Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

RNA-Seq onthult Th17-celdifferentiatieroute als een mechanisme van door straling veroorzaakt hersenletsel

561 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68322

⸱

20 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Radiation Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie heeft tot doel de activering van de Th17-celdifferentiatieroute te onderzoeken bij muizen met door straling geïnduceerd hersenletsel.

Samenvatting

Radiotherapie is een veel voorkomende therapeutische modaliteit voor maligniteiten van het hoofd en de nek; het resulteert echter steevast in door straling veroorzaakte schade aan normaal hersenweefsel, culminerend in door straling veroorzaakt hersenletsel (RBI). Ondanks uitgebreid onderzoek naar door straling geïnduceerde neuro-inflammatie, blijft het verband tussen RBI en de Th17-celdifferentiatieroute onvoldoende begrepen. C57BL/6-muizen ondergingen een enkele toediening van 30 Gy schedelbestraling om het RBI-model te ontwikkelen. De cognitieve functie werd geëvalueerd door middel van het Morris-waterdoolhof (MWM), de open veldtest, de nieuwe objectherkenningstest en de rotarod-test. Histopathologische veranderingen in hersenweefsel werden geanalyseerd met behulp van hematoxyline en eosine (H & E) kleuring. Immunofluorescentiekleuring werd gebruikt om de activering van microglia (IBA-1) en astrocyten (GFAP) te beoordelen. RNA-sequencing werd uitgevoerd om differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren, terwijl Simple Western en qPCR werden gebruikt om belangrijke signaalmoleculen te onderzoeken die betrokken zijn bij Th17-celdifferentiatie. RBI-muizen vertoonden duidelijke cognitieve tekorten, met name in ruimtelijk leren en geheugenbehoud. Histologisch onderzoek wees op activering van microglia en astrocyten in de cortex en hippocampus van bestraalde muizen. RNA-sequencinganalyse identificeerde een significante verrijking van de Th17-celdifferentiatieroute in de cortex van de RBI-groep. Verdere validatie door middel van Simple Western- en qPCR-analyses bevestigde de opregulatie van TGF-β, IL-6, RORγt, IL-17 en P-STAT3 in de cortex van RBI-muizen. Deze bevindingen suggereerden dat de Th17-celdifferentiatieroute een cruciale rol speelde in de pathogenese van door straling veroorzaakt hersenletsel. Neuro-inflammatie gemedieerd door Th17-cellen kan een cruciaal mechanisme zijn dat ten grondslag ligt aan door straling geïnduceerde cognitieve disfunctie.

Inleiding

Radiotherapie is een cruciale behandeling voor zowel primaire als gemetastaseerde hoofd-halstumoren, maar door straling geïnduceerd hersenletsel (RBI) kan optreden als een ernstige complicatie, gekenmerkt door schade aan het centrale zenuwstelsel. De incidentie van RBI varieert per tumortype en behandelingsmodaliteit, met gerapporteerde percentages variërend van 28%-50% na stereotactische radiotherapie voor meningeomen1, 1,9%-5% voor nasofarynxcarcinoom 2,3, 1%-24% voor laaggradige gliomen 4,5 en 8%-20% voor hersenmetastasen 6,7. RBI wordt ingedeeld in acute, vroegvertraagde en laatvertraagde typen, waarbij cognitieve disfunctie, met name geheugenstoornissen, en leerstoornissen prominent aanwezig zijn in de laatvertraagde vorm. Door straling geïnduceerde cognitieve disfunctie (RICD), die 50%-90% van de langdurige overlevenden van hoofd-halskanker treft, heeft een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van leven8, maar de pathogenese ervan blijft slecht begrepen en effectieve preventieve en therapeutische strategieën ontbreken.

Neuro-inflammatie is een belangrijk pathologisch kenmerk van RBI, verergert de verstoring van de bloed-hersenbarrière en belemmert de neurogenese in de hippocampus. Th17-cellen, een subset van CD4+ T-cellen die bekend staan om het produceren van het pro-inflammatoire cytokine IL-179, zijn in verband gebracht met verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder multiple sclerose en de ziekte van Parkinson10,11. Deze cellen kunnen onder bepaalde ontstekingsaandoeningen de bloed-hersenbarrière passeren en bijdragen aan neuro-inflammatie12. Sinds hun ontdekking in 2005 hebben Th17-cellen de aandacht getrokken voor hun rol in zowel immuunresponsen tegen ziekteverwekkers als hun betrokkenheid bij ontstekingsziekten, waardoor ze een potentieel doelwit zijn voor het bestuderen van de mechanismen van RBI en gerelateerde cognitieve disfunctie13.

In deze studie werden alleen mannelijke muizen gebruikt. De uitsluiting van vrouwen was bedoeld om mogelijke verstorende effecten als gevolg van oestruscyclus-geassocieerde neuro-inflammatoire fluctuaties te voorkomen, aangezien progesteronspiegels tot tien keer kunnen variëren in verschillende fasen van de cyclus14. Bovendien is ons experimentele model ontworpen om de klinische context van radiotherapie bij hoofd-halskanker weer te geven, waarbij ongeveer 72% van de patiënten15 man is. In overeenstemming hiermee hebben de meeste gepubliceerde onderzoeken naar de mechanismen van door straling geïnduceerd hersenletsel (RBI) mannelijke knaagdieren gebruikt om pathologische kenmerken vast te stellen16.

Hoewel er verschillende modellen zijn gebruikt om RBI te bestuderen, hebben traditionele methodologieën zoals histopathologische kleuring en eenvoudige Western blotting te maken met beperkingen op het gebied van gevoeligheid, doorvoer en nauwkeurigheid17. Recente ontwikkelingen zoals RNA-sequencing (RNA-Seq) en high-throughput proteomics hebben meer robuuste inzichten opgeleverd in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan RBI18. Deze technologieën zorgen voor een uitgebreid begrip van veranderingen in genexpressie en eiwitveranderingen, waardoor nauwkeurigere gegevens worden verkregen dan eerdere methoden19. Simple Western in het bijzonder is een nieuwe en geautomatiseerde techniek die de voordelen van capillaire elektroforese combineert met eiwitdetectie via chemiluminescentie, waardoor high-throughput-analyse mogelijk wordt met een minimaal monstervolume en verhoogde reproduceerbaarheid20. Vergeleken met traditionele Western blotting, elimineert Simple Western de noodzaak van membraanoverdracht en biedt het kwantitatieve eiwitexpressiegegevens, wat verschillende voordelen biedt op het gebied van gevoeligheid en reproduceerbaarheid, vooral bij eiwitdetectie met een lage abundantie21,22.

Praktische richtlijnen voor RNA-extractie en -bereiding zijn cruciaal voor het succes van hoogwaardige sequencing en kwantificering. Voor een optimale RNA-extractie raden we aan om hoogwaardige RNA-isolatiekits te gebruiken en ervoor te zorgen dat de concentratie binnen het bereik van 100-1000 ng/μL ligt, met een RNA-integriteitsnummer (RIN) boven 7,0 om degradatie te voorkomen. Bij het uitvoeren van eiwitanalyse met Simple Western is het belangrijk ervoor te zorgen dat eiwitmonsters goed worden gedenatureerd en geladen met een concentratie van ongeveer 1-5 μg per capillair. Gebruik voor qPCR-validatie hoogwaardig cDNA dat is gesynthetiseerd uit ten minste 1 μg RNA, waardoor consistente reverse transcriptiecondities worden gegarandeerd. Veelvoorkomende valkuilen bij de bereiding van RNA, zoals besmetting met genomisch DNA of RNA-degradatie, moeten worden vermeden door RNA-vrije apparatuur te gebruiken en fasescheiding onmiddellijk uit te voeren om RNA-degradatie te voorkomen.

Door deze methoden toe te passen, wil deze studie onderzoeken of de Th17-celdifferentiatieroute wordt geactiveerd in muizenmodellen van RBI en hoe deze bijdraagt aan de pathogenese van door straling geïnduceerde cognitieve disfunctie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimentele procedures die hier worden uitgevoerd, zijn in strikte overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). Goedkeuring werd verkregen van het Institutional Animal Care and Use Committee van het Beijing Institute of Radiation Medicine (Goedkeuring nr. AF/SC-08/02; Datum: 25 februari 2024).

1. Bestraling van de schedel van muizen

  1. Gebruik in totaal 10 mannelijke C57BL/6-muizen in de leeftijd van 6-8 weken in het onderzoek, waarbij vijf dieren worden toegewezen aan de RBI-groep en vijf aan de controlegroep, waarbij de controlegroep bestaat uit blanco controlemuizen die geen RBI hebben gekregen. Houd de muizen onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden, waaronder gereguleerde temperatuur, vochtigheid en een licht/donkercyclus van 12 uur. Acclimatiseer de muizen gedurende 1 week voordat u met het experiment begint.
  2. Verdoof dieren met behulp van een intraperitoneale injectie van 1% pentobarbital-natrium bij 50 mg/kg lichaamsgewicht. Bevestig de juiste verdoving door te controleren of er geen reflexieve reactie is op een stevige kneep in de poot. Breng onmiddellijk na het begin van de anesthesie veterinaire oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
  3. Plaats de dieren in buikligging met behulp van een speciaal houten bevestigingsmiddel en bedek de niet-gerichte delen van het lichaam met een 3 mm dikke lood (Pb) afschermingsplaat (99,9% zuiverheid) om plaatselijke bestraling te garanderen.
  4. Collimeer het bestralingsveld van 2 x 2 cm2 met inherente filtratie (1,5 mm Al + 0,25 mm Cu). Lijn het veld uit met de middellijn van de schedel met geïntegreerd laserdradenkruis (λ = 635 nm ± een nauwkeurigheid van 0,5 mm) en controleer de real-time positionering met een geïntegreerd CMOS-camerasysteem en IR-achtergrondverlichting. Bestraal het schedelgebied met een enkele röntgendosis van 30 Gy bij 1,325 Gy/min met behulp van een X-RAD 320-systeem onder de volgende parameters: 320 kVp/12,5 mA, SSD = 50 cm.
  5. Voer wekelijkse dosiskalibratie uit met behulp van een traceerbare ionisatiekamer die in het isocentrum is geplaatst. Houd de bundelparameters op 320 kVp/12,5 mA met 3,2 mm Cu HVL-filtratie om een dosistempo van 1,325 Gy/min te bereiken (± variatie van 3%). Controleer dagelijks de uniformiteit van de straal (> 95% binnen het veld) met behulp van Gafchromische EBT3-film.
  6. Dien meloxicam (1-2 mg/kg, subcutaan) eenmaal daags gedurende 3 dagen toe om postoperatieve pijn te beheersen. Plaats de dieren in een voorverwarmde verkoeverkamer en houd ze continu in de gaten totdat ze weer volledig bij bewustzijn komen en hun sternale lighouding kunnen behouden. Laat dieren niet onbeheerd achter tijdens de herstelperiode.
  7. Noteer gedurende het hele onderzoek wekelijks het lichaamsgewicht van alle muizen. Observeer de muizen in totaal 4 weken, inclusief 1 week acclimatisatie en 3 weken na de bestraling.

2. Analyse van dierlijk gedrag

  1. Voer gedragsexperimenten uit 3 weken na RBI.
  2. Morris water doolhof
    1. Vul een rond zwembad (diameter: 120 cm, hoogte: 50 cm) met ondoorzichtig water (20-22 °C) met melkpoeder om het ondergedompelde platform te verduisteren. Plaats een verborgen platform (diameter: 10 cm) 1 cm onder het wateroppervlak in een vast kwadrant.
    2. Acclimatiseer de muizen ten minste 30 minuten in de testruimte voordat ze gaan proeven. Begin de trainingsfase door elke muis in het water te plaatsen vanaf een van de vier pseudo-willekeurig geselecteerde startpunten (N, S, E, W).
    3. Laat de muis maximaal 60 seconden zwemmen om het verborgen platform te vinden. Als de muis het platform niet binnen 60 s vindt, leidt u hem naar het platform en laat u hem daar 15 s staan.
    4. Voer vier proeven per dag per muis uit met een interval van 15 minuten tussen de proeven. Droog elke muis tussen de proeven door grondig af met een warme handdoek om onderkoeling te voorkomen. Ga 5 opeenvolgende dagen door met trainen om de leerverwerving te beoordelen.
    5. Verwijder op de proefdag van de sonde het platform en laat de muis 60 seconden vrij zwemmen. Registreer parameters zoals de tijd die wordt doorgebracht in het doelkwadrant, platformovergangen en zwempaden.
    6. Volg en analyseer alle proeven met behulp van een geautomatiseerd videovolgsysteem met onderzoekers die blind zijn voor groepstoewijzing.
  3. Open veld test
    1. Acclimatiseer de muizen ten minste 30 minuten voor het experiment in de testruimte. Gebruik een open veldapparaat (50 cm x 50 cm x 40 cm) gemaakt van ondoorzichtig plastic. Verlicht de arena gelijkmatig (meestal 25-30 lux) om sterke schaduwen te voorkomen en stress te minimaliseren.
    2. Reinig de arena met 70% ethanol voordat u elk dier test om geursignalen te elimineren. Plaats de muis voorzichtig in het midden van het open veld om de test te beginnen. Laat de muis de arena 10 minuten vrij verkennen.
    3. Registreer de locomotorische activiteit en positie met behulp van een geautomatiseerd volgsysteem. Definieer de centrale zone als de binnenste 20%-25% van de totale oppervlakte. Meet de tijd die in de centrale zone wordt doorgebracht en de totale afgelegde afstand.
    4. Breng de muis na de sessie terug naar zijn thuiskooi en maak het apparaat grondig schoon.
  4. Test voor de herkenning van nieuwe objecten
    1. Acclimatiseer muizen ten minste 30 minuten voorafgaand aan het experiment in de testruimte. Gebruik een open veldbak (50 cm x 50 cm x 40 cm) met gelijkmatige verlichting (20-30 lux). Reinig de arena grondig met 70% ethanol tussen de dieren om olfactorische signalen te elimineren.
    2. Plaats elke muis in de lege arena en laat hem 10 minuten vrij verkennen. Plaats in deze fase geen voorwerpen.
    3. Plaats na 24 uur twee identieke voorwerpen (A en A') in tegenovergestelde hoeken van de arena (minstens 8 cm van de muren). Plaats de muis voorzichtig in het midden van de arena en laat hem 10 minuten verkennen.
    4. Neem objectinteractie op met behulp van een geautomatiseerd videosysteem. Definieer objectverkenning als de snuit van de muis die zich binnen 2 cm van het object bevindt terwijl hij ernaartoe is gericht.
    5. Breng de muis na de proef terug naar zijn thuiskooi en maak de arena en objecten schoon.
    6. Plaats na een retentie-interval van 1 uur een bekend object (A) en een nieuw object (B) in dezelfde posities. Breng de muis terug naar de arena en laat hem 5 minuten verkennen.
    7. Registreer de tijd die u besteedt aan het verkennen van elk object aan de hand van dezelfde criteria als voorheen. Bereken de erkenningsindex als:
      Herkenningsindex (%) = [Tijd op nieuw object / (Tijd op roman + bekend object)] x 100
  5. Rotarod test
    1. Acclimatiseer muizen ten minste 30 minuten voorafgaand aan het testen in de testruimte. Gebruik een gemotoriseerd rotarod-apparaat met een staafdiameter van ~3 cm en een hoogte van ~30 cm boven de basis.
    2. Stel de rotatiemodus in op acceleratiesnelheid (van 4 tpm tot 40 tpm gedurende 5 minuten). Reinig het oppervlak van de staaf met 70% ethanol voordat u elke muis plaatst.
    3. Plaats de muis voorzichtig op het midden van de roterende staaf, naar voren gericht. Start de rotatie en begin onmiddellijk met timen.
    4. Registreer de latentie om automatisch door het systeem te vallen. Vang de muis veilig op bij het vallen om letsel te voorkomen. Wacht een rustperiode van ten minste 15 minuten tussen de proeven om vermoeidheid te voorkomen.
    5. Voer 3 opeenvolgende proeven per muis per dag uit en neem het gemiddelde van de latentie als eindresultaat. Zorg ervoor dat alle tests worden uitgevoerd door geblindeerde onderzoekers onder consistente omstandigheden. Breng de muis na het testen terug naar zijn thuiskooi en desinfecteer het apparaat grondig.

3. Euthanasie bij dieren en voorbereiding van monsters

  1. Verzamel weefselmonsters 5 weken na RBI.
  2. Bereid natriumpentobarbital (100 mg/kg) en een steriele spuit. Injecteer natriumpentobarbital intraperitoneaal. Wacht tot de muis stopt met ademen en tot de hartslag stopt, wat de dood bevestigt.
  3. Onthoofd snel bij de occipitale overgang en snijd sagitaal schedelnaden in met een fijne schaar, til vervolgens de bilaterale schedelflappen voorzichtig op met een gebogen tang met behoud van de meningeale integriteit voordat neurale verbindingen worden verbroken.
  4. Breng de intacte hersenen binnen 60 s over naar een voorgekoelde matrix voor midsagittale bisectie met behulp van steriele scheermesjes. Noteer onmiddellijk anteroposterieure afmetingen (8,2 ± 0,3 mm), mediolaterale breedte (4,5 ± 0,2 mm) en weefselmassa (112 ± 8 mg) met precisie-instrumenten.
  5. Ontleed de corticale en hippocampale weefsels op ijs. Bevries de linkerhersenhelft snel in vloeibare stikstof voor RNA-sequencing, qPCR en Simple Western.
  6. Fixeer de rechterhersenhelft in 4% paraformaldehyde (PFA) voor histologie. Dehydrateer de gefixeerde hersenen in graduele ethanol van 70% tot 100%, waarbij elke stap 30 minuten duurt.
  7. Maak de hersenen 2 uur lang vrij van xyleen. Infiltreer de weefsels met gesmolten paraffine bij 60°C gedurende 4 uur. Veranker de gezuiverde hersenen in paraffineblokken en laat ze bij kamertemperatuur stollen. Snijd coronale secties op een dikte van 5 μm met behulp van een microtoom.

4. Hematoxyline en eosine kleuring

  1. Deparaffineer weefselcoupes door objectglaasjes 3x 5 minuten onder te dompelen in xyleen. Rehydrateer de secties door middel van een gegradueerde ethanolserie: 100%, 95%, 70% en gedestilleerd water, elk gedurende 5 minuten.
  2. Kleur de secties gedurende 5 minuten met hematoxyline, afhankelijk van de gewenste kleuringsintensiteit. Spoel de secties 5 minuten in stromend kraanwater om overtollig hematoxyline te verwijderen.
  3. Differentieer de secties in 1% zoutzuur in ethanol gedurende enkele seconden om het gewenste contrast te bereiken. Spoel opnieuw 5 minuten af in stromend kraanwater. Kleur de secties gedurende 1 minuut met eosine.
  4. Spoel de secties kort af in gedestilleerd water. Dehydrateer de secties door middel van een gegradueerde ethanolreeks: 70%, 95% en 100%, elk gedurende 5 minuten.
  5. Spoel de secties 3x 5 minuten in xyleen. Monteer de secties met een dekglaasje met behulp van een montagemedium. Maak foto's met behulp van een Nikon Eclipse Ni-U-microscoop met een 20x objectief.

5. Immunofluorescentie

  1. Fixeer het weefsel door de objectglaasjes 15 minuten bij kamertemperatuur onder te dompelen in 4% PFA. Was de objectglaasjes 3x 5 minuten in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om overtollig PFA te verwijderen.
  2. Permeabiliseer het weefsel door objectglaasjes te incuberen met 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Blokkeer de niet-specifieke binding door de objectglaasjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te incuberen met 5% normaal serum.
  3. Incubeer met de primaire antilichamen IBA-1 en GFAP, verdund in een blokkeerbuffer in een verdunning van 1:2000, 's nachts bij 4 °C, afhankelijk van de specificaties van de antilichamen. Was de objectglaasjes 3x 5 minuten in PBS om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen.
  4. Incubeer met Geit Anti-Konijn IgG secundair antilichaam geconjugeerd aan Alexa Fluor 488, verdund bij 1:1000 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Was de dia's in PBS gedurende 5 minuten, 3x, om overtollig secundair antilichaam te verwijderen.
  5. Monteer de dia's met een antifade montagemedium dat DAPI bevat. Sluit het dekglaasje af met doorzichtige nagellak.
  6. Leg fluorescentiebeelden vast met behulp van een confocaal microscoopsysteem met een 20-voudig objectief.
  7. Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit met behulp van ImageJ. Voer kwantitatieve analyse uit met behulp van ImageJ's Analyze Particles-tool met groottedrempels van 50-200μm2 (microglia) en 100-500μm2 (astrocyten). Trek de achtergrond af met behulp van het Rolling Ball-algoritme (straal = 50 pixels).

6. qPCR-analyse

  1. Extraheer totaal RNA uit weefsel met behulp van een RNA-extractiekit. Volg het protocol van de fabrikant voor homogenisatie, lysis en RNA-zuivering.
  2. Kwantificeer het geëxtraheerde RNA met behulp van een spectrofotometer om de concentratie te meten en de zuiverheid te beoordelen (verhouding A260/A280). Zorg ervoor dat de RNA-concentratie geschikt is voor cDNA-synthese (100-500 ng/μL).
  3. Beoordeel de kwaliteit van het RNA met behulp van een bioanalyzer. Zorg ervoor dat het RNA geen degradatie vertoont (scherpe banden voor 18S en 28S rRNA) en een RNA-integriteitsnummer (RIN) van meer dan 7 heeft.
  4. Bereid een reactiemengsel van 20 μl met 1 μg RNA, reverse transcriptiebuffer, oligo-dT, dNTP's, RNaseremmer en reverse transcriptase.
  5. Incubeer gedurende 60 minuten bij 42 °C om cDNA te synthetiseren. Verwarm gedurende 5 minuten bij 85 °C om de reverse transcriptase te deactiveren.
  6. Combineer cDNA, mastermix, voorwaartse primer, omgekeerde primer (tabel 1) en nucleasevrij water in een PCR-plaat met 96 putjes. Gebruik 2 μL cDNA per 20 μL reactie en zorg voor een uiteindelijke primerconcentratie van 200 nM. Sluit de plaat af met een optische kleeffolie om verdamping te voorkomen.
Genprimer volgorde (5'-3', vooruit/achteruit)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
TAGGGGACGTGTGTCATCAC
IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17ATCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
IL-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTTTT
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

Tabel 1: qPCR-sequentieprimers.

  1. Plaats de reactieplaat in een real-time PCR-instrument en programmeer de thermische cycler. Gebruik de volgende cyclusomstandigheden: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 30 s.
  2. Normaliseer de expressie van de doelgenen naar GAPDH. Bereken relatieve expressieniveaus met behulp van de ΔΔCt-methode en presenteer de gegevens als vouwveranderingen in vergelijking met de controlegroep.

7. Analyse van RNA-sequencing

  1. Verdoof en euthanaseer de muis volgens de protocollen voor dierenverzorging van instellingen. Onmiddellijk perfuseren met koude PBS om circulerend bloed te verwijderen.
  2. Ontleed de hersenen op ijs. Isoleer de hersenschors met behulp van steriele dissectiehulpmiddelen. Minimaliseer de dissectietijd om de RNA-integriteit te behouden.
  3. Bevries het corticale weefsel snel in vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 °C als RNA-extractie niet onmiddellijk wordt uitgevoerd.
  4. Homogeniseer de bevroren cortex (30-50 mg) in 1 ml RNA-extractiereagens met behulp van een gemotoriseerde homogenisator totdat er geen zichtbare fragmenten meer zijn.
  5. Voer chloroformfasescheiding uit. Voeg 200 μL chloroform toe, schud krachtig gedurende 15 s, incubeer gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C.
  6. Breng de bovenste laag over in een nieuwe buis, voeg een gelijk volume van 70% ethanol toe en ga verder met RNA-zuivering met behulp van een kit op basis van silicakolommen.
  7. Gebruik on-column DNase-digestie om genomisch DNA te verwijderen tijdens RNA-zuivering. Verzamel totaal RNA in 30-50 μL en bewaar op ijs voor onmiddellijk gebruik.
  8. Gebruik een spectrofotometer om de RNA-concentratie en -zuiverheid te kwantificeren. Bevestig de A260/A280-verhouding van ~2,0. Analyseer 1 μL RNA op een Bioanalyzer. Zorg ervoor dat RIN groter is dan 8.0 voor sequencing.
  9. Gebruik een poly(A)-selectieprotocol en een gestrande bibliotheekvoorbereidingskit. Volg het protocol van de fabrikant om bibliotheken van 300-400 bp te genereren. Zuiver bibliotheken met een commerciële kit.
  10. Gebruik een bioanalyzer om de fragmentgrootte te bevestigen en kwantificeer met een pool bibliotheken in evenwicht. Voer sequencing met gepaarde uiteinden uit (2x, 150 bp) met behulp van een Illumina-platform.
  11. Trim adaptors met Trim Galore, beoordeel de kwaliteit met FastQC, stem lezingen af op het muizengenoom (GRCm39) met behulp van STAR en kwantificeer genexpressie met featureCounts. Identificeer differentieel tot expressie gebrachte genen met behulp van DESeq2.
  12. Gebruik de output van DESeq2 en filter op significant differentieel tot expressie gebrachte genen DEG's (aangepaste p-waarde < 0,05 en |log2FC| > 1). Voer een GO- en KEGG-routeverrijkingsanalyse uit met behulp van Phyper op basis van de hypergeometrische test. Identificeer routes met een gecorrigeerde P-waarde ≤ 0,05 als statistisch significant.

8. Eenvoudige westerse analyse

  1. Homogeniseer de hersenschors van de muis in de RIPA-buffer met protease- en fosfataseremmers en centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C om vuil te verwijderen. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-test.
  2. Denatureer de eiwitmonsters door ze te mengen met de monsterbuffer en gedurende 5 minuten bij 95°C te incuberen om een volledige denaturatie te garanderen.
  3. Laad 3 μL gedenatureerde eiwitmonsters in de Simple Western haarvaten. Zorg ervoor dat de monsters goed worden geladen om overlopen te voorkomen. Plaats de haarvaten in het Simple Western instrument.
  4. Incubeer de gescheiden eiwitten met 1:50 verdunde primaire antilichamen, waaronder p-STAT3, STAT3, RORγt, TGF-β, IL-6 en IL-17, gedurende 30 minuten.
  5. Was het capillaire systeem met wasbuffer gedurende drie wasbeurten van elk 5 minuten om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen. Voeg het HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam verdund in blokkeerbuffer toe en incubeer gedurende 30 minuten.
  6. Voer 3 wasbeurten van elk 5 minuten uit met wasbuffer om overtollig secundair antilichaam te verwijderen. Voer het detectieprogramma uit op het Simple Western-systeem om de eiwitten automatisch te detecteren met behulp van chemoluminescentie.
  7. Analyseer de gegevens met behulp van de Compass for Simple Western software. Kwantificeer de eiwitexpressie door de relatieve piekgebieden in het elektroferogram te vergelijken. Normaliseer de gegevens naar GAPDH-eiwit.

9. Statistische analyse

  1. Open GraphPad Prisma 9.0.0. software. Klik op Bestand > Gegevens importeren om gegevens te laden. Presenteer gegevens als gemiddelden ± SD. Gebruik de ongepaarde t-toets voor vergelijkingen tussen twee groepen.
  2. Beoordeel de normaliteit met behulp van de Shapiro-Wilk-test. Als de normaliteit wordt geschonden (p < 0,05), pas dan de Mann-Whitney U-test toe voor vergelijkingen tussen groepen. Als aan de normaliteit is voldaan (p ≥ 0,05), voer dan een onafhankelijke steekproef t-test uit om groepsverschillen te evalueren.
  3. Rapporteer resultaten met p-waarden. Beschouw p < 0,05 als statistisch significant. Gebruik de volgende notatie: n.s. voor niet significant, * voor p < 0,05, ** voor p < 0,005, *** voor p < 0,0005 en **** voor p < 0,0001.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Cognitieve stoornissen bij RBI-muizen
Na blootstelling aan een bestraling van de hele hersenen met 30 Gy werd het lichaamsgewicht van de muizen wekelijks gecontroleerd. De cognitieve functie werd geëvalueerd tijdens de4e week (Figuur 1A). De eerste metingen gaven aan dat het lichaamsgewicht van de controle- en RBI-groep vergelijkbaar was. Tussen 1 en 3 weken na bestraling vertoonde de RBI-groep ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kritieke stappen binnen het protocol
Dit protocol omvat de inductie van RBI bij muizen, gevolgd door uitgebreide beoordelingen van neuro-inflammatie en de Th17-celdifferentiatieroute (Figuur 6). Een kritieke stap is craniale bestraling van C57BL/6-muizen met een dosis van 30 Gy, een ingeburgerd model voor RBI1. Nauwkeurige dosiskalibratie met behulp van ionisatiekamers zorgt voor reproduceerbaarheid

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Ondersteuning voor dit werk werd verleend door het Beijing Institute of Radiation Medicine

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12-230 kDa Separation Module, 8 x 25 capillary cartridgesProteinSimpleSM-W004voor SimpleWestern
anti-GAPDH-antilichaamProteintechHRP-600041:500 verdunning/antilichaam voor SimpleWestern
anti-GFAP-antilichaamAbcamab72601:2000 verdunning/antilichaam voor immunofluorescentie
anti-IBA-1-antilichaamAbcamab1788461:2000 verdunning/antilichaam voor immunofluorescentie
anti-IL-17 A/F-antilichaamThermoMA5-237481:10 verdunning/antilichaam voor SimpleWestern
anti-IL-1β-antilichaamCST122421:50 verdunning/antilichaam voor SimpleWestern
anti-IL-6-antilichaamThermoMA5-238001:5 verdunning/antilichaam voor SimpleWestern
Anti-muis detectiemoduleProteinSimpleDM-002secundair antilichaam voor SimpleWestern
anti-P-STAT3(Try705)-antilichaamThermoMA5-151931:2 verdunning/antilichaam voor SimpleWestern
Anti-konijn detectiemoduleProteinSimpleDM-001secundair antilichaam voor SimpleWestern
anti-RORγt-antilichaamThermo14-6988-821:5 verdunning/antilichaam voor SimpleWestern
anti-STAT3-antilichaamThermo7100771:20 verdunning/antilichaam voor SimpleWestern
anti-TGF β-1,2,3-antilichaamThermoMA5-237951:10 verdunning/antilichaam voor SimpleWestern
BAC-assayThermoA55860eiwitanalyses
EZ Standard Pack 1 12-230 kDaProteinSimplePS-ST01EZ-8voor SimpleWestern
Gekapt anti-konijn IgG H&LAbcamab1500771:1000 verdunning/antilichaam voor immunofluorescentie
RNeasy-kitQiagen74134RNA-extractie
SuperScript IV First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher Scientific18091050Omgekeerde transcriptie
SYBR Green Master MixTakara BioRR820AQ-PCR
TRIzol-reagensInvitrogen15596026RNA-extractie

Referenties

  1. Milano, M. T., et al. Radiation-induced edema after single-fraction or multifraction stereotactic radiosurgery formeningioma: a critical review. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (2), 344-357 (2018).
  2. Tian, Y., et al. Radiation encephalopathy in nasopharyngeal carcinoma patients in mainland China: a systematic evaluation. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 24 (5), 471-473 (2002).
  3. Na, A., et al. Cerebral radiation necrosis. Asia Pac J Clin Oncol. 10 (1), 11-21 (2014).
  4. Deangelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344 (2), 114-123 (2001).
  5. Kumar, A. J., et al. Malignant gliomas: MR imaging spectrum of radiation therapy-and chemotherapy-induced necrosis of the brain after treatment. Radiology. 217 (2), 377-384 (2000).
  6. Minniti, G., et al. Single-fraction versus multifraction (3 x 9 Gy) stereotactic radiosurgery for large (>2 cm) brain metastases: acomparative analysis of local control and risk of radiation-induced brain necrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 95 (4), 1142-1148 (2016).
  7. Minniti, G., et al. Repeated stereotactic radiosurgery for patients with progressive brain metastases. J Neurooncol. 126 (1), 91-97 (2016).
  8. Turnquist, C., Harris, B. T., Harris, C. C. Radiation-induced brain injury: current concepts and therapeutic strategies targeting neuroinflammation. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa057(2020).
  9. Raphael, I., et al. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine. 74 (1), 5-17 (2015).
  10. Moser, T., et al. The role of TH17 cells in multiple sclerosis: Therapeutic implications. Autoimmun Rev. 19 (10), 102647(2020).
  11. MacMahon, C. A., et al. The Pathogenesis of Parkinson's Disease: A Complex Interplay Between Astrocytes, Microglia, and T Lymphocytes. Front Neurol. 12, 666737(2021).
  12. Kebir, H., et al. Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation. Nat Med. 13 (10), 1173-1175 (2007).
  13. Omenetti, S., et al. The Intestine Harbors Functionally Distinct Homeostatic Tissue-Resident and Inflammatory Th17 Cells. Immunity. 51 (1), 77-89.e6 (2019).
  14. Mangold, C. A., et al. Sexually divergent induction of microglial-associated neuroinflammation with hippocampal aging. J Neuroinflammation. 14 (1), 141(2017).
  15. SEER Cancer Stat Facts: Head and Neck Cancer. , National Cancer Institute. https://seer.cancer.gov/statfacts/html/headneck.html (2025).
  16. Holmes-Hampton, G. P., et al. Time- and sex-dependent delayed effects of acute radiation exposure manifest via miRNA dysregulation. iScience. 27 (2), 108867(2024).
  17. Kempf, S. J., et al. The cognitive defects of neonatally irradiated mice are accompanied by changed synaptic plasticity, adult neurogenesis and neuroinflammation. Mol Neurodegener. 9, 57(2014).
  18. Zhao, J., et al. RNA-seq reveals Nup62 as a potential regulator for cell division after traumatic brain injury in mice hippocampus. PeerJ. 11, e14913(2023).
  19. Zhang, P., et al. Quantitative proteomics analysis to identify diffuse axonal injury biomarkers in rats using iTRAQ coupled LC-MS/MS. J Proteomics. 133, 93-99 (2016).
  20. Sormunen, A., et al. Comparison of Automated and Traditional Western Blotting Methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
  21. Mishra, M., et al. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  22. Edouard, S., et al. Automated Western immunoblotting detection of anti-SARS-CoV-2 serum antibodies. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 40 (6), 1309-1317 (2021).
  23. Galland, F., et al. Astrocyte culture models: Molecular and function characterization of primary culture, immortalized astrocytes and C6 glioma cells. Neurochem Int. 131, 104538(2019).
  24. Wu, B., et al. The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation. Immunity. 54 (2), 308-323.e6 (2021).
  25. Korn, T., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  26. Kumar, R., et al. RORγt protein modifications and IL-17-mediated inflammation. Trends Immunol. 42 (11), 1037-1050 (2021).
  27. Qin, Z., et al. TCR signaling induces STAT3 phosphorylation to promote TH17 cell differentiation. J Exp Med. 221 (3), e20230683(2024).
  28. Lampert, P. W., et al. Delayed effect of radiation on the human central nervous system, 'early' and 'late' delayed reactions. Neurology. 14, 912-917 (1964).
  29. Martin, A., et al. Neurological imaging of brain damages after radiotherapy and/or chemotherapy. J Neuroradiol. 41 (1), 52-70 (2014).
  30. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17, 13(2016).
  31. Allen, B. D., et al. Mitigation of helium irradiation-induced brain injury by microglia depletion. J Neuroinflammation. 17 (1), 159(2020).
  32. Singh, R. P., et al. Th17 cells in inflammation and autoimmunity. Autoimmun Rev. 13 (12), 1174-1181 (2014).
  33. Monje, M. L., Toda, H., Palmer, T. D. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis. Science. 302 (5651), 1760-1765 (2003).
  34. Pazzaglia, S., et al. Neurocognitive Decline Following Radiotherapy: Mechanisms and Therapeutic Implications. Cancers. 12 (1), 146(2020).
  35. Zhang, X., et al. DNA methylation changes and their role in radiation-induced brain injury,". Neurobiol Dis. 129, 96-104 (2019).
  36. Lee, H. J., et al. Profiling of gene expression in the brain associated with anxiety-related behaviors in the chronic phase following cranial irradiation. Sci Rep. 12 (1), 13162(2022).
  37. Cañada-García, D., Arévalo, J. C. A Simple, Reproducible Procedure for Chemiluminescent Western Blot Quantification. Bio Protoc. 13 (9), e4667(2023).
  38. Raber, J., et al. Radiation-induced cognitive impairments are associated with changes in indicators of hippocampal neurogenesis. Radiat Res. 162 (1), 39-47 (2004).
  39. Zhang, J., et al. Th17 cell-mediated neuroinflammation is involved in neurodegeneration of aβ1-42-induced Alzheimer's disease model rats. PLoS One. 8 (10), e75786(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

RNA sequencingneuro inflammatiecognitieve dysfunctiemicroglia activatieastrocytenactivatieMorris water mazeSimple WesternqPCR analyse
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.