsindex tijdens het frezen 12,33,46. Verder, aangezien de precieze begeleiding gebaseerd is op fluorescentiemicroscopie in plaats van SEM, leidt de optische straling niet tot detecteerbare schade zolang de intensiteit onder de drempel wordt gehouden die leidt tot devitrificatie^37,47. De hier gedemonstreerde mogelijkheden breiden de toegankelijke biologische monsters uit met zeldzame en kleine (<300 nm in axiale omvang) interessante doelen, terwijl de workflow wordt gestroomlijnd.

De belangrijkste stap in dit protocol is bepalen wanneer moet worden gestopt met frezen op basis van veranderingen in de fluorescerende helderheid van een interessant doelwit. Momenteel gaat het om snel handmatig ingrijpen om het frezen op gewenste tijden te stoppen. Deze methode is voldoende gebleken voor de huidige doelen die zijn verkend, maar toekomstige aanpassingen zouden de Python-toolkit verder kunnen integreren in het FIB-systeem om het frezen direct te stoppen. Deze wijziging kan nodig zijn als er snellere freessnelheden nodig zijn, omdat dit minder tijd geeft voor handmatige interventie. Als alternatief, als langzamere freessnelheden kunnen worden getolereerd, geeft dit indien nodig meer tijd voor handmatige interventie.

Na het genereren van interessante lamellenbevattende biologische structuren, maakt onze op maat gemaakte beeldtransformatiesoftware correlatie op CryoTEM-niveau mogelijk, met behulp van atlasoverzichten van lamellen om de verzameling van CryoET-gegevens te begeleiden. Over het algemeen is het hier gepresenteerde protocol essentieel voor het in beeld brengen van fluorescerend gelabelde, kleine en zeldzame biologische doelen door middel van cryogene elektronentomografie in dikke eukaryote cellulaire monsters. Vergeleken met bestaande niet-samenvallende Cryo-FIB-systemen, zoals de Aquilos 2 met iFLM, behaalt onze workflow een hoger slagingspercentage bij het richten op deze functies.

Deze hoge richtprecisie gaat ten koste van de efficiëntie. Omdat het frezen handmatig gebeurt in plaats van geautomatiseerd, is de doorvoer van de lamellengeneratie beperkt. In een freessessie van 8 uur produceren we meestal 6-8 lamellen, waarvan er ongeveer vijf een interessant doel bevatten. We zijn echter van mening dat deze workflow in de toekomst kan worden geautomatiseerd om de doorvoer te verbeteren. Automatisering zou aangepaste scripts vereisen om continu actieve freesgebieden in het FIB-beeld te bewaken en de fluorescentie-intensiteit in realtime te volgen om het behoud van het doel te garanderen. Er blijven belangrijke uitdagingen, waaronder het tot stand brengen van effectieve communicatie tussen alle aangepaste scripts en de besturingssoftware voor zowel de CryoFIB-SEM als de fluorescentiemicroscoop.

Kijkend naar de toekomst, is er veel werk aan de winkel om andere geavanceerde fluorescentiemicroscopietechnieken op te nemen die eerder zijn besproken, waaronder fluorescerende biosensoren, superresolutiebeeldvorming en confocale microscopie. Desalniettemin verwachten we dat drievoudige samenvallende geometrieën standaard zullen worden in toekomstige instrumenten en dat gelijktijdige fluorescentiebeeldvorming tijdens het frezen routine zal worden. Als dat zo is, kan dit protocol dienen als een waardevolle gids voor onderzoekers die details op moleculaire schaal willen vastleggen van de kleine en zeldzame biologische structuren, die ondanks hun omvang en overvloed centraal staan in de celbiologie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aquilos 2 Cryo-FIB	ThermoFisher Scientific		https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m &gad_source=1&gad_campaignid=12 764255901&gbraid=0AAAAADxi_GS s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9&gclid= Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9 KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy 2EALw_wcB
Autogrid compatible cryo grid box	Electron Microscopy Sciences		https://www.emsdiasum.com/autogrid -compatible-cryo-grid-box?srsltid= AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
Autogrid rings and C-clips	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
CLEM Software Suite	Dahlberg Research Group at Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
Dragonfly 2022.1	Object Research Systems		https://dragonfly.comet.tech/
ENZEL	Delmic B. V.		ENZEL system is een aangepast instrument en momenteel niet commercieel verkrijgbaar
IMOD 4.12	University of Colorado		https://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4 liquid nitrogen dewar	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Pin lid manipulator tool	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
Python toolkit	Dahlberg Research Group at Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2, LF, 200 mesh, Au EM grid	Electron Microscopy Sciences		https://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
Serial EM	University of Colorado Boulder		https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Spearlab standard vessel (transfer dewar)	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
Tweezers	Electron Microscopy Sciences		https://www.emsdiasum.com/style-3sa