Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gebruik van biosensoren voor hele cellen om ionisch kwik in watermonsters te meten

647 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68257

⸱

3 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Moléculas Individuales, Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 2Kenniscentrum AI, Erasmushogeschool Brussel, 3Open BioLab Brussels, Erasmushogeschool Brussel

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert protocollen voor het gebruik van twee biosensoren voor hele cellen (Mer-Blue en Mer-RFP) om ionisch kwik te detecteren. Door gedetailleerde procedures te bieden voor hun werking en outputanalyse, beoogt de studie een bredere acceptatie en verdere ontwikkeling van deze technologieën voor het monitoren van specifieke verontreinigende stoffen te vergemakkelijken.

Samenvatting

Biosensoren voor hele cellen (WCB's) zijn instrumentele platforms voor het ontdekken en karakteriseren van regulerende elementen en het bevorderen van bio-engineering. Ze zijn ook enorm veelbelovend voor milieu- en voedselmonitoring. Hoewel er aanzienlijke inspanningen zijn geleverd om hun gevoeligheid en draagbaarheid te verbeteren, blijft de standaardisatie van hun verwerking en gegevensanalyse relatief onderontwikkeld. Dit artikel bevat een uitgebreide gids voor het gebruik van twee recent ontwikkelde WCB's, Mer-Blue en Mer-RFP, waarvan bewezen is dat ze in staat zijn om ionisch kwik te detecteren op niveaus onder de drinkwaterlimieten van de Wereldgezondheidsorganisatie. De protocollen die hierin worden beschreven, omvatten de voorbereiding van microbiële culturen, sensorkalibratie, gegevensverzameling en analyse. Voor de fluorometrische Mer-RFP-biosensor wordt een nieuw biosynthese-allocatietheorema gebruikt om het tijdsinterval voor betrouwbare en nauwkeurige dosis-responsmetingen te identificeren. Voor de colorimetrische Mer-Blue-biosensor maakt een goedkope camera-opstelling rigoureuze metingen mogelijk in omgevingen zonder dure spectrofotometers en fluorimeters, waardoor gedecentraliseerde monitoring van vervuiling mogelijk wordt. De procedures die worden gebruikt voor het testen van zoetwatermonsters worden beschreven en de beperkingen van deze biosensoren met betrekking tot monstertypen worden besproken. Door deze hanterings- en analysetechnieken te delen, moedigen we bredere onderzoeksgroepen aan om deze biologische apparaten toe te passen en te verbeteren voor het ontwikkelen van effectieve oplossingen voor milieumonitoring. Uiteindelijk heeft dit onderzoek tot doel de wijdverbreide acceptatie van biosensortechnologieën binnen de milieuwetenschappelijke gemeenschap te vergemakkelijken en bij te dragen aan een effectievere en efficiëntere monitoring van vervuiling door sporenelementen in verschillende ecosystemen.

Inleiding

Naarmate de bezorgdheid over milieuvervuiling en de veiligheid van het water en de voedselvoorziening toeneemt, zijn biosensoren naar voren gekomen als een aantrekkelijk, betaalbaar alternatief voor traditionele analytische chemiemethoden. Zware metalen zijn zeer giftige verontreinigende stoffen die steeds vaker voorkomen als gevolg van menselijke activiteiten 1,2,3,4. Conventionele detectiemethoden5 zijn echter vaak kostbaar en ontoegankelijk.

Kwikgevoelige WCB's maken gebruik van de opmerkelijke specificiteit en gevoeligheid van de MerR-transcriptiefactor 6,7,8. In zijn oorspronkelijke functie reguleert MerR de expressie van effectoreiwitten, waarvan de ontgiftende activiteit kwikresistentie verleent9. Het vermogen van MerR om genexpressie op een kwikafhankelijke manier te reguleren, is hergebruikt voor de regulatie van reporter-eiwitten in kwikdetectiesystemen 10,11,12,13,14,15,16. Ondanks veelbelovend onderzoek moeten deze WCB's nog worden goedgekeurd voor monitoring in de echte wereld. Factoren zoals biologische kwetsbaarheid, gespecialiseerde behandelingsvereisten en het ontbreken van gestandaardiseerde protocollen en gecertificeerde referentiematerialen hebben de praktische toepassing belemmerd 17,18,19,20.

Er is een WCB-systeem ontwikkeld voor de detectie van ionisch kwik met behulp van MerR gekoppeld aan twee verschillende reportereiwitten. Mer-Blue brengt een chromogeen eiwit tot expressie en dient als een colorimetrische biosensor, die visuele of cameragebaseerde detectie mogelijk maakt. Mer-RFP, een fluorescerende biosensor, maakt het mogelijk om de signaalaccumulatie continu te monitoren. Door de timing van de blootstelling aan monsters tijdens de groeifase zorgvuldig te controleren, is in beide systemen een robuuste reproduceerbaarheid bereikt15.

Dit artikel bevat gedetailleerde protocollen voor het gebruik van zowel Mer-Blue als Mer-RFP, samen met een uitgebreide analyse van hun signaaloutputs. Voor Mer-RFP is de analyse gebaseerd op een recent geïntroduceerde stelling van de toewijzing van eiwitbiosynthese21. Voor Mer-Blue kan colorimetrische analyse worden gedigitaliseerd met behulp van beeldverwerkingssoftware zoals ImageJ. Om consistente instellingen voor beeldacquisitie te garanderen, wordt een goedkope, doe-het-zelf camera-opstelling met de naam PelletCam gepresenteerd. In beide gevallen wordt geautomatiseerde software geleverd om de werking te vergemakkelijken. Door toegankelijke en gestandaardiseerde experimentele methodologieën en data-analysetechnieken te delen, wordt een bredere acceptatie van WCB's aangemoedigd voor de ontwikkeling van betrouwbare en kosteneffectieve op biosensoren gebaseerde monitoringoplossingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van ionische kwikoplossingen

  1. Weeg een kleine massa HgBr2-poeder af (meestal tussen 0,1 en 0,2 g) met geschikte beschermende handschoenen en een masker om inademing en blootstelling van de huid te voorkomen.
  2. Bereken de hoeveelheid water die nodig is om een oplossing van 4 mM te verkrijgen door de gemeten massa vast poeder in ddH2O op te lossen met behulp van de formule:
    figure-protocol-1
    OPMERKING: Het verwachte volume ligt in de buurt van 100 ml; Een vereenvoudigde formule kan worden gebruikt:
    figure-protocol-2
    1. Als alternatief past u bij het gebruik van HgCl2 de formule toe:
      figure-protocol-3
  3. Bewaar de stockoplossing in een hermetisch afgesloten container in een gekoelde omgeving (4 °C) om verdamping te voorkomen.
  4. Bereid seriële verdunningen voor vóór elke titratietest, te beginnen met 1 ml 2 mM Hg2+ en verdunnen tot 40 nM, zoals aangegeven in tabel 1.
    OPMERKING: De concentratie van ionisch kwik kan tijdens opslag veranderen, waarschijnlijk als gevolg van spontane reductie en verdamping van elementair kwik (Hg°). Hoewel koeling en het gebruik van hoogwaardige, hermetische containers deze effecten kunnen verminderen, moet u het gebruik van oplossingen die langer dan 6 weken worden bewaard, vermijden, vooral voor concentraties van 250 nM Hg2+ of lager.

2. M9 medium voorbereiden

  1. Los reagenspoeders op in afzonderlijke kolven met behulp van ultrapuur water om de volgende voorraadoplossingen te bereiden: M9 5×, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2, 20% (m/v) glucose en 20% (m/v) Casaminozuren.
  2. Meng in een glazen fles van 500 ml of 1 l 50 ml M9 5×, 2,5 ml 20% (w/v) casaminozuren en voeg ultrapuur water toe om een totaal volume van 246,475 ml te bereiken.
  3. Autoclaveer het mengsel en de hierboven vermelde voorraadoplossingen gedurende 20 minuten bij 121 °C.
  4. Laat alle oplossingen volledig afkoelen om neerslag van CaCl2 te voorkomen.
  5. Voeg aan het afgekoelde mengsel toe: 25 μL 1 M CaCl2, 500 μL 1 M MgSO4 en 3 ml 20% (w/v) glucose.
    LET OP: Dit resulteert in een rijk aangevuld M9 medium met de volgende eindconcentraties: 0,24% (w/v) glucose, 0,2% (w/v) Casaminozuren, 2 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 6,78 g/L Na2HPO4, 1 g/L NH4Cl.

3. Activeren van de Mer-Blue / Mer-RFP biosensor

  1. Gebruik Escherichia coli DH5α-cellen die zijn getransformeerd met het pUC-Mer-RFP of pUC-Mer-Blue-plasmide (zie materiaaltabel).
  2. Bereid een LB-agar petrischaaltje voor met 100 μg/ml ampicilline.
  3. Zaadcellen uit een gecryopreserveerde glycerolvoorraad op de LB-agarplaat met behulp van de streepmethode.
  4. Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C.
  5. Pluk de volgende dag een enkele kolonie van de LB-agarplaat om een cultuur van 10 ml te inoculeren met behulp van M9-medium (Figuur 1A).
  6. Incubeer de cultuur bij 37 °C met constant schudden bij 220 tpm 's nachts (~16 uur) (Figuur 1B).

4. Titratie-experiment met behulp van Mer-RFP

  1. Meet de optische dichtheid van de nachtelijke bacteriecultuur bij 600 nm (OD600).
  2. Bereken het volume van de nachtcultuur dat nodig is om een OD600 van 0,05 te bereiken in een totaal volume van 10 ml vers M9-medium met behulp van de formule:
    figure-protocol-4
    waarbij C1 de OD600 van de nachtcultuur is, en V1 het volume is dat daaruit moet worden genomen.
  3. Centrifugeer V1 ml van het pre-inoculum bij 3500 × g gedurende 5 min. Gooi het oude M9-medium weg en resuspendeer de bacteriële pellet in 10 ml vers M9-medium (Figuur 1C).
  4. Voeg 195 μl van de geresuspendeerde cultuur toe aan elk putje van een microplaat met 96 putjes. Zorg ervoor dat elke microcultuur in drievoud wordt voorbereid voor nauwkeurige metingen.
  5. Voeg 5 μL 40 nM tot 40 μM ionische kwikoplossingen, zoals beschreven in stap 1, toe aan elk putje om eindconcentraties te bereiken tussen 1 nM en 1 μM (Figuur 1D).
  6. Plaats de microplaat in een multimode microplaatlezer met temperatuurregeling, ingesteld op de volgende parameters (Figuur 1E) - Temperatuur: 37 °C, Schudden: Constant schudden met 60 tpm, Tijdsinterval: Elke 15 minuten gedurende 16 uur aflezen, Optische dichtheidsmeting: Aflezen bij 600 nm, Fluorescentiemeting: Bekrachtiging bij 570 nm en emissie bij 615 nm.
  7. Verzamel na het voltooien van de incubatietijd van 16 uur de gegevens van de microplaatlezer (Figuur 1F).

5. Gegevensanalyse voor Mer-RFP-resultaten

  1. Gebruik de voorkeur voor spreadsheetsoftware of tools voor gegevensbeheer om ruwe OD600-waarden in de loop van de tijd te visualiseren voor alle individuele culturen (Figuur 1G). Controleer of het einde van de vertragingsfase en het begin van de stationaire fase ongeveer op hetzelfde tijdstip plaatsvinden in alle duplo's binnen elke kwikconcentratietoestand. Sluit culturen uit die meer dan 1 uur afwijken van de gemiddelde timing.
  2. Bereken de gemiddelde OD600 voor elk tijdstip voor alle replicaten binnen elke kwikconcentratietoestand. Voor elke drievoudige kweekconditie zullen een enkele, gemiddelde OD600-groeicurve en drie fluorescerende intensiteitsoutputs beschikbaar zijn op verschillende tijdstippen.
  3. Zet de gemiddelde OD600 uit vs. Tijd voor de cultuur zonder kwik. Identificeer en selecteer visueel het tijdsinterval waarin de groeisnelheid positief is (zie figuur 2). Sluit de resterende datapunten uit van alle culturen.
  4. Bereken voor elke cultuur de specifieke groeisnelheid op elk tijdstip door de verandering in OD600 ten opzichte van het vorige tijdstip te vinden en die verandering te delen door de OD600-waarde op dat tijdstip, met behulp van de volgende formule:
    figure-protocol-5
  5. Bereken op dezelfde manier de specifieke fluorescentieproductiesnelheid voor elke cultuur door de verandering in fluorescentie-intensiteit ten opzichte van het vorige tijdstip te vinden en die verandering te delen door de OD600-waarde op dat tijdstip, met behulp van de formule:
    figure-protocol-6
  6. Zet voor elke cultuur de specifieke groeisnelheid uit tegen de fluorescentieproductiesnelheid (zie figuur 3). Identificeer een lineair bereik binnen de late tijdstippen. Sluit vroege tijdstippen buiten beschouwing totdat een lineaire regressie met de hoogste R2, gebaseerd op een minimum van 12 punten (ongeveer 3 uur), is bereikt.
    OPMERKING: De helling van deze lineaire regressie vertegenwoordigt de expressiefractie, d.w.z. het aandeel van de totale eiwitsynthese dat is toegewezen aan het reportereiwit21.
  7. Extraheer voor alle culturen lineaire trends uit ongeveer hetzelfde tijdsinterval en noteer de hellingswaarde voor elke toestand.
    OPMERKING: Het bereiken van de hoogst mogelijke R2-waarde in alle culturen met hetzelfde tijdsinterval kan meerdere pogingen vereisen. Voor geautomatiseerde analyse is de volgende Jupyter Notebook (Google Colab framework) beschikbaar op https://github.com/frank-britto/Mer_RFP. Deze notebook dient als sjabloon voor het optimaliseren van de extractie van lineaire trends en verdere dosis-responsprofilering.
  8. Neem de gemiddelde helling over replicaten voor elke kwikconcentratie.
  9. Zet de gemiddelde hellingswaarden af tegen de kwikconcentratie (zie figuur 4A). Pas een Hill-functie aan de gegevens toe:
    figure-protocol-7
    Waarbij: fRFP de expressiefractie is voor rood fluorescerend eiwit, H staat voor de maximaal mogelijke expressie voor het circuit, [Hg2+] is de ionische kwikconcentratie, kHg is gerelateerd aan de affiniteit voor ionisch kwik, n is de Hill-coëfficiënt die de coöperatie van de respons op Hg2+ uitdrukt.

6. Titratie-experiment met behulp van Mer-Blue biosensor

  1. Centrifugeer een nachtelijke, dichte cultuur verkregen zoals beschreven in stap 3 bij 3.500 × g gedurende 10 min.
  2. Gooi het gebruikte M9-medium weg en resuspendeer de bacteriekorrel in vers M9-medium tot een OD600 van 1,0. Zorg ervoor dat minimaal 5 ml cultuur bij deze dichtheid wordt verkregen (Figuur 1C).
    OPMERKING: Als er geen spectrofotometer beschikbaar is, benader dan de beginomstandigheden door de bacteriepellet opnieuw te suspenderen in een volume vers M9-medium dat gelijk is aan tweemaal het oorspronkelijke volume van de dichte cultuur.
  3. Voeg 9,5 ml M9-medium en 10 μl van een 100 mg/ml ampicilline-stockoplossing toe aan gesteriliseerde glaskweekbuizen (Figuur 1H).
  4. Inoculeer het gesupplementeerde M9-medium met 500 μl van de biosensorcultuur die in stap 6.2 is bereid (OD600 = 1.0).
  5. Voeg 10 μl van de bereide ionische kwikoplossingen toe (zie stap 1) om de uiteindelijke concentraties van 0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 125 nM en 250 nM te bereiken.
  6. Incubeer de culturen gedurende 16 uur bij 37 °C en schud krachtig bij 220 tpm (figuur 1I).

7. Gegevensverzameling en -analyse voor Mer-Blue-resultaten

  1. Breng ongeveer 1,3 ml van elke cultuur over in een microbuisje van 1,5 ml (Figuur 1J).
  2. Centrifugeer de microbuisjes gedurende 3 minuten op topsnelheid om strakke pellets te verkrijgen. Gooi het bovenstaande weg.
  3. (Optioneel) Om grotere pellets te verkrijgen, herhaalt u de centrifugatie en de verwijdering van het bovenstaande tot zes keer.
  4. Fotografeer de bodem van elk microbuisje, met de nadruk op de pellet (Figuur 1K). Gebruik een microbuishouder en een statief of een PelletCam (zie stap 8) om te zorgen voor een consistente en reproduceerbare oriëntatie, verlichting en kleurinstellingen voor alle afbeeldingen (zie afbeelding 5).
  5. Bepaal de kleurintensiteitswaarden van elke pelletafbeelding over de rode, groene en blauwe (RGB) kanalen.
    1. Als u ImageJ gebruikt: Laad de afbeelding en navigeer naar Afbeelding > Type > RGB-stapel om een stapel met drie segmenten te maken (rode, groene en blauwe kanalen). Gebruik de selectietool om een interessegebied (ROI) rond het pelletgebied te tekenen. Navigeer naar Analyseer > meten om de gemiddelde intensiteitswaarden voor het geselecteerde gebied in elk kanaal te verkrijgen.
    2. Bij gebruik van PelletCam: Open het .csv bestand met gemiddelde kleurintensiteitswaarden voor een representatief gebied van negen pixels van de pelletafbeelding.
  6. Bereken de respons van de biosensor voor elk monster door de Euclidische afstand in de RGB-ruimte te berekenen ten opzichte van een wit referentiepelletbeeld (niet-getransformeerde E. coli), zoals eerder beschreven22, met behulp van de vergelijking:
    figure-protocol-8
    Hier vertegenwoordigen Rsample, Gsample en Bsample de gemiddelde kleurintensiteiten van elk RGB-kanaal in het geselecteerde gebied van het pelletbeeld van het monster van de biosensor, terwijl Rref, Gref en Bref de overeenkomstige waarden voor een referentiepellet van niet-getransformeerde E. coli aangeven.
  7. Zet de berekende Euclidische afstanden af tegen de overeenkomstige ionische kwikconcentraties (zie figuur 6). Pas een Hill-functie aan de gegevens aan (zie Afbeelding 4B) met behulp van de volgende vergelijking:
    figure-protocol-9
    Hier is E de Euclidische afstand, H staat voor de maximaal mogelijke kleuring voor het circuit, [Hg2+] is de ionische kwikconcentratie, kHg is gerelateerd aan de affiniteit voor ionisch kwik en n is de Hill-coëfficiënt die de coöperatie van de respons op Hg2+ uitdrukt.

8. Het bouwen van een PelletCam

  1. Download de bestanden om een gesloten microcontrollersysteem te bouwen voor kleurmeting in bacteriële pellets van de website (https://github.com/EhbAIGit/PelletCam-OPENBIOLAB-AI).
    OPMERKING: Basiskennis van lasersnijden, 3D-printen, ESP32 en Arduino is handig. Een inleidende gids voor ESP32-CAM is beschikbaar op (https://lastminuteengineers.com/getting-started-with-esp32-cam/?utm_content=cmp-true). Het wordt aanbevolen om de ESP32-CAM samen met de MB-adapter aan te schaffen om het programmeren te vergemakkelijken. Voor gebruikers die niet bekend zijn met de ESP32, is het raadzaam om eerst de tutorial op https://lastminuteengineers.com/esp32-arduino-ide-tutorial/ te volgen.
  2. Gebruik de LasercutterBox.ai vijl om een multiplex van 3 mm te snijden en te graveren met een lasersnijder.
  3. Bouw de onderdelen van bestand ESP32SET.stl bestand met een 3D-printer. Dit .stl bestand kan direct geïmporteerd worden door bijna alle 3D printer software; bijvoorbeeld Bambu studio (https://bambulab.com/en/download/studio).
  4. Installeer de ESP32 (ESP32-CAM-MB 2640 WiFi Bluetooth-camera module) door de .cpp en .h en .ino bestanden in één map te plaatsen. Open vervolgens het .ino-bestand met Arduino IDE-software en klik op >Uploaden. Eenmaal geüpload, start de ESP32 automatisch.
  5. Op dit punt moet de gebruiker verbinding kunnen maken met het WiFi-toegangspunt met de naam >PELLET en het wachtwoord >PELLETCAM, zoals gespecificeerd in het .ino-bestand van de ESP32. Het IP-adres van de PelletCam wordt weergegeven in de seriële monitor van de Arduino IDE. Open een webbrowser en navigeer naar het adres: http://192.168.4.1.
    NOTITIE: Dit maakt het mogelijk om de afbeelding te bekijken of om een nieuwe afbeelding te maken (>CAPTURE PHOTO), de afbeelding te roteren (>ROTATE) of de luminantie van de LED-strip in te stellen (>LED's).
  6. Sluit de ESP32 Arduino aan op de LED-strip (NeoPixel Stick - 8 x 5050 RGB LED met geïntegreerde drivers) en een 5V USB-kabel volgens het schema in het bestand InstallationManual.pptx.
  7. Gebruik een lijmpistool om de ESP32 en LED-strip op de 3D-geprinte steunen te lijmen.
  8. Plaats een microbuisje met een gekleurde bodem (of een bacteriepellet) in de 3D-geprinte voorkant van de PelletCam. Plaats de ESP32-LED-steun ongeveer 5 cm verder en maak een foto via de webpagina. Als er een scherp en goed verlicht beeld wordt verkregen, lijm dan de ESP32-LED-steun op de bodem van de houten kist. Als dit niet het geval is, pas dan de afstand tussen de voorkant en de ESP32-LED-steun aan en herhaal de procedure totdat een bevredigende afstand is verkregen.
  9. Zet de doos in elkaar door plakband te gebruiken en alle onderdelen aan elkaar te lijmen met houtlijm.
  10. Sluit de PelletCam via de USB-kabel aan op een USB-voeding die minimaal 1 A kan leveren.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat Python 3.9 of een latere versie is geïnstalleerd.
  11. Open een opdrachtprompt of terminalvenster. Navigeer naar de map met het pellet.py bestand. Voer het script uit met behulp van de opdracht >python pellet.py.
  12. Als het pellet.py-script niet kan worden uitgevoerd, kan dit te wijten zijn aan ontbrekende Python-bibliotheken. Installeer de vereiste bibliotheken met behulp van de opdracht >pip install pillow tkinter pathlib statistics. Voor extra begeleiding bij het opzetten van uw eigen systeem, verwijzen wij u naar het document PelletCam Example.docx.

9. Meten van watermonsters in de omgeving

  1. Verzamel monsters van milieubronnen zoals rivieren of vijvers en bewaar ze in luchtdichte containers bij lage temperaturen om verdamping te minimaliseren. Zie de sectie Discussie voor meer informatie.
  2. Centrifugeer de monsters bij 3.500 × g gedurende 10 minuten op sedimentzand en organisch puin en isoleer de waterige fractie.
  3. Steriliseer het geklaarde monster met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm.
    OPMERKING: Vermijd hittesterilisatie, aangezien kwik vluchtig is en tijdens het proces kan verdampen.
  4. (Optioneel) Bereid een afzonderlijk aangezuurd aliquot voor door 5% HCl toe te voegen voor onafhankelijke meting met behulp van standaard analytische chemische technieken. Gebruik alleen het niet-aangezuurde monster voor biosensortesten.
  5. Meng 5 ml van het steriel gefilterde omgevingsmonster met 4,5 ml 2× M9-medium, wat resulteert in een verdunning van het monster in 1:2.
  6. Inoculeer het verdunde monster-mediummengsel met 0,5 ml van een nachtcultuur (bereid zoals beschreven in stap 5.4). Deze inoculatie komt overeen met een 20-voudige verdunning van de cultuur, wat een OD600 van 0,05 oplevert om de test te starten.
    1. Bij gebruik van Mer-RFPTransfer 200 μL van het monster-mediummengsel op een microtiterputje en start de metingen met behulp van een microplaatlezer zoals beschreven in stap 3.6.
    2. Bij gebruik van Mer-Blue: Incubeer het 10 ml monster-medium mengsel bij 37 °C gedurende 16 uur onder krachtig schudden bij 220 tpm, zoals beschreven in stap 5.6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Beide biosensoren vertonen geen detecteerbare basislijnexpressie van hun respectievelijke reporter-eiwitten onder kwikvrije omstandigheden. Mer-Blue-culturen beginnen doorgaans tussen 6-8 uur na inoculatie zichtbare verkleuring met het blote oog te vertonen bij HgBr2-concentraties van 25 nM en hoger. Als ze correct worden uitgevoerd, leveren titratie-experimenten met Mer-RFP of Mer-Blue antwoorden op die passen bij een Hill-functie met een Hill-coëfficiënt dicht bij 1, wat wij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De biosensorcircuits die hier worden gebruikt, zijn identiek, alleen verschillen ze in het reportereiwit. Beide zijn volledig gecodeerd op plasmiden met een hoge kopie, waardoor ze kunnen worden ingezet in Escherichia coli-cellen van verschillende stammen. Hoewel functioneel in E. coli B-stamcellen, werd een sterker gekleurd signaal van Mer-Blue waargenomen in K-12-stammen, met name DH5α en chemisch competente E. coli-cellen 15.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek wordt gepresenteerd dankzij de steun van Programa Nacional de Investigación Científica y Estudios Avanzados PROCIENCIA via het programma EF-041-2024-01 "Proyectos de Investigación aplicada", subsidiecontract PE501086520-2024-PROCIENCIA. De ontwikkeling van de kwikbiosensoren werd gefinancierd door VLIR-UOS via de subsidiecode PE2020SIN292B122 van het Zuidinitiatief. M.D. bedankt VLIRUOS, DGD en de Raad van de Vlaamse Hogescholen en Kunsten voor de XRAI-subsidie in het kader van het Global Minds-project BE2017GMHVLHC106.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3 mm dik multiplex houtVeel distributeurs
5 V USB-kabelVeel distributeurs
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-behandelde MicroplatesCorning3599
AgarpoederHiMediaGRM026
AmpicillineGold Biotechnology, Inc.A-301-100
CaCl2Millipore208290
CasaminozurenCalbiochem2040OP
D-(+)-GlucoseCentral Drug House (P) Ltd.506250
ESP32-CAM-MB 2640 Bluetooth WiFi-cameramodule USB naar seriële poort ontwikkelingsbord Auto Download (Type C)Veel distributeurs
Glazen kweekbuizenCorning9825
HgBr2, Kwik(II) bromideMerck200085
HgCl2, Kwik(II) chlorideMerck21465
Luria-bouillon (Miller)Sigma-AldrichL3522
M9 minimale zoutenSigma-AldrichM6030
MgSO4HiMediaGRM684
NeoPixel Stick - 8 x 5050 RGB LED met geïntegreerde driversAdafruit1426
Plasmid: pUC-Mer-Blue Onze groep-Volledige sequentie beschikbaar in https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1
Plasmid: pUC-Mer-RFP Onze groep-Volledige sequentie beschikbaar in https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1
Spuitfilters, hydrofiel, poriegrootte 0,22 micrometerMilliporeSLGV004SLVoor het steriliseren van milieumonsters.

Referenties

  1. Cooke, C. A., Balcom, P. H., Biester, H., Wolfe, A. P. Over three millennia of mercury pollution in the Peruvian Andes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (22), 8830-8834 (2009).
  2. Gautam, R. K., Sharma, S. K., Mahiya, S., Chattopadhyaya, M. C. Contamination of heavy metals in aquatic media: transport, toxicity and technologies for remediation. Heavy Metals in Water: Presence, Removal and Safety. Sharma, S. K. , Royal Society of Chemistry. Cambridge. 1-24 (2014).
  3. Chen, C. Y., et al. A critical time for mercury science to inform global policy. Environ Sci Technol. 52 (17), 9556-9561 (2018).
  4. Ali, H., Khan, E., Ilahi, I. Environmental chemistry and ecotoxicology of hazardous heavy metals: environmental persistence, toxicity, and bioaccumulation. J Chem. 2019, 6730305(2019).
  5. Gao, Y., et al. Determination and speciation of mercury in environmental and biological samples by analytical atomic spectrometry. Microchem J. 103, 1-14 (2012).
  6. Ralston, D. M., O'Halloran, T. V. Ultrasensitivity and heavy-metal selectivity of the allosterically modulated MerR transcription complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3846-3850 (1990).
  7. Brown, N. L., Stoyanov, J. V., Kidd, S. P., Hobman, J. L. The MerR family of transcriptional regulators. FEMS Microbiol Rev. 27 (2-3), 145-163 (2003).
  8. Wang, D., et al. Structural analysis of the Hg(II)-regulatory protein Tn501 MerR from Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 6, 33391(2016).
  9. Nucifora, G., Chu, L., Silver, S., Misra, T. K. Mercury operon regulation by the merR gene of the organomercurial resistance system of plasmid pDU1358. J Bacteriol. 171 (8), 4241-4247 (1989).
  10. Cai, S., et al. Engineering highly sensitive whole-cell mercury biosensors based on positive feedback loops from quorum-sensing systems. Analyst. 143 (3), 630-634 (2018).
  11. Guo, M., et al. Using the promoters of MerR family proteins as "rheostats" to engineer whole-cell heavy metal biosensors with adjustable sensitivity. J Biol Eng. 13, 70(2019).
  12. Wang, D., et al. Engineered cells for selective detection and remediation of Hg2+ based on transcription factor MerR regulated cell surface displayed systems. Biochem Eng J. 150, 107289(2019).
  13. Wang, D., et al. Visual detection of Hg2+ by manipulation of pyocyanin biosynthesis through the Hg2+-dependent transcriptional activator MerR in microbial cells. J Biosci Bioeng. 129 (2), 223-228 (2020).
  14. Guo, Y., Hui, C., Liu, L., Chen, M., Huang, H. Development of a bioavailable Hg(II) sensing system based on MerR-regulated visual pigment biosynthesis. Sci Rep. 11, 13516(2021).
  15. Zevallos-Aliaga, D., et al. Highly sensitive whole-cell mercury biosensors for environmental monitoring. Biosensors. 14 (1), 246(2024).
  16. Zhang, N. -X., et al. Versatile artificial mer operons in Escherichia coli towards whole-cell biosensing and adsorption of mercury. PLoS One. 16 (5), e0252190(2021).
  17. Chen, Y., et al. Advances in bacterial whole-cell biosensors for the detection of bioavailable mercury: a review. Sci Total Environ. 868, 161709(2023).
  18. Chen, S., Chen, X., Su, H., Guo, M., Liu, H. Advances in synthetic-biology-based whole-cell biosensors: principles, genetic modules, and applications in food safety. Int J Mol Sci. 24 (7), 7989(2023).
  19. Yu, W., et al. Genetically encoded biosensors for microbial synthetic biology: From conceptual frameworks to practical applications. Biotechnol Adv. 62, 108077(2023).
  20. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (6), 2000187(2020).
  21. Vaccari, N. A., Zevallos-Aliaga, D., Peeters, T., Guerra, D. G. Biosensors characterisation: Formal methods from the perspective of proteome fractions. Synth Biol. 10 (1), ysaf002(2025).
  22. Liljeruhm, J., et al. Engineering a palette of eukaryotic chromoproteins for bacterial synthetic biology. J Biol Eng. 12, 8(2018).
  23. Alon, U. An Introduction to Systems Biology. , Chapman and Hall/CRC. Boca Raton. (2019).
  24. Lineweaver, H., Burk, D. The determination of enzyme dissociation constants. J Am Chem Soc. 56 (3), 658-666 (1934).
  25. Wyatt, L., et al. Spatial, temporal, and dietary variables associated with elevated mercury exposure in Peruvian riverine communities upstream and downstream of artisanal and small-scale gold mining. Int J Environ Res Public Health. 14 (12), 1582(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Detectie van ionisch kwikanalyse van watermonstersmilieumonitoringsensorkalibratiebereiding van microbi le culturendosis responsmetingcolorimetrische biosensorfluorometrische biosensorvervuilingsmonitoring
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.