Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte trigeminusganglia

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68284

⸱

1 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Endodontics, School of Dentistry, University of Alabama at Birmingham, 3Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering, Incheon National University, 4Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft in vivo GCaMP-calciumbeeldvorming van intacte trigeminusganglion (TG)-neuronen. Deze beschrijving omvat TG-blootstellingschirurgie, in vivo confocale microscopiebeeldvorming van TG-neuronen, toepassing van somatische stimuli tijdens microscopische beeldvorming van TG-neuronen en analyse van in vivo GCaMP-calciumbeeldvormingsgegevens.

Samenvatting

Calciumbeeldvorming is een belangrijk hulpmiddel voor het monitoren van signaalmechanismen die ofwel Ca2+ in het cytosol instromen of Ca2+ vrijgeven uit intracellulaire Ca2+ -voorraden. Het gebruik van Pirt-GCaMP3-muizen, waarbij de Ca2+sensor GCaMP3 stroomafwaarts van het Pirt-promotorgebied is ingebracht en tot expressie komt in bijna alle (>95%) primaire sensorische neuronen, maakt gelijktijdige monitoring van de activiteit van >3.000 neuronen mogelijk via Ca2+ beeldvorming van trigeminusganglion (TG) primaire sensorische neuronen. Dit stelt onderzoekers in staat om neurale netwerkreacties op schadelijke stimuli en somatosensorische en hormonale reacties in vivo te bestuderen, die anders erg moeilijk te detecteren zouden zijn met andere methoden.

In het bijzonder maakt de mogelijkheid om het TG-gebied dat het gezicht en andere delen van het hoofd afzonderlijk innervert te monitoren, het mogelijk om primaire sensorische neuronen te monitoren die worden geactiveerd door stimuli van het gezichtsgebied vóór latere lagen van neuronenverwerking. Het aantal neuronen dat Ca2+ -transiënten genereert en de amplitude van Ca2+ -transiënten, die hun gevoeligheid voor verschillende sensorische modaliteiten aangeven, kunnen ook worden waargenomen. Bovendien kunnen onderzoekers de diameter van neuronen meten, wat een indicator is van het type vezel dat wordt geactiveerd (niet-schadelijke mechanologievezels versus schadelijke nociceptieve vezels, Aβ-, Aδ- en C-vezels). Daarom zou Pirt-GCaMP3-calciumbeeldvorming van TG een krachtig hulpmiddel zijn om specifieke sensorische modaliteiten en neuronale celtypen te ontleden om pijn van trigeminusoorsprong (orofaciale en craniofaciale, tand- en/of tandpijn, hoofdpijn, migraine, temporomandibulaire gewrichtspijn, trigeminusneuralgie), jeuk en aanraking en andere somatosensaties, evenals hormonale reacties.

Inleiding

Primaire sensorische neuronen innerveren direct weefsels, waaronder de huid, en geven sensorische signalen door aan het centrale zenuwstelsel (ruggenmerg of hersenstam). Trigeminusganglion (TG) neuronen innerveren het hoofd en reageren op sensorische stimuli, waaronder pijn van de tanden, periorbitale regio, orofaciale en craniofaciale regio's, kaakgewricht 1,2 en hersenvliezen 3,4,5. TG-neuronen variëren in grootte, niveau van myelinisatie en genexpressieprofielen 6,7,8,9. Kleinere neuronen zijn nociceptief, terwijl grotere neuronen over het algemeen reageren op niet-pijnlijke mechanische stimuli10,11. Disfunctie van trigeminusganglionneuronen kan zowel de neuronen zelf als de sensorische neuronen van het centrale zenuwstelsel (CZS) sensibiliseren11,12.

In een normale fysiologische context in niet-pathologische omstandigheden zijn het in vivo afvuren van neuronen noodzakelijk voor pijn, maar tot de laatste twee decennia waren de instrumenten voor het bestuderen van intacte sensorische ganglia in vivo beperkt tot het monitoren van relatief weinig neuronen tegelijk13. Vanwege de normaal lage cytoplasmatische calciumconcentraties, calciuminstroom tijdens actiepotentialen en het gebruik van calcium als cytoplasmatisch signaal, is calciumdynamiek krachtige surrogaten om actiepotentialen of cellulaire activiteit in vivo te monitoren met behulp van calciumgevoelige fluorescerende indicatoren. De grondgedachte voor deze methode is dat fluorescentiemicroscopie deze indicatoren tegelijkertijd kan monitoren in honderden tot duizenden neuronen tegelijk in perifere sensorische ganglia van muizen 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 en ratten25,26. Dit is een krachtig voordeel ten opzichte van methoden die een beperkter aantal neuronen in vivo kunnen monitoren.

Het doel van deze methode is directe observatie van cytoplasmatische Ca2+ dynamiek in vivo in de TG als reactie op mechanische, temperatuur-, chemische en hormonale stimuli in hoofdpijnpijnmodellen 19,23,24. Deze methode kan worden gebruikt als aanvulling op pijn of andere somatosensorische tests in het orofaciale gebied. In vivo trigeminusbeeldvorming Ca2+ is gebruikt om thermische en sensorische codering te karakteriseren19,22, klassen van mechanoreceptorente bestuderen 27, een nieuwe klasse van mechanosensitieve neuronente ontdekken 28, trigeminusreacties op normale mechanische spanningen op de hersenvliezente monitoren 29, de effecten van hormonen op pijngevoeligheid te bestuderen24, orofaciale pijnmodellen te karakteriseren30, en studie die bijdraagt aan door alcoholontwenning veroorzaakte pijn23.

Pirt-GCaMP3-muizen maken het mogelijk om de neurale activiteit in vivo te monitoren omdat de Ca2+-sensor GCaMP3 is ingebracht in het promotorgebied van het Pirt-gen, dat sterk tot expressie komt in alle (>95%) primaire sensorische neuronen12,18. Dit artikel demonstreert een techniek voor het uitvoeren van in vivo TG chirurgische blootstelling en het verzamelen en analyseren van calciumindicatormicroscopiegegevens voor de rechterkant TG van Pirt-GCaMP3-muizen met behulp van confocale laserscanmicroscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hierin beschreven procedures worden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee. De operatie is niet-overleven. De paragrafen 1 en 2 van deze procedure moeten onmiddellijk na aanvang worden uitgevoerd. Deel 3 kan op een later tijdstip worden uitgevoerd.

1. Vastzetten en chirurgie van de muis voor TG-beeldvorming aan de rechterkant

OPMERKING: Pirt-GCaMP3 C57BL/6J muizen18 moeten een volwassen lichaamsgrootte hebben (meestal 8 weken of ouder), ongeacht het geslacht. Bilaterale TG-beeldvorming is mogelijk. De hier vermelde tijden zijn schattingen door een ervaren technicus. Als de bloeding meer is dan normaal, kan het enkele minuten langer duren voor elke bepaalde tijd.

  1. Bereid een steriele zoutoplossing met 40 mg/ml ketamine en 6 mg/ml xylazine. Bereid voldoende volume voor op chirurgie en euthanasie na beeldvorming (minimaal 9 μL per gram lichaamsgewicht van de muis).
    OPMERKING: Er zijn veel soorten anesthesie gebruikt tijdens in vivo beeldvorming. Let op: Ketamine is schadelijk als het wordt geïnjecteerd, ingeslikt of in contact komt met de ogen. Voorzichtig behandelen.
  2. Steriliseer alle chirurgische instrumenten in een kralensterilisator. Was instrumenten met 70% ethanol.
    OPMERKING: U kunt de instrumenten ook vooraf autoclaveren.
  3. Injecteer 2,25 μl ketamine/xylazine per gram lichaamsgewicht (respectievelijk 90 mg/kg en 13,5 mg/kg ketamine en xylazine) i.p. in Pirt-GCaMP3-muizen 15-25 minuten voor de operatie. Niet meer dan 120 mg/kg ketamine gebruiken.
  4. Knijp na 15-25 minuten anesthesie-injectie (stap 1.3) met een tang in de achterpoot om ervoor te zorgen dat de muis zich op een chirurgisch anesthesievlak bevindt.
    OPMERKING: De kneep moet intens genoeg zijn om vocalisatie te veroorzaken bij een bewuste muis, maar niet intens genoeg om letsel te veroorzaken. Het is belangrijk om de muis bij deze stap niet langer dan nodig te laten om een daling van de lichaamstemperatuur te voorkomen. Het is handig om de kooi warm te houden, indien mogelijk.
  5. Plaats de muis op een verwarmingskussen om ervoor te zorgen dat de lichaamstemperatuur op 37 °C blijft en plaats het hoofd van de muis in een stereotactisch masker (Figuur 1A,B), met het hoofd ongeveer 15° naar links gekanteld (Figuur 1B).
    OPMERKING: Een stereotactisch masker dat zowel het hoofd stabiliseert als een route biedt om isofluraan toe te dienen, wordt hier beschreven. Als bij een procedure geen isofluraan wordt gebruikt of als er geen stereotactisch masker wordt gebruikt, moet een andere methode worden gebruikt om het hoofd te stabiliseren om beweging te voorkomen.
  6. Breng oogzalf aan op de ogen om uitdroging en irritatie te voorkomen, omdat irritatie activiteit van de nervus trigeminus veroorzaakt.
  7. Scheer de rechterkant van het hoofd van de muis.
    OPMERKING: Deze stap duurt 90 seconden. De onderzoeker kan het dier kort van het verwarmingskussen halen om te scheren.
  8. Maak een rechthoekige incisie van 9 mm x 5 mm tussen het rechteroor en het rechteroog (Figuur 2A). Stop het bloeden met een hemostatisch uitstrijkje of laboratoriumdoekje.
    LET OP: Deze stap duurt 2 minuten. De onderzoeker kan een hemostatische tang of een retractor gebruiken om de incisie open te houden. Dit is een niet-overlevingsprocedure, wat betekent dat extra reiniging niet nodig is. De onderzoeker kan de operatieplaats echter afvegen met povidonjodium. De grootst toegestane incisiegrootte wordt gegeven. Als de chirurg voldoende bekwaam is, heeft een kleinere incisie de voorkeur boven een grotere incisie om weefselbeschadiging te minimaliseren. De TG innerveert dit weefsel en kan beschadigd raken.
  9. Snijd het weefsel (periosteum) op het schedeloppervlak net ventrale tot aan het oog (Figuur 2B).
  10. Boor met behulp van een tandboor en conische spleet TNT-boor 31p een gat van ongeveer 9 mm x 5 mm in de dorsale schedel gecentreerd op de incisieplaats (Figuur 2C). Breng de boor zo licht mogelijk aan op het schedeloppervlak.
    OPMERKING: Deze stap duurt ongeveer 2 minuten. Als de chirurg voldoende bekwaam is, heeft een kleiner gat de voorkeur boven een groter gat.
  11. Kantel de kop totdat de TG duidelijk zichtbaar is (Figuur 2C). Als er een bloeding op de TG is, zuig dan het bloed op of verwijder het bloed door het af te voeren met een hemostatisch wattenstaafje of laboratoriumdoekje. Zorg ervoor dat de TG duidelijk zichtbaar is zonder corticaal weefsel te verwijderen (Figuur 2C).
    OPMERKING: We brengen TG routinematig 3-6 uur of langer in beeld zonder tekenen van angst in neuronen, maar een onderzoeker kan ervoor kiezen om een dekglaasje of een andere bedekking te plaatsen om te voorkomen dat de TG uitdroogt.
  12. Verplaats het dier en het verwarmingskussen naar de microscooptafel en plaats de neus van de muis in de stereotactische neuskegel. Sluit de zuurstof-/isofluraanlijnen aan zodat de muis continue isofluraan-anesthesie krijgt (Figuur 3A).
    OPMERKING: Deze stap duurt 3 minuten. Continue isofluraan vereist zuurstoftanks, gastoevoerslangen en een anesthesieverdamper. Het is ook mogelijk om tijdens de hele procedure de anesthesie te handhaven door periodieke injecties met verdovingsmiddel.
  13. Plaats het stereotactische frame zo dat het objectief van de microscoop 9 mm direct boven de schedelopening ligt (Figuur 3B).
    OPMERKING: De exacte afstand is afhankelijk van het objectief, de microscoop en de muis.
  14. Plaats de rectale thermometer. Sluit het netsnoer aan op de rectale thermometer en het verwarmingskussen. Sluit het anesthesiemasker aan op de isofluraan in de zuurstofleiding met 1% isofluraan.

2. TG-beeldvorming

OPMERKING: Gebruik groene (FITC) instelling 495 nm, emissie 519 nm, detectiegolflengte 500-580 nm, GaAsP-Pmt1-beeldvormingsapparaat, GaAsP-PMT-detector of gebruik de aanbevolen instellingen voor de microscoop. Zie Tabel 1 voor een overzicht van de software-instellingen.

  1. Gebruik een 5x/0,25 M27-objectief, software van de microscoopfabrikant en een verticale confocale laserscanmicroscoop. Lokaliseer het TG-oppervlak met de microscoop.
    OPMERKING: De keuze van het objectief hangt af van de microscoop en de voorkeur van de onderzoeker.
  2. Pas het objectief en de neuskegel aan om het TG-oppervlak zo vlak mogelijk te maken en een zo groot mogelijk oppervlak in het brandvlak te hebben.
    OPMERKING: Een plattere TG zorgt voor een scherper beeld, zorgt ervoor dat software scherpere films samenstelt, meer neuronen in beeld brengt en vereenvoudigt en verbetert de nauwkeurigheid van de analyse in vergelijking met een meer gekantelde TG.
  3. Houd de muis onder narcose door 1-1,5% isofluraan aan te brengen op de zuurstofstroom door het anesthesiemasker.
    OPMERKING: Het dier moet tijdens de procedure nauwlettend worden gevolgd door elke 20-30 minuten in de achterpoot te knijpen om ervoor te zorgen dat het dier onder narcose blijft. Het percentage isofluraan dat nodig is om de anesthesie te behouden, is afhankelijk van de individuele muis. Als het dier tijdens een proefknijp beweegt, moet het isofluraan worden verhoogd. Als de ademhaling oppervlakkig wordt, moet het isofluraan worden verlaagd. LET OP: Isofluraan is schadelijk bij inademing en kan duizeligheid of slaperigheid veroorzaken. Vermijd inademing en zorg voor voldoende ventilatie in de werkomgeving.
  4. Laad het high-speed scanprotocol van de microscoop: voxelgrootte 4,160 μm x 4,160 μm x 14 μm, 512 x 512 pixels, 10 optische plakjes Z-stack, 1,02 luchtige eenheden (AU)/33 μm, 15% 488 nm laservermogen/75 mW, pixeltijd 1,52 μs, lijntijd 0,91 ms, frametijd 465 ms, LSM-scansnelheid 8, bidirectioneel scannen, GaAsP-PMT-detectorversterking 550 V, digitale winst 1.
    OPMERKING: Optimale instellingen kunnen variëren tussen microscopen en dieren.
  5. Scan de TG in korte bursts van 6-8 cycli. Maak orthogonale projecties van de scans (één scan maakt één filmframe) om een film te maken en controleer de helderheid en consistentie van het beeld tussen frames. Pas indien nodig de positie van het stereoscopische frame en de dikte van het optische gedeelte aan en herhaal deze stap totdat er een heldere, consistente film is gemaakt.
    OPMERKING: Deze stap moet worden herhaald als het hoofd van de muis beweegt of als de onderzoeker de muis verplaatst of het brandvlak aanpast.
  6. Laad het scanprotocol met hoge resolutie van de microscoop: voxelgrootte 0,520 μm x 0,520 μm x 14 μm, 4096 x 4096 pixels, 6 optische slice Z-stack, 1,02 luchtige eenheid (AU)/33 μm, 20% 488 nm laservermogen/100 mW, pixeltijd 0,52 μs, lijntijd 4,95 ms, frametijd 20,26 s, LSM-scansnelheid 6, bidirectioneel scannen, GaAsP-PMT detector versterking 550 V, digitale versterking 1.
    OPMERKING: Optimale instellingen zijn afhankelijk van de microscoop en het dier. Als cellen zijn gelabeld met td-Tomato, stelt u de microscoop in om het rode kanaal 592 nm excitatie/614 nm emissie, detectiegolflengte 600-700 nm naast het groene kanaal te scannen.
  7. Maak een afbeelding met hoge resolutie van de TG.
    OPMERKING: Deze afbeelding kan nuttig zijn voor het tellen van neuronen, het meten van de diameter van zwakke neuronen of het geven van een gedetailleerd beeld om te onderscheiden of hetzelfde neuron reageerde op twee verschillende stimuli of twee verschillende neuronen reageerden.
  8. Laad het scanprotocol met hoge snelheid van de microscoop (zie stap 2.4).
  9. Registreer spontane activiteit gedurende 80 cycli (ongeveer 10 min). Maak een orthogonale projectiefilm en controleer of de beelden duidelijk en consistent genoeg zijn om te analyseren.
    OPMERKING: Dit levert voldoende frames op om spontane activiteit te analyseren. Het aantal kan worden verlaagd of verhoogd, afhankelijk van hoe belangrijk spontane activiteit is voor een bepaald experiment.
  10. Om stimulatie toe te passen, stelt u de microscoop in op het scannen van 15-20 cycli.
    OPMERKING: Wees voorzichtig bij het toepassen van stimuli om het hoofd van de muis niet te bewegen. Het verplaatsen van de TG met zelfs microns tijdens de stimulus kan de beeldvorming verstoren. Door het scannen kunnen cycli een basislijn, een stimulus, tot stand brengen en de neuronen observeren nadat de stimulus is verwijderd.
  11. Wacht tot de cycli 1-5 zijn voltooid om een basislijn te genereren. Pas stimulatie toe tijdens scans 6-10. Wacht minstens 5 minuten na elke stimulus om desensibiliserende neuronen te voorkomen.
    OPMERKING: Elke stimulus vereist een afzonderlijke scan van 15-20 cycli. Pas eerst mechanische stimulatie toe, gevolgd door koude, hitte- en chemische stimulatie. Pas laagfrequente stimulatie toe (bijv. lage mechanische kracht, temperatuur dicht bij kamertemperatuur) vóór hoogfrequente stimulatie (hoge mechanische kracht, temperatuur ver van kamertemperatuur). Pas op dat u de TG niet beweegt bij het toepassen van stimulatie. Als scans duidelijk te horen zijn, kan stimulatie direct na scan 5 worden toegepast. Elke methode die zorgt voor een consistente timing van stimulatie zal echter werken. Zie de discussie over stimulusvolgorde.
  12. Voor von Frey in het gebied dat wordt geïnnerveerd door het V2-deel van de TG, houdt u het filament vast en brengt u het herhaaldelijk aan op het ipsilaterale gebied onder het oog en boven de mond van onmiddellijk na scan 5 tot onmiddellijk na scan 10.
  13. Voor von Frey in het gebied dat wordt geïnnerveerd door het V3-deel van de TG, houdt u het filament vast en brengt u het herhaaldelijk aan op het ipsilaterale gebied net onder het oor van onmiddellijk na het einde van scan 5 tot onmiddellijk na het einde van scan 10.
  14. Voor koude en warmteprikkels koelt of verwarmt u de waterbeker tot iets onder (voor koude) of boven (voor warmte) de gewenste temperatuur en begint u vervolgens met scannen met een plastic transferpipet. Breng de stimulus met de transferpipet direct na scan 5 aan op het ipsilaterale gebied net onder het oog, boven de mond (voor V2) of net onder het oor (voor V3).
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de temperatuur binnen 1 °C ligt van de gewenste temperatuur voor scan 5. Om te voorkomen dat de neuronen ongevoelig worden, mag u de stimulus niet toepassen als de temperatuur van het bekerglas niet correct is. Koel of verwarm het water in plaats daarvan opnieuw en probeer het opnieuw.
  15. Aan het einde van de experimenten injecteer je vanaf cyclus 6 subcutaan 50 mM kaliumchloride in de V2- of V3-gebieden om alle responsieve neuronen te activeren en te identificeren.
  16. Nadat alle stimuli zijn toegediend en geregistreerd, euthanaseert u het dier door een overdosis ketamine/xylazine (200 mg per kg ketamine, 30 mg per kg xylazine of 5 μl per g van de oplossing bereid in stap 1.1) en onthoofdt u vervolgens.

3. Protocol voor analyse

  1. Open het orthogonale projectiebestand met behulp van de optie slepen en neerzetten . Selecteer het afbeeldingstype uit Afbeelding | Soort | RGB-kleur. Optioneel: Gebruik de StackReg31-plug-in onder Plug-ins | jars | StackReg om bewegingsartefacten en uitlijning te corrigeren.
    OPMERKING: De onderzoeker kan het beeldtype kiezen op basis van voorkeur. RGB vereenvoudigt het maken van kleurenafbeeldingen voor publicatie.
  2. Open de ROI-manager met behulp van Analyseren | Gereedschap | ROI-manager.
  3. Selecteer actieve neuronen door een ROI te tekenen met behulp van de ellips of rechthoek op de werkbalk en plaats deze vervolgens in het ROI-bestand door op de knop Toevoegen in het ROI Manager-venster te klikken of door op de "t"-toets te drukken.
    OPMERKING: Sla ROI-bestanden regelmatig op. ROI's kunnen worden hersteld door het ROI-bestand naar ImageJ te slepen en neer te zetten en op het vak Alles weergeven onder aan het ROI Manager-venster te klikken. Het opslaan van een ROI-.zip-bestand vereenvoudigt de analyse in vergelijking met het opslaan van ROI's als een overlay. Een neuron dat tijdens de basislijnperiode fluctueert, moet worden uitgesloten als spontaan actief, in plaats van als reagerend op de stimulus.
  4. In Analyseren | Meetinstellingen, vink Gemiddelde grijswaarde aan (optioneel, maar aanbevolen: verwijder het vinkje bij alle andere vakjes onder Meetinstellingen).
  5. Gebruik het ROI-venster in Meer | Multi-Measure om de intensiteit te meten.
    OPMERKING: Soms zijn aangrenzende neuronen te dichtbij om een afzonderlijke ROI te trekken. Deze neuronen kunnen worden opgenomen in het aantal actieve neuronen, maar kunnen niet worden opgenomen in metingen van voorbijgaande intensiteit.
  6. Multi-measure genereert een CSV-bestand in een nieuw venster met de naam 'Resultaten'. Sla het CSV-bestand op door op Bestand | Opslaan als. Open het .csv bestand met spreadsheetsoftware en sla het bestand op als spreadsheet.
    OPMERKING: Zie aanvullend bestand 1 voor een analysesjabloon.
  7. Bereken de Ca2+ transiënte intensiteit als ΔF/F0 = (Ft-F 0)/F0, waarbij Ft de pixelintensiteit in de ROI is op het tijdstip van interesse en F0 de basislijnintensiteit is die wordt bepaald door de gemiddelde intensiteit van de 2-4 frames voorafgaand aan de Ca2+ transiënt voor spontane activiteit of de eerste 1-5 frames voor stimulus-geïnduceerde Ca2+ transiënten. Sluit alle neuronen uit die Ca2+ -pieken genereren vóór stimulatie en analyseer de activiteit na stimulatie niet.
  8. Voor de analyse van de voorbijgaande intensiteit van Ca2+ wordt willekeurig ongeveer hetzelfde aantal neuronen uit elk ganglion bemonsterd om te voorkomen dat de ganglia die het grootste aantal reagerende neuronen genereert, de analyse domineert. Pieken uitsluiten met ΔF/F0 < 0,15.
    OPMERKING: Er zijn alternatieve gepubliceerde methoden voor het analyseren en opnemen en uitsluiten van neuronen 15,16,19,22,32,33,34,35.
  9. Meet de diameter van neuronen door de gemiddelde lengte te berekenen van een lijn die in AfbeeldingJ is getekend langs de langste en kortste diameters met behulp van het gereedschap Lijn op de werkbalk.
    OPMERKING: Een onderzoeker kan ook de oppervlakte en elliptische parameters van ROI's meten om de diameter te schatten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Beeldvorming van grote aantallen neuronen en specifieke trigeminustakken door confocale scanning van het Pirt-GCaMP trigeminusganglion
Na chirurgische blootstelling aan TG bij Pirt-GCaMP3-muizen maakt confocale microscopie beeldvorming van meer dan >3.000 neuronen tegelijk mogelijk (Figuur 4). Dit biedt het krachtige voordeel dat duizenden TG-neuronen tegelijkertijd kunnen worden waargenomen in hun normale fysiologische context. Spontane ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Pijnstoornissen van het kaakgewricht en apicale parodontitis treffen respectievelijk ongeveer 5%36 en 30-70%37,38 van de algemene bevolking. Primaire sensorische neuronen detecteren schadelijke stimuli in de huid, het mondslijmvlies, de tanden en de periorbitale gebieden, en hun plasticiteit draagt bij aan aanhoudende pijn. Celcultuur en explantaten kunnen worden gebruikt om neuronen te bestuderen, maar wo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R01NS0128574 en R01DE031477 (aan Y.S.K.) en een Rising STAR Award van het University of Texas-systeem (Y.S.K.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anased Injection (Xylazine)Covetrus, Akorn33197
Flurar 5x/0.25 M27 obejctiveCal Zeiss420130-9900-000
Cotton Tipped ApplicatorsMcKesson24-106-1S
Curved HemostatFine Science Tools13007-12
DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
DC Temperature Controller Heating PadFHC40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated ForcepsFine Science Tools11252-50
FHC DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
Fluriso (Isoflurane)MWI Animal Health, Piramal Group501017
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16221-14
GelFoamPfizer09-0353-01
ImageJNational Institutes of Healthij153
Ketaset (Ketamine)ZoetisKET-00002R2
Model 923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder (Adult mouse)Kopf Instruments923-B
Luminescent Green Stage TapeJSITON/ AmazonB803YW8ZWL
M35 Compact Electric Lab Handpiece SystemBuffalo Dental Manufacturing Co., Inc.M35
Matrx VIP 3000 Isoflurane VaporizerMidmark91305430
Micro dissecting scissorsRobozRS-5882
Micro dissecting spring scissorsFine Science Tools15023-10
Micro dissecting spring scissorsRobozRS-5677
Mini Rectal Thermistor ProbeFHC40-90-5D-02
Operating scissorsRobozRS-6812
Pirt-GCaMP3 C57/BL/6J miceJohns Hopkins UniversityN/AEither sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
Potassium chlorideFisher ScientificBP366-500
Stereotaxic frameKopf Model 923-B923-B
Sterotactic mask (active) for mice <30g with tubesRWD Life Sciences68663
Taper Fissure TNT Bur (31P)Buffalo Dental Manufacturing Co., Inc.31P-GOLD
td-Tomato C57BL/6J miceJackson Laboratory7909
Top Plate, 6in x 10inNewport290-TP
Transfer pipette, 3mLCole ParmerUX-06226-23
TrpV1-Cre C57BL/6J miceJackson Laboratory17769
Zeiss LSM 800 confocal microscopeCal ZeissLSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition SoftwareCal ZeissZen (Blue Edition) 2.6

Referenties

  1. Kuramoto, E., et al. Three-dimensional topography of rat trigeminal ganglion neurons using a combination of retrograde labeling and tissue-clearing techniques. J Comp Neurol. 532 (2), e25584(2024).
  2. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. Int J Mol Sci. 22 (11), 5810(2021).
  3. Levy, D., Burstein, R., Kainz, V., Jakubowski, M., Strassman, A. M. Mast cell degranulation activates a pain pathway underlying migraine headache. Pain. 130 (1-2), 166-176 (2007).
  4. Moskowitz, M. A., Macfarlane, R. Neurovascular and molecular mechanisms in migraine headaches. Cerebrovasc Brain Metab Rev. 5 (3), 159-177 (1993).
  5. Strassman, A. M., Raymond, S. A., Burstein, R. Sensitization of meningeal sensory neurons and the origin of headaches. Nature. 384 (6609), 560-564 (1996).
  6. Avraham, O., et al. Profiling sensory neuron microenvironment after peripheral and central axon injury reveals key pathways for neural repair. Elife. 10, e68457(2021).
  7. Bhuiyan, S. A., et al. Harmonized cross-species cell atlases of trigeminal and dorsal root ganglia. Sci Adv. 10 (25), eadj9173(2024).
  8. Chu, Y., et al. Single-cell transcriptomic profile of satellite glial cells in trigeminal ganglion. Front Mol Neurosci. 16, 1117065(2023).
  9. Mapps, A. A., et al. Diversity of satellite glia in sympathetic and sensory ganglia. Cell Rep. 38 (5), 110328(2022).
  10. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Curr Biol. 9 (12), R429-R431 (1999).
  11. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  12. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of trpv1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  13. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  14. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Sci Rep. 9 (1), 7651(2019).
  15. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., Mcmahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  16. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Sci Adv. 2 (11), e1600990(2016).
  17. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. J Neurosci. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  18. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  19. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: Modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. J Physiol. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  20. Macdonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  23. Son, H., et al. Mast-cell-specific receptor mediates alcohol-withdrawal-associated headache in male mice. Neuron. 112 (1), 113-123.e4 (2024).
  24. Son, H., Zhang, Y., Shannonhouse, J., Gomez, R., Kim, Y. S. PACAP38/mast-cell-specific receptor axis mediates repetitive stress-induced headache in mice. J Headache Pain. 25 (1), 87(2024).
  25. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  26. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  27. Moayedi, Y., et al. The cellular basis of mechanosensation in mammalian tongue. Cell Rep. 42 (2), 112087(2023).
  28. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954.e4 (2017).
  29. Blaeser, A. S., et al. Trigeminal afferents sense locomotion-related meningeal deformations. Cell Rep. 41 (7), 111648(2022).
  30. Son, H., et al. Elucidation of neuronal activity in mouse models of temporomandibular joint injury and inflammation by in vivo GCaMP Ca2+ imaging of intact trigeminal ganglion neurons. Pain. 165 (12), 2794-2803 (2024).
  31. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  32. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  33. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nat Commun. 7, 11450(2016).
  34. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nat Commun. 6, 8171(2015).
  35. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nat Neurosci. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  36. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine 2020. Temporomandibular disorders: Priorities for research and care. Yost, O., Liverman, C. T., English, R., Mackey, S., Bond, E. C. , The National Academic Press. Washington, DC. (2020).
  37. Eriksen, H. M. Endodontology--epidemiologic considerations. Endod Dent Traumatol. 7 (5), 189-195 (1991).
  38. Sidaravicius, B., Aleksejuniene, J., Eriksen, H. M. Endodontic treatment and prevalence of apical periodontitis in an adult population of vilnius, lithuania. Endod Dent Traumatol. 15 (5), 210-215 (1999).
  39. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Nav1.8-positive and Nav1.8-negative sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  40. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. (192), e64826(2023).
  41. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca2+ activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. J Neurosci. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  42. Zheng, Q., et al. Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain. Neuron. 110 (2), 209-220.e6 (2022).
  43. Mahadevan, A. S., et al. Cytonet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Comput Biol. 18 (6), e1009846(2022).
  44. Chen, C., et al. Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice. Nat Commun. 10 (1), 3087(2019).
  45. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca2+ responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. J Pharmacol Sci. 137 (1), 101-104 (2018).
  46. Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
  47. Li, J., et al. Engineering of nemo as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
  48. Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nat Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
  49. Tan, C. H., Mcnaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  50. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nat Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  51. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  52. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  53. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with genetically-encoded voltage indicator, ASAP4.4-kv. bioRxiv. , (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Trigeminusganglionin vivo beeldvormingGCaMP3-muizenconfocale beeldvormingsensorische modaliteitenVon Frey-stimulatiecalciumtransiënten
In vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte trigeminusganglia
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.