Methodenartikel

Bidirectionele elektrische en opto-elektronische interfaces in gezonde en ischemische ex vivo rattenharten

DOI:

10.3791/68305

⸱

18 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago, 2The James Franck Institute, The University of Chicago, 3Department of Chemistry, The University of Chicago, 4The Institute for Biophysical Dynamics, The University of Chicago

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst geavanceerde materiaalfabricage en ex vivo rattenhartmethoden voor optische en elektrische bidirectionele bio-interfacing, waardoor nauwkeurige hartstimulatie, registratie en infarctmodellering voor bio-elektronicaonderzoek mogelijk zijn.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrofysiologische studies zijn cruciaal bij het onderzoeken van interacties tussen materialen en cardiale bio-interfaces. Recente ontwikkelingen hebben verschillende nieuwe geleider- en halfgeleidermaterialen geïntroduceerd voor bidirectionele interfaces met cardiale modellen, waardoor stimulatie met lage intensiteit mogelijk is naast opnames met een hoge spatiotemporele en hoge signaal-ruisverhouding (SNR). Het ex vivo knaagdierhartmodel dient als een effectief platform voor het valideren van de functionaliteiten van nieuwe materialen en apparaten, waarbij in-vitrobevindingen worden overbrugd naar translationele inzichten en tegelijkertijd ethische en administratieve problemen worden geminimaliseerd. In dit protocol beschrijven we de isolatie en ex vivo perfusie van volwassen rattenharten met behulp van een Langendorff-apparaat, waarbij nauwkeurige bidirectionele stimulatie en opname tot stand wordt gebracht met hoogwaardige halfgeleiders en geleiders, waaronder nanoporeus silicium, nanoporeuze koolstof en flexibele gaasachtige micro-elektrode-arrays. Daarnaast presenteren we een myocardinfarctmodel geïnduceerd door ischemie-reperfusie (I/R) letsel, beoordeeld door middel van meerkanaals opname en kartering, evenals infarctkleuring, waardoor hartziekte-relevante studies en mogelijke therapeutische verkenningen mogelijk zijn. Deze methodologie biedt waardevolle inzichten in het onderzoek naar materiaal-bio-interfaces en de ontwikkeling van cardiale bio-elektronica van de volgende generatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebied van cardiale bio-elektronica vordert snel, gedreven door de noodzaak om materialen en apparaten te ontwikkelen die nauwkeurige en efficiënte bidirectionele communicatie met het hart mogelijk maken 1,2,3,4. Elektrofysiologische studies spelen een cruciale rol in dit streven en bieden kritische inzichten in hoe materialen interageren met cardiale bio-interfaces door middel van modulatie en detectie. Hoewel in vitro-modellen, zoals gekweekte HL-1-cellijnen en primaire cardiomyocyten van knaagdieren, een gecontroleerde omgeving bieden voor eerste beoordelingen 5,6,7,8, slaagt hun eenvoud er vaak niet in om de complexe, dynamische omstandigheden van een levend hart na te bootsen. Deze modellen missen de 3D-architectuur van het hart, cruciaal voor gecoördineerde elektrische geleiding en mechanische krachtgeneratie, en kunnen geen ritmische contractie-ontspanningscycli of perfusiedynamiek nabootsen die cruciaal zijn voor de afgifte van zuurstof en voedingsstoffen9. Omgekeerd bieden in vivo-modellen de meest fysiologisch relevante inzichten, maar brengen ze aanzienlijke ethische, administratieve en technische uitdagingen met zich mee, waaronder de noodzaak van uitgebreide training, geavanceerde chirurgische opstellingen en naleving van strikte regelgevingskaders10.

Om deze kloof te overbruggen, bieden ex vivo hartmodellen, zoals het Langendorff-geperfuseerde volwassen rattenhart, een overtuigend alternatief voor wetenschappelijk onderzoek11,12. Deze modellen combineren de fysiologische relevantie van in vivo systemen met de beheersbaarheid en toegankelijkheid van in vitro opstellingen. Door het hart te isoleren en in een functionele toestand te houden, stelt het Langendorff-apparaat onderzoekers in staat om high-fidelity studies uit te voeren naar cardiale elektrofysiologie onder nauwkeurig gecontroleerde omstandigheden. De afwezigheid van systemische variabelen zoals neurale input en circulerende hormonen vereenvoudigt de interpretatie van de resultaten, terwijl de belangrijkste aspecten van de hartfysiologie behouden blijven. Bovendien verminderen ex vivo-modellen veel ethische bezwaren en verminderen ze de belasting van middelen, waardoor ze een veelzijdig en praktisch platform zijn voor translationeel onderzoek13.

Naast het translationele potentieel vormt dit protocol een maatstaf voor de evaluatie van materiaalprestaties. Door representatieve materiaalstrategieën op te nemen, zoals opto-elektronische platforms voor draadloze fotostimulatie en elektronische systemen voor bekabelde stimulatie en opname, wordt een reproduceerbaar kader voor vergelijkende studies gecreëerd. Deze standaardisatie vergemakkelijkt niet alleen innovatie, maar verbetert ook de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van bevindingen in alle onderzoeksgroepen. In het verleden zijn veel hoogwaardige foto-elektroden en elektroden veelbelovend gebleken voor bio-elektrische studies, zoals PEDOT: PSS14, MXene15, iridiumoxiden16, platina17, molybdeen18, silicium 19,20,21, quantum dots 22,23,24 en organische halfgeleiders 25. Hier presenteert dit protocol representatieve en state-of-the-art materialen, waaronder nanoporeus silicium26, nanoporeus koolstof27 en flexibele gaasachtige gouden multi-elektrode-arrays (MEA's)28,29, die in het protocol worden geïntegreerd om hun mogelijkheden in bidirectionele cardiale interfaces te demonstreren. Deze materialen maken stimulatie met lage intensiteit boven de drempel, hoge spatiotemporele resolutie en hoge SNR-opnames mogelijk, wat hun potentieel voor het bevorderen van cardiale bio-elektronica aantoont. Bovendien biedt de opname van een myocardinfarctmodel geïnduceerd door I/R-letsel een robuust kader voor ziekterelevante studies en therapeutische verkenningen.

Dit werk presenteert gedetailleerde methoden voor het vervaardigen en toepassen van geavanceerde materialen voor draadloze fotostimulatie en elektrische stimulatie en detectie met ex vivo rattenharten (Figuur 1A). Nanoporeuze siliciummembranen werden vervaardigd door middel van fotolithografiepatronen, reactief ionenetsen (RIE) en gebufferd fluorzuur (HF) die vrijkomen uit silicium-op-isolator (SOI) wafers met een apparaatlaag van 5 μm, gevolgd door vlek-etsen en overbrengen naar zachte polydimethylsiloxaan (PDMS) membranen26. Voor elektrische stimulatie en opname werd nanoporeuze koolstof ontwikkeld door laserablatie van met zout geïncubeerde cellulosesubstraten, gevolgd door overdracht van waterfasen en warmtelaminering, wat verbeterde opslag- en injectiemogelijkheden voor lading biedt in vergelijking met traditionele gouden elektroden27. Bovendien werden flexibele MEA's vervaardigd op met polyimide gecoate Si-wafers met behulp van fotolithografie, e-beam metallisatie, etsen, inkapseling en afgifteprocessen om ruimtelijk opgeloste epicardiale opname en kartering mogelijk te maken28,29.

Naast fabricage biedt het protocol een stapsgewijs protocol voor de isolatie, perfusie, monitoring en interface van volwassen ratten met optische en elektrische apparaten. De apparaten werden getest op geïsoleerde harten, waarbij representatieve resultaten werden aangetoond op het gebied van pacing en registratie voor elektrofysiologische evaluatie. Dit protocol introduceert ook een methode voor het creëren van een myocardinfarctmodel door middel van I/R, gevalideerd door fysiologische opnames, kleuring en morfologische evaluaties. Deze uitgebreide methodologie stelt een reproduceerbaar kader vast voor het evalueren van materialen en apparaten in cardiale bio-interfaces. Figuur 1B-D schetst de workflows van de fabricage van materialen voor evaluatie in dit ex vivo hartmodel. Figuur 2A-C toont de verwachte resultaten in foto's van de as-gefabriceerde apparaten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Chicago (protocolnummer 72378).

1. Fabricage van nanoporeuze siliciummembranen (Figuur 1B, Figuur 2A, Figuur 3)

  1. Ontwerp het fotomaskerpatroon in AutoCAD-software (Afbeelding 3). Zorg ervoor dat de grootte van het apparaat overeenkomt met de lengteschaal van het biologische doelwit. Gebruik voor het rattenhart een apparaatgrootte van 2 - 10 mm. Voeg in het ontwerp kleine gatenreeksen met een diameter van 20 - 100 μm toe om het vrijkomen van de Si-apparaatlaag in gebufferd HF te vergemakkelijken. Maak de drie grote gaten met een diameter van 200 - 1000 μm en vorm een chirale letter L om de juiste kant van het membraan te helpen identificeren.
  2. Reinig de SOI-wafel met aceton en isopropylalcohol (IPA) elk 3 minuten in het ultrasone bad. Bak 20 minuten op 200 °C op de hete plaat.
  3. Centrifugeer de dikke positieve resist AZ40XT-11D 45 s bij 3000 tpm en bak 3 minuten op 115 °C. Pas op dat u niet te veel fotoresist op de wafer giet. Verwijder na de spin-coating de resten aan de achterkant van de wafer met acetonstaafjes.
    OPMERKING: AZ40XT-11D is een zeer viskeuze positieve fotoresist.
  4. Gebruik de Heidelberg MLA150 direct writer om het fotoresistpatroon te belichten bij 375 nm en een dosis van 800 mJ/cm2. Voer het bakken na blootstelling uit op 110 °C gedurende 2 min.
  5. Ontwikkel het patroon in de AZ 300MIF-ontwikkelaar gedurende 2 minuten. Spoel de wafel 60 s af met gedeïoniseerd (DI) water en droog vervolgens af met N2 lucht.
  6. Ets de onbedekte SOI met behulp van een SF6/CHF3 (20 sccm:50 sccm) RIE-proces gedurende 12 minuten met behulp van inductief gekoppeld plasma bij 600 W en een radiofrequentie van 60 W in een inductief gekoppelde plasmafluoride-etser met een kamerdruk van 10 mT, wat resulteert in een etssnelheid van ongeveer 660 nm/min.
  7. Strip de fotoresist met AZ NMP in een ultrasoonbad van 80 °C gedurende 10 minuten en reinig de wafer in een ultrasoonbad gedurende 3 minuten in aceton, gevolgd door 3 minuten in IPA en gedroogd met gecomprimeerde stikstof.
  8. Dompel het monster onder in gebufferd HF bij kamertemperatuur om begraven oxidelagen te verwijderen. Het apparaat wordt binnen 4 - 8 uur losgelaten. Verhoog de temperatuur van de oplossing iets (40 °C) om het vrijkomen te vergemakkelijken.
  9. Breng de vrijgekomen membranen met 1 cm x 1 cm filterpapier voorzichtig over naar twee afzonderlijke DI-waterbaden om eventueel achtergebleven HF te verwijderen.
    OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd. Week het membraan in een IPA-bad voor opslag bij 4 °C.
  10. Breng het membraan met behulp van filtreerpapier over op een petrischaal met gedeïoniseerd (DI) water. Het membraan zal op het wateroppervlak drijven als gevolg van hydrofobiciteit en oppervlaktespanning.
    OPMERKING: Siliciummembranen kunnen rigoureus van IPA naar water gaan als gevolg van het Marangoni-effect30.
  11. Maak in een apart petrischaaltje de vleketsoplossing met een volumeverhouding van 100:1 van geconcentreerd HF en geconcentreerd salpeterzuur (bijv. 10 ml HF en 0,1 ml HNO3). Meng het goed voor het etsen.
  12. Breng het membraan met filtreerpapier over in de vlek-etsoplossing en ets gedurende 30 s. Let op de zijkant van het Si-membraan door de letter L-oriëntatie te noteren die wordt gevormd door de drie grote gaten. Het Si-membraan moet op het etsmiddel drijven, waar slechts één kant van het membraan is geëtst.
  13. Breng het membraan met filtreerpapier over in twee afzonderlijke DI-waterschaaltjes om het residu HF weg te spoelen.
    OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd. Breng het membraan over naar IPA voor opslag bij 4 °C.
  14. Maak een ondersteunend substraat met dunne PDMS. Meng deel A (basispolymeer) en deel B (verhardingsmiddel) in een gewichtsverhouding van 10:1 en ontgas gedurende 30 minuten.
  15. Centrifugeer de PMMA (495 A6) opofferingslaag op de glasplaat bij 2.000 tpm gedurende 45 s. Bak 60 s op 180 °C.
  16. Centrifugeer PDMS bij 4.500 tpm gedurende 45 s op het PMMA-gecoate glas, wat moet resulteren in een dikte van 10 - 20 μm. Hard 2 uur uit in een oven of kookplaat van 80 °C.
    OPMERKING: Om mechanische schade te beperken, werd PDMS gebruikt als een zacht substraat voor het accommoderen van de nanoporeuze siliciummembranen, die bescherming bieden tegen mogelijke schade door directe hantering met een pincet.
  17. Breng het met vlekken geëtste Si-membraan over van IPA naar PDMS. Gebruik schoon weefsel om het overtollige IPA te verwijderen, en het Si-membraan zal zich stevig hechten aan PDMS nadat de IPA is verdampt. Let op de zijkant van het Si-membraan door de letter L-oriëntatie te identificeren die wordt gevormd door de drie grote gaten. De geëtste poreuze Si moet naar buiten gericht zijn en de niet-geëtste Si moet communiceren met PDMS.
  18. Snijd de PDMS in de omtrek af met een scheermesje dat het Si-membraan bevat. Laat voldoende ruimte over en pas op dat u het Si-membraan niet beschadigt.
  19. Week het apparaat in aceton totdat de Si/PDMS vrijkomt. Vermijd te lang weken, omdat dit PDMS-zwelling kan veroorzaken. Spoel het af met gedemineraliseerd water en droog het af met N2. Voer een O2 plasmabehandeling uit bij 400 W gedurende 10 minuten.

2. Fabricage van flexibele micro-elektrode-arrays (Figuur 1C, Figuur 2B, Figuur 4)

  1. Ontwerp de structuur van flexibele MEA's in AutoCAD (Afbeelding 4). We introduceren twee verschillende ontwerpen met hetzelfde projectiegebied van de elektrode, maar met verschillende substraatstructuren (Figuur 2B, Figuur 4).
  2. Reinig het substraat van de siliciumwafer in aceton en IPA gedurende elk 3 minuten in een ultrasoonbad.
    OPMERKING: Dit protocol vereist geen extra oppervlaktebehandeling om de hechting tussen polyimide (PI) en Si-wafer te verbeteren om het loslaten van het apparaat te vergemakkelijken. Zuurstofplasmabehandeling kan indien nodig worden gebruikt om de hechting te verbeteren.
  3. Giet 4 ml van de PI-precursoroplossing van poly (pyromellitisch dianhydride-co-4,4′-oxydianiline) op de wafer. Draai de wafer 45 s rond bij 1.500 tpm. Gebruik NMP of aceton om de voorloper aan de achterkant van de wafer te verwijderen.
  4. Bak 3 minuten voor op 110 °C en vervolgens 3 minuten op 180 °C. Hard de PI-gecoate wafel uit in de resist-oven met een profielmodus. Begin bij kamertemperatuur, verwarm tot 250 °C met een aanloopsnelheid van 4 °C/min en houd 30 minuten vast. Verwarm de wafel vervolgens tot 350 °C met een hellingssnelheid van 2.5 °C/min en houd deze 60 minuten op 350 °C en koel dan langzaam af tot RT. Het resultaat is een PI-film van ongeveer 5 μm dik.
  5. Centrifugeer de PI-gecoate wafer met AZ nlof 2020 bij 2.000 tpm gedurende 45 s. Bak de wafel 2 minuten op 110 °C. Gebruik de Heidelberg MLA150 direct writer om het fotoresistpatroon te belichten bij 375 nm en een dosis van 200 mJ/cm2.
  6. Voer het bakken na blootstelling uit op 110 °C gedurende 2 min. Ontwikkel het patroon in AZ 300MIF Developer gedurende 1 minuut. Spoel de wafer 60 s af met gedemineraliseerd water en droog vervolgens af met N2 lucht.
  7. Zet 10 nm titanium en 200 nm goud af met behulp van een e-beam verdamper. Strip de fotoresist met AZ NMP in een bad van 80 °C gedurende 3 uur en reinig de wafer in een ultrasoonbad gedurende 3 minuten in aceton, gevolgd door 3 minuten in IPA en gedroogd met gecomprimeerde stikstof.
  8. Draai de dikke positieve resist AZ40XT-11D bij 3.000 tpm gedurende 45 s. Reinig de fotoresist aan de achterkant van de wafel met aceton. Bak de wafel 3 minuten op 115 °C.
  9. Gebruik de Heidelberg MLA150 direct writer om het fotoresistpatroon te belichten bij 375 nm en een dosis van 800 mJ/cm2. Voer het bakken na blootstelling uit op 110 °C gedurende 2 min.
  10. Ontwikkel het patroon in AZ 300MIF Developer gedurende 3 minuten. Spoel de wafer 60 s af met gedemineraliseerd water en droog vervolgens af met N2 lucht.
  11. Ets de onbedekte PI met behulp van een SF6/CHF3 (20 sccm: 50 sccm) RIE-proces gedurende 20 minuten met inductief gekoppeld plasma bij 600 W en een radiofrequentie van 60 W in een inductief gekoppelde plasmafluoride-etser met een kamerdruk van 10 mT.
  12. Strip de fotoresist met AZ NMP gedurende 10 minuten in een bad van 80 °C en reinig de wafel met milde sonicatie gedurende 3 minuten in aceton, gevolgd door 3 minuten in IPA en gedroogd met gecomprimeerde stikstof.
    NOTITIE: Gebruik ultrasoonbehandeling met laag vermogen om te voorkomen dat het apparaat losraakt. Vermijd sonicatie als de PI tekenen van loslating vertoont.
  13. Verwerk de wafer in een hexamethyldisilazane (HMDS) oven om de HMDS-behandeling toe te passen. Draai de vacht SU-8 2002 bij 2.000 tpm gedurende 45 s. Dit resulteert in een SU8-dikte van ongeveer 2,5 μm.
  14. Bak de wafel 20 minuten op 95 °C. Gebruik de Heidelberg MLA150 directe schrijver om het fotoresistpatroon te belichten bij 375 nm en een dosis van 950 mJ/cm2.
  15. Ontwikkel het patroon in SU-8 Developer gedurende 1 minuut. Spoel het af met IPA- en DI-water en droog het af met N2 gas. Als er tijdens het IPA-spoelen witte vlekken op de wafer verschijnen, week de wafer dan in SU8 developer totdat de witte vlekken verdwijnen.
  16. Bak een nacht hard op 160 °C. Gebruik kortere baktijden (~30 min) voor acute experimenten. Bak niet onder 150 °C of boven de 200 °C. Verwijder de flexibele PI-ondersteunde flexibele MEA van het substraat.

3. Fabricage van nanoporeuze koolstof (Figuur 1D, Figuur 2C, Figuur 5)

  1. Ontwerp het koolstoffilmpatroon in de ontwerpsoftware (Afbeelding 5).
    OPMERKING: Deze methode bevat het fabricageprotocol voor twee soorten elektroden: nanoporeuze stimulatie-elektrode op basis van koolstof en detectie-elektrode.
  2. Impregneer het filtreerpapier gedurende 1 uur in waterige oplossingen van natriumboraat (0,15 M, pH 9,4) en droog het vervolgens een nacht bij 60 °C (figuur 1D).
    OPMERKING: Klasse 1 Whatman-filterpapier diende voornamelijk als het representatieve poreuze substraat op vezelbasis. Natriumboraat wordt na het impregnerings- en droogproces opgenomen in cellulosevezels. Zout werkt als katalysatoren die fotochemische carbonisatie mogelijk maken onder lasersynthese27.
  3. Voer lasersynthese uit met behulp van een CO2 -laser met vooraf ontworpen patronen (Figuur 5A). Voer patroonvorming uit in rastermodus met geoptimaliseerde parameters: vermogen = 1,8 W; snelheid = 1,6 cm/s; punten per inch = 1000.
  4. Bereid polyethyleentereftalaat (PET) film met een dikte van 50 μm voor en reinig de film met aceton en isopropylalcohol (IPA) elk 3 minuten in het ultrasoonbad.
  5. Zet 5 nm titanium en 100 nm goud af met behulp van een e-beam verdamper. Pas de waterfaseoverdrachtsprocedure toe om de MEA op de PET-folie (12.5 μm) over te brengen.
    OPMERKING: De overdracht van de waterfase werd uitgevoerd met behulp van twee opeenvolgende processen: scheiding van de waterfase en capillaire overdracht.
  6. Dompel papiersubstraten geleidelijk onder in gedemineraliseerd water voor delaminatie tijdens de scheiding van de waterfase.
    OPMERKING: De spanningsenergie die werd veroorzaakt door het zwellen van cellulose vergemakkelijkte de scheiding van het koolstofmembraan van het ondersteunende substraat in minder dan een seconde, waardoor het op het wateroppervlak dreef.
  7. Gebruik de ondersteunende ondergrond, bijv. PET-folie, voor het overbrengen van de patronen in het watermedium tijdens de capillaire overdracht. Dompel het substraat onder in water en breng het in contact met het ene uiteinde van het gewenste koolstofmembraan om een contactlijn te vormen (het transferfront). Houd het substraat vervolgens met de hand vast en beweeg het met lage snelheid in een gekantelde of verticale richting.
    OPMERKING: Voor hydrofobe ondersteunende substraten kan externe kracht of O2-plasmabehandeling worden toegepast om te helpen bij het vormen van de contactlijn.
  8. Breng na de overdracht ongeveer 20 μL perfluorsulfonzuur (PFSA) polymeeroplossing (met een concentratie van ~5% in een mengsel van lagere alifatische alcoholen en water) aan op de koolstofpatronen en laat drogen onder kamertemperatuur (23 °C) en druk (1 atm) omstandigheden voor fixatie.
  9. Zet de nanoporeuze stimulatie-elektrode op basis van koolstof vast door deze aan te sluiten op een Cu-draad met behulp van geleidende zilverlijm. Kapsel de blootliggende verbinding tussen de Cu-draad en de elektrode in met siliconenlijm om isolatie en stabiliteit te garanderen. Na een uitharding van 3 uur bij kamertemperatuur is de stimulatie-elektrode klaar voor gebruik. Experiment kan hier worden gepauzeerd.
  10. Ontwerp het carbon- en MEA-patroon in de AutoCAD (Figuur 5B). Fabriceer 4 x 4 micro-elektrode-arrays op een PI-film van 25 μm met behulp van de standaard fotolithografieprocedure zoals beschreven in stap 2.
    OPMERKING: De PI-film kan worden gemaakt door middel van een PI-voorloper of door commerciële PI-film op Si-wafer te lamineren met behulp van AZ2020-fotoresist. Het protocol voor fotolithografie en metaalafzetting is hetzelfde als stap 2.
  11. Maak een monolithisch koolstofmembraan (2 cm x 2 cm) op een papieren substraat na zoutimpregnering en laserschrijven, zoals in de stappen 3.1-3.3. Breng het koolstofpatroon over op vooraf ontworpen PET-steunfolie met behulp van een standaard waterfase-overdrachtsmethode, zoals in de stappen 3.6-3.9.
  12. Breng een 10 wt% polyethyleen-co-vinylacetaat (EVA) oplossing in hexaan aan op het koolstofpatroon en wacht tot het droogt onder kamertemperatuur (23 °C) en druk (1 atm). Ontwerp en lasersnijd een 10 μm dikke PET-sjabloon (met een EVA-coating aan de onderkant) met 16 gaten uitgelijnd met het MEA-patroon, die dienen als inkapselingslaag.
  13. Lijn de MEA, de PET-inkapselingslaag en het koolstofmembraan uit op de PET-steun. Druk het geheel aan met een in de handel verkrijgbare hete lamineermachine bij een verwerkingstemperatuur van 120 °C voor overdracht en inkapseling.
  14. Koel de nanoporeuze detectie-elektrode met koolstof af tot kamertemperatuur, verwijder het residu en spoel het 3x af met ethanol en water voordat u het gebruikt.

4. Isolatie, perfusie en monitoring van rattenharten (Figuur 6)

  1. Bereid ratten voor op hartextractie (Figuur 6A). Dit protocol maakte gebruik van mannelijke CD/SD-ratten van 3 tot 4 maanden oud, verkregen van Charles River.
  2. Bereid N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethaansulfonzuur (HEPES) Tyrode's oplossing door de chemicaliën op te lossen volgens tabel 1. Pas de pH aan op 7,2-7,4 met 2M NaOH. Pre-oxygeneer door zuurstofgas gedurende 0,5-1 uur te laten borrelen en ga door met oxygenatie tot het einde van de experimenten.
  3. Plaats drie tubes Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, geen calcium, geen magnesium) op ijs. Bereid schone chirurgische instrumenten voor (scherpe schaar, gebogen schaar, twee hemostaten, scherp pincet, twee kleine pincetten).
    OPMERKING: Een operatie is niet bedoeld om te overleven, dus steriliteit is niet nodig.
  4. Haal volwassen CD/SD mannetjesratten met een gewicht tussen 400 en 500 g op bij de dierenfaciliteit. Dien 0,5 ml heparine (1000 IE/kg) intraperitoneaal toe in de onderbuik. Gebruik dikke handschoenen om de rat vast te houden ter bescherming.
  5. Pak de rat bij zijn bovenrug vast, zodat de buik bloot komt te liggen. Houd de rat stevig vast, maar zonder overmatige kracht om het dier geen pijn te doen. Injecteer snel en nauwkeurig de heparineoplossing. Wacht 20-30 minuten. Bereid in de tussentijd het Langendorff-apparaat voor.
    OPMERKING: De rat kan van tevoren worden verdoofd om de juiste voorbereidingsstap voor de chirurgische ingreep te garanderen.
  6. Voordat u HEPES Tyrode's Solution bijvult, wast u de zak voor intraveneuze therapie (IV) met water en droogt u deze volledig af om de juiste uiteindelijke samenstelling te garanderen. Vul de zak met voorgeoxygeneerde HEPES Tyrode's oplossing.
  7. Zet de thermostaat en de watercirculatie in het Langendorff-apparaat aan op 37 °C (Figuur 6A). Bereid de canule voor, hecht en plaats de petrischaal op het koude pak voor weefselsectie. Bereid de canule voor met ijskoude HBSS voordat u deze in secties snijdt.
  8. Bereid je voor op het uitvoeren van thoracotomie bij ratten (Figuur 6B). Verdoof het dier met isofluraan in een stolpconfiguratie. Doe 8 tot 10 ml isofluraan in een buisje van 50 ml gevuld met een gaasje. Sluit het dier met de geopende buis (met isofluraan) in een bakje.
  9. Observeer de voortgang van de anesthesie door de teenknijpreflex te testen. Dieren worden onder narcose gebracht en verliezen binnen 2-3 minuten het bewustzijn. Houd de toestand van de rat nauwlettend in de gaten en breng hem over naar de chirurgische plank onmiddellijk nadat hij het bewustzijn heeft verloren. Langdurige anesthesie kan leiden tot de ondergang van de rat.
  10. Breng het dier over naar de operatiebord. Leg het op zijn rug en doe 5 ml isofluraan in een buisje van 50 ml gevuld met een gaasje over de bek van de rat. Bevestig de algehele anesthesie door in een van de poten te knijpen. Ga alleen door als er geen reactie is opgemerkt.
  11. Bevestig de boven- en onderarmen met naalden aan de chirurgische plank. Maak een incisie (~ 5 cm) om de ribbenkast van de rat net onder de borst te openen. Snijd voorzichtig door het middenrif om het hart en de longen bloot te leggen.
  12. Snijd de ribben aan beide zijden door om de ribbenkast volledig te openen voor volledige toegang. Zet de ribbenkast vast aan het borstbeen met behulp van een hemostaat. Houd de vena cava van onder het hart vast met behulp van een hemostaat. Verwijder het hart door onder de hemostaat te knippen met een gebogen, stompe schaar, zo dicht mogelijk bij de onderkant van de ribbenkast.
  13. Breng het hart over naar ijskoude HBSS. Minimaliseer de duur van de stap om langdurige onderbreking van de zuurstoftoevoer naar het samentrekkende hart te voorkomen.
  14. Bereid u voor op het uitvoeren van Langendorff-perfusie en -monitoring. Vul de canule en petrischaal volledig met ijskoude HBSS. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem aanwezig zijn.
  15. Breng het hart over naar de petrischaal die is voorgevuld met HBSS voor secties. Verwijder met een pincet en een schaar de longen en ander bindweefsel (Figuur 6C).
    OPMERKING: Stompe dissectie wordt aanbevolen voor de sectieprocedure om mogelijke schade aan het hart te voorkomen. Gebruik voor het verdelen van aangrenzende weefsels twee scharen en scheur het weefsel voorzichtig uit elkaar.
  16. Lokaliseer de aorta door op het hart te drukken en het bloedpad te volgen wanneer het naar buiten gaat. Snijd onder de eerste stijgende slagader en canuleer de aorta als de aortaboog tijdens de extractie behouden blijft (Figuur 6D). Bevestig de aorta aan de canule met een dubbele knoop.
    NOTITIE: Plaats de canule niet te diep in om ervoor te zorgen dat de klep gesloten blijft. Plaats de hechtdraad niet te laag, omdat dit de kransslagaders kan blokkeren.
  17. Dompel het Langendorff-apparaat onder voor met voorgeoxideerde werkoplossing. Open de bufferstroom en bevestig de canule aan het apparaat (Figuur 6E). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd. Het hart begint bij deze stap samen te trekken.
    OPMERKING: In eerste instantie kan er wat buffer uit de ventrikels spatten, maar overmatige lekkage wordt niet verwacht. Pas de hechting indien nodig aan om bufferlekkage te voorkomen. In deze stap zal geen hartfibrillatie worden waargenomen als de operatie en voorbereiding correct worden uitgevoerd.
  18. Snijd de boezems af. Laat de ballon leeglopen voordat u deze in de linkerventrikel plaatst en vul deze vervolgens met water met behulp van de aangesloten spuit.
  19. Sluit BP-100-sondes aan op de perfusieleiding en met water gevulde ballonnen om respectievelijk de perfusie en de linkerventrikeldruk (LVP) te bewaken (Figuur 6F).
    NOTITIE: De BP-100-sondes moeten voor gebruik worden gekalibreerd. Bellen in de ballonnen moeten worden uitgestoten om een nauwkeurige drukdetectie te garanderen.
  20. Bewaak de bufferdruk van de HEPES Tyrode en de basislijn van LVP. Zorg ervoor dat de bufferdruk binnen het optimale bereik van 80-100 mmHg wordt gehouden. Pas de basislijn-LVP aan op ongeveer 20 mmHg door het watervolume dat in de ballon wordt geïnjecteerd aan te passen (Figuur 6F).
  21. Sluit ECG-elektroden aan. Aard de canule en plaats de elektrode op de zijkanten, bovenkant of top op basis van voorkeur (Figuur 6F).
  22. Versterk alle signalen (perfusie, linkerventrikeldruk en ECG) met behulp van een IA-400D-versterker en gekoppeld aan een computer met behulp van een digitizer met Clampex-software (Figuur 6F).

5. Ontstaan van een hartinfarct met behulp van IR-proces (Figuur 6G, Figuur 7)

  1. Vul de verwarmde kamer met de voorverwarmde buffer van 37 °C HEPES Tyrode. Dompel het hart onder in de buffer in de verwarmde kamer en stel de kraan af om de bufferstroom te stoppen, waardoor globale ischemie ontstaat. Pas de duur van ischemie aan op basis van de specifieke doelen van het experiment.
  2. Draai de kraan om de bufferstroom naar het hart te herstellen na 30 minuten ischemie, waardoor de reperfusie op gang komt. Laat de reperfusie van het hart gedurende 45 minuten duren voordat u het experiment voor kleuring beëindigt om de grootte van het infarct te beoordelen (Figuur 6G).
    OPMERKING: De ischemie- of reperfusietijd wordt bepaald op basis van experimentele doelstellingen.
  3. Controleer een succesvolle inductie van ischemie door hartslagverlaging en onregelmatige ECG-patronen te observeren (Figuur 7A). Aritmie of ventrikelfibrilleren zal worden waargenomen.
  4. Dien langzaam 10 ml HBSS van 4 °C toe via de zijpoort van de kraan om het hart te stoppen. Verwijder het hart uit de perfusiekolom, knip eventueel achtergebleven atriale weefsel weg en plaats het hart in een weefselsnijmatrix.
  5. Bedek de matrix met transparante folie en vries het hart ongeveer 8 minuten in bij -80 °C of totdat het een marshmallow-achtige consistentie heeft bereikt. Haal de tissue slicing matrix uit de vriezer en plaats de scheermesjes om het hart in stukken van 2 mm dik te snijden.
  6. Verwijder de weefselplakken één voor één uit de snijmatrix en bewaar ze bij -80 °C totdat ze nodig zijn voor biochemische experimenten.
  7. Voer infarctkleuring uit (Figuur 7B). Incubeer de hartschijfjes in 10 ml 1% m/v trifenyltetrazoliumchloride (TTC) bij 37 °C gedurende 30 min.
  8. Breng het plakje weefsel over op 10% gebufferde formaline en laat het een nacht op kamertemperatuur fixeren. Voor het beste resultaat verwijdert u het hart van formaline en brengt u het weefsel binnen 24 uur in beeld. Minimaliseer de blootstelling aan licht tijdens deze stap om degradatie van de vlek te voorkomen.
  9. Fotografeer de bevlekte plak en gebruik software zoals ImageJ om de grootte van het infarct te schatten.

6. Het tot stand brengen van bidirectionele opto-elektrische interfaces tussen apparaten en hartweefsel (Figuur 8, Figuur 9)

  1. Plaats het silicium opto-elektronische membraan op de gewenste plaats voor stimulatie. Siliciummembraan hecht zichzelf met capillaire kracht aan het epicardium (Figuur 8A). Als het hechten moeilijk is, gebruik dan lijm voor nat weefsel om het hechten te vergemakkelijken.
    OPMERKING: Het verlagen van de perfusiesnelheid kan de hoeveelheid water op het hartoppervlak verminderen, wat de hechting vergemakkelijkt. Eenmaal bevestigd aan het hartoppervlak, hecht het siliconenmembraan zich tijdens het gebruik meestal aan de vooraf bepaalde positie.
  2. Sluit de elektroden aan op de RHD-systemen of andere elektrofysiologische platforms voor gegevensregistratie. De MEA's zijn voorzien van 16-kanaals I/O-pads met een pitch van 0,5 mm aan het ene uiteinde, die via een zero-insertion-force (ZIF)-connector zijn verbonden met een adapterkaart. Het adapterbord wordt vervolgens via een Omnetics-connector verbonden met de hoofdstage.
  3. Plaats de flexibele MEA's op de ventriculaire oppervlakken van het geïsoleerde rattenhart (Figuur 8A). Plaats de MEA's in het raam als u een venstervormig siliconenmembraan gebruikt (Figuur 8B).
  4. Programmeer de 635 nm laserbron met de gewenste frequentie (bijv. 4 Hz) en inschakelduur (bijv. 0.4%, pulsduur van 1 ms) met behulp van Transistor-Transistor Logic (TTL)-signalen. Stel de laserspot scherp op het siliciummembraan, met een spotgrootte van ongeveer 1 mm. Draag een beschermende laserveiligheidsbril. Begin met een lage intensiteit om scherp te stellen.
  5. Start het opname- en stimulatieprotocol. Verhoog geleidelijk de laserintensiteit totdat een ononderbroken override-pacing wordt waargenomen (Afbeelding 8C).
    OPMERKING: In de normen van dit protocol wordt de drempelintensiteit gedefinieerd die de laser 10 s ononderbroken stimulatie mogelijk maakt.
  6. Programmeer het laserprofiel met verschillende pulsduur om een intensiteits- versus duurprofiel te krijgen om de prestaties van het apparaat te benchmarken (Afbeelding 8D). De opstelling maakt meerkanaalsopname van ECG, TTL en LVP mogelijk (Afbeelding 8E).
  7. Verander de locatie van het siliciummembraan of de lichtvlek en herhaal stap 6.3-6.6 om te bestuderen hoe verschillende stimulatielocaties de versnelde golfvormen en hartgeleiding beïnvloeden (Figuur 9A).
  8. Identificeer de versnelde QRS-pieken van elke opnameplaats om de isochroon- of activeringsvertragingskaart te construeren. Identificeer de vroegste QRS-piek en stel die locatie in als nulvertraging om de activeringsvertragingskaart uit te zetten (Figuur 9B-C).
    OPMERKING: Hoewel de activeringsvertragingskaart in het sinusritme (zonder pacing) als referentie kan dienen, kan het patroon aanzienlijk variëren, afhankelijk van de hartaandoening en de plaatsing van MEA18,30. De resultaten zijn betekenisvoller wanneer er een duidelijke stimulatiebron, zoals externe stimulatie, aanwezig is.

7. Het tot stand brengen van bidirectionele elektrische interfaces tussen apparaten en hartweefsel ( Figuur 10)

  1. Sluit de stimulatie-elektroden (0,5 cm x 0,5 cm) aan in een configuratie met twee elektroden, waarbij de werkelektrode op de linkerventrikelwand wordt geplaatst terwijl de contra-elektrode zich op de rechterventrikelwand bevindt.
  2. Lever vierkantestroomgolfvormen (bijv. 1 mA, 1 ms pulsduur) af via een potentiostaat tot succesvolle stimulatie (Figuur 10A-B). Voer tests uit om stimulatiestroom versus pulsduur en stimulatiespanning versus pulsduurplots te verkrijgen om de werkzaamheid van materiaalstimulatie te evalueren (Figuur 10C-D).
  3. Voer elektrische opname uit met behulp van een 4 x 4 micro-elektrode-array (2 mm afstand tussen de elektroden) en opgenomen met behulp van een RHD USB-interfacekaart en RHD 16-kanaals ingangsopname headstage. Neem de signalen op met 10 kS/s in de bandbreedte van 0,1-100 Hz.
  4. Meet de ruis van elke opname-elektrode (Figuur 10E). Bereken de SNR met behulp van de volgende vergelijking (Figuur 10F):
    figure-protocol-1offigure-protocol-2
    waarbij signaal de signaalamplitude is enstd-ruis de standaarddeviatie van ruisniveaus. In de opname is het 60-Hz notch-filter uitgeschakeld om de onbewerkte resultaten weer te geven.
  5. Voer aanvullende analyses uit en plot isochronale kaarten van de elektrische voortplanting met behulp van Python.
  6. Bepaal een tijdstempel van piekafbuiging (versneld QRS-complex) voor elke contractie en bereken het gemiddelde voor meerdere signalen. Gebruik Gaussiaanse interpolatie voor het renderen van kaarten om de leesbaarheid te verbeteren.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De stimulatie-elektrofysiologie van een breed scala aan opto-elektronische en elektronische materialen kan efficiënt worden gevalideerd met behulp van het ex vivo hartsysteem, dat een gemakkelijke en gecontroleerde opstelling biedt (Figuur 1A). Materialen met hoge ladingsinjectie, zoals poreus silicium en poreus koolstof, vergemakkelijken bio-elektrische modulatie met een lage optische intensiteit en laagspanningsstimulatie, waardoor veiligheid en ladingsgebalanceerde capacitieve werking worden gegarandeerd.

Nanoporeus silicium vertoont een significant hogere fotostroomgeneratie in vergelijking met conventionele siliciumstructuren, zoals pn- of p-in-juncties (Figuur 11A), vanwege de porositeits-enabled heterojunctie20, verbeterde ladingsopslagcapaciteit, verminderde impedantie en verbeterde optische absorptie. Deze overwegend capacitieve fotostromen maken bioveilige, ladingsgebalanceerde stimulatie mogelijk31 (Figuur 12A-B), waarbij optische stimulatie van ex vivo rattenharten wordt bereikt bij 240 bpm met een lichtintensiteit van 0,51 mW/mm2 en een pulsduur van 1 ms (Figuur 8C), of zo laag als 0,167 mW/mm2 met een pulsduur van 10 ms (Figuur 11B) - waarden die vergelijkbaar zijn met of lager zijn dan optogenetische methoden en ruim onder de laserveiligheidsdrempels31, 32. okt. 32. Onder deze intensiteiten kunnen gedeeltelijke of niet-opgevangen lichtpulsen optreden. Daarentegen hebben andere materialen, zoals p-i-n siliciummembranen of met goud versierde p-i-n siliciummembranen, aanzienlijk hogere optische intensiteiten nodig om stimulatie op te wekken (Figuur 11B). Continue stimulatie met nanoporeus silicium verhoogt de mechanische contractie, zoals aangegeven door verhoogde LVP (Figuur 8E). Bovendien vertoont het apparaat in zijn monolithische vorm fotostroominjectie met hoge ruimtelijke resolutie onder gelokaliseerde lichtpulsen, waardoor multisite en potentiële willekeurig toegankelijke stimulatiestudies mogelijk zijn26.

In bidirectionele, venstervormige siliciummembraanstudies (Figuur 3D, Figuur 8B) produceert multisite-stimulatie verschillende multi-elektroderegistratieprofielen en hartgeleidingspatronen, waardoor de originaliteit van de golfvoortplanting van elk stimulatiepunt wordt gevalideerd (Figuur 9). Deze functie benadrukt het vermogen van het systeem om complexe hartgeleidingsroutes met hoge precisie te analyseren en het vermogen om abnormale hartaandoeningen zoals een hartinfarct te diagnosticeren.

De gefabriceerde MEA's zijn ongeveer 10 μm dik en bevatten macroporeuze structuren of serpentijnverbindingen om buigstijfheid te minimaliseren en de flexibiliteit of rekbaarheid te verbeteren (Figuur 4)33,34. De arrays bestaan uit 16 onafhankelijke opnamelocaties die zijn gerangschikt in een 4 x 4-configuratie, die een gebied van 6 mm x 6 mm bestrijken. Deze arrays maken directe registratie van epicardiale signalen mogelijk op meerdere plaatsen op het hartoppervlak. Een representatieve 16-kanaals opname wordt geïllustreerd in figuur 13. Iochronkaarten die op basis van de opnames zijn gemaakt, visualiseren elektrische geleiding over het hartoppervlak, met of zonder plaatselijke stimulatie. Gelokaliseerde stimulatie veroorzaakt vaak vertragingen in de geleiding die het intrinsieke sinusritme en de geleidingsroutes van het ex vivo hart overschrijven (Figuur 9B).

Nanogestructureerde koolstofmaterialen vormen een effectieve oplossing om de prestaties van bio-elektronische apparaten te verbeteren vanwege hun hoge opslagcapaciteit voor lading en lage impedantie (Figuur 14). Onze zoutondersteunde laseroverdrachtsmethode maakt gemakkelijke patronen en onmiddellijke overdracht van nanoporeuze koolstofapparaten op flexibele substraten of traditionele Au-elektroden mogelijk voor het verbeteren van de bio-elektronicaprestaties. Impedantiekarakterisering bevestigde verder dat de koolstofcoating de impedantie van de Au-elektrode aanzienlijk verminderde met ongeveer 2 ordes van grootte, van 7244,4 Ω tot 63,1 Ω bij een frequentie van 100 Hz die relevant is voor ECG-signalen (Figuur 14A-B). De Helmholtz-capaciteit van de Au-elektrode nam aanzienlijk toe na koolstofcoating, van 0,025 mF/cm2 tot 1,98 mF/cm2 (Figuur 14C). De toename van de capaciteit met behulp van deze microcondensatorcoatingstrategie kan de polarisatiespanning effectief verlagen in vergelijking met de traditionele Au-elektrode (Figuur 14D).

Dit protocol stelt een op nanoporeus koolstof gebaseerd platform op voor effectieve bio-interfaces voor elektrische modulatie of detectie van hartsystemen (Figuur 10). Voor het evalueren van de prestaties van nanoporeuze koolstofelektronica voor hartstimulatie werd de Au- of Au-C-elektrode op de linkerventrikelwand (LV) geplaatst voor ladingsinjectie bij bifasische vierkantsstroomgolfvormen35 (Figuur 10A). Bij stimulatie van 4 Hz (1 mA) bereikten zowel Au- als Au-C-elektroden een effectieve overdrive-stimulatie (Figuur 10B). Een opmerkelijk hogere ECG-amplitude, een indicatie van de contractiesterkte, werd echter waargenomen in de Au-C-groep. Beide elektroden vertoonden een exponentiële afname van de drempelstroom voor stimulatie met pulsduur. Stimulatiedrempels, die de laagste spanningen aangeven voor effectieve frequentiemodulatie, werden ook gemeten over verschillende pulsbreedtes (Figuur 10C-D). De sterkte-duurcurve werd gemodelleerd met behulp van de vergelijking:

figure-results-1

waarbij I(t) verwijst naar de stimulusstroom bij de pulsduur (t), Irheobase de drempelstroom is bij een oneindig lange pulsduur (rheobase), en τ de membraantijdconstante36 is. De berekening maakt gebruik van de minimale lading die nodig is voor succesvolle stimulatie bij chronaxie als figure-results-2. Wijkmin. De waarden werden bepaald als 0,79 en 0,71 μC voor respectievelijk Au- en Au-C-elektroden (Figuur 10C). Bij een stimulatiestroom van 4 mA/cm2 werden drempelspanningen voor effectieve stimulatie waargenomen bij respectievelijk 1,32 V en 0,90 V voor Au- en Au-C-elektroden (Figuur 10D). De verlaging van de drempelspanning met 30,3% suggereert een mogelijke afname van oxidatieve stress tijdens langdurige stimulatie31, waardoor veiligere bio-elektronicatoepassingen met minimale weefselbeschadiging mogelijk worden. Daarnaast werd een met koolstof geënte 16-kanaals Au-elektrode ontwikkeld voor verbeterde epicardiale ECG-signaaldetectie (Figuur 10E-F). De nanogestructureerde koolstofoverdracht verbeterde de signaal-ruisverhouding aanzienlijk met een factor 8,0 in vergelijking met traditionele Au-elektroden, wat de effectiviteit aantoont van nanoporeuze op koolstof gebaseerde coatings voor high-fidelity bio-elektronica.

De succesvolle inductie van I/R-infarctmodellen werd ter plaatse tijdens het experiment of post-experimenteel gevalideerd door middel van respectievelijk fysiologische signaalmonitoring of TTC-kleuring. Na het snijden en kleuren zal het hart van het infarct een witgekleurd gebied vertonen, dat myocardiale schade vertegenwoordigt en overeenkomt met de grootte van het infarct (Figuur 7B). Daarentegen zal een gezond hart na het kleuren geen witte gebieden hebben. Tijdens real-time monitoring zal een succesvol ischemiemodel een aanzienlijk verlaagde hartslag vertonen, wat blijkt uit LVP- en ECG-metingen. Bovendien zal MEA-mapping van het ischemische hart een verminderde elektrische geleidingssnelheid over het epicardium onthullen, wat resulteert in een langere vertragingstijd37 (Figuur 7A).

figure-results-3
Figuur 1: Schematische weergave van het protocol en de fabricageworkflow. (A) Schematische illustratie van de ex vivo opstelling van het rattenhart en de interface van het apparaat. (B) Fabricageproces van poreus siliciummembraan (stap 1). De fabricage van het poreuze Si-membraan begint met een SOI-wafer, waarbij een fotoresistlaag via fotolithografie wordt gevormd om zeshoekige kenmerken te definiëren. RIE verwijdert selectief blootliggend silicium, gevolgd door een lift-off-proces in gebufferd HF om Si-membranen vrij te maken. Het membraan ondergaat vlek-etsen in een op HF gebaseerde oplossing, waardoor een nanoporeuze Si-structuur ontstaat. Het resulterende poreuze Si-membraan wordt voorzichtig losgemaakt en overgebracht naar een PDMS-substraat voor mechanische ondersteuning. Ten slotte wijzigt plasmabehandeling de oppervlakte-eigenschappen voor verbeterde fotostromen. (C) Fabricageproces van flexibele macroporeuze multi-elektrode-arrays (stap 2). De fabricage van flexibele MEA's begint met PI-coating op een siliciumwafer om als flexibele substraatlaag te dienen. Fotopatroonvorming wordt uitgevoerd met behulp van AZ 2020 fotoresist om elektrodegebieden te definiëren. Metaalafzetting (Au/Ti) wordt uitgevoerd via e-beam-verdamping om geleidende sporen te creëren, gevolgd door een andere fotopatroonstap met AZ 40XT-11D om geselecteerde gebieden te beschermen tegen RIE om macroporeus substraat te vormen. Een SU-8-fotopatroon en harde bakstap voegt inkapseling toe voordat het laatste lift-off-proces de flexibele MEA uit de Si-wafel vrijgeeft. (D) Workflow van koolstofmembraanpatronen en -overdracht (stap 3), inclusief vezelverwerking via zoutimpregnering, microfabricage door lasersynthese en waterondersteunde patroonoverdracht van papiersubstraat naar andere dragers. Figuur 1D is gewijzigd ten opzichte van27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 2: Optische en SEM-beelden van de as-fabricated apparaten. (A) Dwarsdoorsnede SEM (boven) en optisch microscopisch beeld (onder) van nanoporeus Si. (B) Optische beelden van macroporeuze multi-elektrode-arrays met holle (boven) en serpentijn (onder) ontwerpen. (C) Dwarsdoorsnede optisch microscopisch beeld (boven) en foto (onder) van verkoolde substraten. Figuur 2A is gewijzigd ten opzichte van26. Figuur 2C is gewijzigd ten opzichte van27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 3: CAD-ontwerpen van het Si-membraanapparaat. De afbeelding geeft de parameters weer voor (A) kleine, (B) middelgrote, (C) grote en (D) open venstervormige siliciummembraanapparaten. Eenheid: mm. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 4: CAD-ontwerp van de macroporeuze MEA's. (A) De ontwerptekeningen en annotaties voor de holle MEA. (B) De ontwerptekeningen en annotaties voor de serpentijnvormige MEA. Eenheid: mm. Figuur 4A is gewijzigd van26. Figuur 4B is gewijzigd ten opzichte van28. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 5: Schema's en ontwerpen van de op koolstof gebaseerde elektrode-arrays voor hartinterfaces. (A) Ontwerp voor de stimulerende elektrode-interfaces (stap 3). Tijdens een typische stimulatie werden stimulatie-elektroden aangesloten in een configuratie met twee elektroden. De werkelektrode (serpentijn nanoporeus koolstofpatroon) werd op de linkerventrikelwand geplaatst, terwijl de contra-elektrode op de rechterventrikelwand werd geplaatst en met de grond werd verbonden. Vierkantestroomgolfvormen werden afgeleverd via een potentiostaat. (B) De 16-kanaals MEA's voor het maskeren en overbrengen van koolstofelektroden (stap 3). Laag 1 geeft het Au-patroon aan van een 16-kanaals MEA op een PI-substraat. Laag 2 geeft de PET-inkapselingsfilm aan. Dit cijfer is gewijzigd van27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 6: Schematische en fotografische weergave van de ex vivo opstelling en het experimentele proces. (A) Apparaten en gereedschappen die worden gebruikt voor ex vivo opstelling, met inbegrip van conische kolven, chirurgische instrumenten, perfusiesystemen en temperatuurregelingssystemen (stap 4). (B) Extractieproces van rattenhart: Verdoof het dier met isofluraan; Zet de armen van de rat vast; open de ribbenkast van de rat; Oogst het rattenhart. (C) Verwijdering van omringend vetweefsel uit het geëxtraheerde hart om het voor te bereiden op de experimentele opstelling. (D) Bevestiging van het geëxtraheerde hart aan het ex vivo perfusiesysteem. (E) Perfusie-opstelling waarbij het hart wordt weergegeven dat op het systeem is aangesloten om fysiologische omstandigheden te simuleren. (F) Hart-ECG-opname ingesteld. (G) Ischemie-reperfusie (I/R) processen worden gedemonstreerd door de opstelling (stap 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 7: Vergelijking tussen gezond geïsoleerd hart en I/R-hart. (A) LVP-, ECG- en ECG-voortplantingsvertragingen werden geregistreerd bij schijngezonde harten en ischemie/reperfusie (I/R) harten. (B) Representatieve foto's van met trifenyltetrazoliumchloride (TTC) gekleurd gezond hart en I/R-hartsecties. Het witte gebied geeft de grootte van het infarct aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 8: Bidirectionele opto-elektronische stimulatie en elektrische registratie van ex vivo rattenhart met behulp van poreus siliciummembraan en flexibele MEA's. (A) Foto van de bevestiging van het siliciummembraan en de plaatsing van serpentijnvormige MEA's naast het siliciummembraan op het hart. (B) Foto van de bevestiging van een open raamvormig siliconenmembraan en holle MEA's die in het Si-venster zijn aangebracht. (C) Optische stimulatie op het ex vivo rattenhart met niet-vangst, gedeeltelijke opname en volledige opname met drie verschillende intensiteiten bij 240 bpm en een pulsduur van 1 ms. (D) Plot van intensiteit versus duur om de pacingdrempel van het apparaat te evalueren. (E) Optische stimulatieprofielen met een intensiteit van 0,24 mW/mm2 en een pulsduur van 10 ms. Figuur 8B-D is gewijzigd van26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-11
Figuur 9: Multisite pacing en mapping in bidirectionele interfaces. (A) Posities van pacing- en opnameplaatsen. (B) Isochronkaart toont de vertraging van de activering van het elektrische signaal na fotostimulatie van acht verschillende locaties op een monolithisch Si-apparaat met open venster. (C) De voorbeeldige controle en het tempo van 16-kanaals ECG-sporen op verschillende stimulatielocaties. Door verschillende locaties te stimuleren, veroorzaakte ruimtelijke activering tijdelijke vertragingen in de QRS-evolutie die werd gedetecteerd in weefsels op verschillende opnameplaatsen. Deze kunnen worden weergegeven als een activeringsvertragingskaart, waarmee geleidingspaden op het hartoppervlak kunnen worden onderzocht. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-12
Figuur 10. Nanoporeuze bio-elektronica op basis van koolstof voor hartstimulatie en -registratie. (A) Optisch beeld van een poreus koolstofmembraan-geënte Au (Au-C) elektrode voor hartstimulatie. De inzetafbeelding toont de vergrote weergave van een serpentijn-gestructureerde microcondensator op de Au-elektrode. (B) ECG-respons van geïsoleerd rattenhart op bifasische, vierkante-stroom golfvormstimulatie met een frequentie van 4 Hz. Bij dezelfde stroomdichtheid van 4,0 mA/cm2 vertoonde het hart verschillende ECG-responsen onder stimulatie van Au- of Au-C-elektroden. (C) De duur-sterktecurves van Au- en Au-C-stimulatie-elektroden en hun curve-fitting zijn aanwezig bij een stimulatiefrequentie van 4 Hz. (D) De drempelspanning die op de elektroden wordt toegepast voor effectieve stimulatie met verschillende duur voor Au- en Au-C-elektroden. (E) Basislijncurven van ECG-signalen die zijn opgenomen met de Au-elektrode en de Au-C-elektrode. (F) De signaal-ruisverhouding (S/N) wordt berekend op basis van de geregistreerde ECG-curves. De inzetfiguren tonen de optische beelden van de Au en de Au-C-elektrode-array die worden gebruikt voor ECG-registratie (elektrodegrootte: 1 mm; stap 7.5). Dit cijfer is gewijzigd van27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-13
Figuur 11: Vergelijking van fotostromen voor verschillende Si-apparaten en evaluatie van de pacingdrempel. (A) Vergelijking van fotostroommagnitudes op vier Si-gebaseerde apparaten. Blauwe sporen vertegenwoordigen de gemiddelde fotostromen van N = 8 onafhankelijke apparaten, en de overlappende grijze sporen illustreren individuele apparaatmetingen. Het bijbehorende staafdiagram toont de piekwaarden van de fotostroom (in blauw) en geïntegreerde ladingsinjecties (in oranje). Staafdiagrammen worden uitgedrukt als gemiddelde ± s.d. Schaalbalk, 10 ms. (B) Ex vivo hartstimulatie werd uitgevoerd met behulp van de drie verschillende apparaten. De stimulatie werd uitgevoerd met een snelheid van 240 bpm en een pulsbreedte van 10 ms. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-14
Figuur 12: Karakterisering van de lading-balans door integratie van de geïnjecteerde en teruggekeerde lading. (A) Illustratie van het laad- en ontlaadproces in het karakteristieke fotostroomspoor. (B) Berekening van de totale kosten die gemoeid zijn met het injecteren en teruggeven van ladingen. De resultaten toonden over het algemeen een goede ladingsbalans onder verschillende stimulatieduur. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-15
Figuur 13: De representatieve elektrische signalen die door elke elektrode in de 16-kanaals MEA worden verzameld. De elektrische signalen in 16 kanalen (Ch) tonen de elektrocardiogram (ECG) informatie van het ex vivo kloppende hart. Het cijfer is gewijzigd van28. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-16
Figuur 14. Elektrochemische eigenschappen van nanoporeuze bio-elektronica op basis van koolstof. (A) De elektrochemische interface tussen exciteerbare weefsels en koolstofinterfaces met patronen. (B) Impedantie- en fasespectra van Au- en Au-C-elektroden met aangepaste curven volgens het circuit weergegeven in A. (C) CV-meting van Au- en C-patronen met dezelfde geometrie, met een spanningsbereik van -0,2 tot 0,4 V versus een standaard Ag/AgCl-elektrode. (D) Spanningsveranderingen van Au- en Au-C-elektrode tijdens een bifasische galvanostatische stimulatiecyclus. Dit cijfer is gewijzigd van27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

VerbindingAanbevolen variëteitConc. [ml]MWPer 1 LPer 2 L
NaClSigma (S9625)12658.47.3614.7
KclSigma (P4504)5.474.60.40.8
GlucoseSigma (G7021)101801.83.6
HEPESSigma (H4034)102382.3834.766
MgCl2.7H2OSigma (M9272)12031 ml2 ml
Voorraad 1 mVoorraad 1 m
CaCl2.2H2OSigma (C3881)21471 ml2 ml
Voorraad 2 mVoorraad 2 m
NaH2PO4Sigma (S0751)0.391201 ml2 ml
Voorraad 0,39 mVoorraad 0,39 m

Tabel 1: HEPES Tyrode's Solution Components.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol introduceerde het ex vivo rattenhartplatform (Figuur 1A) en het I/R-model om snelle en gemakkelijke elektrofysiologische studies op orgaanniveau aan te bieden ter begeleiding van de snelgroeiende onderzoeksinspanningen en -eisen in de bio-elektronica38. Het beschreef de fabricage en validatie van drie apparaatsystemen, namelijk nanoporeus silicium, flexibele multi-elektrode-arrays en nanoporeuze koolstof (figuren 1B-D), als benchmark voor bidirectionele elektrofysiologische ondervragingen. Nanoporeus silicium maakt capacitieve en hoge spatiotemporele stimulatie met lage intensiteit mogelijk, flexibele multi-elektrode-arrays maken meerkanaals opname en kartering van epicardiale activiteiten mogelijk, en nanoporeuze koolstof leidt tot laagspanningsstimulatie en hoge SNR-registratie in combinatie met MEA's27.

Optische stimulatie is eerder aangetoond met behulp van optogenetica, een methode die genetische modificatie vereist om lichtgevoelige ionenkanalen in doelweefsels tot expressie te brengen33. Hoewel optogenetica effectief is, brengt het een aanzienlijke complexiteit met zich mee vanwege de behoefte aan virale vectoren of transgene benaderingen, waardoor veiligheids-, ethische en regelgevende problemen ontstaan, met name voor klinische toepassingen. Daarentegen biedt op halfgeleiders gebaseerde, niet-genetische biostimulatie een eenvoudiger en meer translationeel levensvatbaar alternatief 39,40,40,42. Materialen zoals silicium en andere organische halfgeleiders maken directe opto-elektronische modulatie van weefsels mogelijk zonder genetische verandering, waarbij gebruik wordt gemaakt van capacitieve fotostromen voor bioveilige en ladingsgebalanceerde stimulatie. Deze aanpak bereikt vergelijkbare of zelfs superieure prestaties als optogenetica in termen van stimulatie-intensiteit, waarbij ruim onder de laserveiligheidsdrempels wordt gewerkt om weefselbeschadiging te minimaliseren31,32 (Figuur 8). De niet-genetische aard van op halfgeleiders gebaseerde biostimulatie elimineert de barrières die gepaard gaan met genetische modificatie, wat de weg vrijmaakt voor een bredere acceptatie in klinische omgevingen en diverse toepassingen in weefselmanipulatie en bio-elektronische geneeskunde. De apparaten moeten echter zorgvuldig worden ontworpen om te integreren met het weefsel, waarbij biocompatibiliteit zorgvuldig moet worden overwogen, evenals de plaats van interface voor efficiënte stimulatie en registratie (Figuur 8A-B). Bovendien kan de aanwezigheid van materiaal op het weefseloppervlak de mogelijkheid van real-time beeldvorming belemmeren, tenzij een apparaat kan worden ontworpen om transparant te zijn voor het excitatie-emissievenster van bepaalde beeldvormingsmiddelen.

Nanoporeus silicium onderscheidt zich van halfgeleiderfotografen omdat er geen kunstmatige retourelektrode voor nodig is, in tegenstelling tot eerder gerapporteerde materialen26. Deze unieke eigenschap komt voort uit het vermogen om ruimtelijk opgeloste kathode- en anodegebieden te vormen op basis van de grootte en locatie van de lichtvlek. Het verlichte oppervlak dient als kathodische injectieplaats, terwijl de omliggende perifere gebieden de terugkeer van de anodische stroom mogelijk maken. Dit mechanisme maakt stimulatie op meerdere locaties mogelijk op monolithische, pixelloze membranen, waardoor nauwkeurige en lokale stimulatie mogelijk is. Met name gelokaliseerde lichtstimulatie, in plaats van globale verlichting, is van cruciaal belang voor het creëren van efficiënte bipolaire stimulatieprofielen. Bovendien heeft de grootte van het apparaat een aanzienlijke invloed op de prestaties; Grotere apparaten genereren hogere stromen onder dezelfde stimulatieomstandigheden, waardoor hun functionele veelzijdigheid verder wordt vergroot.

Het falen van optische stimulatie kan het gevolg zijn van verschillende factoren, zelfs in gezonde biologische modellen, die voornamelijk verband houden met de integriteit van het apparaat en de koppeling van de bio-interface. Ten eerste is grondige fotostroomkarakterisering van cruciaal belang vóór hartstimulatie. Lager dan verwachte fotostromen kunnen het gevolg zijn van materiaaldegradatie43 oxidepassivering na langdurige opslag, over-etsen tijdens het vlekkenetsproces, apparaatbreuken tijdens het hanteren of overbrengen, of onjuiste oriëntatie van het apparaat tijdens het tussenfakken. Om mechanische schade te beperken, werd PDMS gebruikt als een zacht substraat voor het onderbrengen van de nanoporeuze siliciummembranen, die bescherming bieden tegen mogelijke schade door directe hantering met een pincet. Ten tweede is het essentieel om een naadloze interface tot stand te brengen met het epicardium, dat in deze opstelling is doordrenkt met biovloeistoffen. Een dikke laag biovloeistof kan een goede hechting belemmeren en de pacing-efficiëntie in gevaar brengen. Om de bio-interfacekoppeling te verbeteren, kunnen biolijmen42,43 of hechten worden gebruikt om de verbinding te stabiliseren en een betrouwbare stimulatie te garanderen. Met name het nanoporeuze silicium dat in onze studie wordt gebruikt, is biologisch afbreekbaar, ondersteunt tijdelijke stimulatietoepassingen, maar verslechtert de prestaties binnen 1-2 dagen onder fysiologische omstandigheden. Voor stabiliteit op langere termijn moet oppervlaktepassivering44 of het gebruik van duurzamere halfgeleidermaterialen worden overwogen.

Tijdens ex vivo stimulatie is de geleidelijke LVP-toename (Figuur 8E) bij hogere frequenties (bijv. 4 Hz) waarschijnlijk het gevolg van verbeterde myocardiale contractiliteit, calciumaccumulatie en het Frank-Starling-mechanisme45. Verhoogde stimulatiesnelheden verbeteren de intracellulaire calciumcyclus en de dynamiek van de ventriculaire vulling, waardoor de voorbelasting en contractiesterkte toenemen46. Hoewel dit de myocardiale zuurstofbehoefte en het risico op aritmie kan verhogen, kunnen deze effecten worden verzacht door voldoende pre-oxygenatie, nauwgezette ECG-monitoring en gecontroleerde stimulatieparameters. In onze experimenten werden geen significante nadelige effecten waargenomen.

Bij het registreren van meerdere elektroden is het specificeren van de elektrodelocaties op het hart en hun relatieve posities ten opzichte van de stimulatie-elektrode cruciaal voor een zinvolle analyse. Het is essentieel om overspraak tussen elektroden te elimineren om ervoor te zorgen dat verschillende golfvormen en tijdelijk opgeloste patronen worden vastgelegd. Flexibele elektrode-arrays zorgen doorgaans voor een goede interface met het epicardium; De hechting kan echter verder worden verbeterd met behulp van ionisch geleidende lijmcoatings, zoals dunne hydrogellagen28,43 om de stabiliteit en signaalkwaliteit te verbeteren.

Nanogestructureerde grafeen/koolstofmaterialen, met grote oppervlakken voor ladingsopslag en -injectie, kunnen de prestaties van bio-elektronische apparaten verbeteren door de impedantie bij elektrode-zoutjuncties te verminderen en de mogelijkheden voor ladingsinjectie te vergroten35. Huidige methoden voor het vormen van grafeenmaterialen op flexibele elektroden (bijv. Au) omvatten elektrodepositie, spincoating en zeefdruk47. Deze methoden worden echter meestal geassocieerd met complexe fabricageprocessen, beperkte patroonvormingsmogelijkheden en verminderde prestaties als gevolg van het dode volume van bindmiddelen. Een lasersynthesemethode werd gebruikt om nanogestructureerde koolstofpatronen op cellulosesubstraat te genereren en deze vervolgens over te brengen op andere zachte films om een conforme bio-interface te creëren, die een gemakkelijke en effectieve manier biedt voor de fabricage van bio-elektronica. De combinatie van koolstofcoatings met patronen en kleine geometrische afmetingen tot op het niveau van één cel, waardoor het gelokaliseerde elektrische veld zou toenemen, en zeer poreuze structuren van koolstofmembraan om de weerstand op het grensvlak tussen elektrode en weefsel te verminderen, zal in de toekomst synergetisch efficiënte biologische stimulatie en registratie bereiken48.

Hoewel het een handig ziektemodel is, mist het Langendorff ex vivo I/R-model systemische interacties, isoleert het hart van neurohormonale en immuunresponsen en vertrouwt het op kunstmatige perfusie met buffers, die fysiologische omstandigheden zoals zuurstofafgifte en endotheelfunctie kunnen veranderen. De beperkte levensvatbaarheid beperkt studies tot acute gebeurtenissen. Desalniettemin biedt het model een zeer gecontroleerde omgeving met nauwkeurige parameteraanpassingen en een goede reproduceerbaarheid. Het maakt ook real-time meting van de hartfunctie mogelijk, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor het verkennen van nieuwe therapeutische strategieën voor ischemische hartaandoeningen. Elektroceutische apparaten kunnen bijvoorbeeld worden overwogen om het hart voor te conditioneren, het te trainen om omgevingen met ernstige reactieve zuurstofsoorten (ROS) te doorstaan, of om ROS-niveaus te verminderen voor verbeterd herstel. De werkzaamheid van dergelijke behandelingen kan worden geëvalueerd aan de hand van statistieken zoals hartslagpatronen, ECG-golfvormen en geleidingssnelheid. Bovendien zou een multisite stimulatieplatform ruimtelijke informatie kunnen verschaffen over een hartinfarct, waardoor een meer gedetailleerde beoordeling van de getroffen regio's mogelijk wordt. Deze benadering zou ook verbeterde stimulatiedrempels kunnen aantonen, gecorreleerd met de ernst van het infarct, en biedt een uitgebreid kader voor therapeutische evaluatie en optimalisatie.

Hoewel het protocol het gebruik van de drie apparaten in bidirectionele ex vivo hartmodellen benadrukte, reikt hun toepasbaarheid veel verder dan hartweefsel. Deze apparaten kunnen gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met andere elektrisch prikkelbare weefsels of organen, zoals neurale weefsels, skeletspieren en gastro-intestinale systemen, waar nauwkeurige elektrische modulatie van cruciaal belang is, waardoor ze veelzijdige hulpmiddelen zijn voor zowel onderzoek als translationele toepassingen in de bio-elektronische geneeskunde.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PL en BT hebben een patent aangevraagd op de fabricage en toepassing van het nanoporeuze siliciumapparaat. P.L., C.Y. en B.T. hebben een patent aangevraagd op de fabricage en toepassing van het nanoporeuze koolstofapparaat. P.L. en B.T. hebben een patent aangevraagd op de fabricage en toepassing van flexibele micro-elektronenarrays.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd financieel ondersteund door het National Institute of Health via subsidie 1R56EB034289-01 en 1R01EB036091-01, en het US Army Research Office via subsidie W911NF-24-1-0053. P. L. is dankbaar voor de steun van de Grier Prize in Biophysical Sciences Innovation.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16 Channel HeadstageIntan TechnologiesC3334
2,3,5-Triphenyltetrazolium chlorideSigma AldrichT8877-5Gtrifenyltetrazoliumboorchloride
2-Propanol (IPA) Fischer ScientificA451-4
635 nm Laser, 500 mWLaserglowNA
AcetoneFischer ScientificA18-4
Angstrom Evovac e-beam evaporatorAngstromNA
AZ 300MIF DeveloperMicrochemicals18441123163Ontwikkelaar
AZ nlof 2020 Microchemicals1A002020
AZ NMP MicrochemicalsNAVerwijderaar voor fotoresistor
AZ40XT-11D Microchemicals1000300Fotoresistor
Buffered HFThermo ScientificAA44627K2
CaCl2.2H2OSigma Aldrich(C3881)
CO2 laser Universal Laser SystemsVLS 4.60
Conductive silver paintPELCO16062Leidbaar zilververf voor hechting tussen elektrode en koperdraad
Koperdraad met isolatie van 0,1 mmAmazonhttps://www.amazon.com/Enameled-Temperature-Resistance-Transformers-Inductors/dp/
B09TNM51S5/ref=asc_df_B09
TNM51S5?mcid=155de761ea4
c389ea86d45ba61a83e8d&tag
=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid
=693675076770&hvpos=&hvnetw
=g&hvrand=664358781094905
4431&hvpone=&hvptwo=&hvqmt
=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint
=&hvlocphy=9021716&hvtargid=
pla-1878323158943&psc=1
Digidata 1550 digitizerMolecular DevicesNA
GlucoseSigma AldrichG7021
HBSS, zonder calcium, zonder magnesium, zonder fenolroodThermo Scientific14175095
Heidelberg MLA150 direct writerHeidelbergNA
Heparine (1000 IE/kg)Sagent Pharmaceuticals1009655
HEPESSigma Aldrich(H4034)
Hexaan Sigma Aldrich52750-10MLOplosmiddel
HFFisher ScientificA513-500Tracemetal grade
HMDS Vapor Prime OvenYield Engineering SystemsNA
HNO3Fisher ScientificA509P500Tracemetal grade
HetelamineerapparaatOffice DepotL410-AMultilayer encapsulatie
Intan RHD-systemenIntan TechnologiesC3100
iWorx ECGiWorxIA-400D
iWorx LVD probeiWorxBP-100
iWorx voorversterkeriWorxC-ISO-256
KClSigma Aldrich(P4504)
Latexballon (maat 4)Radnoti170404
MgCl2.7H2OSigma Aldrich(M9272)
NaClSigma Aldrich(S9625)
Nafion 117 met oplossingSigma Aldrich31175-20-9Fixeermiddel voor nanoporeuze koolstofpatronen
NaH2PO4Sigma Aldrich(S0751)
NaOHSigma Aldrich221465
PDMSFisher ScientificNC9285739
Plasma-Therm plasmafluoride-etserPlasma-ThermNA
PMMA (495 A6) MicrochemicalsM130006
poly (pyromellitic dianhydride-co-4,4'-oxydianiline)Sigma Aldrich575801PI-precursor
Poly(ethyleen-co-vinylacetaat)Sigma Aldrich437247-250GPolymeer voor infiltratie
Poly(vinylalcohol)Sigma Aldrich341584-25G
Polyethyleentereftalaat (PET)AmazonKS-6304-21-11Type D Doorzichtige PET-folie van 0,0005 inch dik x 27 inch breed x 10 ft lengte 1 stuk
PotentiostatBioLogicSP-200Elektrische stimulatie
WeerstandsovenDespatchLCC1-15-5
Scanning electron microscopyCarl ZeissMerlinInstrument voor morfologische karakterisering
Silicion wafer NOVA Electronic MaterialsHS39626
Silicone lijmWPIKWIK-SIL-SEncapsulatie
NatriumboraatSigma AldrichSX0355
SOI waferUltrasil3-10541Type-Orient:P/B(100) DT:7+/-1um DR:<.005 Ohmcm HT:300+/-10um HR:1-30 Ohmcm Box:1um+/-5% UD-13998/UH-13962
SU-8 2002MicrochemicalsSU-8 2000 Series
SU-8 ontwikkelaarMicrochemicalsSU-8 2000 Series
Nassgewebekleber3M1469SB
Whatman kwalitatief filterpapier, graad 1Sigma AldrichWHA1001150Substraat voor koolstofpatronen
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sunwoo, S. H., et al. Soft bioelectronics for the management of cardiovascular diseases. Nat Rev Bioeng. 2 (1), 8-24 (2024).
  2. Choi, H., et al. Adhesive bioelectronics for sutureless epicardial interfacing. Nat Elect. 6 (10), 779-789 (2023).
  3. Choi, Y. S., et al. Fully implantable and bioresorbable cardiac pacemakers without leads or batteries. Nat Biotech. 39 (10), 1228-1238 (2021).
  4. Cingolani, E., Goldhaber, J. I., Marbán, E. Next-generation pacemakers: from small devices to biological pacemakers. Nat Rev Cardiol. 15 (3), 139-150 (2018).
  5. Sala, L., Ward-van Oostwaard, D., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L., Bellin, M. Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs). J Vis Exp. (123), e55587(2017).
  6. Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J Vis Exp. (159), e61167(2020).
  7. Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M. J., Jones, S. M., Kanisicak, O. Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes. J Vis Exp. (164), e61073(2020).
  8. Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. J Vis Exp. (128), e56634(2017).
  9. Trayanova, N. A. Whole-Heart Modeling: Applications to Cardiac Electrophysiology and Electromechanics. Circ Res. 108 (1), 113-128 (2011).
  10. Yin, R. T., et al. Open thoracic surgical implantation of cardiac pacemakers in rats. Nat Protoc. 18 (2), 374-395 (2023).
  11. Wu, K., et al. Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice. J Vis Exp. (171), e62514(2021).
  12. Pendexter, C. A., et al. Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts. J Vis Exp. (208), e66815(2024).
  13. Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-current possibilities and strive for future applications. J Tissue Eng Regenerat Med. 16 (10), 853-874 (2022).
  14. Jiang, Y. W., et al. Topological supramolecular network enabled high-conductivity, stretchable organic bioelectronics. Science. 375 (6587), 1411-1417 (2022).
  15. Driscoll, N., et al. MXene-infused bioelectronic interfaces for multiscale electrophysiology and stimulation. Sci Transl Med. 13 (612), eabf8629(2021).
  16. Gablech, I., Głowacki, E. D. State-of-the-Art Electronic Materials for Thin Films in Bioelectronics. Adv Elect Mater. 9 (8), 2300258(2023).
  17. Cho, Y. H., Park, Y., Kim, S., Park, J. 3D Electrodes for Bioelectronics. Adv Mater. 33 (47), 2005805(2021).
  18. Chen, Z., et al. bioresorbable, transparent microelectrode arrays for multimodal spatiotemporal mapping and modulation of cardiac physiology. Sci Adv. 9 (27), eadi0757(2023).
  19. Jiang, Y. W., et al. Rational design of silicon structures for optically controlled multiscale biointerfaces. Nat Biomed Eng. 2 (7), 508-521 (2018).
  20. Prominski, A., et al. Porosity-based heterojunctions enable leadless optoelectronic modulation of tissues. Nat Mater. 21 (6), 647-655 (2022).
  21. Huang, Y. X., et al. Bioresorbable thin-film silicon diodes for the optoelectronic excitation and inhibition of neural activities. Nat Biomed Eng. 7 (4), 486-498 (2023).
  22. Balamur, R., et al. Capacitive and Efficient Near-Infrared Stimulation of Neurons via an Ultrathin AgBiS2 Nanocrystal Layer. ACS Appl Mater Inter. 16 (23), 29610-29620 (2024).
  23. Karatum, O., Kaleli, H. N., Eren, G. O., Sahin, A., Nizamoglu, S. Electrical Stimulation of Neurons with Quantum Dots via Near-Infrared Light. ACS Nano. 16 (5), 8233-8243 (2022).
  24. Han, M., et al. Photovoltaic neurointerface based on aluminum antimonide nanocrystals. Comm Mater. 2 (1), (2021).
  25. Ejneby, M. S., et al. Chronic electrical stimulation of peripheral nerves via deep-red light transduced by an implanted organic photocapacitor. Nat Biomed Eng. 6 (6), 741-753 (2022).
  26. Li, P., et al. Monolithic silicon for high spatiotemporal translational photostimulation. Nature. 626 (8001), 990-998 (2024).
  27. Yang, C., et al. A bioinspired permeable junction approach for sustainable device microfabrication. Nat Sustain. 7 (9), 1190-1203 (2024).
  28. Shi, J., et al. Monolithic-to-focal evolving biointerfaces in tissue regeneration and bioelectronics. Nat Chem Eng. 1 (1), 73-86 (2024).
  29. Shi, J., et al. Active biointegrated living electronics for managing inflammation. Science. 384 (6699), 1023-1030 (2024).
  30. Zhang, L., et al. Marangoni Effect-Driven Motion of Miniature Robots and Generation of Electricity on Water. Langmuir. 33 (44), 12609-12615 (2017).
  31. Cogan, S. F. Neural Stimulation and Recording Electrodes. Ann Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).
  32. Nussinovitch, U., Gepstein, L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nat Biotechnol. 33 (7), 750-754 (2015).
  33. Hsueh, B., et al. Cardiogenic control of affective behavioural state. Nature. 615 (7951), 292-299 (2023).
  34. Tian, B. Z., et al. Macroporous nanowire nanoelectronic scaffolds for synthetic tissues. Nat Mater. 11 (11), 986-994 (2012).
  35. Fang, Y., et al. Micelle-enabled self-assembly of porous and monolithic carbon membranes for bioelectronic interfaces. Nat Nanotechnol. 16 (2), 206-213 (2021).
  36. Kay, G. N., Shepard, R. B. Stimulation and Excitation of Cardiac Tissues. Clin Cardiac Pacing Defibrillat Resynchronizat Ther. , 61-113 (2017).
  37. Zhang, J., et al. Gold-modified nanoporous silicon for photoelectrochemical regulation of intracellular condensates. Nat Nanotechnol. , (2025).
  38. Li, P., Kim, S., Tian, B. Beyond 25 years of biomedical innovation in nano-bioelectronics. Device. 2 (7), 100401(2024).
  39. Yang, C., Cheng, Z., Li, P., Tian, B. Exploring Present and Future Directions in Nano-Enhanced Optoelectronic Neuromodulation. Acc Chem Res. 57 (9), 1398-1410 (2024).
  40. Prominski, A., Li, P., Miao, B. A., Tian, B. Nanoenabled Bioelectrical Modulation. Acc Mater Res. 2 (10), 895-906 (2021).
  41. Li, P., Kim, S., Tian, B. Nanoenabled Trainable Systems: From Biointerfaces to Biomimetics. ACS Nano. 16 (12), 19651-19664 (2022).
  42. Majmudar, A., Kim, S., Li, P., Tian, B. Perspectives on non-genetic optoelectronic modulation biointerfaces for advancing healthcare. Med-X. 2 (1), 18(2024).
  43. Hwang, S. W., et al. A Physically Transient Form of Silicon Electronics. Science. 337 (6102), 1640-1644 (2012).
  44. Yu, Y., et al. Enhanced photoelectrochemical efficiency and stability using a conformal TiO2 film on a black silicon photoanode. Nat Ener. 2 (6), 17045(2017).
  45. Kosta, S., Dauby, P. C. Frank-Starling mechanism, fluid responsiveness, and length-dependent activation: Unravelling the multiscale behaviors with an in silico analysis. PLoS Computat Bio. 17 (10), e1009469(2021).
  46. Silverman, D. N., et al. Heart Rate-Induced Myocardial Ca2+ Retention and Left Ventricular Volume Loss in Patients With Heart Failure With Preserved Ejection Fraction. J Am Heart Assoc. 9 (17), e017215(2020).
  47. Zeng, M., et al. Printing thermoelectric inks toward next-generation energy and thermal devices. Chem Soc Rev. 51 (2), 485-512 (2022).
  48. Rastogi, S. K., et al. Remote nongenetic optical modulation of neuronal activity using fuzzy graphene. Proc Natl Acad Sci. 117 (24), 13339-13349 (2020).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ex vivo hartbidirectionele interfacescardiale bio elektronicaLangendorff perfusieischemie reperfusiemyocardinfarctmodelmulti elektrode arrayopto elektronische stimulatienanoporeuze koolstofelektrodensignaal ruisverhouding

Gerelateerde artikelen