Methodenartikel

Muismodel van metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte met fibrose

DOI:

10.3791/68294

⸱

18 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muismodel van metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD) met metabole disfunctie, veranderingen in levergenexpressie en histopathologische veranderingen in de lever die lijken op menselijke MASLD, waaronder fibrose die evolueert naar gevorderd fibrose stadium 3. Dit model kan worden gebruikt in studies naar de pathofysiologie van MASLD en in preklinische studies van nieuwe therapieën.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leverfibrose is de belangrijkste voorspeller van nadelige resultaten bij metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD). In preklinische studies van MASLD zijn muizen het meest gebruikte ziektemodel. In die modellen is leverfibrose echter moeilijk op te wekken. Dit protocol beschrijft een muismodel van MASLD waarin hyperfagische Ay-muizen een dieet krijgen dat rijk is aan vet en fructose, dat lijkt op het gemiddelde dieet in de VS. De muizen ontwikkelen leversteatose, verwonding, ontsteking en fibrose. Fibrose evolueert van pericellulaire fibrose in stadium 1 na 16 weken in overbruggende fibrose in stadium 3 na 12 maanden. Deze muizen ontwikkelen ook obesitas, hypertriglyceridemie, glucose-intolerantie en hyperinsulinemie. Dit ziektemodel repliceert de histopathologie van de lever, de veranderingen in de genexpressie van de lever en de metabole disfunctie van de ziekte bij de mens. Dit protocol omvat twee methoden om fibrose te kwantificeren: histologische kleuring van collageen door picro-sirius rood en kwantificering van het levergehalte van hydroxyproline. Deze methoden kunnen worden gebruikt voor de studie van MASLD pathofysiologie en voor preklinische studies van mogelijke therapieën.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD) is de meest voorkomende leverziekte, met een prevalentie van 31% tot 40% in de VS en 42% wereldwijd 1,2,3,4. Patiënten met MASLD kunnen metabole disfunctie-geassocieerde steatohepatitis (MASH), voorheen niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), cirrose en hepatocellulair carcinoom 5,6 noemen. MASLD verhoogt het risico op hepatocellulair carcinoom en na de recente toename van de prevalentie van MASLD is het de meest voorkomende leverziekte geworden bij patiënten die hepatocellulair carcinoom ontwikkelen 7,8. Bij MASLD is fibrose de primaire voorspeller van progressie naar cirrose en van ongunstige klinische uitkomsten, waaronder levergerelateerde morbiditeit (leverdecompensatie, leverfalen of leverkanker) en levergerelateerde mortaliteit 6,9,10,11. Dienovereenkomstig stimuleert de Food and Drug Administration de ontwikkeling van therapieën die gericht zijn op MASH/NASH met fibrose, evenals het gebruik van geschikte diermodellen12.

In preklinische studies van geneesmiddelen en in mechanistische studies van MASLD worden muismodellen het meest gebruikt13. Er zijn duizenden muismodellen van MASLD beschreven, wat wijst op een gebrek aan consensus over een optimaal model13,14. Het opstellen van optimale modellen brengt verschillende uitdagingen met zich mee. Hoewel het relatief eenvoudig is om obesitas en steatose bij muizen op te wekken door ze een vetrijk dieet te geven, is leverfibrose moeilijker te induceren 13,14,15,16. In MASLD-modellen die worden aangedreven door obesogene diëten, ontwikkelt fibrose zich langzaam17 Hoewel deze langzame progressie de ziekte bij de mens beter kan nabootsen18, verhoogt het de duur en kosten van dierstudies. Diëten met een hoog cholesterolgehalte (bijv. 2%) bevorderen de ontwikkeling van fibrose; Ze verminderen echter ook de endogene synthese van cholesterol, wat het tegenovergestelde is van de toename beschreven bij de ziekte bij de mens 15,16. Sommige MASLD-modellen gebruiken mutante of genetisch gemodificeerde muizen; Ze kunnen echter kanttekeningen hebben: OB/OB-muizen ontwikkelen obesitas, steatose en insulineresistentie, maar ze missen leptine, dat een bemiddelaar is van fibrose; PTEN null-muizen ontwikkelen steatose maar ontwikkelen geen insulineresistentie15,17. Daarom vereisen muismodellen van MASLD vaak een lange studieduur, diëten met een hoog cholesterolgehalte of genetische manipulaties om significante fibrose te ontwikkelen14. Om een aantal van deze problemen aan te pakken, hebben we een muismodel ontwikkeld waarin de dieren MASLD ontwikkelen met fibrose die evolueert van pericellulair/perisinusoïdaal (stadium 1) naar overbruggende fibrose (stadium 3)19.

Het doel van dit artikel is om dit model van MASLD met leverfibrose en twee methoden om fibrose te kwantificeren te beschrijven: histologische kleuring van collageen door picro-sirius rood en kwantificering van het hydroxyprolinegehalte in de lever.

De grondgedachte voor het ontwikkelen van dit model was dat de meest bruikbare diermodellen de modellen zijn die de ziekte bij de mens het beste repliceren, zowel bij de veroorzakers van de ziekte als bij veranderingen in histopathologie en genexpressie. Daarom hebben we een dieet gebruikt dat lijkt op het gemiddelde dieet in de VS, met matig hoge hoeveelheden vet en fructose19,20. We hebben dit dieet gevoerd aan muizen met de Agouti gele (Ay) mutatie, die op grote schaal zijn gebruikt als modellen van obesitas21. Deze muizen brengen alomtegenwoordig het agouti-eiwit tot expressie, een antagonist van de melanocortinereceptoren, waaronder MC4R, dat hyperfagie veroorzaakt en de verhoogde voedselinname repliceert die vaak voorkomt bij obesitas bij de mens 21,22,23. Dit model recapituleert de veranderingen die MASH definiëren, waaronder steatose, hepatocellulair letsel, ontsteking, fibrose en metabole disfunctie.

De belangrijkste voordelen van dit model zijn de kenmerken die het vergelijkbaar maken met de ziekte bij de mens. Het model maakt gebruik van een westers dieet, dat is ontworpen om te lijken op het typische Amerikaanse dieet en waarvan is aangetoond dat het het meest effectieve dieet is bij het repliceren van het fenotype van menselijke MASLD14,20. De muizen ontwikkelen histopathologische veranderingen in de lever die vergelijkbaar zijn met die beschreven in de lever van mensen met MASH19,24. De muizen ontwikkelen metabole disfunctie, wat een essentieel criterium is voor de diagnose van MASLD5. De levers van muizen met MASH vertonen veranderingen in genexpressie die die van mensen met MASH/NASH19 samenvatten. Een recente studie vergeleek 39 muismodellen van MASLD op hun gelijkenis met de ziekte bij de mens. Het omvatte MC4R-knock-outmuizen, die hetzelfde mechanisme van hyperfagie delen en hetzelfde dieet kregen als het model dat we beschrijven14. Dat model stond op de vijfde plaats (van de 39) vanwege de gelijkenis met menselijke MASLD zoals beoordeeld door fenotype, leverhistopathologie en transcriptomics14.

Bijkomende voordelen van dit model zijn: Ay-muizen zijn in de handel verkrijgbaar bij het Jackson Laboratory en zijn verkrijgbaar in de C57BL/6J-stam, die vaak wordt gebruikt in metabole studies21,25; Gemuteerde muizen zijn gemakkelijk te herkennen aan de kleur van hun vacht; het model kan worden gecombineerd met modellen van functiewinst of -verlies om de rol van specifieke genen in de ontwikkeling van MASLD te bestuderen; en tot slot maakt het model geen gebruik van tekorten aan voedingsstoffen (choline- of methioninetekort), ongebruikelijke voedingscomponenten (cholzuur, ethionine), een ongewoon hoog gehalte aan specifieke voedingsstoffen (transvetten) of hepatotoxinen (tetrachloorkoolstof), die geen veelvoorkomende oorzaken van MASLD zijn en de ziekte bij de mens mogelijk niet repliceren 13,14,17.

Deze methode is geschikt voor het onderzoek naar mechanismen die bijdragen aan de ontwikkeling en progressie van MASLD en voor de evaluatie van interventies voor de behandeling of preventie ervan. Dit model is vooral nuttig omdat de dieren niet alleen zowel steatohepatitis als metabole disfunctie ontwikkelen, maar ook fibrose ontwikkelen die zich ontwikkelt tot stadium 3. Het model is mogelijk niet geschikt voor de studie van mechanismen die het voedingsgedrag beïnvloeden (bijv. GLP1R-agonisten), aangezien deze muizen hyperfagie hebben.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierenverzorging van Brooklyn College; IACUC-protocolnummer 318.

1. Muismodel van MASLD met fibrose

  1. Fok muizen om Ja-nakomelingen te produceren. Zet fokparen op met Ay-muizen (B6. Cg-Ay/J). Noteer de geboortedatum van de pups.
  2. Zorg ervoor dat nesten een vergelijkbaar aantal pups hebben om voldoende en gelijkmatige voeding en groei te bevorderen. Streef ernaar om vijf tot zes pups per nest te hebben, aangezien dit de gemiddelde worpgrootte is voor C57BL/6J-muizen. Extra pups, bij voorkeur die van het geslacht dat niet nodig is, kunnen worden geëuthanaseerd of opgevangen.
    OPMERKING: Het gebruik van Ay-mannetjes en wildtype vrouwtjes (C57BL/6J Jax 0000664) kan de efficiëntie van het fokken verbeteren, aangezien wildtype C57BL/6J vrouwtjesmuizen gemakkelijk te verkrijgen zijn en betere fokkers kunnen zijn dan Ay-vrouwtjesmuizen.
  3. Zet kooien op voor experimenten zoals hieronder beschreven.
    1. Identificeer de Ay-muizen aan de hand van hun gele vachtkleur. Wijs een unieke identificatie toe aan elke muis en tag of markeer de muizen.
      OPMERKING: Het agouti gele (Ay) allel van het agouti-gen geeft een gele vachtkleur. Het allel is semidominant bij heterozygoten. Homozygotie veroorzaakt embryonale letaliteit. Daarom zijn muizen met een gele vachtkleur heterozygoot voor het Ay-gen.
    2. Speen muizen als ze 21 dagen oud zijn. Groepeer muizen die tijdens het onderzoek in dezelfde kooi worden gehuisvest. Huisvest drie of vier Ay-muizen per kooi, volgens het verwachte lichaamsgewicht en de richtlijnen van de instelling.
    3. Voer standaard voer en water. Huismuizen bij standaardtemperatuur (20-23 °C) en relatieve vochtigheid (40% tot 60%) met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur.
  4. Geef de Ay-muizen het dieet met veel vet en fructose (High Fat and Fructose Diet, HFFD) vanaf een leeftijd van 8 weken, zoals hieronder beschreven.
    1. Geef de Ay-muizen het westerse dieet, dat rijk is aan vet en sucrose (Aangepaste calorieën Western Diet Inotiv TD.88137) ad libitum.
    2. Bereid een oplossing met fructose (23 g/l) en glucose (19 g/l) in drinkwater. Steriliseer de oplossing door filtratie door een filter van 0,2 μm en bewaar deze in steriele flessen. Eenmaal geopend, bewaar de oplossing gekoeld.
    3. Geef de muizen de oplossing met fructose en glucose om te drinken, in steriele drinkflessen. Vervang de oplossing en de flessen minstens wekelijks en controleer op groei van micro-organismen.
    4. Gebruik bodembedekking in een kooi zonder voedingswaarde (bijv. houtsnippers).
  5. Voer controlemuizen een dieet met weinig vet en fructose zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Het type controlemuizen dat moet worden gebruikt, hangt af van de onderzoeksopzet: Als Ay-HFFD-muizen worden gebruikt om het effect van geneesmiddelen te evalueren, kunnen de controlemuizen Ay-HFFD-muizen zijn die met een placebo worden behandeld. Als het model wordt gebruikt om het effect van een genetische modificatie op de ontwikkeling van fibrose te bestuderen, kunnen Ay-HFFD-muizen zonder de genetische modificatie als controle worden gebruikt. Als besturingselementen zonder MASH gewenst zijn, volgt u de stappen die hier worden beschreven.
    1. Gebruik wildtype muizen die nestgenoten zijn van de Ay-muizen. Ze zijn te herkennen aan hun zwarte vachtkleur.
    2. Geef de muizen vanaf dezelfde leeftijd een controledieet (Low Fat Control Diet Inotiv TD.08485; aangeduid als Low Fat and Fructose Diet, LFFD). Voorzie de muizen van regelmatig drinkwater.
  6. Volg de ontwikkeling van obesitas door de muizen wekelijks te wegen door de wakkere dieren in een getarreerde container op een laboratoriumweegschaal te plaatsen en hun gewicht te registreren.
  7. Zorg ervoor dat de muizen te allen tijde voldoende voedsel- en drinkoplossing hebben. Bewaak en registreer het verbruik van voedsel en drinkvloeistof om de calorie-inname te schatten, indien gewenst.
  8. Verzamel weefsels zoals hieronder beschreven.
    1. Voer weefselverzameling uit na 16 weken op het HFFD-dieet. Euthanasie van de muis door inhalatie van kooldioxide (of andere methoden die zijn goedgekeurd door de IACUC van de instelling).
      OPMERKING: Na 16 weken hebben Ay-muizen die het HFFD-dieet krijgen meestal stadium 1 fibrose; Verlenging van de tijd zal leiden tot grotere fibrose, die na 9 tot 12 maanden overgaat in stadium 3.
    2. Weeg de muis en noteer het gewicht19.
    3. Verzamel bloed indien nodig. Om dit te doen, neemt u bloed af uit de inferieure vena cava met een spuit van 1 ml en een naald van 27 G na het openen van de buik en voordat u de lever ontleedt (of gebruikt u een andere methode die is goedgekeurd door de IACUC).
    4. Ontleed de lever door de buik te openen met een incisie in de middellijn, de lever bij het handvat vast te houden met een tang en de ligamenten die de lever aan het middenrif en retroperitoneum binden met een schaar door te snijden. Weeg de lever en noteer het gewicht.
    5. Spoel de lever af in een ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Fotografeer de lever en voeg een liniaal of ander object toe als maatreferentie in de afbeelding. Plaats de lever in een petrischaaltje dat op ijs wordt geplaatst.
    6. Ontleed monsters (ongeveer 100 tot 150 mg per monster) van verschillende lobben, waaronder de mediane lob, de linkerlob en de rechterkwab. Zorg ervoor dat de monsters een dikte hebben van niet meer dan 4 mm om fixatie te vergemakkelijken. Plaats ze gedurende 24 uur in fixeeroplossing (formaline 10% of formaldehyde 4%) en verwerk ze voor histopathologische analyse (zie hieronder).
    7. Ontleed extra monsters van verschillende lobben. Plaats ze in tubes (1,5 of 2 ml), vries ze in door ze onder te dompelen in vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C. Deze monsters zullen worden gebruikt om het hydroxyprolinegehalte te meten.
    8. Verzamel indien gewenst monsters van andere organen (vetweefsel, spieren, enz.)

2. Histochemische kleuring van collageen en morfometrische kwantificering

NOTITIE: De stappen die het gebruik van gevaarlijke en/of vluchtige chemicaliën vereisen, moeten in een zuurkast worden uitgevoerd. Alle objectglaasjes moeten parallel worden verwerkt met behulp van kleurschalen en objectglaasjeshouders.

  1. Bereid leversecties voor zoals hieronder beschreven.
    1. Fixeer leverweefsel door het 24 uur bij kamertemperatuur in formaline (of formaldehyde) te bewaren. Gebruik een volume fixatief dat 20 keer groter is dan het weefselvolume. Breng vervolgens weefsels over naar 70% ethanol. Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd.
      OPMERKING: Weefsels kunnen in histologiecassettes worden geplaatst die vervolgens in een container met fixatief worden geplaatst of, als alternatief, in individuele containers of buisjes.
    2. Veranker weefsels in paraffine. Dit wordt meestal gedaan door een histopathologie kernfaciliteit of -dienst.
    3. Zorg voor secties met een dikte van 0,5 μm die op dia's zijn gemonteerd (niet-geladen dia's zijn voldoende). Laat de secties drogen door ze bloot te stellen aan lucht bij kamertemperatuur. Een histopathologie kernfaciliteit of -dienst doet dit meestal. Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd.
  2. Deparaffiniseren en rehydrateren secties zoals hieronder beschreven.
    1. Deparaffiniseer de secties door ze onder te dompelen in twee wisselingen van deparaffinisatie-/klaringsoplossing (xyleen of citrisolv), gedurende 5-15 minuten in elk.
    2. Rehydrateer door dia's achtereenvolgens onder te dompelen in 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en water, gedurende 5 minuten in elk.
  3. Bevlek secties met picro-sirius rood zoals hieronder beschreven.
    1. Dompel secties onder in een oplossing van Sirius rood (direct rood 80) 1 g/L in picrinezuur 1,3% gedurende 1 uur. Kleur niet veel langer, omdat direct rood vlekken kan maken op andere structuren dan collageen (bijv. kernen). Voeg snel groen (1 g/l) toe aan de kleuroplossing als tegenkleuring gewenst is26. U kunt ook kernen kleuren met hematoxyline27 van Weigert.
    2. Doe de picro-sirius rode oplossing terug in een gesloten, donkere glazen of plastic container voor opslag. De oplossing kan meerdere keren worden hergebruikt (gedurende minimaal 20 jaar27).
  4. Dompel de monsters 5 minuten onder in ethanol (100%) om te dehydrateren. Herhaal met een tweede verandering van ethanol.
  5. Dompel ze onder in klaringsoplossing (xyleen of citrisolv) totdat ze afzonderlijk worden verwijderd voor montage.
  6. Verwijder één dia per keer uit de klaringsoplossing en verwijder overtollige vloeistof door op keukenpapier te deppen. Voeg montagemedium toe (ongeveer 50 tot 100 μL). Bedek het gedeelte met een dekglaasje en druk het dekglaasje voorzichtig naar beneden om luchtbellen te verwijderen. Laat aan de lucht drogen.
    OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd.
  7. Observeer secties met behulp van een lichtmicroscoop met helderveldverlichting en objectieven 4x tot 20x - collageen lijkt rood op een licht geeloranje achtergrond. Breng interessegebieden in beeld met een kleurencamera, volgens de instructies van de camera.
  8. Voer beeldvorming uit met gepolariseerde lichtmicroscopie zoals hieronder beschreven.
    1. Schakel de polarisator- en analysefilters orthogonaal in en pas deze aan om ervoor te zorgen dat collageen zichtbaar is en dat het achtergrondsignaal minimaal is. Collageen is zichtbaar als wit, geel of oranje op een donkere achtergrond. In secties met weinig of geen fibrose zal collageen in de bloedvatwanden zichtbaar zijn. Houd de instellingen, inclusief de verlichtingsintensiteit, hetzelfde voor alle monsters die moeten worden vergeleken.
    2. Afbeelding met behulp van een monochrome camera of monochrome modus in een kleurencamera. Gebruik een objectief met een vergroting van 4x. Maak meerdere foto's per sectie. Vermijd gebieden in de buurt van de hilum als ze grote bloedvaten hebben. Gebruik dezelfde instellingen voor alle afbeeldingen die moeten worden vergeleken.
  9. Voer morfometrische kwantificering uit met behulp van Photoshop (alternatief a) zoals hieronder beschreven.
    1. Kwantificeer het witte gebied in de afbeeldingen, dat overeenkomt met collageen. Klik in Photoshop op Selecteer > Kleurbereik, kies vervolgens Hoogtepunten en pas de parameters Fuzziness en Range aan om pixels te selecteren die wit zijn, overeenkomend met collageen. Selecteer vervolgens Venster > histogram > Uitgebreide weergave en noteer het aantal geselecteerde pixels, weergegeven naast de parameter Pixels. Gebruik dezelfde parameters voor alle afbeeldingen die moeten worden vergeleken.
    2. Kwantificeer de totale oppervlakte van de afbeelding. Klik in Photoshop op Selecteren > Alles en noteer vervolgens het totale aantal pixels zoals eerder gedaan.
    3. Bereken het percentage van het beeldgebied dat overeenkomt met collageen door het aantal witte pixels te delen door het totale aantal pixels. Waarden worden meestal uitgedrukt als oppervlaktepercentages.
  10. Voer morfometrische kwantificering uit met behulp van ImageJ (alternatief b) zoals hieronder beschreven.
    1. Selecteer witte gebieden in de afbeeldingen die overeenkomen met collageen. Open de tool Drempel door te klikken op Afbeelding > >Drempel aanpassen (of druk op Shift + T). Stel het drempelbereik in om ervoor te zorgen dat alleen met collageen bevlekte gebieden (witte gebieden) rood worden gemarkeerd (bijv. minimumdrempel 64; maximumdrempel: 255) en klik op Toepassen. Hiermee wordt de afbeelding binarige, waarbij het collageengebied wordt omgezet in zwart en de achtergrond in wit.
    2. Meet het totale afbeeldingsgebied door te klikken op Analyseren > Metingen instellen. Controleer het gebied en het etiket weer. Klik op OK. Klik op Analyseren > meten (of druk op M op het toetsenbord). In het resultatenvenster wordt het totale afbeeldingsgebied weergegeven.
    3. Als u het collageengebied en -percentage wilt meten, schakelt u eerst Limiet tot drempel in door te klikken op Analyseren > Metingen instellen. Controleer het gebied, de gebiedsfractie (ImageJ berekent automatisch het collageenpercentage), de limiet tot de drempel en het etiket weergeven. Klik op OK. Klik vervolgens op Analyseren > meten (of druk op M). Het resultatenvenster toont: Collageengebied (absoluut aantal pixels) en Gebiedsfractie (collageen% van het totale beeld).
    4. Sla de resultaten op door Opslaan als te selecteren of kopieer ze naar het klembord en plak ze in een spreadsheet.

3. Kwantificering van leverhydroxyproline

OPMERKING: De stappen die het gebruik van sterke basen en zuren vereisen, moeten worden uitgevoerd met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

  1. Weeg levermonsters die in stap 1.8.7 zijn bereid en noteer de gewichten. Plaats weefselaliquots in een buis die geschikt is voor homogenisatie. Voeg gedeïoniseerd water toe met een water/weefselverhouding van 900 μL water per 100 mg weefsel.
  2. Homogeniseer door kralen te slaan of een andere methode volgens de instructies van de fabrikant totdat het weefsel volledig is gehomogeniseerd, zoals beoordeeld door visuele observatie. Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd en homogenaten kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.
  3. Voer eiwitprecipitatie uit zoals hieronder beschreven. De volgende stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, behalve wanneer een andere temperatuur is opgegeven.
    1. Breng ongeveer 500 μl over op 1000 μl homogenaat op centrifugebuisjes van 1,5 ml. Breng hetzelfde volume over voor alle monsters.
    2. Voeg trichloorazijnzuur toe voor een eindconcentratie van 12% (voeg bijvoorbeeld 120 μL trichloorazijnzuur toe aan 880 μL homogenaat)28. Vortex kort mengen.
    3. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten in een ijs-/waterbad. Centrifugeren bij 6.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min. Er vormt zich een neerslag met daarin het eiwit. Verwijder het bovenstaande door aspiratie. Houd de tubes op ijs.
    4. Voeg 1 ml ijskoude ethanol (100%) toe om de pellet te wassen. Resuspendeer de pellet door middel van sonicatie (of een andere methode) en controleer visueel of het materiaal opnieuw is gesuspendeerd. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 6.000 x g bij 4 °C en verwijder het bovenstaande door aspiratie. Gebruik sonicatie-instellingen volgens de instructies van de apparatuur (bijv. met behulp van een Branson SFX 150-sonifier met een microtip met een diameter van 3.2 mm, is een amplitude van 70% gedurende 10 s effectief voor de meeste samples). Herhaal 2x wassen.
    5. Laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen, of langer indien nodig.
  4. Voer eiwithydrolyse uit zoals hieronder beschreven.
    1. Voeg 800 μL 6 N zoutzuur toe aan de buisjes met het eiwitprecipitaat. Resuspendeer de pellet door middel van sonicatie (of een andere methode), met dezelfde instellingen als in stap 3.3.4.
    2. Breng de eiwitsuspensie over in glazen buisjes of flesjes met schroefdoppen; Sluit goed af. Incubeer de buizen in de oven bij 110 °C gedurende 22 ± 2 h29.
    3. Centrifugebuisjes op 16.000 x g gedurende 10 minuten; Deeltjes vormen een pellet. Dit vereist meestal het overbrengen van het hydrolysaat van de glazen flesjes naar centrifugebuisjes vóór het centrifugeren.
    4. Breng de supernatant, die hydroxyproline bevat, over in buisjes van 1,5 ml. Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd. Hydrolysaten kunnen worden opgeslagen bij 4 °C.
  5. Bereid een standaardcurve voor de hydroxyprolineconcentratie voor. Voor levermonsters met fibrose stadium 1 tot 3, met behulp van de hoeveelheden weefsel die in dit protocol worden aangegeven, zijn standaardconcentraties tot 125 μg/ml voldoende (bijv. seriële verdunningen van 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,81, 3,91, 1,95 en 0 μg/ml). Bereid de standaarden voor door hydroxyproline te verdunnen in 6 N zoutzuur.
  6. Breng 40 μL van elk monster en standaard over naar 1,5 ml geëtiketteerde centrifugebuisjes. Voeg 10 μL 10 N natriumhydroxide toe aan elk en vortex kort om te mengen.
  7. Voer oxidatie van hydroxyproline uit zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid acetaat-citraatbuffer met azijnzuur 1,2% v/v, citroenzuur 46 g/l, natriumacetaattrihydraat 120 g/l en natriumhydroxide 34 g/l in gedeïoniseerd water en pas de buffer-pH aan op 6,5.
    2. Bereid een oplossing van 12,7 g/L chlooramine T in water:n-propanol:acetaat-citraatbuffer (1:1:8 v:v:v). Los eerst chlooramine T op in water door te mengen, voeg dan n-propanol toe, meng en voeg dan acetaat-citraatbuffer toe en meng.
    3. Voeg 450 μL chlooramineoplossing toe aan buisjes met monsters en standaarden. Mengen door vortexing. Incubeer 25 minutenen 30 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Bereid het reagens van Ehrlich met 1 M 4-(dimethylamino) benzaldehyde in perchloorzuur:propanol 1:2 (v/v). Voeg 500 μL van het reagens van Ehrlich toe aan monsters en standaarden. Mengen door vortexing.
  9. Incubeer gedurende 20 minuten bij 65 °C in een verwarmingsblok, waterbad of broedmachine. Wanneer de incubatie eindigt, laat u monsters en standaarden afkoelen tot kamertemperatuur.
  10. Meet de absorptie van monsters en standaarden bij een golflengte van 550 nm met behulp van een spectrofotometer.
  11. Zet de extinctie af tegen de standaardhoeveelheden en gebruik een lineaire regressie om een standaardcurve te maken. Gebruik de parameters uit de standaardcurve om de concentratie hydroxyproline in de monsters te berekenen.
  12. Bereken de hoeveelheid hydroxyproline in de levermonsters op basis van het totale volume van het hydrolysaat (stap 3.4) en normaliseer met de weefselmassa die overeenkomt met het volume homogenaat dat is gebruikt voor de eiwitprecipitatie (stap 3.3.1). Druk de resultaten uit als ng hydroxyproline per mg weefsel. Als alternatief kan de eiwitconcentratie in homogenaten worden gemeten en kunnen de resultaten worden uitgedrukt in massa hydroxyproline per massa eiwit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ay-muizen die de HFFD krijgen, krijgen meer gewicht dan wildtype muizen die de LFFD krijgen en ontwikkelen obesitas (Figuur 1A). Ze komen sneller aan tijdens de eerste 4 weken van HFFD-voeding en komen ongeveer 3-4 g/week aan. Na 8 weken komen ze aan met een snelheid die vergelijkbaar is met die van controlemuizen (ongeveer 0,6 g/week)19. Na 16 weken wegen de Ay-muizen die de HFFD krijgen ongeveer 45 g tot 50 g (gemiddelde van drie af...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een muismodel van MASLD met leverfibrose dat de ziekte bij mensen repliceert 5,6. De muizen ontwikkelen leversteatose, zoals blijkt uit gemengde micro- en macrovesiculaire steatose in de histologie en een verhoogd gehalte aan triacylglycerol in de lever19. De muizen ontwikkelen ook obesitas, hypertriglyceridemie, glucose-intolerantie en er is gemeld dat ze hypertensie hebben, die, i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflict om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies K22CA178098, R03DK101863 en R15DK131627 en startfondsen van het National Institutes of Health van Brooklyn College (naar JMC).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-(Dimethylamino)benzaldehydeSigma-AldrichD2004
AzijnzuurVerschillendeNA
Aangepaste calorieën dieet Western dieetInotivTD.88137Dieet bevat vet (42 %kcal) en sucrose (34 %w/w). Andere leveranciers bieden diëten met dezelfde samenstelling
B6.Cg-Ay/JThe Jackson Laboratory000021Stam heeft de Agouti lethal yellow mutatie en een C57BL6/J achtergrond. Momenteel heeft The Jackson Laboratory de stam bevroren.
C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664
CentrifugeVerschillendeNAMet rotor voor 1,5 mL buizen, gekoeld, in staat om 16.000 xg te bereiken.
CentrifugeVerschillendeNA
Chloramin-T-hydraatSigma-Aldrich857319
CitroenzuurVerschillendeNA
Direct Red 80Sigma365548-5G
EthanolDecon Laboratories2701
Formaline-oplossing, neutraal gebufferdSigmaHT501128
FructoseSigma-AldrichF0127
GlucoseSigma-AldrichG8270
Histologie verwerkingsapparatuurNANAInbedding en snijden kan worden gedaan in het onderzoekslab of externe faciliteit
HomogenisatorVerschillendeNABead beaters zijn efficiënt om meerdere monsters te verwerken. Andere homogenisatiemethoden kunnen worden gebruikt
ZoutzuurVerschillendeNA
HydroxyprolineSigmaH5534
Vetarme controledietInotivTD.08485Controoldiët, laag in vet (13 %kcal) en sucrose (12 %w/w)
Microscoop uitgerust voor gepolariseerd lichtmicroscopieVerschillendeNA
N-propanolVerschillendeNA
PerchloorzuurVerschillendeNA
Permount-montagemediumFisher ScientificSP15-100
Picrinezuur, verzadigde waterige oplossing, spectrumFisher18612375
NatriumacetaattrihydraatVerschillendeNA
NatriumhydroxideVerschillendeNA
SonicatorVerschillendeNASonicator is handig om pellets op te schorsen in stap 2.5, maar niet absoluut noodzakelijk
TrichloorazijnzuurVerschillendeNA
VWR Micro Dekglasjes, RechthoekigVWR 48393-081
VWR Premium Superfrost Plus Microscoopglaasjes | VWRVWR 48311-703
Water, gedeïoniseerdVerschillendeNAGedeïoniseerd water van waterzuiveringssysteem of gekocht bij een leverancier.
XyleenFisher ScientificX3FCitrisolv-klaringsmiddel (Fisher 22-143-975) wordt verkocht als een milieuvriendelijke alternatief

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciardullo, S., Carbone, M., Invernizzi, P., Perseghin, G. Exploring the landscape of steatotic liver disease in the general US population. Liver Int. 43 (11), 2425-2433 (2023).
  2. Lee, B. P., Dodge, J. L., Terrault, N. A. National prevalence estimates for steatotic liver disease and subclassifications using consensus nomenclature. Hepatology. 79 (3), 666-673 (2024).
  3. Kalligeros, M., et al. Prevalence of Steatotic Liver Disease (MASLD, MetALD, and ALD) in the United States: NHANES 2017-2020. Clin Gastroenterol Hepatol. 22 (6), 1330-1332.e4 (2024).
  4. Younossi, Z. M., Kalligeros, M., Henry, L. Epidemiology of Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease. Clin Mol Hepatol. 31 ((Suppl)), S32-S50 (2024).
  5. Rinella, M. E., et al. A multisociety Delphi consensus statement on new fatty liver disease nomenclature. Hepatology. 78 (6), 1966-1986 (2023).
  6. Rinella, M. E., et al. AASLD Practice Guidance on the clinical assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 77 (5), 1797-1835 (2023).
  7. Friedman, S. L. Hepatic Fibrosis and Cancer: The Silent Threats of Metabolic Syndrome. Diabetes Metab J. 48 (2), 161-169 (2024).
  8. Phoolchund, A. G. S., Khakoo, S. I. MASLD and the Development of HCC: Pathogenesis and Therapeutic Challenges. Cancers. 16 (2), 259(2024).
  9. Taylor, R. S., et al. Association Between Fibrosis Stage and Outcomes of Patients With Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Gastroenterology. 158 (6), 1611-1625.e12 (2020).
  10. Younossi, Z. M., et al. Liver histology is associated with long-term clinical outcomes in patients with metabolic dysfunction-associated steatohepatitis. Hepatol Commun. 8 (6), e0423(2024).
  11. Dulai, P. S., et al. Increased risk of mortality by fibrosis stage in nonalcoholic fatty liver disease: Systematic review and meta-analysis. Hepatology. 65 (5), 1557-1565 (2017).
  12. Noncirrhotic Nonalcoholic Steatohepatitis With Liver Fibrosis: Developing Drugs for Treatment; Draft Guidance for Industry. The Federal Register / FIND. , Food and Drug Administration. (2018).
  13. Im, Y. R., et al. A Systematic Review of Animal Models of NAFLD Finds High-Fat, High-Fructose Diets Most Closely Resemble Human NAFLD. Hepatology. 74 (4), 1884-1901 (2021).
  14. Vacca, M., et al. An unbiased ranking of murine dietary models based on their proximity to human metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD). Nat Metab. 6 (6), 1178-1196 (2024).
  15. Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Animal Models of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis: Do They Reflect Human Disease. Adv Nutr. 11 (6), 1696-1711 (2020).
  16. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  17. Farrell, G., et al. Mouse Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Toward Optimization of Their Relevance to Human Nonalcoholic Steatohepatitis. Hepatology. 69 (5), 2241-2257 (2019).
  18. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. J. Hepatol. 68 (2), 230-237 (2018).
  19. St Rose, K., et al. Mouse model of NASH that replicates key features of the human disease and progresses to fibrosis stage 3. Hepatol Commun. 6 (10), 2676-2688 (2022).
  20. Hintze, K. J., Benninghoff, A. D., Cho, C. E., Ward, R. E. Modeling the Western Diet for Preclinical Investigations. Adv Nutr. 9 (3), 263-271 (2018).
  21. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L. J., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Dis Model Mech. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  22. Okumura, K., et al. Exacerbation of dietary steatohepatitis and fibrosis in obese, diabetic KK-A(y) mice. Hepatol Res. 36 (3), 217-228 (2006).
  23. Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, Pathophysiology, and Therapeutics. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 706978(2021).
  24. Brunt, E. M. Pathology of fatty liver disease. Mod Pathol. 20 Suppl 1, 40(2007).
  25. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Dig Dis Sci. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  26. Caviglia, J. M., et al. MicroRNA-21 and Dicer are dispensable for hepatic stellate cell activation and the development of liver fibrosis. Hepatology. 67 (6), 2414-2429 (2018).
  27. Kiernan, J. Histological and histochemical methods. , Scion Publishing Ltd. (2015).
  28. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. S. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Sci. 18 (5), 980-993 (2009).
  29. Davidson, I. Hydrolysis of samples for amino acid analysis. Methods Mol Biol. 211, 111-122 (2003).
  30. Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clin Biochem. 29 (3), 225-229 (1996).
  31. Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
  32. Mark, A. L., et al. Contrasting blood pressure effects of obesity in leptin-deficient ob/ob mice and agouti yellow obese mice. J Hypertens. 17 (12 Pt 2), 1949-1953 (1999).
  33. Luo, Y., et al. Metabolic phenotype and adipose and liver features in a high-fat Western diet-induced mouse model of obesity-linked NAFLD. Am J Physiol Endocrinol Metab. 310 (6), 418(2016).
  34. Lonardo, A., Suzuki, A. Sexual Dimorphism of NAFLD in Adults. Focus on Clinical Aspects and Implications for Practice and Translational Research. J Clin Med. 9 (5), 1278(2020).
  35. Lonardo, A., Ballestri, S., Mantovani, A., Targher, G., Bril, F. Endpoints in NASH Clinical Trials: Are We Blind in One Eye. Metabolites. 14 (1), 40(2024).
  36. Giles, D. A., et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. Nat Med. 23 (7), 829-838 (2017).
  37. Hao, L., Khan, M. S. H., Zu, Y., Liu, J., Wang, S. Thermoneutrality Inhibits Thermogenic Markers and Exacerbates Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Mice. Int J Mol Sci. 25 (15), 8482(2024).
  38. Horakova, O., et al. Thermoneutral housing promotes hepatic steatosis in standard diet-fed C57BL/6N mice, with a less pronounced effect on NAFLD progression upon high-fat feeding. Front Endocrinol. 14, 1205703(2023).
  39. Suzuki, A., Diehl, A. M. Nonalcoholic Steatohepatitis. Annu Rev Med. 68, 85-98 (2017).
  40. Arrese, M., et al. Insights into Nonalcoholic Fatty-Liver Disease Heterogeneity. Semin Liver Dis. 41 (4), 421-434 (2021).
  41. Wentworth, B. J., Caldwell, S. H. Pearls and pitfalls in nonalcoholic fatty liver disease: tricky results are common. Metab Target Organ Damage. 1 (1), 2(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Metabole leverziekte met dysfunctiemuismodel voor fibrosehepatische steatoseleverfibrosecollageenkleuringSirius Red kleuringhydroxyprolinekwantificeringvetrijk dieetleverhistopathologiegepolariseerde lichtmicroscopie

Gerelateerde artikelen