Methodenartikel

Onderzoek naar de sequentiële cellulaire gebeurtenissen van fagocytose veroorzaakt door Godanti Bhasma in zoogdiercellen

DOI:

10.3791/68321

⸱

11 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shobhit Institute of Engineering & Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie verheldert de fagocytische verwerking van Godanti Bhasma (GB) deeltjes in zoogdiercellen, waarbij hun cellulaire opname, vacuoledynamiek, verzuring en afbraak worden gekarakteriseerd. Deze bevindingen vergroten niet alleen ons begrip van fundamentele fagocytosemechanismen, maar vestigen GB ook als een veelbelovend modelsysteem voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagocytose is een vitaal cellulair mechanisme waardoor cellen vreemde deeltjes, ziekteverwekkers of puin overspoelen en afbreken, en een sleutelrol spelen bij de immuunafweer en het behoud van weefselhomeostase. Verstoringen in dit proces worden in verband gebracht met verschillende ziekten. Om de complexe gebeurtenissen in de fagocytoseroute te onderzoeken, zijn geavanceerde slimme deeltjes en effectieve monitoringtechnieken essentieel. Godanti Bhasma (GB), een traditioneel Indiaas medicijn dat bestaat uit bioactieve calciumsulfaatdeeltjes, wordt snel geïnternaliseerd door fagocytose in zoogdiercellen, waardoor aanzienlijke cytoplasmatische vacuolatie wordt geïnduceerd. De belangrijkste stadia van GB-geïnduceerde fagocytose werden hier geëvalueerd met behulp van flowcytometrie (FC), beeldvorming van levende cellen en specifieke kleuringstechnieken. Flowcytometrische analyse toonde de vorming aan van fagocytische bekerachtige structuren die verband houden met internalisatie van deeltjes. Beeldvorming van live-cellen maakte real-time observatie van fagocytische processen mogelijk, waaronder deeltjesopname, vacuolevorming, degradatie van opgeslokte materialen en vacuolaire omzet. Kleuring met neutraal rood en acridineoranje werd gebruikt om de vacuolaire verzuring te beoordelen. Interessant is dat behandeling met de lysosomale remmer BFA1 in met GB behandelde cellen niet leidde tot vacuolatie, zoals blijkt uit het ontbreken van neutrale roodopname, wat de noodzaak benadrukt van een zure omgeving om vacuolatie te laten plaatsvinden. Deze bevindingen onderstrepen het potentieel van GB-geïnduceerde fagocytose als een model om de sequentiële cellulaire gebeurtenissen die bij dit proces betrokken zijn op te helderen, wat van cruciaal belang is voor het begrijpen van interacties tussen gastheer en ziekteverwekker, intracellulair verkeer en het ontwikkelen van innovatieve therapeutische strategieën voor aandoeningen die verband houden met fagocytose.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagocytose is een essentieel cellulair proces dat wordt uitgevoerd door professionele fagocyten die in het weefsel wonen, zoals macrofagen en dendritische cellen, evenals niet-professionele fagocyten, zoals epitheelcellen en fibroblasten, die vreemde deeltjes opslokken en afbreken. Deze cellen internaliseren en elimineren vreemde deeltjes, ziekteverwekkers of celresten, wat aanzienlijk bijdraagt aan de immuunafweer en weefselhomeostase1. Dit proces begint met de herkenning van ziekteverwekkers, puin of deeltjes door middel van patroonherkenningsreceptoren (PRR's), zoals Toll-like receptoren (TLR's), die binden aan pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's)2. Deze herkenning veroorzaakt de vorming van een fagocytische beker, waar plasmamembraanuitsteeksels zich uitstrekken rond het doeldeeltje3. Actinefilamenten spelen een cruciale rol in deze stap en drijven de membraanremodellering aan die nodig is voor deeltjesverzwelging4. Zodra het deeltje is ingesloten in een fagosoom, wordt een membraangebonden blaasje gevormd. Het fagosoom ondergaat rijping, gekenmerkt door de fusie met vroege en vervolgens late endosomen, gevolgd door de opname van lysosomen die hydrolytische enzymen bevatten5. Deze enzymen, zoals cathepsines, lysozym en nucleasen, worden geactiveerd door verzuring in het fagosoom, bereikt door vacuolair ATPase (V-ATPase), waardoor de pH wordt verlaagd tot 4,5-5,5. Het afbraakproces wordt afgesloten met de exocytose van restanten uit de cel. Stoornissen in dit dynamische en complexe proces kunnen leiden tot aanzienlijke immuunuitdagingen 6,7,8.

Om het complexe cellulaire proces van fagocytose nauwkeurig te evalueren, is er behoefte aan verbeterde en gemakkelijke methoden voor het monitoren van de belangrijkste cellulaire gebeurtenissen van fagocytose. Traditioneel omvat de monitoringmethode voor kwantificering van fagocytose technieken zoals het fixeren van fagocyten op vooraf bepaalde tijdsintervallen voor microscopische visualisatie, het meten van de internalisatie van kleurstof-gelabelde doelen door middel van beeldvorming of flowcytometrie of het tellen van het aantal doelcellen dat overblijft na een bepaalde duur van fagocytose, Deze methoden leggen echter niet de fluctuaties van minuut tot minuut vast die optreden tijdens het fagocytoseproces9. Bovendien is het mogelijk dat methoden die gebaseerd zijn op indirecte indicatoren zoals de opname van kleurstof de werkelijke fagocytische gebeurtenissen niet nauwkeurig weergeven vanwege mogelijke passieve kleurstofoverdracht10.

Recente ontwikkelingen op het gebied van beeldvorming van levende cellen, flowcytometrie en kleuringstechnieken hebben een revolutie teweeggebracht in ons vermogen om fagocytose met hoge spatiotemporele precisie te monitoren. Beeldvorming van live-cellen maakt bijvoorbeeld continue observatie van dynamische processen mogelijk met sequentiële gebeurtenissen die11 volgen. Flowcytometrie wordt veel gebruikt voor het analyseren van zoogdiercellen en het detecteren van biomarkers in klinisch onderzoek12. Traditionele FC-methoden zijn echter niet toegerust om de morfologische en ruimtelijke kenmerken van individuele cellen te evalueren12. Imaging Flow Cytometry (IFC) dient als een robuust alternatief dat het mogelijk maakt om gedetailleerde informatie van afzonderlijke cellen te verzamelen. IFC combineert de analytische mogelijkheden van flowcytometrie met beeldvorming met hoge resolutie, waardoor analyse van één cel met morfologische en ruimtelijke details mogelijk is. Verschillende deeltjes, waaronder fluorescerende latexkorrels, zymosan-APC en synthetische nanodeeltjes, worden vaak gebruikt om fagocytose te bestuderen en inzicht te krijgen in receptorbetrokkenheid, fagosoomvorming en immuunresponsen12.

In tegenstelling tot conventionele biochemische technieken, die doorgaans gebaseerd zijn op eindpuntanalyse, biedt beeldvorming van levende cellen continue, dynamische monitoring van cellulaire processen. Deze methode biedt een hoge spatiotemporele resolutie en de mogelijkheid om sequentiële gebeurtenissen bij fagocytose waar te nemen. Als gevolg hiervan is het een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van het complexe proces van fagocytose, waardoor nauwkeurigere en gedetailleerdere inzichten in cellulair gedrag en mechanismen mogelijk zijn13.

Naast de vooruitgang in beeldvormingssystemen is er behoefte aan slimme fagocytische deeltjes die fagocytische gebeurtenissen duidelijk kunnen markeren, met name de degradatiestappen die plaatsvinden in het fagosoom. Fagocytosestudies maken vaak gebruik van deeltjes zoals latexkralen, zymosan, bacteriën, apoptotische cellen en synthetische nanodeeltjes om mechanismen zoals receptorbetrokkenheid, fagosoomvorming en immuunresponsen te onderzoeken. Hoewel deze deeltjes waardevolle inzichten bieden, hebben ze beperkingen bij het volgen van het volledige afbraakproces of het direct beoordelen van de rijping van fagosomen. Latexkralen zijn bijvoorbeeld niet biologisch afbreekbaar en kunnen geen afbraak aantonen, terwijl zymosan en bacteriën vaak een complexe etikettering vereisen en mogelijk geen consistente afbraakprofielen opleveren14,15.

Onze vorige studie toonde het nut aan van GB, een traditionele Ayurvedische formulering die voornamelijk bestaat uit calciumsulfaat, als een ideaal deeltje voor het bestuderen van de rijping en afbraak van fagosomen16. GB lost na verloop van tijd op in de zure omgeving van het fagosoom, waardoor een duidelijke visualisatie van de degradatie van deeltjes mogelijk is. Bovendien vergemakkelijkt het vermogen van GB om robuuste vacuolevorming te induceren het onderzoek naar verschillende stadia van fagosoomrijping, van vroege vorming tot verzuring en uiteindelijke resolutie. In tegenstelling tot andere deeltjes, elimineert GB de noodzaak van externe labeling, waardoor een zelfvoorzienend systeem wordt geboden om de volledige levenscyclus van fagosomen te bestuderen, waardoor het een ideaal model is voor het begrijpen van de dynamiek van fagocytose en geassocieerde aandoeningen16.

Deze studie presenteert een gestandaardiseerd en reproduceerbaar protocol dat is ontworpen om door deeltjes geïnduceerde fagocytose en vacuolevorming te evalueren met behulp van Godanti Bhasma (GB) in zowel professionele (RAW 264.7) als niet-professionele (HeLa en 3T3-L1) fagocytische cellijnen. Het algemene doel van deze methode is om een robuust platform te bieden voor het bestuderen van cellulaire opnamemechanismen, vacuolaire biogenese en intracellulaire deeltjesverwerking in verschillende celtypen. GB werd gesuspendeerd in DMEM in een concentratie van 10 mg/ml, en om uniformiteit te garanderen, mochten grotere deeltjes bezinken terwijl de bovenste fractie werd verzameld voor experimenteel gebruik. Voor flowcytometrie-assays werden cellen gezaaid met een dichtheid van 2 x 105 cellen per putje in platen met 12 putjes, en 300 μL van de GB-werksuspensie werd aan elk putje toegevoegd. Voor op beeldvorming gebaseerde analyses werden 5.000-10.000 cellen per put gezaaid in platen met 96 putjes of op kamerglaasjes. Deze methode stelt GB vast als een betrouwbaar model voor het onderzoeken van vacuolevorming en deeltjesinternalisatie in diverse cellulaire typen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celcultuur en zaaien

  1. Bereid een volledig DMEM-medium aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerde FBS en antibiotica (100 μg/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine). Steriliseer alle reagentia en apparatuur voor gebruik.
  2. Kweek de 3T3-L1, HeLa en RAW 264.7 cellen in 25 cm2 kolven en 35 mm kweekschaaltjes met behulp van DMEM. Houd de culturen in een bevochtigde broedstoof op 37 °C met 5% CO2 en vervang het medium elke 48 uur.
  3. Voor subcultuur de cellen 2x wassen met PBS, vervolgens aanhangende cellen losmaken met 500 μL trypsine-EDTA en 5 minuten incuberen. Voeg 1 ml DMEM toe om de trypsine-EDTA-oplossing te neutraliseren, pipetteer om een eencellige suspensie te creëren en pas het volume aan op 10 ml met verse DMEM. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min, resuspendeer de pellet in 1 ml vers medium.
  4. Meng 10 μL celsuspensie met 0,4% trypanblauw (1:1), tel levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer, bereken de dichtheid als cellen/ml = gemiddeld aantal x 104 x 2.
  5. Voor platen met 96 putjes: Doseer 100 μL van de celsuspensie (met 10.000 cellen) in elk putje. Zaai voor caviteitsglaasjes 50 μL van de celsuspensie (met 5000 cellen) in twee holtes en laat de middelste holte leeg. Voeg 50 μL DMEM toe aan elk van de gezaaide holtes.
  6. Incubeer de platen en dia's bij 37 °C in een CO2 van 5 % gedurende 24 uur om celhechting en stabilisatie mogelijk te maken. Inspecteer de cellen onder een omgekeerde microscoop met een vergroting van 20x om morfologie, confluentie en contaminatie te beoordelen voordat u verder gaat met de experimenten.

2. Bereiding van GB-voorraadoplossing/cocktail voor celcultuur

  1. Koop GB en weeg precies 100 mg van het poeder af. Suspendeer het poeder in 10 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine.
  2. Draai de suspensie los en laat deze 1 minuut staan om grotere deeltjes te laten bezinken. Breng vervolgens de bovenste 5 ml van de suspensie over in een steriele centrifugebuis.
  3. Wijs deze 5 ml bereide GB-suspensie aan als de standaardoplossing voor latere celkweekexperimenten. Draai de suspensie grondig om een gelijkmatige verspreiding van de deeltjes te garanderen voordat u deze aan de cellen toevoegt.

3. Analyse van flowcytometrie

  1. Oogst RAW 264.7, HeLa, of 3T3-L1 cellen door trypsinisatie, neutraliseer met volledige DMEM, centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min, suspendeer in 1 ml vers medium, meng 10 μL met 0,4% trypanblauw (1:1), tel levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer, bereken de dichtheid en pas aan op 2 x 105 cellen/ml.
  2. Zaai 2 x 105 cellen per putje in een plaat met 12 putjes en kweek gedurende 24 uur. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2.
  3. Behandel de cellen met GB-suspensie (300 μL per putje) gedurende verschillende duur: 30 minuten, 1 uur en 12 uur. Was de cellen na de behandeling 5x met PBS om overtollige deeltjes te verwijderen.
  4. Probeer de cellen zoals in stap 1.3 en spoel ze grondig met PBS. Laad de voorbereide suspensie in de monsterpoort van de flowcytometer. Start de software en selecteer de juiste acquisitie-instellingen. Kies de modus Helder veld voor beeldvorming.
  5. Start gegevensverzameling door in de software op Uitvoeren te klikken. Verkrijg gegevens voor ten minste 10.000 gebeurtenissen terwijl het systeem beelden vastlegt van individuele cellen die door de stroomcel gaan.
  6. Gebruik spreidingsdiagrammen voor de verhouding tussen oppervlakte en beeldverhouding om afzonderlijke intacte cellen te poorten. Dit helpt bij het uitsluiten van doubletten en clusters. Bekijk de bijbehorende afbeeldingen in de afbeeldingenbibliotheek. Verzamel individuele celafbeeldingen uit de softwarebeeldbibliotheek om de morfologische veranderingen te bestuderen die door de behandeling worden veroorzaakt.
  7. Zaai voor deeltjesanalyse 2 x 105 cellen per putje in platen met 12 putjes en kweek gedurende 24 uur. Behandel de cellen met GB-suspensie (300 μL per putje) voor verschillende duur: 1 uur, 7 uur, 14 uur en 24 uur.
  8. Schud na de behandeling de kweekplaat voorzichtig gedurende 1 minuut en verzamel de kweekmedia in buisjes van 1,5 ml. Was de cellen 5x met PBS om eventuele extracellulaire deeltjes te verwijderen.
  9. Voeg 500 μL RIPA buffer toe (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,1% Triton X-100; 1% natriumdeoxycholaat) om de cellen volledig te lyseren.
  10. Laat het kweekmedium en de gelyseerde celmonsters met deeltjes afzonderlijk door de flowcytometer lopen. Laad de samples in de samplepoort van het systeem. Start de software en selecteer de juiste acquisitie-instellingen. Kies de Bright Field-modus voor deeltjesanalyse.
  11. Start gegevensverzameling door in de software op Uitvoeren te klikken. Verkrijg gegevens voor ten minste 20.000 gebeurtenissen terwijl het systeem beelden vastlegt van individuele deeltjes die door de stroomcel gaan.
  12. Gebruik spreidingsdiagrammen voor de verhouding tussen oppervlakte en beeldverhouding om alle deeltjes te poorten. Gebruik de hulpmiddelen voor spreidingsdiagrammen om het aantal deeltjes te analyseren.

4. Time-lapse microscopie

  1. Kweek 3T3-L1-cellen (3,0 x 104) in een schaaltje van 35 mm met 2 ml DMEM bij 37 °C in een CO2 -gehalte van 5% tot ze een samenvloeiing van 70% hebben bereikt.
  2. Meng 300 μL GB suspensie grondig in het voorverwarmde verse kweekmedium van 2 ml en plaats vervolgens het kweekschaaltje met de cellen en GB op de tafel van de beeldmicroscoop.
  3. Selecteer het 10x objectief. Schakel de helderveldverlichting in met de knop Helder. Klik op de film knop om de time-lapse-modus te openen. Stel de intervaltijd in op 5 min. Begin met opnemen door op de knop Opnemen te klikken.
  4. Leg beelden vast met tussenpozen van 5 minuten gedurende 16 uur tot 24 uur, zodat u onder standaardomstandigheden continu beeld kunt krijgen in een CO2 -incubator.
  5. Gebruik ImageJ-software om de vastgelegde afbeeldingen samen te voegen tot een time-lapse-video. Deze techniek maakt de differentiatie van verschillende stadia van fagocytose mogelijk, van internalisatie tot volledige afbraak van deeltjes.

5. Neutrale rode kleuring

  1. Na 24 uur celgroei in platen met 96 putjes en caviteitsglaasjes, mengt u de GB-deeltjessuspensie grondig en voegt u 30 μL van de suspensie toe aan elk putje of holte.
  2. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2 om de vorming van vacuoles te induceren. Gebruik onbehandelde putjes of holtes als negatieve controles.
  3. Voor neutrale rode (NR) kleuring bereidt u een 0,5 mg/ml NR-oplossing in serumvrije DMEM en filtreert u deze door een filter van 0,2 μm.
  4. Voor beeldvorming van vacuolen in platen met 96 putjes en in de holtedia: verwijder de media, voeg 60 μL NR-kleurstof toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C. Was 3x met PBS om overtollige kleurstof te verwijderen en ga vervolgens verder met microscopische beeldvorming.
  5. Onderzoek de vacuolen onder een microscoop met behulp van het 20x-objectief om de grootte, morfologie en het aantal vacuolen te beoordelen.

6. Behandeling met Bafilomycine A1 voor vacuolevorming en verzuringsremming

  1. Bereid een stockoplossing van Bafilomycine A1 (BFA1) in een concentratie van 100 μg/ml (160,5 nM) door 100 μg BFA op te lossen in 50 μl DMSO, gevolgd door verdunning in 950 μl DMEM. Verdun 1 μl van deze voorraad in 1,6 ml DMEM om een werkoplossing van 0,1 nM te verkrijgen.
  2. Meng grondig en voeg 100 μl van de werkende BFA-oplossing toe aan putjes met cellen in de platen met 96 putjes. Voeg ook 30 μL GB-deeltjessuspensie toe om de remming van de vorming van vacuole en fagosoom te beoordelen.
  3. Om de verzuring van fagosomen te remmen, voegt u 100 μL van de werkende BFA-oplossing toe aan putjes met voorgevormde vacuolen (eerder behandeld met GB-deeltjes). Incubeer alle putjes bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
  4. Voeg 60 μL neutrale rode (NR) kleurstof toe aan elk putje, incubeer nog eens 15 minuten en analyseer de vorming en verzuring van vacuoles.

7. Acridine oranje (AO) kleuring

  1. Behandel de cellen die in caviteitsglaasjes zijn gekweekt met 50 μL GB en incubeer een nacht onder standaard experimentele omstandigheden.
  2. Incubeer de cellen na de behandeling met acridine-sinaasappeloplossing (1 mg/ml) gedurende 15 minuten bij 37 °C om selectieve kleuring van vacuolen en zure vesiculaire organellen mogelijk te maken.
  3. Was de cellen 3x met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om ongebonden kleurstof te verwijderen en achtergrondfluorescentie te minimaliseren.
  4. Analyseer de objectglaasjes snel met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 20x objectief en een blauw excitatiefilterbereik van 450-492 nm, om de cellulaire morfologie en de opname van acridineoranje te beoordelen, wat inzicht zal geven in de vacuolaire dynamiek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie belicht de belangrijkste cellulaire reacties op GB-deeltjes in zoogdiercellen. We gebruikten een beeldvormende flowcytometer om de internalisatie van GB-deeltjes in 3T3-L1-cellen te onderzoeken (Figuur 1). De cellen werden blootgesteld aan deeltjes gedurende een periode van 30 minuten tot 12 uur. Na 30 minuten observeerden we de deeltjes op het celoppervlak (Figuur 1B) en begon het celmembraan naar binnen te vouwen op ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagocytose dient als een cruciaal immuunafweermechanisme, dat de verzwelging en daaropvolgende eliminatie van deeltjes, ziekteverwekkers en apoptotische cellen mogelijk maakt. Om de processen van fagosoomvorming en rijping te begrijpen, zijn slimme biocompatibele deeltjes in combinatie met geavanceerde beeldvormingstechnieken essentieel voor het bestuderen van dynamische gebeurtenissen zoals de vacuolaire progressie, verzuring en degradatie van opgeslokte materialen18,1...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door de Science & Engineering Research Board (SERB) Core Research Grant (CRG/2022/009045), Department of Science and Technology, Government of India.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
25 cm2 CultuurkolvenNEST, India707001
96- en 6-wells platenTarsons India Pvt. Ltd., Kolkata, India; Thermo Scientific, India980040; 140675
Acridine oranjeSRL, India82407
Antibiotica en Trypsin-EDTA oplossingHigh Media, India628242; 655111
Cellijnen - HeLa, 3T3-L1 en RAW-264.7National Centre For Cell Science (NCCS), Pune, Maharastra
kweekschalen (35mm) SPL Lifesciences, India101350
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle medium (DMEM)MP Biomedicles, India1033126
Foetaal bovien serum (FBS)High Media, India651257
FlowcytometerMillipore, USAAmnisAmnis Imaging Flow Cytometers,
Fluorescente microscoopDiGi Lab, IndiaModel: DiGi 110 Infinity
Godanti BhasmaPatanjali Ayurved240002
Neutral Red kleurstofCDH, India593630
Time lapse microscoopNanoEnTek Inc.  Seoul, Korea.JuLiJuLi smart fluorescente cel-analyzer,
Time lapse microscoopLEEDZ MICRO IMA. UKS.No. LIM225552358A58EA PRIME Inverted microscoop

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. B. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8 (2), 131-141 (2008).
  2. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12 (7), 492-502 (2012).
  3. Gordon, S. Phagocytosis: An immunobiologic process. Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).
  4. Flannagan, R. S., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol Mech Dis. 7, 61-98 (2012).
  5. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: Going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (10), 781-795 (2008).
  6. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
  7. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  8. Méresse, S., Gorvel, J. P., Chavrier, P. The rab7 GTPase resides on a vesicular compartment connected to lysosomes. J Cell Sci. 112 (21), 3195-3204 (1999).
  9. Caponegro, M. D., Thompson, K. K., Tayyab, M., Tsirka, S. E. A Rigorous Quantitative Approach to Analyzing Phagocytosis Assays. Bio Protoc. 10 (15), e3698(2020).
  10. de Neergaard, T., Sundwall, M., Wrighton, S., Nordenfelt, P. High-Sensitivity Assessment of Phagocytosis by Persistent Association-Based Normalization. J Immunol. 206 (1), 214-224 (2021).
  11. Chu, C. C., et al. High-resolution quantification of discrete phagocytic events by live cell time-lapse high-content microscopy imaging. J Cell Sci. 133 (5), jcs237883(2020).
  12. Park, Y., et al. Imaging Flow Cytometry Protocols for Examining Phagocytosis of Microplastics and Bioparticles by Immune Cells of Aquatic Animals. Front Immunol. 11, 203(2020).
  13. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochem Pharmacol. 116, 107-119 (2016).
  14. Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
  15. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annu Rev Immunol. 31, 443-473 (2013).
  16. Das, S. K., et al. Godanti bhasma (anhydrous CaSO4) induces massive cytoplasmic vacuolation in mammalian cells: A model for phagocytosis assay. Methods. 230, 158-168 (2024).
  17. Huss, M., et al. Proton translocation by V-ATPase: molecular mechanism and target for inhibition by Bafilomycin A1. J Bioenerg Biomembr. 34, 243-250 (2002).
  18. Méndez-Alejandre, A., Raymond, B. B. A., Trost, M., Marín-Rubio, J. L. Bi-functional particles for real-time phagosome acidification and proteolysis multiplex assay in macrophages. Front Immunol. 14, 1204223(2023).
  19. Lancaster, C. E., et al. Phagosome resolution regenerates lysosomes and maintains the degradative capacity in phagocytes. J Cell Biol. 220 (9), e202005072(2021).
  20. Krendel, M., Gauthier, N. C. Building the phagocytic cup on an actin scaffold. Curr Opin Cell Biol. 77, 102112(2022).
  21. Barger, S. R., et al. Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis. Nat Commun. 10 (1), 1249(2019).
  22. Ghosh, M., et al. Quantitative determination of phagocytosis using pH-sensitive fluorescent bioparticles. J Vis Exp. (125), e56093(2017).
  23. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. J Vis Exp. (120), e54646(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fagocytosepadinternalisatie van deeltjesvacuolevormingflowcytometrielive cell imagingneutral red kleuringacridine orange kleuringrijping van het fagosoom

Gerelateerde artikelen