Methodenartikel

Isolatie en flowcytometrische beoordeling van neuro-immuuninteracties in een mini-beroerte muizenmodel

DOI:

10.3791/68308

⸱

20 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om de immuuncelfunctie na een ischemische beroerte te beoordelen met behulp van flowcytometrische analyse in een mini-beroertemodel. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek van neuro-immuuninteracties mogelijk en kan worden aangepast voor het bestuderen van andere neurodegeneratieve ziekten, waardoor ons begrip van immuunresponsen bij beroertepathologie wordt vergroot.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beroerte is wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak en langdurige invaliditeit, waarbij ischemische beroerte de meerderheid van de gevallen vertegenwoordigt. Na een ischemische beroerte worden residente en infiltrerende immuuncellen geactiveerd, wat bijdraagt aan verdere neuronale schade. De rol van het immuunsysteem in de pathologie van ischemische beroerte wordt echter niet volledig begrepen, grotendeels als gevolg van de complexe en dynamische regulatie van immuunresponsen als reactie op veranderingen in de micro-omgeving tijdens neuro-inflammatie. Daarom is het essentieel om de activering van residente en infiltrerende immuuncellen in de loop van de tijd na een ischemische beroerte te monitoren en te analyseren. In deze studie presenteren we een protocol voor het beoordelen van de functie van deze immuuncellen na een ischemische beroerte met behulp van flowcytometrische analyse in een mini-beroertemodel. We microdisseceren het infarct-hersenweefsel op specifieke tijdstippen en dissociëren het vervolgens tot een eencellige suspensie met behulp van zowel mechanische als enzymatische methoden. De cellen worden door een celzeef van 70 μm geleid en gelabeld met fluorescerend gelabelde antilichaamcocktails voordat ze worden gekwantificeerd door middel van flowcytometrische analyse. Hoewel deze test speciaal is ontwikkeld om neuro-immuuninteracties na een ischemische beroerte te onderzoeken, kan deze ook gemakkelijk worden aangepast om neuro-immuunmechanismen te bestuderen bij andere neurodegeneratieve ziekten, zoals multiple sclerose, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beroerte is wereldwijd een overheersende doodsoorzaak en langdurige invaliditeit, waarbij ischemische beroerte de overgrote meerderheid van de gevallen uitmaakt 1,2,3. Het algemene doel van deze methode is om ons begrip van de neuro-immuuninteracties die optreden na een ischemische beroerte te vergroten door een verfijnde benadering te bieden voor het beoordelen van de activering van zowel residente als infiltrerende immuuncellen in een mini-beroerte muizenmodel 4,5. Het ingewikkelde samenspel tussen deze immuuncellen en de neuronale micro-omgeving is cruciaal voor het begrijpen van de pathofysiologie van ischemische beroerte. De precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan deze neuro-immuuninteracties blijven echter slecht opgehelderd, voornamelijk vanwege de dynamische en veelzijdige aard van immuunresponsen veroorzaakt door neuro-inflammatie6. Deze techniek heeft tot doel de complexe dynamiek van immuunresponsen in de context van neuro-inflammatie en hun daaropvolgende impact op neuronale schade en herstelresultaten op te helderen.

De grondgedachte achter de ontwikkeling van deze techniek komt voort uit de cruciale rol die immuuncellen spelen bij het verergeren van neuronale schade en het beïnvloeden van herstel na een ischemische gebeurtenis. Traditionele methoden om deze interacties te bestuderen missen vaak de resolutie die nodig is om de temporele en ruimtelijke nuances van immuuncelactivering vast te leggen. Door gebruik te maken van flowcytometrische analyse op eencellige suspensies afgeleid van microdissected herseninfarct, biedt dit protocol een meer gedetailleerde en dynamische beoordeling van immuuncelprofielen in de loop van de tijd 7,8. Deze benadering maakt de identificatie mogelijk van specifieke immuuncelpopulaties en hun functionele toestanden, die cruciaal zijn voor het begrijpen van de pathofysiologie van ischemische beroerte.

Vergeleken met alternatieve technieken zoals histologische kleuring of bulk-RNA-sequencing, die beperkte inzichten kunnen verschaffen in de individuele bijdragen van immuunceltypen, biedt deze flowcytometrische methode verschillende voordelen. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat flowcytometrie een high-throughput-analyse van meerdere markers tegelijk mogelijk maakt, waardoor een uitgebreidere karakterisering van fenotypes en functies van immuuncellen mogelijk wordt 9,10,11,12,13. Bovendien toont het vermogen van deze methode om zich aan te passen aan een verscheidenheid aan neurodegeneratieve aandoeningen - zoals multiple sclerose, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer - de veelzijdigheid en relevantie ervan aan in de bredere literatuur over neuro-immuuninteracties.

Voor onderzoekers die de toepassing van deze methode overwegen, is het essentieel om de specifieke doelen van hun onderzoek te evalueren. Deze techniek is met name geschikt voor onderzoeken die een gedetailleerde temporele analyse van immuunresponsen vereisen in de context van ischemische beroerte of gerelateerde neurodegeneratieve ziekten. Het wordt aanbevolen dat gebruikers een fundamenteel begrip van flowcytometrie en ervaring met muizenmodellen hebben om dit protocol effectief te implementeren en de resulterende gegevens te interpreteren. Door een robuust kader te bieden voor het bestuderen van neuro-immuuninteracties, draagt deze methode aanzienlijk bij aan de voortdurende inspanningen om de complexiteit van immuunbetrokkenheid bij beroertepathologie af te bakenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University. We raden aan om alle oplossingen steriel te filteren en om alle gebruikte buisjes steriel te maken.

1. Voorbereiding van reagentia en buffer

  1. Spijsverteringsenzymmix: Los collagenase IV op om een concentratie van 0,25% te verkrijgen en verdun DNase I om een eindconcentratie van 2 E/ml te bereiken.
  2. Magnetische geactiveerde celsortering (MACS) buffer: Los runderserumalbumine (BSA) en ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) op om concentraties van respectievelijk 0,5% en 2 mM te bereiken in 1x PBS.

2. Focale ischemische slagmodel

OPMERKING: C57BL/6 J-muizen (8-10 weken oud) werden gebruikt om een focaal ischemisch slagmodel op te stellen, zoals eerder beschreven14. Muizen kunnen als alternatief worden verdoofd met een oplossing van 1,25% avertin in een dosering van 0,2 ml per 10 g lichaamsgewicht.

  1. Verdoof de muizen met 3% isofluraan, waarbij een dosering van 1,5% wordt aangehouden met een gasanesthesieapparaat. Houd de lichaamstemperatuur gedurende de hele procedure op 37 °C met behulp van een verwarmingskussen.
    OPMERKING: Deze studie benadrukt het belang van het verifiëren van het bereiken van het chirurgische vlak voorafgaand aan de start van de procedure. Deze stap is cruciaal om een optimale toegang tot het beoogde gebied te garanderen en mogelijke complicaties tijdens de operatie tot een minimum te beperken.
  2. Trim de vacht in het gebied tussen het rechteroog en het rechteroor met een elektrisch scheerapparaat. Maak een verticale incisie in het aangewezen gebied naast de ogen onder een dissectiemicroscoop.
  3. Scheid voorzichtig alle weefsels om de schedel bloot te leggen en identificeer de distale tak van de rechter middelste hersenslagader (MCA), gekenmerkt door een verticale "Y"-vormige vasculaire structuur. Gebruik een elektrische boor om de schedel binnen te dringen en zorg ervoor dat u deze voorzichtig verwijdert.
  4. Snijd de hersenvliezen voorzichtig weg met een microtang.
  5. Leg de distale tak van de rechter middelste hersenslagader (MCA) bloot en voer vervolgens een permanente ligatie uit van de distale tak van de rechter MCA met behulp van een 10-0 hechtdraad.
  6. Verplaats het weefsel naar zijn oorspronkelijke staat en sluit de incisie in de gezichtshuid met weefsellijm.
  7. Plaats de muis in rugligging en trim de vacht in de nek met een elektrisch scheerapparaat.
  8. Maak een horizontale incisie in het nekgebied en trek de submandibulaire klieren voorzichtig uit elkaar.
  9. Ontleed de halsslagaderschede zorgvuldig met een microtang, identificeer de gemeenschappelijke halsslagader en scheid deze van de nervus vagus.
  10. Rijg een 4-0 hechting door de gemeenschappelijke halsslagader en zet deze vast met een schuifknoop.
  11. Herhaal stap 10 op de contralaterale gemeenschappelijke halsslagader. Sluit de bilaterale gemeenschappelijke halsslagaders (CCA's) tijdelijk af gedurende 7 minuten.
  12. Plaats het weefsel van de submandibulaire klier terug naar zijn oorspronkelijke positie en sluit de incisie in de nek met weefsellijm.
    OPMERKING: De schijnoperatiegroep onderging procedures die identiek waren aan die van de beroertegroep, met als enige uitzondering dat de distale MCA en CCA niet-geligeerd bleven.
  13. Bewaak de muis tijdens en na de chirurgische ingreep, inclusief de ademhaling en lichaamstemperatuur. Houd de muis op een warmhoudkussen totdat hij helemaal wakker is.

3. Hersenperfusie en -dissectie

  1. Maak een spuit van 50 ml klaar en bevestig een naald van 26 G aan het uiteinde. Vul de spuit met een zoutoplossing.
  2. Dien een dubbele dosis van 1,25% avertin toe om diepe anesthesie bij de muis te bereiken.
    OPMERKING: Er moet grondig worden bevestigd dat de muis volledig verdoofd is voordat u doorgaat naar de volgende stap.
  3. Plaats de muis in rugligging op een schuimrubberen plank, strek zijn voor- en achterpoten uit en zet ze op hun plaats met naalden van 26 G.
  4. Zodra de muis grondig is verdoofd, pakt u de buikhuid vast met een oogheelkundige tang en maakt u een zijdelingse incisie om de lever te onthullen. Ga verder met het snijden langs beide zijden van de ribben om het hart bloot te leggen.
  5. Steek de naald van 26 G in de linkerventrikel en snijd de oorschelp door, druk vervolgens de spuit in om het bloed eruit te laten stromen.
  6. Ga door met het perfusieproces totdat het bloed dat uit de oorschelp stroomt helder lijkt.
  7. Onthoofd de muis net boven het ruggenmerg met een rechte chirurgische schaar.
  8. Maak een achterste-anterieure incisie in de huid van het hoofd om de schedel bloot te leggen. Maak twee laterale incisies op de kruising van de laterale wanden en de basis van de schedel.
  9. Snijd door de schedel langs de sagittale hechting en maak een incisie tussen de oogkassen.
  10. Gebruik een tang om de schedel die elk halfrond bedekt te verwijderen, waardoor de hersenen worden blootgesteld, en breng deze over naar een stalen hersenmatrix van muizen. Verdeel vervolgens de hersenen in opeenvolgende kronische plakjes van 2 mm dik.

4. Vertering van corticaal weefsel tot eencellige suspensie en antilichaamkleuring voor flowcytometrie

  1. Breng 500 μL spijsverteringsenzymmengsel in elk putje van een plaat met 12 putjes.
  2. Scheid het infarctweefsel voorzichtig en breng het met behulp van een microtang over in de spijsverteringsenzymmix (Figuur 1).
  3. Fragmenteer het weefsel minutieus in de kleinst mogelijke stukjes met een oftalmische schaar en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
  4. Gebruik een P1000-pipet, aspireer en doseer de oplossing 10 keer om het weefsel in individuele cellen te dissociëren en leid de oplossing vervolgens door een celzeef van 70 μm. Spoel zowel de plaat met 12 putjes als de celzeef continu af met ijskoude HBSS met calcium en magnesium.
  5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C en gooi het bovenstaande dan voorzichtig weg.
    OPMERKING: Aangezien de geproduceerde pellets vrij los zitten en gemakkelijk losraken, dient u ze niet te verstoren om celverlies te voorkomen.
  6. Resuspendeer de pellet in 1 ml 1x PBS en herhaal stap 5. Resuspendeer vervolgens de pellet in 150 μL 1x PBS en breng de suspensie over in een plaat met 96 putjes met een ronde bodem. Centrifugeer vervolgens opnieuw bij 500 × g bij 4 °C gedurende 5 min.
  7. Pak de plaat met 96 putjes stevig vast en keer deze snel om om de supernatant weg te gooien.
  8. Verdun de fluorescentiekleurstof voor de levensvatbaarheid van de cellen in een verhouding van 1:100 in 1x PBS en suspendeer de pellet vervolgens opnieuw in een aliquot van 150 μl. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT), afgeschermd van licht.
  9. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg. Verdun de antilichaamcocktail op het celoppervlak in de MACS-buffer. Voeg zonder de cellen te wassen de antilichaamcocktail van het celoppervlak toe en incubeer nog 15-20 minuten bij 4 °C.
  10. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de pellet in 150 μl MACS-buffer.
  11. Herhaal stap 4.10 en breng de suspensie over in centrifugebuisjes van 1,5 ml of 5 ml reageerbuisjes van polystyreen met ronde bodem.

5. Analyse en sortering van flowcytometrie

  1. Ontwerp een meerkleurig flowcytometriepaneel volgens de instrumentconfiguratie, met behulp van handmatige technieken of een online ontwerptool, om de selectie van fluoroforen geconjugeerd aan antilichamen te optimaliseren en spectrale overlap te minimaliseren.
    OPMERKING: Bij het ontwerpen van een meerkleurig flowcytometriepaneel moet rekening worden gehouden met verschillende cruciale overwegingen. Ten eerste is het essentieel om zich voor aanvang vertrouwd te maken met de configuratie van het gebruikte instrument, inclusief de lasers en filters. Ten tweede, gebruik heldere fluorofoorlabels op antilichamen voor antigenen met een lage abundantie, terwijl u kiest voor zwakke fluorofoorlabels op antilichamen die gericht zijn op sterk tot expressie gebrachte antigenen. Ten slotte is het absoluut noodzakelijk om een kleurstof voor de levensvatbaarheid van cellen in het paneel op te nemen om niet-levensvatbare cellen en puin effectief uit de gegevens te weren. Met name om te zorgen voor een passende gating van lage abundantie of slecht gekarakteriseerde antigenen, moeten fluorescentie minus één (FMO) -controles worden gebruikt15. FMO-controles omvatten alle afstammingsmarkers behalve de markers die van belang zijn, waardoor een nauwkeurige afbakening tussen positief en negatief gekleurde cellen16 mogelijk wordt.
  2. Pas de instellingen van de detectoren voor voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) aan om ervoor te zorgen dat de cellen van belang op de juiste manier op de schaal worden weergegeven en naar wens kunnen worden afgeschermd.
  3. Nauwkeurig afstellen van FSC en SSC om vuil of extern geluid te elimineren. Onderscheid doubletten van enkele cellen binnen een puntdiagram dat zowel de oppervlakte als de hoogte van FSC illustreert. Isoleer levensvatbare cellen op basis van het fluorescentie-kleurstof-negatieve signaal van de cellevensvatbaarheid.
    OPMERKING: De instellingen voor verschillende instrumenten kunnen kleine variaties vertonen. Sommige celsorteerders gebruiken bijvoorbeeld de breedte en hoogte van FSC om doubletten te onderscheiden van enkele cellen, terwijl andere de oppervlakte en hoogte van FSC voor hetzelfde doel gebruiken.
  4. Pas de compensatie voor elk kanaal aan.
    OPMERKING: Zowel cellulaire monsters als in de handel verkrijgbare compensatiekorrels kunnen worden gebruikt voor fluorescerende spillovercompensatie.
    1. Vergelijk de autofluorescentieregeling (niet-gekleurde cellen) met de positieve controles voor gekleurde cellen om ervoor te zorgen dat de gekleurde cellen voor elke parameter op de juiste manier worden geschaald. Verfijn bovendien de compensatie door meerkleurige celmonsters te analyseren, 2-kleuren puntplots te bewaken en compensatie-instellingen naar boven of naar beneden aan te passen om ervoor te zorgen dat de celpopulaties verticaal of horizontaal met elkaar zijn uitgelijnd.
    2. Gebruik CD45- en CD11b-signalen om onderscheid te maken tussen lymfocyten (CD11b-CD45hoog), microglia (CD11b+CD45int), myeloïde cellen (CD11b+CD45hoog) en astrocyten (CD11b-CD45-GLAST+)17,18.
    3. Gebruik nep-hersenweefsel als een auto-fluorescentiecontrole en een referentie voor onderscheidende lymfocyten. Als een specifiek doelwit wordt onderzocht, gebruik dan een FMO-controle met hersenweefsel na een beroerte.
  5. Begin met het verzamelen van controle- en voorbeeldgegevens en zorg ervoor dat deze worden opgeslagen.
    OPMERKING: Aangezien het hier beschreven mini-beroertemodel resulteert in een klein infarct, worden er doorgaans minder cellen verzameld dan het middelste cerebrale arterie-occlusie (MCAO)-model. Over het algemeen levert het verzamelen van 5 × 105 cellen respectievelijk ongeveer 5 × 103 microglia en 1 × 105 astrocyten op.
  6. Selecteer en sorteer de gewenste celpopulaties in 5 ml polystyreen reageerbuisjes met ronde bodem of conische centrifugebuisjes van 15 ml.
    OPMERKING: Voeg 500 μL PBS toe en spoel de tube zorgvuldig om de levensvatbaarheid van de cellen te garanderen en te helpen bij de vorming van de celpellet.

6. Analyse van genexpressie in geselecteerde celpopulaties

OPMERKING: Totale RNA-extractie kan ook worden uitgevoerd met behulp van commerciële kits volgens de richtlijnen van de fabrikant.

  1. Centrifugeer de cellen uit stap 5.6 bij 500 ×g bij 4 °C gedurende 3 minuten en gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de cellen in 1 ml TRIzol-reagens.
    LET OP: Het aantal gesorteerde cellen is aanzienlijk lager in vergelijking met gekweekte cellen of weefsel. Bijgevolg kan een hogere centrifugatiesnelheid helpen bij het vormen van een compactere celpellet. De cellen die uit deze stap worden verkregen, kunnen worden gebruikt voor volgende toepassingen, zoals celkweek- of single-cell RNA-sequencing-pijplijnen.
  2. Laat het monster 5 minuten op RT staan om de dissociatie van nucleoproteïnecomplexen te vergemakkelijken.
  3. Voeg 0,2 ml chloroform toe aan het monster en zet de buis vast. Schud de buizen krachtig gedurende 15 s en incubeer vervolgens gedurende 2 minuten bij RT.
  4. Centrifugeer de monsters gedurende 15 minuten bij 10.000 g bij 4 °C. Het RNA blijft uitsluitend in de bovenste waterige fase.
  5. Breng de bovenste waterige fase voorzichtig over naar een schone buis en zorg ervoor dat u de interface niet verstoort.
    OPMERKING: Het volume van de waterige fase moet ongeveer 500 μL zijn.
  6. Sla het RNA uit de waterige fase neer door 0,5 ml isopropanol in te brengen en voorzichtig te mengen door de buis meerdere keren om te keren. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij RT.
  7. Centrifugeer de monsters bij 10.000 g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het RNA te verzamelen.
  8. Decanteer het bovenstaande en verwijder de resterende vloeistof grondig door aspiratie.
  9. Was de RNA-pellet één keer met 75% ethanol en voeg minimaal 1 ml 75% ethanol toe. Meng het monster grondig en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 7500 × g bij 4 °C.
  10. Elimineer alle sporen van ethanol. Laat de RNA-pellet 5 minuten aan de lucht drogen.
  11. Los het RNA op in 10 μL RNasevrij water door op en neer te pipetteren.
  12. Ga verder met het uitvoeren van real-time PCR volgens de instructies van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie presenteren we een verfijnd protocol voor het evalueren van de functionaliteit van immuuncellen na een ischemische beroerte, waarbij gebruik wordt gemaakt van flowcytometrische analyse binnen een mini-beroertemodel. De mini-beroerte werd veroorzaakt door de permanente ligatie van de distale tak van de rechter middelste hersenslagader (MCA), gevolgd door een occlusie van 7 minuten van de bilaterale gemeenschappelijke halsslagaders (CCA's). Deze methodologie levert een milde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie presenteren we een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van de functie van immuuncellen na een ischemische beroerte, met behulp van flowcytometrische analyse in een mini-beroertemodel. De kritieke stappen van dit protocol omvatten het tot stand brengen van een focale ischemische beroerte via de permanente ligatie van de distale tak van de rechter middelste hersenslagader (MCA) naast een zeven minuten durende occlusie van de bilaterale gemeenschappelijke halsslagaders...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 82201622) en de Natural Science Foundation of Inner Mongolia (nr. 2020MS03017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL Microcentrifuge TubeNEST 615601Lab materiaal
1× PBSCorning21-040-CMReagens
96-well Clear Round Bottom TC-treated MicroplateCorning3799Lab materiaal
APC anti-mouse CD19Biolegend152410Antilichaam
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45Biolegend103116Antilichaam
Avertin (1.25%)Nanjing Aibei Biotechnology M2920Reagens
BD FACSAria IIBD642510Apparatuur
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD4Biolegend100437Antilichaam
Brilliant Violet 605 anti-mouse / human CD11bBiolegend101237Antilichaam
BSASigma-AldrichA1933-1GChemisch
Collagenase IVSigma-AldrichC4-28-100MGEnzym
DNase INew England BiolabsM0303LEnzym
EDTASigma-AldrichEDS-100GChemisch
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test TubesCorning352052Lab materiaal
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesCorning352095Lab materiaal
FlowJo V10BDSoftware
GLAST (ACSA-1) Antibody, PEMiltenyi Biotec130-118-344Antilichaam
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10Reagens
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3Biolegend100220Antilichaam
PE/Dazzle 594 anti-mouse NK-1.1Biolegend156518Antilichaam
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific Inc.15596026Reagens
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermo Fisher Scientific Inc.10977015Reagens
Vetbond Tissue Adhesives3M1469SBLab materiaal
Zombie Aqua Fixable Viability KitBiolegend423102Amine-reactieve fluorescerende kleurstof

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleindorfer, D. O., et al. 2021 Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American heart association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  2. Pu, L., et al. Projected global trends in ischemic stroke incidence, deaths and disability-adjusted life years from 2020 to 2030. Stroke. 54 (5), 1330-1339 (2023).
  3. Cheng, Y., et al. Projections of the stroke burden at the global, regional, and national levels up to 2050 based on the global burden of disease study 2021. J Am Heart Assoc. 13 (23), e036142(2024).
  4. Ma, Y., Yang, S., He, Q., Zhang, D., Chang, J. The role of immune cells in post-stroke angiogenesis and neuronal remodeling: The known and the unknown. Front Immunol. 12, 784098(2021).
  5. Duan, M., Xu, Y., Li, Y., Feng, H., Chen, Y. Targeting brain-peripheral immune responses for secondary brain injury after ischemic and hemorrhagic stroke. J Neuroinflammation. 21 (1), 102(2024).
  6. Chen, B. R., Wu, T., Chen, T. H., Wang, Y. Neuroimmune interactions and their roles in neurodegenerative diseases. Fundam Res. 4 (2), 251-261 (2024).
  7. Zhang, Z., Lv, M., Zhou, X., Cui, Y. Roles of peripheral immune cells in the recovery of neurological function after ischemic stroke. Front Cell Neurosci. 16, 1013905(2022).
  8. Garcia-Bonilla, L., et al. Analysis of brain and blood single-cell transcriptomics in acute and subacute phases after experimental stroke. Nat Immunol. 25 (2), 357-370 (2024).
  9. Stevens, S. L., et al. The use of flow cytometry to evaluate temporal changes in inflammatory cells following focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. 932 (1-2), 110-119 (2002).
  10. Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22 (1), 72-85 (1998).
  11. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  12. De Haas, A. H., Boddeke, H. W., Biber, K. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  13. Mcdonough, A., Weinstein, J. R. Neuroimmune response in ischemic preconditioning. Neurotherapeutics. 13 (4), 748-761 (2016).
  14. Wang, S., et al. Transcriptome analysis reveals dynamic microglial-induced a1 astrocyte reactivity via c3/c3ar/NF-kappab signaling after ischemic stroke. Mol Neurobiol. 61 (12), 10246-10270 (2024).
  15. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. 69A, 1037-1042 (2006).
  16. Siddiqui, S., Livak, F. Principles of advanced flow cytometry: A practical guide. Methods Mol Biol. 2580, 89-114 (2023).
  17. Sousa, C., et al. Single-cell transcriptomics reveals distinct inflammation-induced microglia signatures. EMBO Rep. 19 (11), e46171(2018).
  18. Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. 124, e55781(2017).
  19. Zhang, W., et al. Microglia-associated neuroinflammation is a potential therapeutic target for ischemic stroke. Neural Regen Res. 16 (1), 6-11 (2021).
  20. Mao, J. H., et al. Microglia polarization in ischemic stroke: Complex mechanisms and therapeutic interventions. Chin Med J (Engl). 134 (20), 2415-2417 (2021).
  21. Shui, X., et al. Microglia in ischemic stroke: Pathogenesis insights and therapeutic challenges. J Inflamm Res. 17, 3335-3352 (2024).
  22. Feng, Y., et al. Infiltration and persistence of lymphocytes during late-stage cerebral ischemia in middle cerebral artery occlusion and photothrombotic stroke models. J Neuroinflammation. 14 (1), 248(2017).
  23. Schulze, J., Gellrich, J., Kirsch, M., Dressel, A., Vogelgesang, A. Central nervous system-infiltrating t lymphocytes in stroke are activated via their TCR (T-cell receptor) but lack CD25 expression. Stroke. 52 (9), 2939-2947 (2021).
  24. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  25. Leelatian, N., et al. Single-cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 92 (1), 68-78 (2017).
  26. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. J Allergy Clin Immunol. 143 (2), 528-537 (2019).
  27. Schmit, T., Klomp, M., Khan, M. N. The application of flow cytometry for simultaneous and multi-parametric analysis of heterogenous cell populations in basic and clinical research. Methods Mol Biol. 2223, 183-200 (2021).
  28. Dukhinova, M., Kopeikina, E., Ponomarev, E. D. Usage of multiparameter flow cytometry to study microglia and macrophage heterogeneity in the central nervous system during neuroinflammation and neurodegeneration. Methods Mol Biol. 1745, 167-177 (2018).
  29. Rui, W., et al. Myeloid gasdermin d drives early-stage T-cell immunity and peripheral inflammation in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 21 (1), 266(2024).
  30. Rauber, S., et al. Flow cytometry identifies changes in peripheral and intrathecal lymphocyte patterns in CNS autoimmune disorders and primary CNS malignancies. J Neuroinflammation. 21 (1), 286(2024).
  31. Rayaprolu, S., et al. Flow-cytometric microglial sorting coupled with quantitative proteomics identifies moesin as a highly-abundant microglial protein with relevance to Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 15 (1), 28(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ischemisch infarctflowcytometriemini infarctmodelactivering van immuuncellendissociatie van hersenweefselsingle cell suspensiekwantificering van immuuncellenneuroinflammatiemuismodel voor infarct

Gerelateerde artikelen