Ontwerp van vastestoffermentatiesystemen voor de productie van polymeerhydrolytische extracellulaire enzymen door filamenteuze schimmels

Summary

Dit protocol maakt gebruik van tarwezemelen in een roterend fermentatiesysteem in vaste toestand om de enzymproductie te verbeteren. Het substraat, aangevuld met inductoren zoals chitine, ondersteunt de schimmelgroei onder gecontroleerde omstandigheden. De resultaten tonen aan dat de enzymopbrengsten 4-6 keer hoger zijn in vergelijking met ondergedompelde fermentatie, wat het aanpassingsvermogen en de effectiviteit van de methode voor diverse biotechnologische toepassingen aantoont.

Abstract

Vastestoffermentatie (SSF) is een bioconversieproces waarbij gebruik wordt gemaakt van een vast substraat dat niet oplost in een waterig medium. Micro-organismen groeien op het oppervlak van het substraat en dringen door in de vaste matrix om essentiële voedingsstoffen voor hun ontwikkeling te extraheren. SSF wordt gekenmerkt door minimaal vrij water, met een vochtgehalte van het substraat dat boven de 70% wordt gehouden, en omvat drie onderling verbonden fasen: gasvormig, vloeibaar en vast. Dit protocol beschrijft het gebruik van tarwezemelen, een agro-industrieel bijproduct, als basissubstraat voor de productie van enzymen in een roterend systeem. Het substraat wordt aangevuld met een inductor, zoals chitine, chitosan, zetmeel of cellulose, om de synthese van hydrolytische eiwitten te bevorderen. Het systeem is zeer aanpasbaar en maakt het gebruik van verschillende schimmelvormen mogelijk, waaronder mycelium, sporen of pellets. In de beschreven methodologie worden de inductor en het substraat gemengd in een verhouding van 1:100 (w/w), gesteriliseerd via autoclaveren en met steriel water aangepast aan het gewenste vochtgehalte. Het schimmelinoculum wordt vervolgens toegevoegd en het roterende systeem werkt met 10 tpm om voldoende menging en oxygenatie te garanderen. Het systeem wordt gedurende 6-8 dagen geïncubeerd onder optimale groeiomstandigheden voor mesofiele of thermofiele/thermotolerante schimmels, waardoor de veelzijdigheid wordt vergroot. Na incubatie kan het enzym gemakkelijk worden geëxtraheerd met behulp van een geschikte koude buffer (bijv. acetaat, citraat of fosfaat), afhankelijk van het type enzym. Het extract wordt geklaard door centrifugatie en filtratie om een celvrij supernatant te verkrijgen. Het enzym kan dan verder worden geconcentreerd of gezuiverd als dat nodig is. De resultaten toonden een 4-6-voudige toename van de enzymactiviteit aan in vergelijking met ondergedompelde fermentatie (SmF), wat de effectiviteit van het systeem benadrukt. Het aanpassingsvermogen aan verschillende substraten, inductoren en schimmelsoorten maakt het een waardevol hulpmiddel voor verschillende biotechnologische toepassingen.

Introduction

Vastestoffermentatie (SSF) is naar voren gekomen als een veelbelovende en duurzame bioconversietechnologie voor de productie van hoogwaardige enzymen, bioactieve stoffen en secundaire metabolieten. Deze techniek omvat de groei van micro-organismen op vaste substraten met minimaal vrij water, waardoor hun natuurlijke omgeving wordt gesimuleerd en efficiënte^{metabolische activiteit mogelijk} wordt 1. Het primaire doel van dit protocol is het optimaliseren van de enzymproductie door middel van een roterend SSF-systeem dat zorgt voor een beter substraatgebruik, zuurstofdiffusie en schaalbaarheid van het proces. Het g....

Protocol

De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de ondergrond

OPMERKING: Gebruik een commercieel merk tarwezemelen om aanzienlijke variaties in substraatkenmerken te minimaliseren. Elke partij tarwezemelen varieert als gevolg van meerdere factoren, waardoor het een heterogeen materiaal is dat moeilijk te standaardiseren is, wat leidt tot fluctuaties in het gehalte aan bestanddelen. Als een gestandaardiseerd materiaal nodig is, kies dan een alternatieve matrix of voer....

Results

Figuur 1A geeft de schematische weergave weer van de roterende menger die in dit systeem wordt gebruikt, die een capaciteit heeft voor zes conische buizen van 50 ml. Figuur 2B illustreert de veranderingen die optreden in de tarwezemelen tijdens de conditionering voordat ze het fermentatieproces in vaste toestand ingaan. Zoals gezien, werden er geen significante structurele veranderingen waargenomen.

<.......

Discussion

Deze studie schetst een relevant protocol voor het optimaliseren van de enzymproductie door middel van solid-state fermentatie (SSF) -systemen, speciaal ontworpen voor filamenteuze schimmels. Hieronder worden kritische aspecten van de methodologie besproken, naast het belang, de beperkingen en de mogelijke toepassingen ervan.

Het succes van het protocol is sterk afhankelijk van belangrijke stappen zoals de voorbereiding van het substraat en het entmateriaal. H.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL Erlenmeyer flask	Sigma-Aldrich	CLS431684	For culturing mycelium in liquid medium.
50 mL conical tube	Sigma-Aldrich	CLS430921	For storing and preparing substrates and inoculum.
Acetate buffer, pH 5.6	Sigma-Aldrich	320866	For chitinase extraction.
Centricon filters	Millipore	UFC905024	For further purification of enzymes.
Counting cells chamber	Sigma-Aldrich	Z359629	Used to count spores under a microscope.
Filter paper	Whatman	1001-110	For filtering the enzyme extract.
Hygrometer	Todomicro	-	To measure relative humidity of the substrate.
Inducer (e.g., commercial chitin)	Sigma-Aldrich	C9752	Used to enhance enzyme production during fermentation.
Phosphate buffer, pH 6.9	Sigma-Aldrich	P5379	For amylase extraction.
Potato-dextrose agar	Sigma-Aldrich	P2182	Culture medium for growing fungal mycelium.
Potato-dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685	Liquid culture medium for growing fungal mycelium.
Rotary mixer	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	To keep substrate moving during fermentation.
Salt solution components (e.g., KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Multiple	For preparing sterile salt solution, see detailed recipe in the protocol.
Wheat bran	Comercial market	-	Substrate for solid-state fermentation.