Dit protocol schetst geoptimaliseerde technieken voor het analyseren van fotoreceptordegeneratie en -behoud in een muizenmodel van retinitis pigmentosa, inclusief intravitreale toediening van geneesmiddelen, cryostaatsecties en immunofluorescentie. De methode waarborgt de integriteit van het netvlies en levert kwantitatieve gegevens over de effectiviteit van therapeutische interventies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van fotoreceptordegeneratie en -behoud in een retinitis pigmentosa-muismodel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Retinopathieën treffen wereldwijd honderden miljoenen mensen en zijn belangrijke oorzaken van slechtziendheid en blindheid. Van deze ziekten is retinitis pigmentosa (RP) een erfelijke oogaandoening die wordt gekenmerkt door progressieve retinale degeneratie, die wereldwijd ongeveer 1,5 tot 2 miljoen mensen treft. Proof of concept studies in diermodellen van erfelijke retinale dystrofieën vormen een belangrijke bewijsbasis voor studies naar pathofysiologische mechanismen van de ziekte, effectiviteit en veiligheid van de behandeling. Intravitreale injectie bij muizen en cryostaatsectie zijn veelgebruikte technieken voor het onderzoeken van geneesmiddeleffecten in RP-modellen, omdat ze een nauwkeurige afgifte van stoffen in glasvocht mogelijk maken en de voorbereiding van hoogwaardige histologische monsters voor gedetailleerde analyse van retinale veranderingen. Ook is het tellen van cellen door middel van immunofluorescentie met behulp van antilichamen tegen recoverine, een calciumafhankelijk eiwit dat tot expressie wordt gebracht in retinale fotoreceptoren, onlangs gebruikt om cellulaire veranderingen geassocieerd met retinale degeneratie in RP-modellen te bestuderen, omdat deze benadering de evaluatie van fotoreceptorverlies en mogelijk cellulair behoud na therapeutische interventies vergemakkelijkt. De intravitreale injectie is geoptimaliseerd om de integriteit van het oog en betrouwbare resultaten te garanderen, waarbij een fijne naald wordt gebruikt om de oplossing in de glaskamer toe te dienen. Na een vooraf bepaalde periode om de effecten van het geneesmiddel te beoordelen, wordt histologische verwerking uitgevoerd, waarbij monsters met een dikte van 10 μm worden doorgesneden met behulp van een cryostaat, gevolgd door immunofluorescentielabeling met recoverine-antilichamen. Ten slotte wordt een celtelling uitgevoerd om te beoordelen of de behandeling met geneesmiddelen een beschermend effect uitoefende, zoals blijkt uit het behoud van fotoreceptoren. Hoewel deze technieken op grote schaal zijn toegepast om consistente gegevens te genereren in retinopathieonderzoek, blijven er uitdagingen bestaan bij het bereiken van nauwkeurige weefselbehandeling en verwerkingskwaliteit. Dit protocol biedt een gestandaardiseerde aanpak om elke stap te optimaliseren, van intravitreale injectie tot de voorbereiding van histologische coupes, waardoor reproduceerbare en hoogwaardige resultaten worden gegarandeerd.
Inleiding
Visie is een van de meest complexe zintuigen van het sensorische systeem, essentieel voor het vastleggen van visuele prikkels uit de omgeving en het vertalen ervan in elektrochemische signalen, die in de hersenen worden verwerkt om beelden te vormen. Verschillende biologische factoren, zoals veroudering, genetische defecten en ziekten, kunnen het gezichtsvermogen in gevaar brengen, wat een aanzienlijke invloed heeft op de kwaliteit van leven en dagelijkse activiteiten.
Het menselijk oog bestaat uit drie primaire kamers. De buitenste laag, gevormd door het hoornvlies en de sclera, biedt structurele ondersteuning aan de oogbol. De tussenlaag omvat de iris, het corpus ciliare en het vaatvlies, waarbij de laatste verantwoordelijk is voor de bloedtoevoer naar de fotoreceptoren. Ten slotte bestaat de binnenste laag uit het netvlies, een structuur die verantwoordelijk is voor het verwerken van lichtstimuli en het omzetten van licht in elektrische signalen die naar de hersenen worden gestuurd voor beeldvorming 1,2.
Het neurale netvlies bestaat uit verschillende cellulaire lagen, waaronder gespecialiseerde cellen zoals fotoreceptoren, bipolaire cellen, horizontale cellen, amacriene cellen en ganglioncellen. Bovendien bevat het netvlies gliacellen zoals microglia, astrocyten en Müller-cellen, evenals gepigmenteerde epitheelcellen. Deze laatste, die zich in het niet-neurale deel van het netvlies bevindt, speelt een cruciale rol bij het behoud van structurele integriteit, bescherming en ondersteuning van fotoreceptoren 3,4. Het neurale deel bevat sensorische en neuronale cellen die direct betrokken zijn bij het opvangen en verwerken van licht 5,6,7.
Omdat het essentieel is voor het gezichtsvermogen, wordt het netvlies vaak aangetast door pathologieën die tot blindheid kunnen leiden. Onder deze aandoeningen onderscheidt retinitis pigmentosa (RP) zich als een van de belangrijkste erfelijke retinopathieën, met meer dan 80 genen geassocieerd met de etiologie 8,9. RP is een heterogene ziekte, die voornamelijk op een autosomaal dominante of recessieve manier wordt overgeërfd, maar ze kan ook voorkomen als X-gebonden of als gevolg van spontane mutaties10.
Met een wereldwijde prevalentie geschat tussen 1 op 3.000 en 1 op 7.000 personen, afhankelijk van de populatie en geografische regio11,12, manifesteert RP zich meestal tijdens de adolescentie of vroege volwassenheid, met initiële symptomen zoals verminderd nachtzicht en verlies van perifeer gezichtsveld. Naarmate de ziekte vordert, raakt het centrale zicht aangetast, wat mogelijk kan leiden tot totale blindheid 9,13.
Hoewel er nog geen remedie is voor RP, hebben verschillende therapieën in ontwikkeling aangetoond dat ze de ziekteprogressie kunnen vertragen of omkeren. Tot deze benaderingen behoren genetische, cellulaire en farmacologische therapieën, evenals elektronische apparaten. Om het begrip van RP te vergroten en nieuwe interventies te evalueren, zijn muizenmodellen van retinale degeneratie op grote schaal gebruikt. Deze modellen, vaak aangeduid als rd (retinale degeneratie), zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van de moleculaire basis en therapieën voor RP. Van de verschillende modellen die worden gebruikt bij de studie van retinitis pigmentosa, vertoont de Pde6βrd10/rd10 (rd10) muizenstam een missense-mutatie in het gen dat codeert voor de staafspecifieke β-subeenheid van fosfodiësterase14, die een langzame degeneratie van fotoreceptoren vertoont die vergelijkbaar is met wat bij mensen gebeurt15.
Intravitreale toediening van geneesmiddelen is veel gebruikt in verschillende onderzoeken 16,17,18. Dit protocol is geschikt voor onderzoekers die de effecten van geneesmiddelen op het netvlies bestuderen, met name met betrekking tot de overleving van fotoreceptorcellen. Op deze manier is het primaire doel van dit protocol het optimaliseren van de toediening van geneesmiddelen via intravitreale injectie in een muizenmodel van retinitis pigmentosa (RP) en het beoordelen van de overleving van fotoreceptoren met behulp van immunofluorescentie voor recoverine, een fotoreceptorcelmarker. Intravitreale injectie maakt gelokaliseerde toediening van geneesmiddelen mogelijk, waardoor systemische bijwerkingen worden geminimaliseerd, de biologische beschikbaarheid van het netvlies wordt verhoogd en bijwerkingen in andere organen worden verminderd. Aan de andere kant maakt immunofluorescentie voor recoverine een specifieke analyse van de overleving van fotoreceptoren mogelijk, wat een effectief hulpmiddel is om de werkzaamheid van deze therapeutische strategie te evalueren. Hun toepasbaarheid hangt echter af van factoren zoals de selectie van diermodellen, de precisie van de injectie en de duur van de behandeling, waarmee rekening moet worden gehouden bij het aanpassen van deze methode aan andere experimentele omgevingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het project en alle protocollen die erin worden uitgevoerd, volgen de richtlijnen voor dierenverzorging van de Nationale Raad voor de Controle van Dierproeven en zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Diergebruik (CEUA - UFF) onder het nummer 1464280219.
1. Dieren
- Gebruik de rd10 muizenstam, die fotoreceptordegeneratie ondergaat, en de C57 Black/6-stam (achtergrond van rd10). Houd deze soorten onder een licht-donkercyclus van 12 uur/12 uur, met ad libitum toegang tot water en voedsel.
2. Anesthesie
- Voer een intraperitoneale injectie uit met een verdovingsmiddel bereid in een dosis van 80 mg/kg ketamine en 8 mg/kg xylazine, verdund in gedestilleerd water. Ketamine werkt als een N-methyl-D-aspartaatreceptor (NMDA)-receptorremmer en heeft een pijnstillende werking, terwijl xylazine werkt als een verdovend kalmerend middel.
- Bereken voor de intraperitoneale injectie het te injecteren volume als 10 μl x gewicht (g).
- Houd de muis vast om een duidelijke toegang tot de buik te garanderen. Reinig het kwadrant rechtsonder van de buikholte met 70% alcohol, waar de naald moet worden ingebracht met de afschuining naar boven.
- Om de afwezigheid van een pijnreflex te bevestigen, knijpt u voorzichtig in de staart of poot van het dier. Als er geen reactie is, geeft dit aan dat het dier goed verdoofd is.
3. Intravitreale injectie
- Terwijl de dieren verdoofd zijn, stelt u de ogen bloot en identificeert u met behulp van een binoculaire stereoscopische microscoop met een vergroting van 10x het limbusgebied, een grijze band tussen het hoornvlies en de sclera, waar de injectie zal worden uitgevoerd.
- Om de injectie uit te voeren, is de hulp van een andere persoon nodig. Onder een binoculaire stereoscopische microscoop moet één persoon het dier vasthouden en de naald inbrengen, terwijl de assistent op de zuiger van de spuit drukt om de stof in het oog te brengen.
- Gebruik eerst een ultrafijne spuit met een vaste naald (31 G x 6 mm) om een punctie in het limbusgebied te maken, waarbij u ervoor zorgt dat u de naald niet te diep inbrengt; Het inbrengen van slechts de helft van de afschuining is voldoende.
- Steek vervolgens de draagbare voorgesteriliseerde microspuit (meter 26 S zonder afschuining), die 1 μl van de betreffende vloeistof/het betreffende geneesmiddel bevat, in de punctie die door de insulinespuit wordt gemaakt.
- Laat de assistent de zuiger van de spuit langzaam indrukken en zorg ervoor dat het volledige volume gedurende ongeveer 30 s wordt toegediend.
- Herhaal het proces voor het andere oog van hetzelfde dier en noteer de tijd.
- Als er meer dan één experimentele groep is, markeer dan het oor van het dier om ervoor te zorgen dat elke groep correct wordt geïdentificeerd.
- Gebruik 1 druppel 0,01 M PBS-oplossing in elk oog van het dier om uitdroging te voorkomen.
- Na deze procedures legt u de dieren op een verwarmingskussen, met de temperatuur ingesteld op 37 °C, totdat ze wakker worden. Het kan 1-2 uur duren. Houd de dieren continu in de gaten terwijl ze verdoofd zijn, en zodra ze wakker zijn, breng ze terug naar hun kooien tot het moment van analyse.
- Voer een eerste trainingssessie uit met een zichtbare kleurstof, zoals trypanblauw, om operators te helpen hun intravitreale injectietechniek bij muizen te verfijnen.
OPMERKING: De kleurstof vergemakkelijkt de visualisatie van het naaldpad, waardoor nauwkeurige aanpassingen in diepte en hoek van de injectie mogelijk zijn, waardoor het risico op beschadiging van de oogstructuur wordt verminderd en de veiligheid van de procedure wordt verhoogd.
4. Euthanasie en voorbereiding van de ogen
- Na een bepaalde duur van de behandeling na de injectie worden de dieren geëuthanaseerd via inhalatie van een overdosis van 5% isofluraan. Ga door met de blootstelling tot ten minste 1 minuut na het stoppen van de ademhaling. Om de dood te garanderen, houdt u het dier bij de achterkant van de nek vast en oefent u stevige tractie uit op de staart totdat cervicale dislocatie is bereikt.
- Voordat u de ogen verwijdert, markeert u de temporale pool. Breng de marker of hete naald/pin voorzichtig aan op het temporale gebied van de sclera en zorg ervoor dat de markering zichtbaar en nauwkeurig is. Deze stap zal dienen als referentiepunt voor oriëntatie tijdens het sectieproces.
- Stel vervolgens de ogen bloot en knip met een steriel scalpel en een iridectomieschaar het omliggende weefsel af om bind- en spierweefsel te scheiden en de oogbol bloot te leggen. Ontleed bij muizen de oogspieren zorgvuldig, omdat dit een uitdaging kan zijn. Om de procedure te vergemakkelijken, maakt u een laterale incisie met een steriel scalpel in beide hoeken van de ooghuid.
- Gebruik een gebogen tang met gemiddelde punt om de ogen voorzichtig uit de oogkas te halen door ze bij de oogzenuw vast te houden en fixeer het weefsel onmiddellijk gedurende 5 minuten in een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing bij kamertemperatuur (RT).
- Breng na fixatie in PFA-oplossing de ogen over op een glasplaat met behulp van een gebogen tang met gemiddelde punt. Deze plaat functioneert als een dissectieplatform en zorgt ervoor dat deze een fosfaatbuffer bevat met een concentratie van 0,1 M pH 7,4.
- Plaats vervolgens de plaat onder een binoculaire stereoscopische microscoop met een vergroting van 10x en maak met een scalpel een kleine incisie net boven de limbus (hoornvliesrand). Voer vervolgens een omtreksnede uit langs de limbus met een micro-iridectomieschaar om het hoornvlies te scheiden.
- Verwijder het hoornvlies, samen met de iris en de lens, met behulp van een Dumont #5 pincet. Fixeer ten slotte de ogen weer in de oplossing van 4% PFA gedurende 55 minuten. Was daarna de ogen driemaal met fosfaatbuffer 0,1 M, pH 7,4.
5. Cryopreservatie en invriezen
OPMERKING: De cryostaatsectie van het netvliesweefsel werd uitgevoerd zoals eerder beschreven met enkele aanpassingen19.
- Cryopreserveer de ogen met een sucrosegradiënt van 10%, 20% en 30%, verdund in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4. Dompel de ogen achtereenvolgens onder in de sucroseoplossingen, beginnend met de laagste concentratie (10%) en geleidelijk oplopend tot de hoogste (30%). Elke stap duurt de nodige tijd totdat de ogen zich op de bodem van de container nestelen, wat aangeeft dat de volgende concentratie kan worden gebruikt. Bewaar de ogen in de uiteindelijke concentratie ongeveer 12 uur bij 4 °C.
- Verwijder de volgende dag de overtollige 30% sucrose en plaats de ogen in een ronde aluminium container met een diameter van 2 cm, gerangschikt volgens de experimentele groepen.
OPMERKING: Maak een aluminiumfoliecontainer in de juiste maat volgens het aantal experimentele groepen. - Verwijder onder een binoculaire stereoscopische microscoop met een vergroting van 10x het overtollige sucrose van binnen en rond de oogbol met behulp van een pipet of filterpapier, waarbij u ervoor zorgt dat de weefselstructuur niet wordt beschadigd.
- Veranker de ogen in een vriesmedium met een optimale snijtemperatuur (OCT), zorg ervoor dat de vorming van luchtbellen in of rond de ogen wordt voorkomen en laat ze 1 uur staan bij RT.
- Plaats na 1 uur in OCT de ogen met het eerder gemarkeerde referentiepunt naar boven gericht. Plaats de aluminiumfoliecontainer op een geschikte aluminiumplaat in een kleine piepschuimdoos om in te vriezen.
- Giet voorzichtig vloeibare stikstof op de aluminium plaat, rond de foliecontainer. Zorg ervoor dat de stikstof zich gelijkmatig over het oppervlak verspreidt. Dit bevordert een uniforme bevriezing van weefsel. Zorg ervoor dat de vloeibare stikstof niet in direct contact komt met de ogen in de foliecontainer. Ga vervolgens verder met het doorsnijden van de ogen met behulp van een cryostaat.
6. Voorbereiding van de dia's
- Smeer poly-L-lysine (200 μg/ml) op de glasplaatjes met matte randen.
- Wacht 12 uur totdat de dia's droog zijn en klaar zijn voor gebruik.
7. Cryostaat doorsnede
- Plaats het bevroren blok op een cryostaat op het platform.
- Draai aan het handwiel om secties te maken met een dikte van 10 μm.
- Pas de positie van het blok aan om ervoor te zorgen dat alle ogen even aanwezig zijn in de snede.
- Ga door met knippen totdat de oogzenuw is geïdentificeerd, met behulp van een helderveldmicroscoop.
- Verzamel de secties op de voorbehandelde objectglaasjes van poly-L-lysine.
- Bewaar de objectglaasjes bij -20 °C tot analyse.
8. Immunofluorescentie
OPMERKING: Immunofluorescentie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven met enkele aanpassingen19,20.
- Incubeer de objectglaasjes verkregen uit de sectie in de cryostaat met 100 μL 0,5% Triton X-100 in 0,01 M PBS gedurende 15 minuten bij RT om het celplasmamembraan te permeeren.
- Was de objectglaasjes twee keer met 0,01 M PBS gedurende 5 minuten elk bij RT om overtollig Triton X-100 te verwijderen.
- Incubeer met 100 μL 1% runderserumalbumine (BSA) in 0,01 M PBS gedurende 30 minuten bij RT om niet-specifieke antilichaambindingsplaatsen te blokkeren.
- Incubeer na het blokkeren de coupes met 100 μL anti-recoverin in een concentratie van 1:1500 verdund in BSA 1% om fotoreceptorcellen te labelen, 's nachts bij 4 °C (koelkast).
- Incubeer de secties de volgende dag met 100 μL anti-konijn polyklonaal secundair antilichaam 488 of anti-konijn polyklonaal secundair antilichaam 568 1:500 verdund in BSA 1% gedurende 2 uur bij RT.
- Was de dia's twee keer met 0,01 M PBS gedurende 5 minuten elk bij RT.
- Incubeer de coupes met 100 μl DAPI 1 mg/ml (4',6-diamidino-2-fenylindool) gedurende 2-3 minuten bij RT.
- Was de dia één keer met 0,01 M PBS gedurende 5 minuten bij RT.
- Behandel de secties ten slotte met een montagemedium dat 2,5 g n-propylgallaat bevat in 40 ml glycerol in 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,4. Ze zullen fungeren als een anti-fade-reagens en een montagemedium, waardoor de monsters worden geconserveerd. Plaats een dekglaasje (24 mm 50 mm) op de objectglaasjes en sluit de secties vervolgens af met nagellak. Ga daarna verder met het bekijken van de monsters onder de microscoop.
9. Fluorescentie microscoop fotomicrografie
- Om beelden te verkrijgen van de cellen die zijn gelabeld met behulp van de immunohistochemietechniek, gebruikt u een fluorescentie optische microscoop die is uitgerust met blauwe, groene en rode filters. Bevestig bovendien een camera voor diamicrografie. Gebruik voor het verkrijgen van de microfoto's een computer met de LAS V3.7 (Leica) software (beeldvormingssoftware), die open moet staan voor gelijktijdige visualisatie met de microscoop.
- Plaats het objectglaasje op de microscooptafel. Gebruik in eerste instantie het objectief met de laagste vergroting en het blauwe filter.
- Pas de scherpstelling aan met behulp van de grove en fijne scherpstelknoppen totdat het netvlies met de gelabelde cellen in blauw (celkernen) duidelijk in beeld is.
- Selecteer het gewenste gebied van het netvlies voor beeldvorming. Verhoog de vergroting geleidelijk tot 40x het objectief en pas de scherpstelling naar behoefte aan.
- Nadat u de scherpstelling hebt aangepast, trekt u aan de bypass-pin om het microscoopbeeld over te brengen naar de beeldvormingssoftware. Selecteer de gewenste filters (A4 (blauw), L5 (groen) en TX2 (rood)). Pas de volgende parameters aan: Belichting, Versterking en Gamma, om ervoor te zorgen dat het beeld helder is en zo dicht mogelijk bij wat er onder de microscoop wordt waargenomen.
- Leg bij een vergroting van 400× vier velden vast met een oppervlakte van 113 × 113 μm, volgens een oriëntatie van de periferie naar het midden van het netvlies. Zorg ervoor dat twee van deze velden het perifere gebied vertegenwoordigen en twee het centrale gebied van het netvlies.
- Om microfoto's van perifere velden te verkrijgen, maakt u beelden op ongeveer 50 μm van de randen van het oog. Selecteer voor microfoto's in het centrale veld aangrenzende gebieden op 50 μm van de oogzenuw en verkrijg de beelden. Gebruik zowel het rechter- als het linkeroog voor kwantificeringen, wat resulteert in een totaal van acht geanalyseerde velden per behandeling.
- Nadat u alle microfoto's hebt gemaakt, gaat u verder met de handmatige kwantificering van de immunogelabelde cellen.
10. Kwantificering van cellen
- Open het programma ImageJ v.1.54g. Klik in het programma op Bestand, vervolgens op Openen en selecteer de afbeelding die op de computer is opgeslagen.
- Terwijl de afbeelding al is geopend, klikt u op Multipunt. Gebruik deze tool om de cellen te kwantificeren door met de linkermuisknop op elke cel te klikken die moet worden geteld.
- Kwantificeer de gelokaliseerde cellen, d.w.z. positief voor recoverine en DAPI, in de buitenste nucleaire laag (ONL).
- Wanneer de telling is voltooid, dubbelklikt u met de linkermuisknop om het totale aantal cellen te zien dat is gemarkeerd.
- Nadat u het aantal herstelpositieve cellen hebt bepaald, voert u het aantal cellen in de Excel-kwantificeringstabel in en gaat u verder met de volgende microfoto.
- Herhaal alle stappen voor de 8 velden die overeenkomen met elk dier.
- Bereken het gemiddelde van deze acht velden, die overeenkomen met een enkel experimenteel punt voor het hele netvlies (n= 1). Gebruik voor de perifere netvliesgrafiek het gemiddelde van de perifere velden, in totaal vier velden: twee van het linkeroog en twee van het rechteroog. Dit gemiddelde komt overeen met één experimenteel punt voor het perifere netvlies (n= 1). Maak het midden van de netvliesgrafiek op dezelfde manier als de perifere grafiek, waarbij alleen het gebied wordt gewijzigd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De immunofluorescentietechniek voor het labelen van fotoreceptoren, recoverine-positieve cellen, stelde ons in staat om het degeneratiepatroon van fotoreceptoren in rd10- en C57Bl6-dieren te observeren, waarbij de laatste als gezond werd beschouwd (Figuur 1). Zoals te zien is, is labeling voor recoverine-positieve cellen exclusief voor de buitenste nucleaire laag (ONL) waar fotoreceptoren worden gevonden, inclusief labeling v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het netvlies is een delicaat weefsel dat moeilijk toegankelijk is; Daarom moet worden nagedacht over de techniek die moet worden gebruikt om een farmacologische behandeling uit te voeren die gericht is op dit weefsel. Intravitreale injectie is een gevestigde en veelgebruikte techniek om geneesmiddelen rechtstreeks op het netvlies af te geven, met name bij de behandeling van oogaandoeningen zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie21, diabetische retinopathie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd uitgevoerd tijdens een onderzoeksbeurs die werd ondersteund door de Nationale Raad voor Wetenschappelijke en Technologische Ontwikkeling (CNPq), Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of Rio de Janeiro State (FAPERJ), en werd ook gedeeltelijk gefinancierd door Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.3% Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Solution voor blokkeringsbuffer |
| 1% BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | Solution voor blokkeringsbuffer |
| 1% Human BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | Fc Block vereist voor blokkeringsbuffer |
| 150 W LED lamp | Amazon | B07VH3CVSF | LED-lichtbron voor foto-irradiatie van weefsel |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | Solution voor blokkeringsbuffer en wasstappen |
| 20 Gallon Opslagcontainer | Amazon | B001B1C4G0 | Container voor foto-irradiatieproces |
| 40 W RGBW flood LED lamp | Amazon | B08QFPJSMD | RGB-lichtbron voor foto-irradiatie van weefsel |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| Alpha-smooth muscle actin DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Abcam | ab64212 | Avidine en biotine blokkeringsoplossing |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixatie-oplossing |
| BOND Dewax Solution | Leica Biosystems | NC0221076 | Ontparaffinisatie-oplossing |
| BOND Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | NC0235529 | Citraat gebaseerde pH 6 epitoop oplossing (ER1) |
| BOND Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | NC0235530 | EDTA gebaseerde pH 9 epitoop oplossing (ER2) |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems | NC0396648 | Geautomatiseerd onderzoekskleuringsreagens |
| BOND RX Research Stainer | Leica Biosystems | NA | Geautomatiseerd onderzoekskleuringsplatform |
| BOND Wash Solution | Leica Biosystems | NC0221077 | Wasbuffer |
| CD15 | BD Biosciences | 347420/AB_400298 | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82/AB_11150959 | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB8165G/AB_2728839 | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| CD45 Phycoerythrin (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE/NA | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135/AB_2892745 | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| Donkey anti-goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| Donkey anti-mouse IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/ AB_2762830 | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| Donkey anti-mouse IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| EasyDip Staining System | Newcomer Supply | 5300KIT | Scherpstellingssysteem |
| Fluoromount-G | Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | Montagemedium |
| Hoechst | Biotium | 40046 | Kernkleuring voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| Imaris File Converter x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Gratis bestandsconverter | |
| ImarisViewer software x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Gratis beeldverwerkingssoftware | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrofobe barrièrepen |
| Lithium Borohydride (1 gram) | STREM Chemicals | 93-0397 | Chemisch voor kleurstof inactivatie, koop kleine hoeveelheden van deze chemische stof (1 gram) |
| Lumican Biotin | R&D Systems | BAF2846 | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48393-241 | Glazen deksels |
| Pan-cytokeratin Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750/AB_2868569 | Antilichaam voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| PELCO BioWave Pro Microwave System | Ted Pella Inc | 36500-230 | Niet-verwarmende wetenschappelijke magnetron |
| PELCO SteadyTemp Pro | Ted Pella Inc | 50062 | Volledig geautomatiseerde temperatuurregeling voor wetenschappelijke magnetron |
| SimpleITK | Open source software | Registratie- en kanaalverwerkingssoftware | |
| Streptavidin Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | Labeling reagens voor IBEX-beeldvorming. Zie tabel 1. |
| Widefield Microscope | Leica Microsystems | NA | Leica Microsystems THUNDER imager met LED8-lichtbron en LAS X-software (3.7.1.21655). Voor fluorescentiebeeldvorming werd een aangepast quad-bandfilter met externe filterwiel (PN: 11536075) met twee extra single-bandfilters (PN: 8118215) gebruikt om zeven kleurstofkanalen per doorgang te beeldvormen. De filterexcitatie, dichroisch en emissielijnen zijn (1) Quad-Band kubus: dichroisch bij 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, geen excitatie of emissiefilters; (2) externe filterwiel positie 1: 434/ |
Referenties
- Kels, J., et al. Anatomy and physiology of the retina: a comprehensive review. Retinal J. 21, 75-92 (2015).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Tsang, S. H., Sharma, T. Retinal degeneration and gene therapy: present and future approaches. Prog Retin Eye Res. 67, 93-120 (2018).
- Gasparini, S. J., Favretto, F., La Greca, C. Biology of the retina: structure, function, and dysfunction. J Biomed Sci. 19 (3), 289-300 (2019).
- Masland, R. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
- Hoon, M., et al. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Liu, W., et al. Retinitis pigmentosa: progress in molecular pathology and biotherapeutical strategies. Int J Mol Sci. 23 (9), 4883(2022).
- Hamel, C. Retinitis pigmentosa. Orphanet J Rare Dis. 1, 40(2006).
- Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Prog Retin Eye Res. 66, 157-186 (2018).
- O'Neal, T. B., Tripathy, K., Luther, E. E. Retinitis Pigmentosa. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), e112142(2014).
- Chang, B., et al. Two mouse retinal degenerations caused by missense mutations in the beta-subunit of rod cGMP phosphodiesterase gene. Vision Res. 47 (5), 624-633 (2007).
- Jae, S. A., et al. Electrophysiological and histologic evaluation of the time course of retinal degeneration in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Korean J Physiol Pharmacol. 17 (3), (2013).
- Strettoi, E., et al. Inhibition of ceramide biosynthesis preserves photoreceptor structure and function in a mouse model of retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18706-18711 (2010).
- Rösch, S., Johnen, S., Mataruga, A., Müller, F., Pfarrer, C., Walter, P. Selective photoreceptor degeneration by intravitreal injection of N-methyl-N-nitrosourea. Investig Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1711-1723 (2014).
- Kellish, P. C., et al. Intravitreal injection of a rationally designed AAV capsid library in non-human primate identifies variants with enhanced retinal transduction and neutralizing antibody evasion. Mol Ther. 31 (12), 3441-3456 (2023).
- Molday, L. L., Cheng, C. L., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells and Subcellular Organelles by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. New York. (2019).
- Cheng, C. L., Djajadi, H., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
- Girgis, S., Lee, L. R. Treatment of dry age-related macular degeneration: a review. Clin Exp Ophthalmol. 51 (8), 835-852 (2023).
- Lee, J. Y., et al. Superoxide dismutase 3 prevents early stage diabetic retinopathy in streptozotocin-induced diabetic rat model. PLoS One. 17 (1), e0262396(2022).
- Isiegas, C., et al. Intravitreal injection of proinsulin-loaded microspheres delays photoreceptor cell death and vision loss in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Investig Ophthalmol Vis Sci. 57 (8), 3610-3618 (2016).
- Doshi, R. R., Bakri, S. J., Fung, A. E. Intravitreal injection technique. Semin Ophthalmol. 26 (3), 104-113 (2011).
- Kim, H. M., Woo, S. J. Ocular drug delivery to the retina: current innovations and future perspectives. Pharmaceutics. 13 (1), 108(2021).
- Jones, B. W., Marc, R. E., Pfeiffer, R. L. Retinal Degeneration, Remodeling and Plasticity. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482309/"K482309 (2016).
- Roche, S. L., Wyse-Jackson, A. C., Byrne, A. M., Ruiz-Lopez, A. M., Cotter, T. G. Alterations to retinal architecture prior to photoreceptor loss in a mouse model of retinitis pigmentosa. Int J Dev Biol. 60, 127-139 (2016).
- Ladha, R., Caspers, L. E., Willermain, F., de Smet, M. D. Subretinal therapy: technological solutions to surgical and immunological challenges. Front Med. 9, 846782(2022).
- Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).
- Bussing, D., et al. Pharmacokinetics of monoclonal antibody and antibody fragments in the mouse eye following intravitreal administration. J Pharm Sci. 112 (8), 2276-2284 (2023).
- Roberge, F. G., de Kozak, Y., Utsumi, T., Faure, J. P., Nussenblatt, R. B. Immune response to intraocular injection of retinal S-antigen in adjuvant. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 227 (1), 67-71 (1989).
- Ishikawa, T., Hokama, H., Katagiri, Y., Goto, H., Usui, M. Effects of intravitreal injection of tacrolimus (FK506) in experimental uveitis. Curr Eye Res. 30 (2), 93-101 (2005).
- Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry: the red, brown, and blue technique. Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).
- Gargini, C., Terzibasi, E., Mazzoni, F., Strettoi, E. Retinal organization in the retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse: a morphological and ERG study. J Comp Neurol. 500 (2), 222-238 (2007).
- Haverkamp, S., Wässle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J Comp Neurol. 424, 1-23 (2000).
- Haverkamp, S., Ghosh, K. K., Hirano, A. A., Wässle, H. Immunocytochemical description of five bipolar cell types of the mouse retina. J Comp Neurol. 455, 463-476 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
