Het ontwikkelen van een rattenmodel voor bipolaire stoornis

Summary

Dit artikel presenteert een protocol voor de inductie van een uniek rattenmodel van bipolaire stoornis dat zowel manie-achtig als depressief-achtig gedrag vastlegt.

Abstract

Bipolaire stoornis is een psychische aandoening die wordt gekenmerkt door extreme stemmingswisselingen, waaronder perioden van emotionele hoogte- (manie) en dieptepunten (depressie). Hoewel de exacte onderliggende neurobiologie nog niet volledig wordt begrepen, lijken onevenwichtigheden in neurotransmittersystemen, met name dopamine, een centrale rol te spelen. Om deze reden zijn manipulaties van dopaminerge routes gebruikt om manie of depressie bij knaagdieren te modelleren. Modellen die de typische omschakeling tussen deze twee afleveringen nauwkeurig weergeven, zijn echter zeldzaam, waardoor de validiteit van het gezicht wordt beperkt. In een uniek model worden moderne technieken gebruikt om de expressie van de dopamine D1-receptor tijdelijk te verhogen, die betrokken is bij de pathologie van een bipolaire stoornis. Een tetracycline-induceerbaar lentiviraal construct dat de dopamine D1-receptor tot expressie brengt onder controle van de calmodulinkinase II alfa-promotor, wordt stereotactisch geïnjecteerd in de mediale prefrontale cortex van volwassen ratten. Overexpressie van de dopamine D1-receptor wordt bereikt door het tetracycline-analoog doxycycline toe te voegen aan het drinkwater van de dieren, wat leidt tot een toename van beloningsgerelateerd, impulsief en risicovol gedrag en een afname van angst. Dit gedrag lijkt op een manie-achtig fenotype. Door doxycycline uit het drinkwater te verwijderen, kan een depressief-achtig fenotype, gekenmerkt door verhoogde hulpeloosheid en anhedonie, binnen hetzelfde dier worden opgewekt. Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van de operatie, evenals procedures voor het induceren van het bipolaire stoornis-achtige fenotype. Daarnaast worden overwegingen beschreven voor het beoordelen van gedragsveranderingen die verband houden met manie-achtig en depressief-achtig gedrag. Dit veelbelovende model, dat een goede construct- en gezichtsvaliditeit aantoont, biedt een waardevol hulpmiddel voor het verder onderzoeken van de pathofysiologische mechanismen van bipolaire stoornis.

Introduction

Bipolaire stoornis (BD) is een ernstige stemmingsstoornis die ongeveer 1% van de wereldbevolking treft¹. Het wordt gekenmerkt door episodes van extreme stemming, depressie en manie, naast euthymische toestanden. Symptomen van depressieve episodes bij BD lijken op die van unipolaire depressie. Patiënten tonen verminderde interesse en plezier in activiteiten en gevoelens van verdriet, hopeloosheid en waardeloosheid. Bovendien kunnen vaak veranderingen in eetlust, slaapgedrag en cognitieve stoornissen worden waargenomen². Manische episodes worden gekenmerkt door een abnormaal verhoogde stemming, verminderde behoefte aan slaap, sociale ontremming, verhoogd gevoel van eigenwaarde en gevoelens van grootsheid, evenals het nemen van verhoogde risico's en prikkelbaarheid².

De ziekte-etiologie van BD lijkt een complex samenspel te zijn van genetische en ontwikkelingsfactoren³, maar de exacte mechanismen die betrokken zijn bij de pathofysiologie ervan zijn nog steeds niet volledig begrepen. Aangenomen wordt dat symptomen voortkomen uit onevenwichtigheden in neurotransmittersystemen⁴ en, met name, studies die zich richten op het dopaminesysteem zijn invloedrijk geweest⁵. Berk et ^al.6 postuleerden bijvoorbeeld de dopamine-hypothese, ervan uitgaande dat een hyperdopaminerge toestand ten grondslag ligt aan manie, terwijl depressie voortkomt uit hypodopaminergie. Sindsdien hebben bewijs uit diermodellen, evenals farmacologische en beeldvormende studies, sterke steun gekregen voor een verband tussen manische symptomen en hyperdopaminergie. Ook kon een verband worden gevonden tussen verminderde dopaminerge signalering en depressieve episodes, zij het in mindere mate⁷. Bovendien hebben de resultaten van genetisch onderzoek het idee van een dopaminehypothese van BD⁸ versterkt.

Om meer licht te werpen op de rol van het dopaminesysteem bij BD, kunnen diermodellen worden gebruikt om de neurobiologische mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de symptomen. Toepassingen en beperkingen van ziektemodellen worden vaak beoordeeld op basis van drie validatiecriteria, oorspronkelijk voorgesteld door Willner⁹. Deze omvatten gezichts-, constructie- en voorspellende validiteit. Gezichtsvaliditeit beschrijft het vermogen van het model om de gedragskenmerken van de stoornis na te bootsen. Constructvaliditeit wordt bereikt wanneer de pathofysiologie en etiologie van de aandoening de basis vormen van het model, terwijl voorspellende validiteit impliceert dat farmacologische behandeling van de aandoening binnen het model kan worden gereproduceerd.

Tot nu toe hebben verschillende knaagdiermodellen bijgedragen aan een beter begrip van BD¹⁰ en omvatten ze een breed scala aan genetische modificaties, farmaceutische interventies en milieumanipulaties¹¹.

Experimentele manipulaties van het Clock-gen hebben bijvoorbeeld aangetoond dat ze een manie-achtig fenotype bij muizen induceren. De transcriptiefactor CLOCK speelt een belangrijke rol bij het reguleren van circadiane ritmes, en genetisch veranderde muizen, die een eiwit tot expressie brengen dat de Clock-transcriptie niet kan activeren, worden gekenmerkt door hyperactiviteit en verhoogde beloningsreacties¹². Het resulterende fenotype lijkt te worden gemedieerd door differentieel gereguleerde genen voor dopaminerge signalering in het ventrale tegmentale gebied van de hersenen¹³.

Het is aangetoond dat het direct beïnvloeden van dopamine-signalering via de toediening van dopamine-verhogende medicijnen, zoals het psychostimulerende amfetamine, hypermotoriek induceert, en daaropvolgende stopzetting is in verband gebracht met depressieve symptomen, waaronder anhedonie¹⁴. Van farmacologische provocaties met ketamine of de dopamine D2/D3-receptoragonist-quinpirole is ook aangetoond dat ze gedrag induceren dat relevant is voor BD^15,16.

Naast farmacologische interventie kunnen manipulaties van de omgeving, zoals slaaptekort, worden gebruikt om gedragsfenotypes te induceren die relevant zijn voor BD¹⁷. Dieren met slaaptekort vertonen een manie-achtig fenotype dat wordt gekenmerkt door verhoogde voortbeweging en emissie van ultrasone vocalisaties die geassocieerd zijn met veranderingen in dopamine-signalering¹⁸.

Er zijn tal van andere knaagdiermodellen om depressief¹⁹ of manie-achtig²⁰ gedrag te bestuderen. Hoewel al deze modellen sterk hebben bijgedragen aan een beter begrip van BD-pathologie, worden ze beperkt door slechts één episode tegelijk of kortetermijneffecten te bestuderen. Daarentegen was het modelleren van de karakteristieke omschakeling tussen affectieve toestanden moeilijk te bereiken.

Hier wordt een protocol voor een uniek rattenmodel voor BD gepresenteerd. Het vertoont een verhoogde gezichtsvaliditeit door beide episodes bij één dier te induceren met behulp van een enkele gerichte manipulatie van het dopaminesysteem, d.w.z. voorwaardelijke overexpressie van de dopamine D1-receptor (DRD1) in de mediale prefrontale cortex (mPFC) van een tetracycline-induceerbaar lentiviraal construct. Door gentranscriptie aan te sturen onder controle van de calmodulinekinase II alpha (CamKIIa)-promotor, wordt DRD1 voornamelijk tot expressie gebracht in glutamaterge neuronen, waardoor de specificiteit van de genetische manipulatie toeneemt.

De oorspronkelijke lentivirus-backbone pRRL.cPPT.WPRE.Sin werd geleverd door Dr. Didier Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Zwitserland)²¹ en gemodificeerd door het GFP-minigen te vervangen door een polylinkerplaats (lentivirusvector PL13). PL13 werd vervolgens gebruikt om PL13.pTRE2.DRD1.CamKIIa.rtTA3 of PL13.pTRE2.dsRedExpress.CamKIIa.rtTA3 te produceren. Het cDNA van rat DRD1 werd verkregen van Dr. David Sibley (NINDS/NIH)²², en de reverse tetracycline-controlled activator 3 (rtTA3) cDNA van Drs. Atze Das en Ben Berkhout (Academisch Medisch Centrum, Universiteit van Amsterdam)²³. Het CamKIIa-promotor-DNA werd geleverd door Dr. Karl Deisseroth (Stanford University, CA), en de dsRedExpress- en de tetracycline-responselement 2 (pTRE2)-sequenties werden gesubkloneerd uit respectievelijk de interne plasmiden pcDNA3.1-dsRedExpress en pcDNA3.1-pTRE2. Virale vectoren werden gegenereerd door PCR-geamplificeerde DNA-sequenties te subklonen, geflankeerd door restrictieplaatsen.

Het model dat deze virale vector gebruikt, heeft aangetoond dat overexpressie van DRD1 in mPFC CamKIIa-positieve neuronen leidt tot een manie-achtig fenotype^24,25, terwijl de daaropvolgende downregulatie van genexpressie depressief-achtig gedrag induceert²⁶. Aangezien het ziekte-achtige fenotype herhaaldelijk kan worden geïnduceerd bij één dier²⁷, weerspiegelt het model een hoge mate van gezichtsvaliditeit. Bovendien hebben manipulaties van het dopaminesysteem een sterke constructvaliditeit voor diermodellen van BD⁷, aangezien veranderingen in DRD1-niveaus^28,29 of DRD1-polymorfismen in verband zijn gebracht met BD-pathologie 30,31,32.

Andere dierstudies hebben ook geleid tot een beter begrip van de functies van prefrontale DRD1. Een afname van DRD1 is bijvoorbeeld een consistente bevinding in modellen van depressie^33,34, terwijl optogenetische stimulatie van DRD1 in mPFC-glutamaterge neuronen angst vermindert en antidepressieve effecten induceert³⁵. In een recente publicatie van Wu et ^al.36 is de rol van mPFC DRD1 bij affectieve toestandsovergangen aangetoond. Deze studie benadrukt dat deze receptoren cruciaal zijn voor onderliggende veranderingen in excitatoire synapsplasticiteit.

Al met al vormt het gebruik van een rattenmodel van BD dat bestaat uit gerichte en voorwaardelijke manipulatie van DRD1 in CamKIIa-positieve neuronen van de mPFC een modelsysteem met een hoge construct- en gezichtsvaliditeit en vertoont het dus een sterk potentieel voor translationeel onderzoek naar BD.

Hieronder worden chirurgische ingrepen voor het genereren van modellen beschreven. Daarnaast zullen methodologische overwegingen voor modelinductie en gedragsbeoordelingen worden gepresenteerd, naast representatieve resultaten van het resulterende ziekte-achtige fenotype. Mogelijke obstakels en beïnvloedende factoren bij modelgeneratie en gedragsassessment worden besproken en er wordt een vooruitblik gegeven op toekomstige richtingen.

Protocol

Het hier beschreven protocol voor stereotactische injectie is goedgekeurd door het LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Noordrijn-Westfalen, Duitsland). Volwassen mannelijke Sprague Dawley-ratten (350-650 g lichaamsgewicht) werden gebruikt. De reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. De lentivirale constructies

OPMERKING: Een lentiviraal systeem van de derde generatie wordt gebruikt voor de voorwaardelijke expressie van DRD1 of rood fluorescerend eiwit (dsRed) als controleconditie^25,27.

1. Produceer het lentivirus op basis van het protocol van Stewart et ^al.37 met verpakkingsplasmiden 8454 en 8455 uit de Addgene-repository.
   OPMERKING: Als de virusproductie niet onafhankelijk wordt gepland, leveren veel kernfaciliteiten een hoge titerlentivirus, zoals Charité Berlin, Duitsland.
2. Titer geconcentreerde virussen en bewaar ze bij -80 °C.
3. Bereid 2 × 10⁷ transducerende eenheden (TU) per μL voor injecties.
4. Virussen op droogijs naar de operatiekamer vervoeren.

2. Dieren

OPMERKING: Het rattenmodel voor BD is vastgesteld bij volwassen mannelijke Sprague Dawley-ratten (lichaamsgewicht van 350-650 g). Voor onderzoek naar vrouwelijke ratten of eerdere ontwikkelingstijdstippen is het van cruciaal belang om te bedenken dat de expressie van DRD1 in de mPFC tijdens de ontwikkeling verandert en kan worden beïnvloed door de oestrische cyclus 38,39,40.

1. Paren huisratten met dieren in dezelfde toestand met voedsel en water ad libitum onder constante temperatuur- en vochtigheidsomstandigheden (45%-65 % relatieve vochtigheid, temperatuur 22 °C ± 2 °C).
2. Houd ratten onder een omgekeerde licht-donkercyclus van 12 uur (lichten uit om 11 uur 's ochtends), omdat gedragsonderzoek moet worden uitgevoerd tijdens de actieve fase van de dieren in het donker.
3. Geef de dieren ten minste zeven dagen de tijd om te wennen aan de faciliteit en de behandeling door de onderzoekers voordat met de experimenten wordt begonnen.

3. Stereotactische injectie van het virale construct

OPMERKING: Voer een operatie uit onder een veiligheidskap (uit voorzorg voor het werken met lentivirus) en aseptische omstandigheden.

1. Voorbereiding
   1. Zorg ervoor dat alle benodigde materialen beschikbaar en functioneel zijn (Materiaaltabel).
   2. Stel het stereotactische frame in met de spuithouder bevestigd aan de stereotactische arm. Sluit de spuithouder aan op de spuitpomp.
   3. Stel de tandartsboor in en monteer een braam van 0.9 mm.
   4. Leg het verwarmingskussen neer en stel het in op 37 °C. Breng het verwarmingskussen op de juiste hoogte om de rat gemakkelijker te positioneren.
   5. Bedek het verwarmingskussen met een absorberend laken.
   6. Bereid geautoclaveerde chirurgische instrumenten voor op een steriel oppervlak.
   7. Monteer een stereotactische injectiespuit van 10 μl met een injectienaald van 33 G op de spuithouder.
   8. Zuig 2,3 μl virale suspensie op voor bilaterale injecties van elk 1 μl. Bevestig visueel de succesvolle opname. Zorg ervoor dat u deze stap uitvoert als de laatste voorbereidende stap om de tijd die het lentivirus nodig heeft om op kamertemperatuur te zijn, te minimaliseren.
2. Analgesie en anesthesie-inductie
   1. Op de ochtend van de operatie meloxicam (1 mg/kg lichaamsgewicht, p.o.).
   2. Twintig minuten voor het begin van de chirurgische ingrepen voor analgesie injecteert u de rat met buprenorfine (0,5 mg/kg lichaamsgewicht, s.c.).
   3. Zet het anesthesieapparaat aan met een zuurstofstroom van 0,8-1 l/min.
   4. Vul de inductiekamer met 4 % isofluraan en plaats de rat in de inductiekamer.
   5. Na succesvolle inductie van anesthesie, zichtbaar door vertraagde ademhaling en bewustzijnsverlies, verwijdert u de rat uit de inductiekamer en verplaatst u deze naar het stereotactische frame.
3. Positionering van de rat
   1. Zorg ervoor dat de anesthesiestroom is overgeschakeld naar het neusmasker.
   2. Breng de rat over van de inductiekamer naar het stereotactische frame en plaats de voortanden in de houder.
   3. Plaats het anesthesiemasker op de juiste manier over de neus en draai het isofluraan naar 1,5-2,3% voor onderhoud.
   4. Bescherm de ogen met een steriele oogcrème.
   5. Injecteer de rat ten minste 10 minuten voor het maken van een incisie plaatselijk met lidocaïne (10 mg/kg lichaamsgewicht, s.c.) direct onder de geplande incisieplaats.
   6. Zet de rat vast in het stereotactische frame met behulp van oorstangen. Zorg ervoor dat de oorstangen gelijkmatig en op gelijke hoogte staan.
   7. Knip de vacht rond de incisieplaats af met een schaar. Verwijder de stukjes vacht met behulp van een cellulosekussen dat is bevochtigd met een antisepticum voor de huid.
   8. Desinfecteer het operatieveld met een huidontsmettingsmiddel.
4. Craniotomie en injectie van viraal construct
   1. Zorg voor een goede anesthesie door te controleren op de afwezigheid van teenreflex.
   2. Desinfecteer de handen en schakel over op steriele handschoenen voordat u apparatuur aanraakt.
   3. Maak een kleine mediale incisie (~1,5 cm) met behulp van een scalpelmesje.
   4. Beveilig de toegang tot het operatieveld door de huid naar de zijkanten te duwen met bulldogklemmen.
   5. Reinig het operatieveld van bloed en achtergebleven weefsel met behulp van steriele swaps. Zorg voor een goed zicht op de bregma en voldoende voorste ruimte.
   6. Stel A/P en M/L coördinaat in op nul op basis van bregma.
   7. Beweeg de stereotactische arm naar de coördinaten A/P + 2.7 en M/L ± 0.4 en visualiseer met een gedesinfecteerd potlood.
   8. Boor een gat met een diameter van ~1 mm, dat de injectiezijden voor beide hemisferen bedekt.
   9. Verwijder eventueel bloed met behulp van een steriele swap.
   10. Stel de D/V-coördinaten in op nul aan het oppervlak van de hersenen en laat de injectienaald langzaam zakken tot -2,8 om in het prelimbische gebied van de mPFC te injecteren.
   11. Wacht 5 minuten om het weefsel te laten ontspannen.
   12. Injecteer 1 μL virale suspensie met een snelheid van 0,1 μL/min.
   13. Wacht 5 minuten voor absorptie voordat u de naald langzaam verwijdert.
   14. Herhaal de injectie op het andere halfrond.
5. Afsluiting en postoperatieve zorg
   1. Verwijder de naald en sluit de opening in de schedel af met botwas.
   2. Verwijder de bulldogklemmen en hecht de huid (3-0 chirurgische hechting).
   3. Injecteer de rat met meloxicam (1 mg/kg, s.c.) voor postoperatieve analgesie.
   4. Schakel de verdoving uit, verwijder het dier uit het stereotactische frame en plaats het in zijn thuiskooi. Zorg ervoor dat de rat volledig wakker wordt.
   5. Spoel de spuit met 100% ethanol om het resterende lentivirus te deactiveren, gevolgd door gedestilleerd H₂O ter voorbereiding op de volgende injectie.
   6. Voer postoperatieve analgesie uit met meloxicam (1 mg/kg, p.o.) elke 24 uur gedurende 3 dagen en scoor de gezondheidsstatus van de dieren gedurende 1 week.
   7. Eenpersoonsdieren gedurende de eerste 24 uur na de operatie om te voorkomen dat anderen met de hechtingen knoeien. Zet ze daarna terug bij hun kooigenoten.

4. Doxycyclinebehandeling voor modelinductie

OPMERKING: Begin al 24 uur na de injectie met de modelinductie. Men kan ook langere perioden wachten tussen injectie en inductie van maximaal enkele maanden, bijvoorbeeld om grotere cohorten dieren tegelijkertijd te testen. Het is aangetoond dat dit geen invloed heeft op de functionaliteit van het virale construct.

1. Inductie van een manie-achtige episode
   1. Om een manie-achtig fenotype op te wekken, geeft u dieren 0,5 g/L doxycyclinehyclaat door het aan het drinkwater toe te voegen. Dit induceert virale transcriptie en de overexpressie van extra DRD1.
   2. Bereid het doxycyclinehoudende water elke 48 uur tot 72 uur vers, een tijdspanne waarin de stabiliteit van doxycycline niet wordt beïnvloed, zelfs niet in niet-ondoorzichtige waterflessen⁴¹.
      OPMERKING: Na behandeling met doxycycline gedurende zeven dagen zal de virusgemedieerde overexpressie zijn maximum hebben bereikt en kan men een gedragsonderzoek uitvoeren tijdens de manie-achtige episode.
2. Inductie van een depressieve episode
   1. Schakel de dieren terug naar normaal drinkwater om een depressieve episode op te wekken.
   2. Wacht 4 dagen totdat de virale transcriptie is gestopt en voer vervolgens een gedragsbeoordeling uit van de depressieve episode.
   3. Voer de volgende afleveringsinducties uit volgens hetzelfde patroon.

5. Gedragsbeoordeling

OPMERKING: Na modelinductie kan men bipolair gedrag beoordelen. Er zijn verschillende kaders voorgesteld voor de vertaling van klinische symptomen naar gedragspatronen die bij knaagdieren kunnen worden waargenomen. Een van de meest invloedrijke is onderzoeksdomein^{criterium 42}, waar veranderingen in domeinen van functioneren en gedrag, mogelijk beïnvloed bij psychiatrische stoornissen, worden onderzocht. Het is echter belangrijk op te merken dat vanwege de soortbarrière sommige symptomen, bijvoorbeeld suïcidaliteit, niet kunnen worden onderzocht bij knaagdieren⁴³. Vanwege hun geavanceerde cognitieve en emotionele capaciteiten hebben rattenmodellen een bijzonder sterk potentieel voor translationele symptoombeoordeling⁴⁴, waardoor uitgebreidere testprocedures mogelijk zijn. Overwegingen voor gedragsbeoordeling worden beschreven in Tabel 1.

1. Plan gedragsonderzoek als een reeks gedragstests⁴⁵, om een uitgebreid beeld te geven van het resulterende fenotype.
2. Besteed er als laatste aandacht aan om meer invasieve tests uit te voeren.
3. Houd rekening met gedragsveranderingen die mogelijk het gevolg zijn van eerdere testervaring bij het testen van één dier in beide ziekte-achtige episodes.
   OPMERKING: Afhankelijk van de vraag die voorhanden is, kan het nuttig zijn om verschillende groepen ratten te testen tijdens de manie- of de depressieve episode, waardoor ook weefselverzameling tijdens de respectieve episode mogelijk zou zijn. De ervaring heeft geleerd dat het testen van gedragsnaïeve dieren kan resulteren in een prominenter fenotype in bepaalde gedragstests.
4. Houd ook rekening met andere factoren, zoals de woonomstandigheden⁴⁶ of het geslacht van de experimentator⁴⁷.
5. Neem alle mogelijke maatregelen om onbedoelde stress bij de dieren te verminderen, niet alleen voor het dierenwelzijn, maar ook om mogelijke interacties van psychiatrische fenotypes met stress uit te sluiten⁴⁸.
6. Besteed speciale aandacht aan het circadiane ritme, aangezien verstoringen van het circadiane ritme een symptoom zijn van BD¹⁷. Aangezien ratten het meest actief zijn tijdens zonsondergang en zonsopgang, moet men testen onder zwak rood licht met dieren die zijn gehuisvest onder een omgekeerde licht-donkercyclus⁴⁹.
   OPMERKING: De meeste van de hier gepresenteerde representatieve resultaten zijn verzameld volgens deze benadering. Een ziekte-achtig fenotype is echter nog steeds waarneembaar als gedragsbeoordeling wordt uitgevoerd zonder de dag-nachtcyclus van de dieren om^{te schakelen 27}.
7. Registreer het experiment altijd vooraf en beschrijf en beschrijf volgens de PREPARE⁵⁰ en ARRIVE⁵¹ richtlijnen.

Results

Wanneer doxycycline aan het drinkwater van de dieren wordt toegevoegd, wordt extra DRD1 tot expressie gebracht en na 7 dagen zal er voldoende overexpressie zijn om het dier te testen op manie-achtig gedrag. Tot nu toe is een toename van beloningsgerelateerd gedrag aangetoond. Mania-achtige dieren drinken meer sacharose-oplossing in vergelijking met water in een keuzetest met twee flessen in vergelijking met controles²⁵. Wanneer ze in een observatiebox met een ontvankelijk vrouwtje worden geplaatst en gedurende 25 minuten worden geobserveerd, vertonen manie-achtige dieren meer seksuele rijdieren in vergelijking met controles²⁷ (Figuur 1A). In een paradigma van zelftoediening van cocaïne dienen ze meer cocaïne toe volgens een schema met een vaste verhouding en vertonen ze een hoger breekpunt in een schema met progressieve verhoudingen. Hun dosis-responscurve is verschoven naar een hogere gevoeligheid voor lage doses²⁵. Deze verschuiving in gevoeligheid wordt ook waargenomen in verhoogde motivationele salience in verschillende conditioneringsparadigma's. Mania-achtige dieren brachten meer tijd door in de geconditioneerde zijkanten voor nicotine, alcohol en cocaïne in vergelijking met controles²⁵. Er werd ook een toename gevonden van het zoeken naar nieuwigheden en meer impulsieve keuzes in een op T-doze gebaseerde test met uitgestelde kortingen:²⁵. In een operante rattenversie van de Iowa Gambling Task beslissen manie-achtige dieren vaker voor de nadelige (hoog risico, hoge winst) keuzes in vergelijking met controles²⁴ (Figuur 1B). Angst bij manie-achtige dieren wordt verminderd, zoals blijkt uit meer tijd doorgebracht op de open armen in het verhoogde plus doolhof²⁵.

Een depressief-achtig fenotype kan worden geïnduceerd door het beëindigen van DRD1-overexpressie. In de depressieve episode kon een toename van hulpeloosheid worden waargenomen. In een triadisch paradigma van hulpeloosheid waren de groep die voor het eerst een elektrische schok kreeg (Figuur 1C), evenals de groep die had geleerd de schok te beheersen, hulpelozer met verhoogde ontsnappingslatenties in vergelijking met hun respectievelijke controles²⁷. De groepen waarin hulpeloosheid werd opgewekt, vertoonden geen verschillen tussen het proef- en het controledier. Anhedonie werd gevonden in de tweeflesjestest voor sucrose²⁷ en in seksueel gedrag (niet-gepubliceerde gegevens). In de marmerbegraaftest waren depressieve dieren ook angstiger²⁶ (Figuur 1D).

Het beschreven diermodel biedt niet alleen de mogelijkheid om manie- of depressief gedrag te onderzoeken, maar het biedt ook een unieke mogelijkheid om een verandering in gedrag waar te nemen bij het beëindigen van de DRD1-overexpressie, die lijkt op de overgang van manie naar depressie bij patiënten. Hier is het belangrijk om gewenning aan bepaald gedrag in gedachten te houden en tests te kiezen met minimale gewenning. Bijvoorbeeld, verhoogd seksueel gedrag in de manie-achtige episode en in de depressieve-achtige episode, werd een vermindering van dergelijk gedrag tot niveaus zoals gezien bij controledieren getoond. In dit experiment werden drie manie-/depressieve-achtige cycli geïnduceerd binnen hetzelfde dier²⁷. Voor het drinken van sucrose werd de voorkeur voor de sucrose-oplossing in de manie-achtige toestand niet alleen teruggebracht tot controleniveaus wanneer overgeschakeld naar de depressieve toestand, maar afgenomen met²⁷. In de rattenversie van de Iowa-goktaak was het aantal nadelige keuzes verhoogd bij manie-achtige dieren, maar niet significant verschillend van controles wanneer de dieren zich in de depressieve toestand bevonden. In de laatste staat was het aantal in totaal verdiende pellets verminderd in vergelijking met controledieren²⁴.

Over het algemeen vertonen dieren een robuust bipolair-achtig fenotype, waarneembaar in verschillende gedragsdomeinen tijdens beide episodes. De omschakeling tussen afleveringen in dit model draagt bij aan een betere gezichtsvaliditeit. Een overzicht van de getroffen gedragsdomeinen wordt gegeven in Figuur 2.

Figuur 1: Gedragsveranderingen in manie- en depressie-achtige toestanden na virale DRD1-overexpressie. Tijdens de virale DRD1-overexpressie, in de manie-achtige toestand, vertonen dieren meer seksuele mounts (A) en een toename van risicovolle keuzes in de Iowa Gambling Task (B) in vergelijking met controles. Na het beëindigen van de overexpressie schakelen dieren over naar een depressieve toestand. Ze vertonen een toename van hulpeloosheid (C) en angst (D). *P < 0,05; **p < 0,01; Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Gedragsfenotype van het model. In de manie-achtige episode is er een toename van beloningsgerelateerd gedrag (bijv. seksueel gedrag), impulsiviteit en het nemen van risico's. Angst werd verminderd in de verhoogde plus doolhoftest. Tijdens de depressieve episode werd de angst verhoogd in de marmerbegraaftest, werd seksueel gedrag verminderd en vertoonden dieren meer hulpeloosheid. De afbeelding van de rat in de figuur is afkomstig van Servier Medical Art en is gelicenseerd onder CC BY 4.0. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Overwegingen voor gedragsbeoordeling. De tabel belicht belangrijke overwegingen voor de belangrijkste experimentele stappen tijdens gedragsassessment. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Hier wordt een nieuw rattenmodel voor BD met verhoogde gezichtsvaliditeit gepresenteerd. Een gerichte manipulatie van DRD1 in de mPFC maakt de inductie van een manie- en depressief-achtig fenotype in hetzelfde dier mogelijk. Representatieve resultaten benadrukken een waarneembaar ziekte-achtig fenotype in beide episodes. Het model is relatief eenvoudig aan te brengen. Er zijn twee induceerbare lentivirale vectoren nodig die DRD1 of dsRed tot expressie brengen als controle. Voor de productie en het gebruik van lentivirale systemen bij dieren zijn bepaalde veiligheidsniveaus vereist, die van kracht moeten zijn. Als de benodigde apparatuur voor de productie van virussen niet beschikbaar is, zijn de ervaringen met het werken met kernfaciliteiten positief.

De meest cruciale stap voor het genereren van het model is de stereotactische injectie van het lentivirale systeem. Stereotactische operaties zijn gevestigde procedures in de neurowetenschappen en de slagingspercentages onder getrainde onderzoekers zijn hoog. Er zijn twee belangrijke mogelijke bronnen van fouten. Problemen met anesthesie kunnen leiden tot dodelijke slachtoffers tijdens de chirurgische ingreep. Hier is het gebruik van isofluraan-inhalatie-anesthesie, zoals beschreven in het protocol, de beste aanpak gebleken, aangezien gemakkelijk instelbare medicijnniveaus een duidelijk voordeel vormen in vergelijking met injectie-anesthesie. Aangezien isofluraan geen pijnstillende effecten heeft en meningeale nociceptoren gevoelig zijn voor stimulatie⁵², wordt aanbevolen om een opioïde te gebruiken voor intraoperatieve analgesie. In combinatie met de juiste postoperatieve medicatie, zoals beschreven in het protocol, zijn er geen waarneembare tekenen van postoperatieve pijn. Mogelijke invloeden op onderzoeksvragen, bijvoorbeeld met betrekking tot interacties van dopamine met het opioïde systeem, moeten echter altijd in overweging worden genomen en dienovereenkomstig moet een geschikt medicatieregime worden gekozen⁵³. Als de operatie onder aseptische omstandigheden wordt uitgevoerd, is het optreden van infecties of verslechtering van de wondgenezing zeldzaam. Als er problemen optreden tijdens de operatie of het herstel, moet het oplossen van problemen gericht zijn op de correcte uitvoering van het beschreven protocol. Het waarborgen van aseptische werkomstandigheden en een nauwkeurige dosering van medicatie zijn essentieel. Toediening van vloeistof of glucoseoplossingen kan bovendien het herstel bevorderen. Als er infecties optreden, mag de behandeling geen tetracyclines bevatten, omdat deze een wisselwerking hebben met de transcriptie van de virale systemen. Eerstelijnsbehandeling voor postoperatieve wondinfecties is enrofloxacine, eventueel in combinatie met carprofen.

Een andere mogelijke bron van fouten tijdens de operatie is de plaatsing van de injectie buiten het doelgebied. Dit gebeurt echter zelden wanneer het protocol correct wordt gevolgd en de juiste positionering van de kop van het dier is gegarandeerd. Succesvolle plaatsing moet altijd worden geverifieerd. Hoewel plaatsing van het virus dat dsRed tot expressie brengt gemakkelijk detecteerbaar is bij controledieren, vereist plaatsingsverificatie van virussen die DRD1 tot expressie brengen extra stappen. Het uitvoeren van antilichaamkleuring tegen verschillende delen van het virale construct leverde geen bevredigende resultaten op. Het wordt aanbevolen om de plaatsing van het virus te verifiëren door de mPFC te ontleden en een PCR uit te voeren om rtTA3-transcripten te detecteren zoals beschreven in Beyer et ^al.24. Het is ook belangrijk op te merken dat de injectie van het virus bilateraal moet zijn met gelijke hoeveelheden virus. Het is aangetoond dat cerebrale en gedragslateralisatie verschillen bij patiënten met een bipolaire stoornis^54,55, en unilaterale virale injecties veroorzaken mogelijk niet het gewenste gedragsfenotype.

Inductie van virale DRD1-expressie en de manie-achtige episode door toevoeging van doxycycline aan het drinkwater werkt heel goed. Het is bewezen dat het vervangen van normaal drinkwater door doxycycline geen duidelijke veranderingen in het drinkgedrag veroorzaakt. Het vloeistofverbruik moet echter worden gecontroleerd. Modulaties zijn mogelijk als andere stoffen, bijvoorbeeld medicijnen, bedoeld zijn om via het drinkwater te worden toegediend. Toediening van doxycycline kan ook worden uitgevoerd via voedselpellets. Maar dit is nog niet gevalideerd.

Voor gedragsonderzoek worden in tabel 1 verschillende overwegingen vermeld. Vooral modelspecifieke eisen moeten worden geëvalueerd bij het plannen van een experiment. Er moet bijvoorbeeld worden besloten of twee groepen dieren worden getest, of dat één dier tijdens beide episodes een gedragsbeoordeling zal ondergaan, waarvoor mogelijk opnieuw moet worden getest. Als het bipolaire fenotype niet detecteerbaar is tijdens het gedragsonderzoek, hoewel plaatsing kan worden geverifieerd, kan het oplossen van problemen zich richten op verschillende factoren die mogelijk van invloed zijn op de gedragsuitkomst. Veranderingen in experimentatoren of het circadiane ritme moeten tijdens het proces kritisch worden geëvalueerd, aangezien stressvolle omstandigheden in de omgeving de gedragsresultaten kunnen beïnvloeden.

Hoewel het model een goede construct- en gezichtsvaliditeit vertoont, moet de voorspellende validiteit nog worden geëvalueerd. Chronische toediening van lithium, als de eerstelijnsbehandeling van BD⁵⁶, zou succesvol moeten zijn in het voorkomen van door het model geïnduceerde gedragsveranderingen. Reacties op andere medicijnen die bij BD worden gebruikt, zoals antipsychotica of anticonvulsiva, kunnen worden onderzocht om de voorspellende validiteit van het model volledig te testen.

Bovendien is een huidige beperking dat de validiteit van het model bij vrouwelijke dieren nog moet worden beoordeeld in toekomstige studies. Hoewel er een trend is om vrouwelijke dieren op te nemen in preklinisch onderzoek, wordt dit vaak nog verwaarloosd. Voor het gepresenteerde model zijn interacties van het dopaminesysteem met de oestrische cyclus te verwachten. Het is echter onduidelijk in welke mate ze zullen voorkomen. Het is ook belangrijk om rekening te houden met de algemene beperkingen van psychiatrische diermodellen. Hoewel de mogelijkheid om beide ziekte-achtige episodes bij één rat te induceren een verhoogde gezichtsvaliditeit biedt, verschillen extern geïnduceerde veranderingen nog steeds van spontaan optreden en cycli van ziekte-episodes bij patiënten met BD. Aangezien het model uitsluitend gebaseerd is op gerichte manipulatie van het dopaminesysteem, zullen belangrijke effecten worden veroorzaakt door veranderingen in de dopaminetransmissie en gerelateerde secundaire effecten. Bijdragen van andere systemen aan de symptomologie van BD worden daarom niet verantwoord.

Concluderend kan worden gesteld dat het gepresenteerde model een sterk potentieel heeft voor het onderzoeken van BD, aangezien beide ziekte-episodes in één enkel dier kunnen worden bestudeerd. Dit biedt unieke mogelijkheden voor het onderzoeken van overgangen tussen episodes in vergelijking met de meeste gevestigde modellen. Het gepresenteerde protocol vereist apparatuur en technische vaardigheden die beschikbaar zijn in de meeste preklinische onderzoekslaboratoria, waardoor het breed toepasbaar is. Tot nu toe is het resulterende gedragsfenotype robuust geweest voor verschillende gedragingen. Andere domeinen zoals sociaal gedrag⁵⁷ of cognitieve functies moeten nog worden verkend. Hoewel het gepresenteerde protocol zich richtte op gedragsresultaten, zijn er verschillende mogelijkheden voor toekomstige toepassingen om moleculaire mechanismen verder te onderzoeken. Uitbreiding van het onderzoek om de onderliggende mechanismen in de pathogenese van BD te begrijpen, vooral met betrekking tot de overgang tussen episodes, kan leiden tot de identificatie van therapeutische doelwitten die uiteindelijk kunnen worden vertaald naar toekomstige klinische toepassingen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 mm burr	FST	19007-09	Burr for craniotomy
10 µl Neuros Syringe	Hamilton	65460-06	Mounted to syringe pump for injection
1ml single use Syringes	Braum	9166017V	Administration of medication
33 G Needles	Hamilton	65461-02	Replacement needles for neuros syringe
4-way valve	UNO	180000259	For simultaneous connection of induction chamber and face mask
Absorbent Drape	Sabanindas	1834014	Covering equipment before placing the animal
Anaesthetic Gas Filter	UNO	180000140	Anesthesia fume collection
Anasthesia mask for stereotactic	Hugo Sachs Electronic	73-4922	Administering anesthesia during surgery
Anesthesia vaporiser	UNO	180000002	Provide and adjust levels of vaporised isoflurane
Bone wax	SMI	Z046	Closing the hole in the skull
Bulldog clamps	FST	18038-45	To retain skin and allow access to the surgical field
Buprenorphine	Elanco	18760711	Interoperative analgesia
Cannula	Tegler	T138339	Administration of medication
Cellulose swabs	Meditrade	1177	Cleaning Skin
Connector	UNO	180000005	Connecting anesthesia tubing to face mask
Control Unit for heating pad	UNO	180000122	Controlling heating pad
Dental Dril	Saeyang	SMT K-38	Dental drill for craniotomy; equipable with fine dental burrs
Desktop digital stereotaxic instrument	RWD	E03135-002	Fully equipped stereotactic frame with digital manipulator
Destilled H2O	-	-	Rinsing the syringe
Doxycycline hyclate	Sigma aldrich	D9891	For model induction
Dry ice	-	-	Transporting viral suspension
Earbars	RWD	68302	Head fixation in the stereotactic frame
Ethanol	-	-	Rinsing the syringe and deactivating virus
Flowmeter	UNO	CM2	Verify and adjust flow rate
Forceps - anatomical	FST	11000-12	Holding skin
Forceps - surgical	FST	11027-12	Holding skin
Heating pad	UNO	180000028	Heating pad for keeping the animal warm during surgery
Induction chamber	UNO	180000233	Chamber for initial induction of anesthesia
Isoflurane	CP Pharma	V7005232.00.00	Anesthesia
Lentiviral suspension	-	-	Lentiviral construct coding for DRD1 or dsRed for model induction
Lidocaine	Combustin	8780701	Local analgesia
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	7578423	Pre- and postoperative analgesia
Needle holder	FST	91201-13	Sutering
Oxygen concentrator	UNO	180000399	Providing oxygen for anesthesia
PE Tubing	-	-	Connecting components of the anesthesia machine to induction chamber & face mask
Pencil	-	-	Marking the correct side for craniotomy
Scalpel blade holder	FST	10003-12	To hold scalpel blade
Scapel blades	FST	10011-00	Fine surgical blade for incision
Scavenger Unit	UNO	180000260	Controlling capacity of fume collector
Skin disinfectant	Bode	975042	Disinfacting skin before incision
Sterile cotton swabs	Boettger	1102241	Cleaning surgical field
Sterile eye cream	Bayer	1578675	Protect eyes during surgery
Surgical Scissors	FST	14000-12	Trimming fur and cutting suture material
Suture 3-0 polyglycolic acid	SMI	11201519	Suturing skin
Syringe pump	KdScientific	788130	Syring pump with connectable holder