Peak-calling algoritmes (WonderPeaks en PeakStream) als hulpmiddelen voor verbeterde ChIP-seq en transcriptomische analyse bij schimmelpathogenen

Samenvatting

Dit rapport introduceert WonderPeaks, een nieuwe computationele tool voor het analyseren van RNA-seq- en ChIP-seq-gegevens. Deze tool identificeert met succes pieken (lees pileups) in sequentiegegevens, waardoor de karakterisering van niet-getransleerde regiogrenzen in RNA-seq mogelijk wordt en chromatineverrijking in ChIP-seq wordt gedetecteerd, wat waardevolle inzichten oplevert voor onderzoek naar schimmelpathogenen.

Samenvatting

Het karakteriseren van veranderingen in genexpressie door middel van transcriptomics en transcriptieregulatoractiviteit is een fundamentele benadering geworden voor het begrijpen van de diverse reacties die betrokken zijn bij de pathogenese van schimmels. Dit artikel introduceert twee computationele hulpmiddelen die zijn ontworpen om de belangrijkste uitdagingen aan te pakken in de studie van transcriptionele regulatie bij schimmelpathogenen, met name niet-modellen met beperkte genomische annotatie. Eerst presenteren we WonderPeaks, een nieuw algoritme voor het aanroepen van pieken dat gebruikmaakt van de eerste afgeleide van in kaart gebrachte genomische gegevens van next-generation sequencing (NGS) experimenten om verrijkte pieken in chromatine immunoprecipitatie te identificeren, gevolgd door sequencing (ChIP-seq). Ten tweede introduceren we PeakStream, een uitbreiding van WonderPeaks voor het annoteren van 3' niet-getransleerde regio's (UTR's) in transcriptomische gegevens die zijn gegenereerd met behulp van poly(A)-geprepareerde bibliotheekvoorbereiding. Samen bieden deze tools een end-to-end data-analysepijplijn, die een gebruiksvriendelijke oplossing biedt voor onderzoekers die transcriptieregulatie in schimmels bestuderen. We tonen hun effectiviteit aan met gegevens van de schimmelpathogeen Candida albicans, waarbij we met succes geverifieerde pieken in ChIP-seq-gegevens identificeren en gevalideerde UTR's annoteren door vergelijking met totale RNA-sequencinggegevens onder dezelfde omstandigheden. We bespreken ook de beperkingen van WonderPeaks voor ChIP-seq-gegevens in vergelijking met de huidige state-of-the-art methoden en stellen richtingen voor toekomstige verbeteringen voor. Uiteindelijk biedt dit werk praktische richtlijnen en krachtige bronnen voor het bestuderen van transcriptieregulatie, met onmiddellijke relevantie voor pathogene schimmels en mogelijke toepassingen in bredere genomische studies.

Inleiding

Schimmelpathogenen zijn een opkomend wereldwijd gezondheidsprobleem, met infecties die de afgelopen jaren zijn toegenomen¹. Veel van deze ziekteverwekkers vertonen een hoge resistentie tegen schimmelwerende stoffen en worden in verband gebracht met aanzienlijke sterftecijfers². In vergelijking met modelschimmelorganismen blijven veel pathogene schimmels echter slecht gekarakteriseerd, wat de noodzaak benadrukt van verder onderzoek naar hun mechanismen van pathogeniteit. Next-generation sequencing (NGS) technieken zoals Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-Seq) en RNA-Sequencing (RNA-Seq) spelen een cruciale rol bij het blootleggen van de moleculaire mechanismen van genexpressie die ten grondslag liggen aan de pathogeniteit van schimmels.

De kwaliteit van de inzichten die uit NGS-gegevens worden afgeleid, is sterk afhankelijk van de nauwkeurigheid van de software die wordt gebruikt voor de analyse van ruwe gegevens. Een van de belangrijkste uitdagingen voor NGS-gegevensanalyse is piekaanroepen - het nauwkeurig identificeren van regio's met verrijkte NGS-lezingen - die bijzonder complex is vanwege de grote verscheidenheid aan technieken voor bibliotheekvoorbereiding en -sequencing, waardoor een universele oplossing onpraktisch is. Het MACS-algoritme³, inclusief de recentere versie, MACS3, wordt algemeen beschouwd als de gouden standaard voor het analyseren van ChIP-seq-datasets. MACS is echter afhankelijk van door de gebruiker gedefinieerde parameters - zoals minimale pieklengte en maximale kloof - die mogelijk niet universeel toepasbaar zijn en vaak moeilijk te bepalen zijn voorafgaand aan de analyse. Met name de nieuwste MACS3-release bevat een cut-off-analysefunctie waarmee gebruikers parameters kunnen schatten voordat de piek wordt aangeroepen. Voor betere prestaties kunnen gebruikers ook een lijst verstrekken van genomische regio's op de "zwarte lijst" waarvan bekend is dat ze vertekening veroorzaken als gevolg van de chromatinestructuur of variatie in het aantal kopieën. Hoewel MACS de meest gebruikte en vertrouwde tool voor piekoproepen voor ChIP-seq-gegevens blijft, zijn er maar weinig alternatieve algoritmen beschikbaar, met name voor gevallen die sterk op maat gemaakte parameterinstellingen vereisen.

RNA-Seq is een techniek van onschatbare waarde voor het bestuderen van de genexpressiereacties van pathogene schimmels tijdens in vivo groei, zoals in weefselkweek- of muisinfectiemodellen 4,5,6,7. Een hoge sequencingdiepte is vereist voor een nauwkeurige differentiële expressieanalyse onder deze omstandigheden, die onbetaalbaar kan zijn voor kosten en middelen ^8,9. Bibliotheekvoorbereidingsmethoden zoals poly-adenylatie (poly(A))-priming Sequencing (3'RNA-Seq), waarbij primers worden gebruikt die zijn ontworpen om uit te gloeien naar de poly(A)-staarten van mRNA voor het genereren van cDNA, kunnen helpen de sequencingdiepte te verminderen die nodig is voor genexpressieanalyse¹⁰. Deze benadering is echter gebaseerd op genoomannotaties van hoge kwaliteit, met name van 3' Untranslated Regions (UTR's), waar pieken van poly(A)-priming-gebeurtenissen doorgaans worden gelokaliseerd¹¹. De genoomannotaties van veel onderbelichte schimmelpathogenen missen UTR-annotaties, waardoor het gebruik van 3'RNA-Seq in deze organismen moeilijk is. Bovendien kan de UTR-lengte voor een enkel gen dynamisch zijn voor verschillende groeiomstandigheden en celtypen^12,13. Hoewel er een aantal nieuwe analyse-instrumenten zijn ontwikkeld om UTR's te identificeren en te annoteren, zijn veel daarvan ontworpen voor datasets van zoogdieren, waarvan de genorganisatie sterk verschilt van die van schimmels, of vereisen ze gegevens van onafhankelijke sequencing-experimenten, zoals single-cell of reverse mRNA-sequencing, die tijd en kosten kunnen verhogen voor een onderzoeker die transcriptoomanalyse wil uitvoeren^{12, 14,15}.

In dit artikel presenteren we WonderPeaks, een nieuwe software voor piekoproeping, ontworpen volgens de principes van de eerste afgeleide, die kan worden gebruikt om pieken in NGS-datasets dynamisch aan te roepen (Figuur 1). WonderPeaks identificeert pieken door de eerste afgeleide van het dekkingssignaal te berekenen en deze waarde - de helling van de piek - te gebruiken om potentiële pieken te definiëren. Het algoritme zoekt naar gevallen waarin de eerste afgeleide een lokaal maximum vertoont boven een door de gebruiker opgegeven of door de gegevens afgeleide hellingsdrempel (wat een toenemend signaal aangeeft), gevolgd door een lokaal minimum boven dezelfde drempel (wat een afnemend signaal aangeeft), waardoor alle kandidaat-pieken in de dataset worden gedetecteerd. Voor ChIP-seq-toepassingen vergelijkt WonderPeaks alle kandidaat-pieken tussen test- en controlemonsters om uniek verrijkte pieken te identificeren. Door WonderPeaks toe te passen op een eerder gepubliceerde ChIP-seq-dataset van een transcriptiefactor in de schimmelpathogeen Candida albicans¹⁶, hebben we aangetoond dat het in staat is om met succes pieken stroomopwaarts van de belangrijkste genen te identificeren die in de oorspronkelijke studie zijn benadrukt, terwijl we ook de huidige beperkingen van het algoritme in deze toepassing bespreken.

We introduceren ook PeakStream, een softwaretool die gebruikmaakt van WonderPeaks om pieken in 3'RNA-Seq-datasets te identificeren. 3'RNA-Seq-bibliotheken zijn afhankelijk van nauwkeurige 3' UTR-annotaties, aangezien lezingen die worden gegenereerd door middel van poly(A)-priming vaak verder reiken dan het stopcodon van de coderende sequenties (CDS) van genen en dus niet worden meegeteld bij gebruik van standaardannotaties die uitsluitend gericht zijn op coderende regio's. De PeakStream-analysepijplijn is ontworpen om nieuwe genoomannotaties te maken met behulp van 3' RNA-Seq-gegevens, met de nadruk op regio's stroomafwaarts van gencoderende sequentieregio's (CDS). PeakStream wijst deze pieken toe aan genen en genereert een nieuwe genoomannotatie voor gebruik in downstream leestelprogramma's. We laten zien dat het gebruik van PeakStream het nauwkeurig kan identificeren en toewijzen van stroomafwaartse poly(A)-gegenereerde pieken aan het juiste gen in een 3'RNA-Seq C. albicans-dataset . PeakStream annoteert ook pieken die waarschijnlijk niet geassocieerd zijn met huidige genannotaties, waardoor de ontdekking van mogelijke nieuwe transcripten wordt vergemakkelijkt. Samen vertegenwoordigen PeakStream en WonderPeaks een krachtige reeks gebruiksvriendelijke tools voor piekdetectie in next-generation sequencing (NGS) datasets.

Figuur 1: Overzichtscijfer van peak-calling door WonderPeaks en PeakStream. Links: Peaking calling met behulp van de eerste afgeleide. Rechtsboven: Peak-calling op ChIP-Seq-datasets met behulp van WonderPeaks. Rechtsonder: Piekaanroeping op RNA-Seq-datasets met behulp van PeakStream. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Installatie (overslaan indien voltooid)

1. Voorwaarden
   1. Installeer Anaconda of Minconda om de vereisten te laden om voorverwerking (sectie 5) en WonderPeaks (sectie 6 of sectie 7) uit te voeren.
      OPMERKING: Voor een gebruikershandleiding voor Anaconda, zie de referentie¹⁶.
   2. Installeer Python: Python binnen Anaconda of Miniconda.
   3. Installeer Jupyter Notebooks om alle functies in deze methode uit te voeren.
      OPMERKING: Een gebruikershandleiding voor beginners voor Jupyter-notebooks is te vinden in de referentie¹⁷.
      LET OP: Zorg voor schimmelgenomen (≤100 Mbp) voor een computeromgeving met ten minste 20 cores, 8 GB RAM en 30 GB beschikbare schijfruimte.
2. Installeer voorbewerkingsfuncties.
   1. Voer in de terminal het volgende uit: conda create -n WP_preprocessing
   2. Voer in de terminal uit: conda activeren WP_preprocessing
   3. Voer in de terminal het volgende uit: conda env update --file environment.yml --name
      OPMERKING: De environment.yml is een bestand dat alle pakketafhankelijkheden bevat en moet worden gedownload van https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing.git.
   4. Voer in de terminal het volgende uit: pip install WonderPeaks-preprocessing
   5. Voer in de terminal uit: conda deactiveer WP_preprocessing
3. Installeer WonderPeaks-functies:
   1. Voer in de terminal het volgende uit: conda create -n WonderPeaks
   2. Voer in de terminal uit: conda activeer WonderPeaks
   3. Voer in de terminal het volgende uit: conda env update --file environment.yml --name
      OPMERKING: De environment.yml is een bestand dat alle pakketafhankelijkheden bevat en moet worden gedownload van https://github.com/mgarber21/WonderPeaks.git.
   4. Voer in de terminal het volgende uit: pip install WonderPeaks
   5. Voer in de terminal uit: conda deactiveer WonderPeaks
      OPMERKING: Met stap 1.2 en 1.3 wordt het volgende bereikt: Ze creëren een speciale Conda-omgeving voor voorverwerking (sectie 5) en WonderPeaks (secties 6 en 7), waarbij afhankelijkheden worden geïsoleerd om conflicten met andere software te voorkomen. Ze activeren de omgeving en stellen deze in voor het installeren en uitvoeren van WP_preprocessing of WonderPeaks-specifieke functies. Ze installeren de software-afhankelijkheden en tools die nodig zijn voor het voorverwerken van de gegevens. Ze deactiveren de omgeving wanneer ze niet in gebruik zijn om onbedoelde wijzigingen te voorkomen en systeembronnen vrij te maken.
4. Download Jupyter Notebooks en sjablonen uit de WonderPeaks GitHub-repository. Upload de WonderPeaks-downloads naar het besturingssysteem dat de onbewerkte gegevens bevat (directory wordt aangemaakt in sectie 2).
   OPMERKING: De Jupyter Notebooks bevatten vooraf geschreven scripts en sjablonen die nodig zijn voor het uitvoeren van voorverwerkings-, WonderPeaks- en PeakStream-workflows. Door ze te uploaden naar hetzelfde systeem als de onbewerkte gegevens, zorgt u ervoor dat de paden en mappen correct worden uitgelijnd.

2. Maak een gegevensmap

OPMERKING: WonderPeaks- en PeakStream-workflows vereisen dat alle gegevens (onbewerkt en verwerkt) in dezelfde map worden opgeslagen. In deze stap wordt uitgelegd hoe u deze nieuwe map maakt ({data_directory} = /path/to/your/data) en hoe u experimentele onbewerkte gegevens (onverwerkte sequencing-lezingen) kunt verplaatsen naar een map in deze map met de naam raw_data.

1. Maak een gegevensmap.
   1. Voer in de terminal mkdir {data_directory} uit (bijv. mkdir /path/to/your/data)
2. Maak een submap met onbewerkte gegevens voor onverwerkte sequencing-lezingen.
   1. Voer in de terminal mkdir {data_directory}/raw_data uit (bijv. mkdir /path/to/your/data /raw_data)
3. Verplaats de niet-verwerkte sequencing-lezingen naar de map met onbewerkte gegevens.
   1. Voer in de terminal mv {current_path_to_raw_data}/*fastq* {data_directory}/raw_data uit (bijv. mv current/data/path/*fastq* /path/to/your/data /raw_data

3. Maak het bestand voor gebruikersinvoer (NGS_user_input.csv)

OPMERKING: Het invoerbestand specificeert de door de gebruiker gegenereerde configuraties voor het uitvoeren van voorverwerking en WonderPeaks.

1. Download sjabloon NGS_user_inputs.csv uit de WonderPeaks GitHub-repository.
2. Werk velden bij in NGS_user_inputs.csv. Werk de velden als volgt bij:
   Gegevensmap: /pad/naar/uw/gegevens
   Genoom directory: /path/to/your/genoom
   Genoom fasta: genoom.fasta
   Genoomannotatie: genome_annotation.gtf (geef de bestandsnaam van de genoomannotatie op in GTF-formaat)
3. Sla de bijgewerkte NGS_user_inputs.csv op in de gegevensmap die in sectie 2 is gemaakt.
   LET OP: Verander de bestandsnaam niet; WonderPeaks herkent dit bestand alleen als het de naam NGS_user_input.csv heeft.

4. Metadatabestand maken (NGS_user_metadata.csv)

OPMERKING: Het metagegevensbestand wordt gebruikt om alle informatie op te slaan die relevant is voor het experiment. Er kunnen extra kolommen worden toegevoegd om de omstandigheden van het experiment te beschrijven, maar deze hebben geen invloed op de volgende stappen.

1. Download sjabloon NGS_user_metadata.csv uit de WonderPeaks GitHub-repository.
2. Velden bijwerken in NGS_user_metadata.csv De velden zijn als volgt:
   1. bestand: Zorg ervoor dat de bestandsnaam geen spaties bevat, de bestandsgreep bevat (bijv. fastq, fastq.gz) en niet het absolute pad bevat.
   2. bedgraph: Geef op of het bestand moet worden opgenomen in PeakStream door dit veld in te stellen op TRUE of FALSE.
      1. Stel het veld bedgraph in op FALSE wanneer het bestand redelijkerwijs kan worden uitgesloten van PeakStream-analyse. Stel bijvoorbeeld in een RNAseq-experiment de bedgraph-parameter bedgraph=FALSE in voor mutanten of andere gevallen waarin UTR-verschillen tussen monsters niet worden verwacht. Zorg er echter voor dat u het veld voor de bedgraph instelt op TRUE voor alle besturingsbestanden in een RNAseq-experiment en voor alle bestanden in een ChIPseq-experiment .
   3. Ontwerpfactor
      1. ontwerpfactor1: Specificeer een ontwerpfactor die relevant is voor de experimentele opzet (bijv. behandeling of sample_type).
      2. ontwerpfactor2: Specificeer een tweede ontwerpfactor die relevant is voor het experimentele ontwerp (bijv. stam of epitoop). Neem voor een RNAseq-experiment behandeling en spanning op als typische ontwerpfactoren. De behandelingskolom geeft een overzicht van de toegepaste behandelingen (bijv. controle, geneesmiddel1) en de stamkolom bevat staminformatie (bijv. wildtype, mutant). Neem voor een ChIPseq-experiment sample_type en epitoop op als typische ontwerpfactoren. De sample_type kolom geeft aan of het eiwit al dan niet gelabeld is, en de kolom met epitoop bevat de naam van het gebruikte epitoop.
         OPMERKING: ontwerpfactoren zijn attributen die specifiek zijn voor de experimentele opzet.
         WonderPeaks is compatibel met niet-getagde besturingselementen of invoerbesturingselementen als basislijn.
      3. Zorg ervoor dat de kolommen met de ontwerpfactor geen uniek replicatienummer bevatten (bijvoorbeeld sample_type: [getagd, getagd, untagged_control, untagged_control] niet sample_type: [tagged_1, tagged_2, untagged_control _1, untagged_control _2]. Het opgeven van unieke replicatienummers resulteert in een fout tijdens de uitvoering.
      4. Zorg ervoor dat u onderstrepingstekens (_) gebruikt in plaats van spaties in de namen van ontwerpfactoren.
      5. Zorg er voor de ChIPseq-toepassing voor dat de kolom sample_type (of aangepaste naam) in het metagegevensbestand termen bevat die de woorden tag en control bevatten.
         OPMERKING: Geldige inzendingen kunnen bijvoorbeeld getagd en untagged_control bevatten. Als u een sample_type kolom opgeeft zonder deze termen, resulteert dit in een fout tijdens de uitvoering.
         LET OP: Voor een ChIP-toepassing moet de gebruiker twee ontwerpfactoren opgeven.
      6. Voeg ontwerpfactoren toe aan de relevante rij NGS_user_inputs.csv. Zorg ervoor dat de kolomnamen die voor ontwerpfactoren worden gebruikt, worden vermeld als een door puntkomma's gescheiden tekenreeks (bijv. behandeling; stam of sample_type; epitoop).
         LET OP: De ontwerpfactoren in NGS_user_inputs.csv moeten exact overeenkomen met kolommen van NGS_user_metadata.csv . Elke niet-overeenkomende uitvoering resulteert in een fout tijdens de uitvoering (Afbeelding 2, Aanvullende Tabel S1 en Aanvullende Tabel S2).

Figuur 2: Voorbeeld NGS_user_input.csv en NGS_user_metadata.csv. Voorbeelden van de NGS_user_input.csv (bovenste paneel) en NGS_user_metadata.csv (onderste paneel), waarbij de overeenkomst tussen de kolommen designfactor en designfactor wordt gemarkeerd met roze of blauwe tekst en pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Voorverwerking van NGS-gegevens

OPMERKING: Ga naar sectie 5 of sectie 6 als u aangepaste voorverwerking gebruikt.

1. Open NGS-voorverwerking Jupyter Notebook (NGS_Preprocessing.ipynb).
2. Activeer WP_preprocessing omgeving (gemaakt in stap 1.2) in de rechterbovenhoek van de notebookinterface.
3. Voer de eerste cel uit door de Shift-toets ingedrukt te houden en vervolgens op Enter (Shift+Enter) te drukken.
4. Werk in de tweede cel van het Jupyter-notebook het mappad bij door de Directory = "path/to/your/data" in te stellen, waarbij path/to/your/data/ de map is die in sectie 2 is gemaakt.
5. Genereer uitlijningsbestanden. De voorbewerkingsfuncties voeren trimmen uit met behulp van FastP¹⁸; Kwaliteitscontrole met behulp van FastQC¹⁹ en MultiQC²⁰; Uitlijning met STAR²¹. De uitvoeruitlijningsbestanden worden opgeslagen in een submap met de naam startout in de gegevensmap (bijv. path/to/your/data/starout); Filteren (optional) met behulp van samtools view²², filter het uitlijningsbestand om alleen lezingen boven een drempel te houden die is gespecificeerd in NGS_user_inputs.csv.
   OPMERKING: Deze functies verwerken slechts enkele lezingen (bijv. R1) van de dataset tegelijk. Gebruikers kunnen uitvoeringsopties voor FastP en STAR in de NGS_user_inputs.csv specificeren (bijv. FastP: adapter_sequence (optioneel); STAR: genomeDir, genomeFastaFiles, sjdbGTFfil).
6. Voer voorverwerkingsfuncties uit in de tweede cel met Shift + Enter.
   OPMERKING: Taken in de tweede cel kunnen enkele uren in beslag nemen. Als de run wordt onderbroken, herhaalt u stap 5.3-5.6 om de run opnieuw te starten. De voortgang van de vorige stappen wordt niet overschreven en het proces gaat verder waar het was gebleven.
7. Genereer tracebestanden van de uitlijningsdekking met behulp van BamCoverage²³ (zie stappen 5.7.1 en 5.7.2).
   OPMERKING: Voor ChIPseq vereist WonderPeaks single bedgraph-bestanden met dekking voor zowel voorwaarts als achterwaarts lezen. Voor RNAseq met Poly(A)-priming heeft PeakStream twee bedgraph-bestanden nodig, één voor voorwaartse lezingen (_fwd.bedgraph) en één voor omgekeerde lezingen (_rev.bedgraph). Vooruit- en achteruitlezen worden gegenereerd met behulp van de filterRNAstrand-parameter in BamCoverage²³.
   1. ChIPseq met behulp van de volgende parameters: outfilfeformat="bedgraph", strand=None, binsize=20, smoothLength=60, minMappingQuality=255, normalizeUsing="CPM".
      OPMERKING: Uitvoer: Produceert enkelvoudige bedgraph-bestanden met dekking voor zowel voorwaartse als achterwaartse metingen. De uitvoer wordt opgeslagen in /path/to/your/data/bedgraphout (Figuur 3).
      1. Voer de BamCoverage-functie uit in de derde cel met behulp van Shift + Enter.
   2. RNAseq met behulp van de volgende parameters: outfilfeformat="bedgraph", strand="vooruit" of "achteruit", binsize=20, smoothLength=60, minMappingQuality=255, normalizeUsing="CPM".
      LET OP: Zorg ervoor dat u de functie twee keer uitvoert met de streng ingesteld op vooruit of achteruit om bestanden te genereren voor lezen in beide richtingen.
      OPMERKING: Uitvoer: Produceert twee bedgraph-bestanden: één voor voorwaarts lezen (_fwd.bedgraph) en één voor omgekeerd lezen (_rev.bedgraph). De uitvoer wordt opgeslagen in /path/to/your/data/ bedgraphout (Figuur 3).
      1. Voer de BamCoverage-functie uit in de derde cel met behulp van Shift + Enter.

Figuur 3: Bestandsorganisatie voor WonderPeaks. Een screenshot van de datamap met de bedgraph bestanden in de directory bedgrapghout/normalizeUsingCPM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. WonderPeaks voor ChIPseq

1. Vooraf controleren
   1. Controleer of alle bedgraph-bestanden met filehandle .bedgraph zich in een subdirectory binnen de datadirectory bevinden met de naam bedgraphout (Figuur 3).
   2. Controleer of de ontwerpfactoren in user_inputs bestand (NGS_user_inputs.csv) (Afbeelding 2) overeenkomen met de kolommen in het metagegevensbestand (NGS_user_metadata.csv) en of de rijen van de ontwerpfactorkolommen niet uniek zijn (zie waarschuwing in stap 4.2.4).
2. Open NGS-voorverwerking Jupyter Notebook (WP4ChIP.ipynb).
3. Activeer WonderPeaks (omgeving gemaakt in stap 1.3) in de rechterbovenhoek van de notebookinterface.
4. Voer de cellen uit met Shift+Enter tot het breekpunt om piekgesprekken uit te voeren. Als u klaar bent, wordt een record van de verwerkte gegevens opgeslagen en opgeslagen in een submap binnen de gegevensmap met de naam WonderPeaks
   1. Zoek naar WOnder_init.csv: een aaneenschakeling van alle ruwe dekking en de resultaten van het berekenen van de eerste afgeleide.
   2. Opmerking WOnder_unfiltered_peaks.csv: een aaneenschakeling van alle ongefilterde pieken die worden aangeroepen op basis van de eerste afgeleide.
   3. Observeer bedgraph_summary.csv: een samenvatting van de scorestatistieken na het groeperen van elk bestand en chromosoom.
5. Parameters voor uitvoeren definiëren:
   1. Voer de 1e^{cel onder} het uitbreekpunt van de afprijzing uit.
      OPMERKING: Er verschijnt een grafiek met de onbewerkte gegevens, gescheiden door de gespecificeerde ontwerpfactoren , en een tabel met de ontwerpfactoren; gebruik de tabel en plot om waarden in volgende stappen te bepalen (Afbeelding 4).
   2. Geef in de volgende cel de waarden op voor score_cut, fold_change en designfactor (Afbeelding 4).
      1. score_cut is de drempelwaarde die wordt gebruikt om te bepalen of een piek in de output moet worden meegerekend. Om de score_cut te bepalen, observeert u de grafiek en kiest u een waarde die dicht bij de mediaan van de getagde gegevens ligt (zie gehashte lijn, figuur 4). Voer deze waarde als volgt in: score_cut= waarde.
      2. fold_change is de drempelwaarde van de ratioscores van tagged:untagged die worden gebruikt om te bepalen of een piek als echt wordt beschouwd. Om de fold_change te bepalen, observeert u de grafiek en kiest u een waarde boven de verhouding van de medianen van de niet-getagde en getagde gegevens. Voer deze waarde als volgt in: fold_change= waarde.
      3. designfactor_value wordt gespecificeerd als onderdeel van het experimentele ontwerp. Mogelijke ontwerpfactoren staan in het rood vermeld in de gedrukte tabel. Als u de ontwerpfactor wilt bepalen, kiest u een van de waarden die in het rood worden vermeld. Voer deze waarde als volgt in tussen offertes: designfactor_value ="{ value}".
6. Voer de volgende cellen uit met Shift + Enter om piekfiltering en toewijzing uit te voeren. De gegevens en samenvattingsplots worden opgeslagen in een submap binnen de gegevensmap met de naam WonderPeaks.
   1. Observeer {designfactor_value}_taggedVuntagged.csv: een draaitabel met alle overlappende pieken met een kolom voor elk van de gelabelde en niet-gelabelde voorbeelden.
   2. Opmerking {designfactor_value}_all_tagged_peaks.csv: Een samenvattende tabel van alle echte pieken, gebaseerd op gebruikersparameters (stap 6.5).
   3. Observeer {designfactor_value}_peaks2gtf.csv: een toewijzing van de echte pieken, op basis van gebruikersparameters (stap 6.5), aan genen in het door de gebruiker opgegeven annotatiebestand.
7. Optioneel: Schakel de parameters in stap 6.5 in door de stappen 6.5-6.6 opnieuw uit te voeren. Als u dezelfde designfactor_value gebruikt, worden de gegenereerde bestanden, zoals beschreven in stap 6.6, overschreven.

Figuur 4: Screenshot met de designfactor_value en door de gebruiker gespecificeerde drempels in WonderPeaks voor ChIP-seq. Screenshot van WonderPeaks jupyter notebook, met de mogelijke designfactor_value opties uit de weergegeven tabel en hoe de designfactor_value in de volgende cel te implementeren. De bovenste zwarte pijl wijst naar een tabel met mogelijke designfactor_value vermeldingen; de Op-waarde wordt omcirkeld en weergegeven als de geselecteerde gebruikersinvoer voor designfactor_value in de optiecel (onderste zwarte pijl). In de grafiek geven ononderbroken en stippellijnen bij benadering de mediane piekscores aan voor respectievelijk gelabelde en niet-gelabelde monsters in de ondoorzichtige celexperimenten. Deze medianen worden gebruikt om de parameters score_cut (gelabelde mediaan) en fold_change (de verhouding tussen gelabelde en niet-gelabelde medianen) te definiëren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. PeakStream voor 3'RNAseq

1. Vooraf controleren:
   1. Controleer of alle bedgraph-bestanden zich in een submap bevinden in de gegevensmap met de naam bedgraphout (Figuur 2).
   2. Open NGS-voorverwerking Jupyter Notebook (PeakStream.ipynb)
   3. Activeer WonderPeaks (omgeving gemaakt in stap 1.3) in de rechterbovenhoek van de notebookinterface.
2. Voer de cellen uit met Shift+Enter tot het breekpunt om piekaanroepen en piektoewijzing uit te voeren. Als u klaar bent, wordt een nieuw annotatiebestand met voorspelde 3' UTR's en FeatureCounts²⁴ leesbestanden opgeslagen en opgeslagen in een submap in uw gegevensmap met de naam PeakStream (Afbeelding 5).
   OPMERKING: Standaard bevat het uitvoerbestand alleen annotaties voor eiwitcoderende biotypen, maar dit kan worden omgeschakeld met de biotype-optie.

Figuur 5: Bestandsorganisatie voor PeakStream. Een screenshot van de datamap met de bedgraph bestanden in de directory bedgrapghout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

WonderPieken
Na het uitvoeren van een ChIP-seq-experiment gebruiken onderzoekers vaak piekbellers, zoals MACS³, om genomische regio's te identificeren die zijn verrijkt met een epitoop-gelabeld DNA-bindend eiwit. We hebben WonderPeaks ontwikkeld als een gebruiksvriendelijke piekroeper die is ontworpen om pieken te identificeren met behulp van de hierboven beschreven methode.

WonderPeaks identificeert pieken door eers...

Discussie

Next-generation sequencing (NGS) technieken bieden een ongeëvenaard inzicht in genregulatie en expressie in schimmelpathogenen. Als zodanig moeten computationele tools zowel alomvattend zijn - het vastleggen van alle gegevens die in een experiment worden gegenereerd - als toegankelijk voor algemene gebruikers, met name bankwetenschappers. In dit rapport hebben we twee tools geïntroduceerd, WonderPeaks en PeakStream, die inspelen op deze behoeften van onderzoekers van schimmelpathogenen i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CORALL Total RNA-seq V1 kit	Lexogen	095	Wet lab material
Filamentous-Fungi riboPOOL	siTOOLs	dp-P096-6	Wet lab material
High Sensitivity RNA ScreenTape	Agilent	5067-5579	Wet lab material
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder	Agilent	5067-5581	Wet lab material
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer	Agilent	5067-5580	Wet lab material
https://github.com/mgarber21/WonderPeaks/blob/main/environment.yml			lijst van afhankelijkheden voor WonderPeaks
https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing/blob/main/environment.yml			lijst van afhankelijkheden voor WonderPeaks_preprocessing
Monarch Spin RNA Cleanup Ki	NEB	T2040L	Wet lab material
pygenometracks (3.9)
QuantSeq 3′ mRNA-Seq FWD Library Prep Kit V1	Lexogen	015	Wet lab material
Qubit RNA High Sensitivity (HS) Assay Kit	Invitrogen	Q32852	Wet lab material
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1016	Wet lab material
TURBO DNA-free Kit	ThermoFisher	AM1907	Wet lab material
WonderPeaks(0.1.14)
WonderPeaks_preprocessing(0.2.3)