Ontwerp van vastestoffermentatiesystemen voor de productie van polymeerhydrolytische extracellulaire enzymen door filamenteuze schimmels

Samenvatting

Dit protocol maakt gebruik van tarwezemelen in een roterend fermentatiesysteem in vaste toestand om de enzymproductie te verbeteren. Het substraat, aangevuld met inductoren zoals chitine, ondersteunt de schimmelgroei onder gecontroleerde omstandigheden. De resultaten tonen aan dat de enzymopbrengsten 4-6 keer hoger zijn in vergelijking met ondergedompelde fermentatie, wat het aanpassingsvermogen en de effectiviteit van de methode voor diverse biotechnologische toepassingen aantoont.

Samenvatting

Vastestoffermentatie (SSF) is een bioconversieproces waarbij gebruik wordt gemaakt van een vast substraat dat niet oplost in een waterig medium. Micro-organismen groeien op het oppervlak van het substraat en dringen door in de vaste matrix om essentiële voedingsstoffen voor hun ontwikkeling te extraheren. SSF wordt gekenmerkt door minimaal vrij water, met een vochtgehalte van het substraat dat boven de 70% wordt gehouden, en omvat drie onderling verbonden fasen: gasvormig, vloeibaar en vast. Dit protocol beschrijft het gebruik van tarwezemelen, een agro-industrieel bijproduct, als basissubstraat voor de productie van enzymen in een roterend systeem. Het substraat wordt aangevuld met een inductor, zoals chitine, chitosan, zetmeel of cellulose, om de synthese van hydrolytische eiwitten te bevorderen. Het systeem is zeer aanpasbaar en maakt het gebruik van verschillende schimmelvormen mogelijk, waaronder mycelium, sporen of pellets. In de beschreven methodologie worden de inductor en het substraat gemengd in een verhouding van 1:100 (w/w), gesteriliseerd via autoclaveren en met steriel water aangepast aan het gewenste vochtgehalte. Het schimmelinoculum wordt vervolgens toegevoegd en het roterende systeem werkt met 10 tpm om voldoende menging en oxygenatie te garanderen. Het systeem wordt gedurende 6-8 dagen geïncubeerd onder optimale groeiomstandigheden voor mesofiele of thermofiele/thermotolerante schimmels, waardoor de veelzijdigheid wordt vergroot. Na incubatie kan het enzym gemakkelijk worden geëxtraheerd met behulp van een geschikte koude buffer (bijv. acetaat, citraat of fosfaat), afhankelijk van het type enzym. Het extract wordt geklaard door centrifugatie en filtratie om een celvrij supernatant te verkrijgen. Het enzym kan dan verder worden geconcentreerd of gezuiverd als dat nodig is. De resultaten toonden een 4-6-voudige toename van de enzymactiviteit aan in vergelijking met ondergedompelde fermentatie (SmF), wat de effectiviteit van het systeem benadrukt. Het aanpassingsvermogen aan verschillende substraten, inductoren en schimmelsoorten maakt het een waardevol hulpmiddel voor verschillende biotechnologische toepassingen.

Inleiding

Vastestoffermentatie (SSF) is naar voren gekomen als een veelbelovende en duurzame bioconversietechnologie voor de productie van hoogwaardige enzymen, bioactieve stoffen en secundaire metabolieten. Deze techniek omvat de groei van micro-organismen op vaste substraten met minimaal vrij water, waardoor hun natuurlijke omgeving wordt gesimuleerd en efficiënte^{metabolische activiteit mogelijk} wordt 1. Het primaire doel van dit protocol is het optimaliseren van de enzymproductie door middel van een roterend SSF-systeem dat zorgt voor een beter substraatgebruik, zuurstofdiffusie en schaalbaarheid van het proces. Het gebruik van tarwezemelen, een overvloedig agro-industrieel bijproduct, als basissubstraat, draagt bij tot de valorisatie van landbouwresiduen en bevordert circulaire bio-economische praktijken².

SSF heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van ondergedompelde fermentatie (SmF), waaronder een lager energie- en waterverbruik, een hogere productconcentratie en compatibiliteit met een breed scala aan goedkope landbouwresiduen zoals tarwezemelen, rijstschillen en suikerrietbagasse³. In tegenstelling tot SmF, waarvoor grote hoeveelheden water en dure voedingsmedia nodig zijn, maken SSF-systemen gebruik van vaste matrices die niet alleen dienen als microbiële groeioppervlakken, maar ook voedingsstoffen leveren die essentieel zijn voor microbiële activiteit. Bovendien minimaliseert het beperkte vrije water in SSF de besmettingsrisico's, waardoor het een robuustere optie is voor enzymproductie in industriële omgevingen⁴. Naast de operationele voordelen biedt SSF aanzienlijke ecologische en economische voordelen in vergelijking met ondergedompelde fermentatie (SmF). Studies hebben gemeld dat SSF het waterverbruik met 50%-70% vermindert en de energiekosten met meer dan 30% verlaagt door de afwezigheid van grote watervolumes die constant moeten worden geagiteerd en belucht. Bovendien minimaliseert het gebruik van agro-industriële residuen als substraten de grondstofkosten en bevordert het circulaire economiepraktijken door agrarische bijproducten te hergebruiken ^2,4.

SSF is uitgebreid gevalideerd op zijn efficiëntie en schaalbaarheid. Studies hebben bijvoorbeeld een 4-6-voudige toename van enzymactiviteit gemeld met behulp van SSF in vergelijking met SmF, wat de economische en ecologische voordelen van deze techniek benadrukt ^2,5. Bovendien wordt het stroomafwaartse proces vereenvoudigd, omdat enzymextractie doorgaans minder water en minder zuiveringsstappen vereist. Dit maakt SSF bijzonder aantrekkelijk voor industrieën die gericht zijn op het verminderen van operationele kosten en milieu-impact⁶.

Het roterende SSF-systeem dat in dit protocol wordt beschreven, biedt verschillende verbeteringen ten opzichte van traditionele statische SSF-methoden. Hoewel statische systemen vaak te maken hebben met uitdagingen zoals ongelijkmatige kolonisatie van het substraat en zuurstofbeperking, zorgt de roterende configuratie voor een grondige menging en beluchting, waardoor een uniforme microbiële groei wordt bevorderd ^7,8,9. Dit systeem is bijvoorbeeld met succes gebruikt om hydrolytische enzymen zoals chitinasen, amylasen en proteasen te produceren met behulp van schimmelsoorten zoals Aspergillus en Trichoderma².

Een belangrijk kenmerk van dit SSF-systeem is het aanpassingsvermogen. Het gebruik van tarwezemelen als basissubstraat toont het potentieel van agro-industriële residuen voor kosteneffectieve bioconversie³. Bovendien verbetert de suppletie van het substraat met inductoren zoals chitine, chitosan en zetmeel de enzymsynthese verder door specifieke metabole routes te stimuleren ^2,10. Het systeem is ook compatibel met verschillende schimmelvormen, waaronder sporen, mycelium en pellets, waardoor gebruikers het proces kunnen afstemmen op hun specifieke vereisten².

SSF biedt een breed potentieel voor toepassing op verschillende gebieden, zoals voedselbiotechnologie, productie van biobrandstoffen en milieusanering¹¹. De integratie van kosteneffectieve substraten, uitzonderlijke enzymopbrengsten en hoge procesflexibiliteit maakt SSF tot een essentiële benadering voor biotechnologische innovaties op industriële schaal.

Protocol

De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de ondergrond

OPMERKING: Gebruik een commercieel merk tarwezemelen om aanzienlijke variaties in substraatkenmerken te minimaliseren. Elke partij tarwezemelen varieert als gevolg van meerdere factoren, waardoor het een heterogeen materiaal is dat moeilijk te standaardiseren is, wat leidt tot fluctuaties in het gehalte aan bestanddelen. Als een gestandaardiseerd materiaal nodig is, kies dan een alternatieve matrix of voer een nabije chemische analyse uit van elke batch tarwezemelen om deze aan te passen aan de behoeften.

1. Was de tarwezemelen drie keer met steriel gedestilleerd water om resten van organisch materiaal, vuil en stof te verwijderen. Dit verwijdert ook eenvoudige suikers die de fermentatie zouden kunnen verstoren.
2. Spreid de gewassen zemelen uit op een aluminium bakje en droog ze 24 uur in een oven op 60 °C.
3. Eenmaal gedroogd, plaatst u de tarwezemelen in een steriele conische buis van 50 ml.

2. Bereiding van het entmateriaal

OPMERKING: Dit protocol beschrijft drie methoden voor de voorbereiding van inoculum: sporensuspensie, directe inoculatie met myceliumschijven en cellulaire suspensie. Bepaal de initiële inoculumconcentratie en kwantificeer de eiwitniveaus voor nauwkeurige opbrengstberekeningen.

1. Bereiding van sporensuspensie
   1. Breng een agarschijf met een diameter van 5 mm verzadigd met mycelium over op een verse aardappeldextrose-agarplaat. Incubeer de plaat 5-7 dagen bij 28 °C, of totdat het mycelium het medium verzadigd heeft. Sommige schimmels hebben mogelijk een langere incubatietijd nodig.
   2. Voeg 5 ml steriel gedestilleerd water toe aan de plaat en maak de sporen mechanisch los met behulp van een steriele lus.
   3. Bereid een verdunning van 1:100 van de sporensuspensie. Plaats 10 μL in het midden van een Neubauer-kamer en tel sporen onder een microscoop. Bereken de sporenconcentratie (sporen/ml) op basis van de factor en verdunning van de kamer.
2. Teelt van mycelium in vloeibaar medium
   1. Breng een met mycelium verzadigd agarschijf van 5 mm over op een verse aardappel-dextrose-agarplaat en incubeer bij 28 °C tot deze verzadigd is.
   2. Bereid 25 ml aardappeldextrosebouillon in een steriele kolf van 125 ml en autoclaaf.
   3. Breng een myceliumschijf van 5 mm van de verzadigde plaat over in de steriele bouillon.
   4. Incubeer de kolf op een shaker bij 125 tpm gedurende 24-48 uur, afhankelijk van de schimmelstam. Verleng de incubatietijd voor langzaam groeiende schimmels.
   5. Verzamel 2 ml voor het entmateriaal en 2 ml voor de bepaling van het droge gewicht.
3. Directe inoculatie van myceliumschijven
   1. Plaats een agarschijf van 5 mm verzadigd met mycelium op een verse aardappel-dextrose-agarplaat. Incubeer bij 28 °C tot verzadiging.
   2. Gebruik een myceliumschijf als inoculum en een andere om het drooggewicht te bepalen.

3. Voorbereiding van het SSF-systeem

OPMERKING: Inductoren kunnen natuurlijk of commercieel zijn. Gezuiverde commerciële inductoren hebben de voorkeur om onzuiverheden te minimaliseren die de fermentatie-efficiëntie zouden kunnen veranderen. Pas de watertoevoegingen aan om een relatieve vochtigheid van ten minste 90% te behouden.

1. Combineer de volgende componenten in een steriele conische tube van 50 ml: 5 g droge tarwezemelen; 0,2 g van de inductor (bijv. in de handel verkrijgbare chitine); 5,5 ml water (aanpassen op basis van het waterabsorptievermogen van de inducer); 5 ml steriele zoutoplossing met 16 g/l monobasisch kaliumfosfaat, 4 g/l natriumsulfaat, 2 g/l kaliumchloride, 1 g/l calciumchloride, 400 mg/l zinkchloride, 60 mg/l boorzuur, 40 mg/l natriummolybdaat, 150 mg/l magnesiumchloride, 100 mg/l ijzerchloride en 400 mg/l kopersulfaat.
2. Meet de relatieve vochtigheid met behulp van een hygrometer op basis van elektroden en zorg voor een luchtvochtigheid van minimaal 90%. Steek de elektrodesonde rechtstreeks in de reactor op verschillende dieptes om een representatieve meting van de vochtverdeling te verkrijgen.
   1. Volg de stappen om de luchtvochtigheid aan te passen als deze lager is dan 90%:
      1. Voeg geleidelijk steriel gedestilleerd water toe in stappen van 1 ml per 10 g substraat. Meng na elke toevoeging grondig om een gelijkmatige verdeling van het vocht te garanderen.
      2. Laat het substraat 10-15 minuten in evenwicht komen. Meet de luchtvochtigheid opnieuw.
      3. Herhaal de bovenstaande stappen totdat de gewenste luchtvochtigheid van 90% is bereikt. Vermijd het te nat maken van de ondergrond tijdens het hele proces.
   2. Volg de stappen om de luchtvochtigheid aan te passen als deze hoger is dan 90%:
      1. Spreid het substraat dun uit in een steriele omgeving. Verwijder overtollig vocht door (1) het substraat bloot te stellen aan laminaire luchtstroom, of (2) het gedurende 10-15 minuten in een droogkamer bij 30 °C te plaatsen.
      2. U kunt het substraat ook voorzichtig mengen om een gelijkmatige herverdeling van het vocht te bevorderen. Beoordeel na de behandeling de luchtvochtigheid opnieuw.
      3. Herhaal de droog- of mengstap indien nodig totdat de luchtvochtigheid 90% bereikt. Ga pas verder met fermenteren als de beoogde vochtigheid is bereikt.
3. Autoclaaf de buis op 15 psi gedurende 15 minuten.
4. Inoculeer het substraat na afkoeling met een van de volgende: 1 ml sporensuspensie (1 x 10^6-1 x 10⁷ sporen/ml), 2 ml cellulaire suspensie of een myceliumschijf van 5 mm.

4. Procedure voor vastestoffermentatie (SSF)

OPMERKING: Voor kinetische studies of parameterevaluaties op verschillende tijdstippen, maakt u voor elk tijdstip afzonderlijke buizen klaar om representativiteit te garanderen.

1. Voorkom klonteren van het substraat door de buizen gedurende 5 minuten in cycli van 1 minuut op maximale snelheid te vortexen.
2. Plaats de buizen in een roterende mixer met een horizontale as. Zorg ervoor dat het substraat vrij in de buizen kan bewegen. Stel de mixer in op 10 tpm.
3. Incubeer de mixer in een broedmachine bij de optimale groeitemperatuur van het micro-organisme. Handhaaf de gerapporteerde temperatuur voor een optimale enzymatische activiteit bij gebruik van warmtegevoelige inductoren.

5. Extractie van enzymen

OPMERKING: De basisprincipes van de extractie zijn gebaseerd op de oplosbaarheid en pH-maximale activiteit van het extracellulaire enzym. Omdat SSF het watermedium vermijdt, is het extracellulaire enzym betrokken bij het water rond de vaste matrix, wat betekent dat de concentratie hoger is dan in SmF. In deze context hangt de selectie van de beste extractiebuffer af van de kennis van de gewenste activiteit. De optimalisatie van de extracties is afhankelijk van de uiteindelijke enzymconcentratie en het type extractiebuffer dat wordt gebruikt.

1. Na de gewenste fermentatieperiode resuspendeert u het substraat in 20 ml voorgekoelde buffer. Voorbeelden zijn: 0,1 M acetaatbuffer, pH 5,6, voor chitinase-extractie; 0,02 M fosfaatbuffer, pH 6,9, voor amylase-extractie.
2. Vortex de buizen in cycli: 1 minuut op maximale snelheid, gevolgd door 1 minuut op ijs. Herhaal 10 keer.
3. Filtreer de suspensie met behulp van papieren filters en extraheer het bovenstaande mechanisch door erop te drukken.
4. Verhelder het bovenstaande door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
5. Gebruik het ruwe extract direct of zuiver het enzym verder via kolomchromatografie of centrifugaalfilters. Kinetisch onderzoek wordt ook aanbevolen om de Michaelis-constante (Km) en de maximale snelheid van enzymatische transformatie (Vmax)¹² te bepalen.

6. Optimalisatie proces

OPMERKING: Optimaliseer dit protocol door de kwaliteit en concentratie van inductoren te evalueren en aan te passen, evenals het type en de concentratie van het inoculum.

1. Bepaal de ideale fermentatietijd en verfijn de extractiestappen om de efficiëntie te verbeteren.
2. Beheers en verfijn de omgevingsomstandigheden, waaronder temperatuur, pH en beluchting.
3. Test verschillende buffers en extractievoorwaarden om de enzymopbrengst en stabiliteit te verbeteren.
4. Voer statistische analyses uit, zoals de methodologie van het responsoppervlak, om de meest invloedrijke variabelen te identificeren en een optimale enzymproductie te bereiken.

Resultaten

Figuur 1A geeft de schematische weergave weer van de roterende menger die in dit systeem wordt gebruikt, die een capaciteit heeft voor zes conische buizen van 50 ml. Figuur 2B illustreert de veranderingen die optreden in de tarwezemelen tijdens de conditionering voordat ze het fermentatieproces in vaste toestand ingaan. Zoals gezien, werden er geen significante structurele veranderingen waargenomen.

<...

Discussie

Deze studie schetst een relevant protocol voor het optimaliseren van de enzymproductie door middel van solid-state fermentatie (SSF) -systemen, speciaal ontworpen voor filamenteuze schimmels. Hieronder worden kritische aspecten van de methodologie besproken, naast het belang, de beperkingen en de mogelijke toepassingen ervan.

Het succes van het protocol is sterk afhankelijk van belangrijke stappen zoals de voorbereiding van het substraat en het entmateriaal. H...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
125 mL Erlenmeyer kolf	Sigma-Aldrich	CLS431684	Voor het kweken van mycelium in vloeibaar medium.
50 mL kegelbuis	Sigma-Aldrich	CLS430921	Voor het opslaan en voorbereiden van substraten en inoculum.
Acetaatbuffer, pH 5,6	Sigma-Aldrich	320866	Voor chitinase extractie.
Centricon filters	Millipore	UFC905024	Voor verdere zuivering van enzymen.
Tellkamer	Sigma-Aldrich	Z359629	Gebruikt om sporen onder een microscoop te tellen.
Filterpapier	Whatman	1001-110	Voor het filteren van het enzymextract.
Hygrometer	Todomicro	-	Om de relatieve luchtvochtigheid van het substraat te meten.
Inducer (bijv. commercieel chitine)	Sigma-Aldrich	C9752	Gebruikt om de enzymproductie tijdens fermentatie te verbeteren.
Fosfaatbuffer, pH 6,9	Sigma-Aldrich	P5379	Voor amylase extractie.
Aardappel-dextrose agar	Sigma-Aldrich	P2182	Kweekmedium voor het kweken van schimmelmycelium.
Aardappel-dextrose bouillon	Sigma-Aldrich	P6685	Vloeibaar kweekmedium voor het kweken van schimmelmycelium.
Roterende mixer	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	Om het substraat tijdens fermentatie in beweging te houden.
Zoutoplossing componenten (bijv. KH2PO4, Na2SO4, KCl, enz.)	Sigma-Aldrich	Meerdere	Voor het bereiden van steriele zoutoplossing, zie gedetailleerd recept in het protocol.
Tarwezemelen	Comercial market	-	Substraat voor vaste-stof fermentatie.