Techniek van conjunctivale biopsie en directe immunofluorescentie voor het diagnosticeren van slijmvliespemfigoïd

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het oogsten en verwerken van conjunctivale biopsie om slijmvliespemfigoïd te identificeren.

Samenvatting

Oculair slijmvliespemfigoïd (MMP) presenteert zich als chronische cicatriserende conjunctivitis die, indien onbehandeld, blindheid kan veroorzaken. Tijdige diagnose en immunosuppressieve therapie voorkomen ziekteprogressie. Directe immunofluorescentiekleuring (DIF) van de conjunctivale biopsie voor afzetting van het immuuncomplex in het basaalmembraan is diagnostisch voor MMP. Het positiviteitspercentage van de biopsie is afhankelijk van de kenmerken van de biopsie, lateraliteit, ouderdom en ziekteactiviteit. Het document met de huidige methoden beschrijft de techniek van het oogsten van de conjunctivale biopsie en het gebruik van mediumgevulde patronen met een optimale snijtemperatuur voor monsteroverdracht en blokvoorbereiding. Een biopsie wordt uitgevoerd vanuit een niet-getekend, niet-betrokken of relatief minder betrokken gebied van het bindvlies in beide ogen. De gebruikelijke biopsiegrootte is 4-5 mm lang, 2-3 mm breed en moet klein onderliggend subconjunctivaal weefsel hebben, zodat het basaalmembraan niet wordt gemist. We raden aan om periodieke Schiff-kleuring met zuur uit te voeren om de aanwezigheid van het basaalmembraan te bevestigen. Met behulp van een gespecificeerd protocol worden de cryosecties van biopsieën gekleurd met fluorescerend-geconjugeerde antilichamen IgG, IgM, IgA en complementfactoren C3c en C4c. Een positieve biopsie toont de groene positieve fluorescentie in het basaalmembraan, en zelfs als een van de antilichamen positief is, is deze MMP-positief. Een negatieve biopsie sluit pemfigoïd niet uit; een positieve bevestigt echter de MMP en onderscheidt deze van door geneesmiddelen geïnduceerde cicatriserende conjunctivitis of pseudopemfigoïde.

Inleiding

Slijmvliespemfigoïd (MMP) is een chronische cicatriserende bindvliesziekte met een auto-immuunetiologie en tast de slijmvliezen in het lichaam^{aan 1,2}. Chronisch cicatriserend bindbind heeft verschillende etiologieën, en differentiatie van MMP van SJS, sarcoïdose, oculaire plaveiselcelneoplasie en pseudopemfigoïd is noodzakelijk omdat de eerste systemische immunosuppressie vereist ^3,4. Bovendien is MMP een potentieel verblindende ziekte waarbij patiënten zich vaak te laat presenteren en in eerste instantie een verkeerde diagnose krijgen ^1,2,5. Alleen oculaire betrokkenheid zonder systemische betrokkenheid kan worden gezien bij 27,4% van de oculaire MMP-patiënten⁶. Diagnose van MMP vereist een conjunctivale biopsie om de aanwezigheid van auto-antilichamen in het basaalmembraan aan te tonen ^2,5. Directe immunofluorescentie (DIF) is een cruciaal diagnostisch hulpmiddel voor het identificeren van auto-immuunziekten die het bindvlies aantasten, zoals MMP. DIF helpt bij het detecteren van de in-situ afzetting van immunoglobulinen en complementcomponenten in de basaalmembraanzone (BMZ), een kenmerk van MMP. De DIF-positiviteitspercentages variëren van 30% tot 80%^1,5. Sommige patiënten kunnen echter een negatieve biopsie hebben, vooral die met alleen oculaire MMP, maar klinische documentatie van ziekteprogressie wordt op dezelfde manier behandeld als biopsie-positieve oculaire MMP-gevallen ^7,8. Vandaar dat Dart et al. de noodzaak benadrukten van afzonderlijke diagnostische criteria voor MMP⁸ met alleen oculair.

De voorgestelde redenen voor het lage positiviteitspercentage in alle onderzoeken zijn gevorderde ziekte met uitgebreide littekens op het oogoppervlak, ontoereikende weefselverwerkings- of kleuringstechnieken en een biopsie-negatieve ziektevariant 8,9,10,11. Een retrospectieve analyse van biopsieën van 27 patiënten die verdacht werden van oculaire MMP onthulde slechts een positiviteitspercentage van 30% en 63,7% had alleen oculaire betrokkenheid¹². DIF vereist een specifiek protocol; Niet elk diagnostisch laboratorium is daarop afgestemd. Er zijn verschillen met betrekking tot de biopsieplaats, het al dan niet uitvoeren van een biopsie van één of beide ogen, en oplossingen voor het overbrengen van monsters 13,14,15. In een retrospectieve analyse van de conjunctivale biopsieën in ons centrum was het DIF-positiviteitspercentage 54,1%, met meer positieven bij bilaterale biopsie (59% vs. 45%)⁸. Hoewel een biopsie van cruciaal belang is, helpen klinische symptomen en progressieve cicatrisatie van het oogoppervlak bij de diagnose MMP. Het is gemakkelijker om een diagnose te stellen wanneer er een extraoculaire plaats bij betrokken is, zoals oraal of huid, gemeld bij respectievelijk 40% en 18% van de patiënten⁵.

Er zijn variaties in de bestaande literatuur en het hier gepresenteerde protocol kan dienen als referentiegids met wijzigingen die zijn aangebracht om de behoefte aan een uniek overdrachtsmedium te verminderen¹⁴. De biopsieën worden overgebracht in een medium met optimale snijtemperatuur (OCT) en in het pathologielaboratorium in dezelfde transfercartridge ingevroren, waardoor er geen extra transfermedium nodig is. Het huidige artikel schetst de methodologie voor DIF-kleuring van bindvlies, weefseloogst en protocol voor monsteroverdracht.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van het LV Prasad Eye Institute.

1. Conjunctivale biopsietechniek

1. Plan een biopsie van beide ogen van de patiënt die verdacht wordt van pemfigoïd onder lokale of lokale anesthesie en een operatiemicroscoop.
2. Vraag geïnformeerde toestemming van de patiënt en maak een lijst van mogelijke bijwerkingen van bloedingen, littekens en de noodzaak om na een operatie met topische steroïden te beginnen.
3. Doe 1-2 druppels 0,5% proparacaïne in beide ogen en wacht 5 minuten voordat u met de procedure begint.
4. Zorg ervoor dat de patiënt geen pijn voelt bij het aanraken van het bindvlies met een fijne tang. Als de patiënt nog steeds pijn voelt na het aanbrengen van topische proparacaïne, injecteer dan 0,2 ml subconjunctivale 2% lidocaïne met een tuberculinespuit van 1 ml.
5. Plaats een speculum in het rechter- of linkeroog, afhankelijk van wat het eerst wordt gekozen.
6. Onderzoek het oogoppervlak op gebieden met littekens en keratinisatie. Selecteer het biopsiegebied dat niet betrokken is en geen littekens of verhoornde heeft.
   OPMERKING: In deze studie heeft het superieure bulbaire bindvlies weg van de limbus de voorkeur als biopsieplaats, gevolgd door het inferieure bulbaire bindvlies.
7. Gebruik de tang van Lim om de sclera van het bindvlies te tillen en snijd lineair weg met de schaar van Westcott, die 4-5 mm lang en 2-3 mm breed is.
8. Breng de hele biopsie onmiddellijk over naar een optimaal snijmedium (OCT).
   LET OP: Men kan biopsieën overbrengen in een normale zoutoplossing of een Michel-transportmedium.
9. Neem een patroon en een plastic tissuevorm met een putje in het midden, maak deze schoon met zoutoplossing en laat hem aan de lucht drogen.
10. Vul de cartridge apart met OCT-medium voor het rechter- en linkeroog. Dompel het uitgesneden bindvliesweefsel onder in het OCT-medium en stuur het naar pathologie.
11. Herhaal dezelfde stappen ook voor de contralaterale zijde.

2. Het weefsel overbrengen

1. Integreer de biopsiemonsters van het bindvlies in een OCT-medium om de weefselarchitectuur en antigeniciteit te behouden als ze worden ontvangen in het transportmedium van Michel of normale zoutoplossing.
2. Vries de ingebedde monsters in met vloeibare stikstof of droogijs en bewaar ze een nacht bij -80 °C.

3. Voorbereiding en weefselsectie

1. Verdeel het bevroren weefsel in plakjes van 4-6 μm (7 in getal) met behulp van een cryostaat bij -20 °C tot -25 °C.
2. Monteer de secties op positief geladen microscoopglaasjes met polylysinecoating om hechting te garanderen en bewaar ze bij -80 °C tot ze vlekken maken in aluminiumfolie.

4. Immunofluorescerende kleuring

1. Ontdooi dia's gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) en fixeer gedurende 10 minuten in koude aceton (100%) om antigenen te behouden en weefselbeschadiging te voorkomen.
2. Spoel driemaal af met 1x PBS, telkens gedurende 5 minuten om overtollig OCT-medium en aceton te verwijderen.
3. Breng geconjugeerde antilichamen anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM en anti-C3 verdund (Fibrinogeen-1:10 [positieve controle], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10) aan op dia's.
   OPMERKING: Antilichamen worden verdund in 1x PBS.
4. Sla voor negatieve controles de toepassing van geconjugeerde antilichamen over en volg de overige stappen hieronder.
5. Volg de richtlijnen van de fabrikant voor het verdunnen van de antilichamen en standaardiseer met bekende positieve en negatieve controles.
6. Incubeer de objectglaasjes in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 45-60 minuten.
7. Was de dia's met PBS (3× gedurende 5 minuten elk) om ongebonden antilichamen te verwijderen.
8. Tegenkleuring met DAPI (4',6 -diamidino-2-fenylidole)-bevattend montagemedium voor nucleaire visualisatie.
9. Leg een dekglaasje over de glaasjes en laat ze 20 minuten uitharden.
10. Onderzoek objectglaasjes met behulp van een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met geschikte filters voor de gebruikte fluoroforen (excitatiegroen filter voor 488 nm).
11. Documenteer de bevindingen met digitale microfoto's.

5. Snel periodiek zuur - Schiff-kleuring

1. Bereiding van periodiek zuur Schiff (PAS)
   1. Los 1 g basische fuschin op in 100 ml heet gedestilleerd water.
   2. Voeg 10 ml zoutzuur en 2 g kaliumdisulfiet toe om de kleurstof te ontkleuren.
   3. Voeg na afkoeling 0,5 g actieve kool toe, roer en filtreer de oplossing om helder periodiek zuur Schiff's reagens te verkrijgen. Bewaar in een donkere fles.
      OPMERKING: Om te testen op Schiff's reagens, giet u 10 ml 37% formaline in een horlogeglas en voegt u een paar druppels Schiff's toe om te testen. Een goed reagens van Schiff zal snel een rood-paarse kleur krijgen. Een verslechterend Schiff-reagens zal een vertraagde reactie veroorzaken en het product zal diep blauwpaars zijn.
2. PAS-kleuring techniek
   1. Hydrateer de glijbanen in water.
   2. Oxideer in 0,5% periodieke zuuroplossing gedurende 5 min.
   3. Spoel af in gedestilleerd water.
   4. Plaats 15 minuten in het reagens van Schiff (de secties zien er tijdens deze stap lichtroze uit)
   5. Was 5 minuten in lauw kraanwater (de secties worden donkerroze).
   6. Tegenvlek in Mayer's hematoxyline gedurende 1 min.
   7. Spoel 5 minuten in kraanwater.
   8. Droog de glaasjes in de volgende oplossingen: Een keer in 80% ethylalcohol gedurende 1 minuut, twee keer in 90% ethylalcohol gedurende 1 minuut, twee keer in 100% ethylalcohol gedurende 1 minuut.
   9. Dehydrateer de glaasjes drie keer in xyleen gedurende 1 minuut elk.
   10. Plaats een dekglaasje over de dia's met behulp van een synthetisch montagemedium (bijv. DPX-mountant)
   11. Bekijk de PAS-resultaten onder de helderveldmicroscoop.

Resultaten

De interpretatie van DIF vereist bevestiging van de aanwezigheid van het basaalmembraan in de weefselcoupes (Figuur 1). In de met PAS gekleurde dia's zal het basaalmembraan verschijnen als een felroze membraan dat zich in het basale gebied van het bindbindbindende epitheel bevindt (Figuur 1C). De continuïteit en architectuur van het basaalmembraan moeten ook worden becommentarieerd. DIF-positiviteit wordt gezien als felgroene BM...

Discussie

De hier beschreven techniek van conjunctivale biopsie maakt gebruik van OCT-medium als overdrachtsmedium, waardoor er geen extra overdrachtsmedium nodig is en de biopt niet hoeft te worden gehanteerd om het over te brengen naar OCT-medium voor cryosectie. Een plastic patroonmal gevuld met medium en biopsie wordt direct ingevroren om weefselblokken te maken en vervolgens in secties gesneden. De voordelen van OCT zijn dat het snel bevriest met minimale schade door kristalvorming en de weef...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 N zoutzuur	Finar  chemical Limited	7647-01-0
Aceton	Qualigens	Q33517
Albumine	DAKO	F0117
Basic fuchsine	Qualigens	Q39402
C3c	Diagnostic Biosystems	F003
C4c	Diagnostic Biosystems	F005
Cartridge	Polysciences	25376-500
Geactiveerde houtskool	Sigma	C-5260
Cryostaat	Leica	CM1860UV
Cryotome bladen	Leica	818
DAPI	Abcam	Ab104139
Fibrinogeen	Diagnostic Biosystems	F006
Fluorescentiemicroscoop	Olympus	CX43
Pincet	Joja surgical	JS1528A
Vochthuidkamer	Diagnostic Biosystems	SM365
IgA	Diagnostic Biosystems	F007
IgG	Diagnostic Biosystems	F008
IgM	Diagnostic Biosystems	F009
IHC Adhesive glass slides	Tomo	33140455
Lim's pincet	Speedway	S-7223
Michel's transportmedium	Fisher Scinitics	NC0253304
Microscopisch dekglaas	Blue star	https://www.bluestarslides.com
OCT Medium	Cryomatrix	6769006
PBS	DAKO	dm831
Periodic zuur	Sigma	375810-25G
Kaliumdisulfiet	Sigma	P2522-500G
Proparacaine 0.5%	Sunway Private	G/1118A
Westcott's schaar	Pillig Gurgical Instruments	423480