Methodenartikel

In vivo Beeldvorming van neurale activiteit bij onverdoofde Drosophila-volwassen vliegen

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68332

⸱

20 juni 2025

 , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

In dit artikel

Samenvatting

Een belangrijke barrière voor het bestuderen van cellulaire activiteit tijdens cognitieve processen zoals leren en geheugen is het gebruik van anesthetica voor in vivo beeldvormingsvoorbereiding. Anesthesie schaadt het kortetermijngeheugen en de cognitie in meerdere modellen, waaronder Drosophila. Deze studie presenteert een unieke methode voor het bereiden van volwassen Drosophila voor in vivo beeldvorming zonder verdoving.

Samenvatting

In vivo beeldvorming is cruciaal voor het bestuderen van neurobiologie in Drosophila , omdat het real-time visualisatie mogelijk maakt van neuronale activiteit, ontwikkeling en plasticiteit in de intacte, zich gedragende vlieg. Deze techniek biedt onschatbare inzichten in dynamische processen, zoals synaptische functie en circuitconnectiviteit, die niet nauwkeurig kunnen worden vastgelegd in vaste of ex vivo preparaten. De meeste technieken voor vliegvoorbereiding voor in vivo beeldvorming omvatten het verdoven van de vliegen kort voor functionele beeldvorming. Desalniettemin toont uitgebreid bewijs aan dat anesthesie invloed heeft op verschillende cognitieve en fysiologische processen. Om deze reden is in vivo beeldvorming van volwassen Drosophila melanogaster zonder het gebruik van anesthetica tijdens de voorbereiding van dieren een uitdagende maar zeer wenselijke benadering. Het hier gepresenteerde protocol omvat het immobiliseren van de kop van wakkere vliegen door de slurf in een kleine metalen buis te zuigen die is aangesloten op een vacuümsysteem. Terwijl het hoofd gefixeerd is, wordt de vlieg voorbereid op functionele beeldvorming zonder dat anesthesie nodig is. Dit protocol is snel en reproduceerbaar en zorgt ervoor dat de vlieg geen schade oploopt. Het belangrijkste voordeel van deze methode ligt in het vermijden van het gebruik van anesthetica, waardoor rekening wordt gehouden met de mogelijke complexe effecten van anesthesie op neurale activiteit. Deze methode is zowel betaalbaar als zeer aanpasbaar en maakt gebruik van goedkope, aanpasbare tools. Het zorgt voor een succesvolle beeldvorming van levende vliegen, waarbij snelle veranderingen in neurale activiteit worden vastgelegd die verband houden met dynamische cognitieve processen.

Inleiding

Recente ontwikkelingen in genetisch gecodeerde activiteitsreporters hebben een revolutie teweeggebracht in de neurowetenschappen door realtime, zeer specifieke inzichten te bieden in neuronale activiteit. Deze reporters, zoals calcium- of spanningssensoren 1,2,3,4,5,6,7,8,9, stellen onderzoekers in staat om de elektrische en chemische signalen in neuronen te volgen met ongekende temporele precisie en ruimtelijke resolutie. Door het mogelijk te maken om specifieke, afzonderlijke neuronen naar neurale netwerken in verschillende hersengebieden te monitoren, hebben deze tools ons begrip verdiept van hoe neuronale vuurpatronen zich verhouden tot cognitieve processen zoals leren, geheugen of besluitvorming 10,11,12,13,14.

Om te profiteren van deze genetisch gecodeerde indicatoren, ontwikkelden onderzoekers geavanceerde methoden om hun modelorganisme voor te bereiden op in vivo beeldvorming. Het eerste rapport van neuronale plasticiteit door in vivo functionele beeldvorming, vaak aangeduid als een "geheugenspoor", werd ontdekt in de antennekwab van de honingbijen na eetlust olfactorische conditionering15. Deze ontdekking inspireerde onderzoek in het genetisch veelzijdige modelorganisme, Drosophila melanogaster, wat leidde tot de ontwikkeling van innovatieve in vivo beeldvormingstechnieken 10,16,17,18.

Drosophila dient als een uitstekend model voor het begrijpen van leren en geheugen vanwege het robuuste vermogen om olfactorische herinneringen te vormen via klassieke conditionering, waarbij een geur (de geconditioneerde stimulus-CS) wordt geassocieerd met een aversieve of belonende stimulus (de ongeconditioneerde stimulus-US)19,20,21,22. In Drosophila zijn geuren schaars vertegenwoordigd in het paddenstoelenlichaam (MB)23, een cruciaal hersengebied voor associatief geheugen dat bestaat uit ongeveer 2.000 Kenyon-celneuronen (KC's) per hemisfeer24. Olfactorische informatie wordt van de kelk naar de MB-lobben verzonden via KC-axonen, die zich bundelen om de lobben te vormen. Tijdens olfactorische conditionering wordt de VS, zoals een elektrische schok of een suikerbeloning, naar de MB-lobben getransporteerd via verschillende dopaminerge neuronen (DAN's): PPL1-neuronen voor aversieve stimuli en PAM-neuronen voor belonende stimuli 25,26,27,28,29,30. Geheugenverwerving wordt verondersteld de gelijktijdige activering van CS- en US-routes in te houden, wat resulteert in een synergetische toename van cyclisch AMP (cAMP), dat codeert voor het geheugen31,32. Dit proces induceert plasticiteit bij de KC→MBON-synapsen, waardoor hun synaptisch gewicht 11,12,13,33,34,35,36,37 wordt gewijzigd. DAN-gemedieerde plasticiteit drijft uiteindelijk de outputneuronen (MBON's) van de paddenstoel ertoe om een toenadering of vermijdingsgedrag ten opzichte van de aangeleerde geur uit te lokken34. Het huidige model suggereert dat de informatiestroom van KC's naar de MBON's de representatie van geur transformeert van geuridentiteit in KC's naar meer abstracte informatie in de MBON's, zoals de valentie van een geur op basis van eerdere ervaring34,38. In tegenstelling tot KC's hebben MBON's breed afgestemde geurreacties; elke gegeven geur resulteert in een reactie op de meeste MBON's39. De geurafstemming van de MBON's wordt gewijzigd door synaptische plasticiteit en varieert aanzienlijk tussen individuele vliegen, wat suggereert dat MBON's hun reactie op geuren veranderen op basis van ervaring. Er zijn 34 MBON's, waarbij het grootste deel van het MBON-netwerk schijnbaar is verdeeld in twee onderling antagonistische klassen die beide benaderingen van vermijdingsgedrag aansturen34. Om deze reden wordt veel gebruik gemaakt van in vivo beeldvorming om het ophalen van geheugen te bestuderen door op te nemen in verschillende MBON's.

Vroege methoden voor in vivo functionele beeldvorming omvatten het uitvoeren van operaties om een deel van de nagelriem van de bovenkant van de hoofdcapsule te verwijderen, die vervolgens werd bedekt met een klein stukje plasticfolie18. Hoewel dit het begin markeerde van in vivo beeldvorming in Drosophila, is er sindsdien aanzienlijke vooruitgang geboekt in de technieken voor het voorbereiden van vliegen en de toediening van stimuli onder de microscoop om processen zoals leren en geheugen te onderzoeken. Maar zelfs vandaag de dag omvatten de meeste technieken voor vliegvoorbereiding voor in vivo beeldvorming het verdoven van de vliegen. Deze praktijk brengt uitdagingen met zich mee, aangezien er uitgebreid bewijs is - en een heel onderzoeksgebied - dat aantoont hoe anesthesie het geheugen beïnvloedt, evenals andere cognitieve en fysiologische processen. Er is bijvoorbeeld een onderzoek uitgevoerd om inzicht te krijgen in de effecten van verschillende anesthetica die zeer vaak in de laboratoriumomgeving worden gebruikt (kooldioxide, isofluraan, sevofluraan en koudeschok). Ze ontdekten dat hoe langer de blootstelling aan anesthesie, er een toename van de hersteltijd was, veranderingen in locomotorische activiteit, lagere vruchtbaarheid en mogelijk van invloed kunnen zijn op water- en lipidenvoorraden40. Bovendien is gemeld dat het geven van koude shock-anesthesie onmiddellijk na de training het kortetermijngeheugen volledig kan verstoren21. Uit deze eerste studie is nu bekend dat er bij Drosophila sprake is van een niet-geconsolideerd geheugen (anesthesiegevoelig geheugen) dat binnen 6-8 uur vervalt, en een vorm van geconsolideerd geheugen (anesthesieresistent geheugen) dat geleidelijk na het leren wordt gevormd en ongeveer 24 uur41 kan duren. Op basis hiervan kan anesthesie de cognitieve verwerking en de activiteit van neuronen beïnvloeden, wat uiteindelijk zorgt voor een goede geheugenexpressie.

De effecten van anesthesie op het geheugen zijn niet beperkt tot Drosophila. Talrijke studies bij mensen en andere zoogdieren hebben soortgelijke bevindingen aangetoond. Uit een cross-sectioneel onderzoek in een universitair ziekenhuis bleek bijvoorbeeld dat het kortetermijngeheugen aanzienlijk was verminderd bij patiënten 24 uur na algehele anesthesie42. Een andere studie bij muizen wees uit dat algemene anesthesie de dynamiek van pieken, decorgerelateerde cellulaire ensembles en veranderde wervelkolomdynamiek in het CA1-gebied van de hippocampus, een belangrijk hersengebied dat betrokken is bij leren en geheugen bij zoogdieren, krachtig verminderde43. Om deze moeilijkheden te overwinnen, is het doel van deze studie om een nieuw protocol te bieden dat het gebruik van anesthesie tijdens de voorbereiding van de vlieg voor in vivo beeldvorming elimineert, waardoor het lichaam van de vlieg volledig vrij blijft. Deze aanpak maakt nauwkeurigere registratie van neuronale activiteit mogelijk, verbetert de gezondheid van vliegen voor langere opnames en elimineert mogelijke verstorende effecten van anesthesie in vergelijking met andere benaderingen. Dit protocol is ontworpen om de activiteit van neuronen in Drosophila vast te leggen, waarbij specifiek wordt gekeken naar hoe neuronen plasticiteit vertonen tijdens en na de leerervaring. Het dissectieprotocol is echter veelzijdig en kan worden aangepast aan verschillende toepassingen in live beeldvormingsonderzoek.

Protocol

De details van de apparatuur en reagentia die voor dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Transgene fruitvliegjes, Drosophila melanogaster

  1. Kruis vrouwelijke maagden en mannelijke vliegen (verhoogd bij 25 °C in 60% relatieve vochtigheid op een licht/donker-cyclus van 12 uur) met respectievelijk de gewenste Gal4- en UAS-constructies om vliegen te produceren waarin specifieke neuronen van belang de gewenste genetisch gecodeerde activiteitsreporter tot expressie brengen.
  2. Veroudert het nageslacht van de bovenstaande kruising totdat ze 2-5 dagen na de eclosie zijn. Zowel mannen als vrouwen kunnen worden gebruikt, aangezien de beeldvormingskamers op maat zijn gemaakt voor beide geslachten.

2. Een aspirator bouwen (workflow van 5 minuten)

  1. Snijd de 6 mm siliconenslang tot ongeveer 8 inch lang met een scheermesje. Neem een p200-pipetpunt en snijd ongeveer de helft ervan af met een scheermesje voor het mondstuk (Figuur 1A). Steek de afgesneden punt in de slang. Knip een p1000 pipetpunt voldoende af zodat een vlieg er doorheen kan bewegen.
  2. Neem een klein stukje katoen en bedek de siliconen slang. Dit is om te voorkomen dat de vlieg in de mond van de onderzoeker zuigt. Plaats de afgeknipte p1000-punt op de met katoen beklede slang.
  3. Bedek de p1000 pipetpunt met een nieuwe p200 pipetpunt. Om de juiste lengte te bepalen voor het knippen van de p200 pipetpunt, verwijdert u eerst de p200 pipetpunt en zuigt u een vlieg in de p1000 pipetpunt. Bevestig de p200-tip terug. Blaas en tik zachtjes op de vlieg om hem zo ver mogelijk in de p200-punt te bewegen.
    1. Zodra het niet meer verder kan komen, gebruik dan een ontleedmicroscoop om het punt te markeren waar de kop van de vlieg eindigt en de thorax begint, met behulp van een scheermesje. Zuig de gulp terug in de p1000 pipetpunt en knip de p200 pipetpunt op de gemarkeerde positie af.

3. Bouwen van de proboscis-aspirator met metalen buizen (workflow van 5 - 10 minuten)

  1. Snijd de 22X gauge injectieve metalen buis op de gewenste maat (~10 cm) met behulp van Dremel gereedschap en een diamantzaagblad. Polijst de uiteinden van de metalen buis met een Dremel 420 doorslijpschijf om een soepele en schone opening te creëren. Deze opening is geschikt voor de slurf van de vlieg.
  2. Wikkel de slang om een centrifugebuis van 15 ml om de gewenste gebogen vorm te krijgen (Figuur 1A). De kromming moet een haakachtige vorm creëren waardoor het lichaam van de vlieg in lijn is met de kamer.
  3. Snijd een stuk (~7 cm lang) van de 12TW gauge onderhuidse metalen slang af met behulp van Dremel gereedschap (deze slang moet in een 2 μL pipetpunt passen). Neem een pipetpunt van 2 μL en snijd het uiteinde af met een scheermesje zodat het in de metalen slang van 22X past. Plaats de grotere metalen slang in het andere uiteinde van de 2 μL pipetpunt.
  4. Meng een kleine hoeveelheid hars en een verharder van epoxylijm door elkaar. Breng het mengsel aan op een plek waar het kleine metalen slangetje de pipetpunt raakt en waar het grotere metalen slangetje aansluit op de pipetpunt. Laat de lijm een nacht volledig uitharden voordat u het geheel aansluit op een houder op een micromanipulator. Pas de hoek zo nodig aan.

4. Het bouwen van een pipet voor schok- en geurafgifte voor leer- en geheugenexperimenten onder de microscoop (workflow van 10 minuten)

  1. Snijd met een Dremel diamantgereedschap 1 ml in een 1/100 glazen pipet bij de markering van 3 ml. Snijd een klein rechthoekig stuk acrylplaat met afmetingen 24,5 mm x 8 mm en een dikte van 1/8 inch.
    OPMERKING: Als alternatief kan dit stuk 3D-geprint worden om het schokrooster beter op te vangen (de stl- en obj-bestanden zijn te vinden in aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2).
  2. Knip het koperen schokrooster af om op het rechthoekige stuk acryl van de vorige stap te passen. Soldeer twee elektrische draden aan weerszijden van het koperen rooster. Plaats het koperen rooster in het rechthoekige stuk acryl en buig het zodat de buik en poten van de vlieg op het schokrooster passen (Figuur 1I).
  3. Plak het koperen rooster met een stuk isolatietape op het rechthoekige plastic. Bevestig de glazen pipet met een heet lijmpistool stevig aan het schokrooster en zorg ervoor dat deze recht en goed gecentreerd is. Controleer met behulp van een digitale multimeter of het koperen rooster werkt om effectief een schok toe te dienen aan de poten van de vlieg.

5. Montage van platinaweerstand voor het smelten van lijm (myristinezuur) (workflow van 20 minuten)

  1. Knip met behulp van draadstrippers 200 mm draden op de gewenste lengte en strip het ene uiteinde van beide draden. Knip ongeveer 60 mm van de platinadraad af (deze lengte zou voldoende moeten zijn om een lus te maken die zal worden gebruikt om de lijm te smelten).
  2. Soldeer met een soldeerpistool het ene uiteinde van de platinadraad aan de elektrische draad. Leid een krimpkous door de elektrische draad en gebruik een bunsenbrander om de slang op de draad te krimpen om de gesoldeerde delen te bedekken.
  3. Knip twee stukken van 20 mm van de 2,55 mm rubberen ID-slang af en haal ze door de platinadraad (houd de platinadraad recht om dit proces te vergemakkelijken). Gebruik het soldeerpistool om het andere uiteinde van de platinadraad aan de andere elektrische draad te solderen. Gebruik een nieuwe krimpkous om dit nieuwe gesoldeerde onderdeel te bedekken.
  4. Verwijder de zuiger van een BD tb 1 ml spuit en leid de draden van de vorige stappen door de cilinder. Het platina moet uit het uiteinde van de spuit steken. Er mogen geen blootliggende draden zijn en de kleine rubberen slang moet de platinadraad bedekken, behalve tot het einde.
  5. Strip met behulp van een draadstripper een kleine hoeveelheid van beide andere uiteinden van de elektrische draden. Soldeer met een soldeerpistool elke draad aan een banaanstekker totdat deze goed is aangesloten.
  6. Gebruik epoxylijm om de bovenkant en onderkant van het spuitvat te lijmen om de draden en het vat aan elkaar te lijmen; Dit voorkomt spanning op de draden in de spuit en zorgt voor een langere levensduur van de weerstand. Laat de lijm een nacht uitharden.
  7. Sluit de afgewerkte weerstand aan op de DC-voeding.

6. Bouw van de opnamekamer - (2-daagse workflow)

  1. Naar aanleiding van aanvullend bestand 3, lasersnijdt u een zwarte vulplaat (dikte 0.0125 inch). De grootte van de opening in het midden van de kamer kan worden aangepast aan de grootte van de vliegen (de grootte in de vijl is over het algemeen geschikt voor vrouwtjes en mannetjes).
  2. Neem een glazen microscoopglaasje dat als basis van de kamer zal dienen. Meng hars en epoxy door elkaar. Neem de zwarte acrylkamer en bevestig met epoxylijm magneten van neodymium 3 mm x 2 mm op alle vier de hoeken. Het wordt aanbevolen om één magneet tegelijk te lijmen en vast te houden terwijl de lijm uithardt met een paperclip.
  3. Plaats twee nieuwe magneten op elk van de magneten die eerder op de kamer zijn gelijmd. Lijm met epoxy de laatst bevestigde magneet op een glasplaatje en gebruik paperclips om deze op zijn plaats te houden tijdens het cureren.
    OPMERKING: Nadat de lijm is samengesteld, is de kamer voltooid en kunnen er meer magneten worden toegevoegd om de hoogte van de kamer voor experimenten aan te passen. Aanvullend bestand 4, aanvullend bestand 5 en aanvullend bestand 6 tonen de gemonteerde opnamekamer.

7. In vivo dissectieprotocol zonder verdoving - (workflow van 5 - 7 minuten)

  1. Verwijder de p200 pipetpunt van de aspirator. Steek de aspirator in de injectieflacon en zuig een enkele vlieg op in de p1000 pipetpunt. Plaats de p200 pipetpunt terug op de aspirator. Blaas en tik zachtjes op de aspirator zodat de vlieg met het hoofd naar voren aan de bovenkant van de p200-pipetpunt geïmmobiliseerd is.
  2. Plaats de dissectiekamer op de houder van de manipulator. Sluit de stofzuiger aan op de vliegenhoudslang en pas het debietniveau naar behoefte aan (~500 ml/min). Gebruik een snelle connector om de stofzuiger eenvoudig en snel aan te sluiten en los te koppelen (Figuur 1A).
  3. Beweeg de vacuüm metalen slang om deze in het gezichtsveld te centreren wanneer u door de microscoop kijkt. Controleer of de kamer correct is geplaatst, zodat deze direct op de metalen buis gaat wanneer deze klaar is om de vlieg te lijmen. Zuig de slurf van de vlieg voorzichtig op in de vacuümhouder (Figuur 1A).
  4. Zodra de vlieg zich in de juiste positie bevindt, verplaatst u de manipulator zodat de kop van de vlieg is uitgelijnd met de kameropening.
  5. Schakel de gelijkstroomvoeding in. De stroom moet worden ingesteld op een bereik tussen 0.40-0.50 Ampère. Hogere stromingen kunnen ervoor zorgen dat het myristinezuur smelt tot het punt waarop de viscositeit te laag wordt, waardoor het risico toeneemt dat de lijm zich over de kop van de vlieg verspreidt.
  6. Lijm met behulp van de platinaweerstand de zijkanten van de ogen en de thorax aan de kamer met gesmolten myristinezuur (Figuur 1B). Om te voorkomen dat er lijm op de nagelriem van het hoofd komt, gebruik je zo min mogelijk lijm, vooral bij het lijmen van de zijkanten van de ogen.
  7. Zodra de ogen en thorax zijn gelijmd, koppelt u de vacuümslang los en gebruikt u de manipulator om de opnamekamer van de vacuümslang te halen. Draai de kamer ondersteboven en gebruik de platinaweerstand om de proboscis van onderaf te lijmen (Figuur 1C). Het lijmen van de ogen vanaf de onderkant is optioneel en kan helpen de vlieg op zijn plaats te houden tijdens dissectie, maar het is niet noodzakelijk.
  8. Zodra alles is gelijmd, schakelt u de gelijkstroomvoeding uit, zet u de kamer rechtop en bevestigt u deze aan de glazen zijvoet. Knip met een schaar een klein stukje tape af en breng het recht voor en achter de kop van de vlieg aan (Figuur 1D).
  9. Draai de kamer zodat het hoofd naar de onderzoeker gericht is op 90. Maak met behulp van een snijnaald een verticale snede langs de zijkanten van de ogen (Figuur 1E). Draai de kamer zodat deze horizontaal staat. Knip met behulp van de snijnaald door de nagelriem (Figuur 1E).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het zojuist gemaakte nagelriemvenster kan worden opgetild met behulp van de snijnaald. Als het zonder enige weerstand omhoog komt, plaatst u de ontleednaald terug op het deksel. Zoutoplossing wordt niet gebruikt in stap 13 en 14 om lichtbreking te voorkomen, die een helder zicht tijdens de sneden zou kunnen belemmeren.
  10. Voeg 100 μL zoutoplossing toe aan de bovenkant van de kop van de vlieg (Figuur 1F). Verwijder met een scherpe tang voorzichtig het raam (Figuur 1G). Verwijder met de scherpe tang voorzichtig het resterende vet of de luchtpijp. De hersenen zouden nu klaar moeten zijn voor beeldvorming (Figuur 1H-1J).

8. Visualisatie van door leren geïnduceerde plasticiteit door middel van aversieve olfactorische conditionering (workflow van 20 minuten)

  1. Gebruik een confocale microscoop uitgerust met een laser en een wateronderdompelingsobjectief om de voorbereide vlieg op het podium van de microscoop te plaatsen. Gebruik optioneel een camera met een macrolens om scherp te stellen op de vlieg en zorg ervoor dat de vlieg gezond en bewegend is.
  2. Pas de positie van het schokrooster/de geurpipet aan met behulp van een micromanipulator zodat de vlieg op het schokrooster zit.
    OPMERKING: De vlieg moet nog steeds vrij kunnen bewegen omdat het schokrooster net de poten en de buik iets raakt (de vlieg moet zijn poten en buik van het rooster kunnen verwijderen als hij wordt ingetrokken). De geurafgiftepipet moet op de antennes van de vlieg worden gericht.
  3. Scan met de grove Z-instelknop door de Z-as van de hersenen en lokaliseer het interessegebied van de hersenen. Pas de framegrootte aan naar 512 x 512 px. De scanfrequentie moet worden aangepast aan de gewenste snelheid - met een minimum van 2 Hz. Stel ten slotte de duur van de opname in.
  4. Begin met het registreren van het neuron van interesse met behulp van een op maat gemaakt of een commercieel geurafgiftesysteem en start tegelijkertijd een "pre-training" geurafgifte (Figuur 2C). Stel de opname in op 2 min. De geurpresentatie voorafgaand aan de training begint met het registreren van reacties op een eerste geurpuls van 5 s (CS-), gevolgd door een tweede geurpuls van 5 s (CS+) met een interstimuli-interval van 30 s.
  5. Wacht na het verzamelen van pre-trainingsreacties 5 minuten voordat u een trainingsprotocol start in het geurafgiftesysteem. Voor dit voorbeeld werd tijdens de training alleen de CS+ gepresenteerd. De CS+-geur wordt gedurende 1 minuut gepresenteerd, geïnitieerd om 30 s na het activeren van het geurafgiftesysteem. De schokstimulator is geprogrammeerd om tegelijkertijd 12, 90 V schokken af te geven terwijl de geur wordt gepresenteerd.
  6. Wacht na de training 5 minuten of 15 minuten voordat u reacties na de training krijgt. Noteer de reacties na de training op dezelfde manier als de reacties vóór de training werden geregistreerd in stap 6. Sla alle bestanden op in het juiste formaat voor latere beeldanalyse.

9. Beeldanalyse

  1. Om opnames te analyseren, tekent u een interessegebied (ROI) rond het gebied van het neuron. Dit moet zo nauwkeurig mogelijk zijn om de invloed van achtergrondfluorescentie te beperken.
  2. Gebruik de meettool om gegevens over de gemiddelde fluorescentie-intensiteit binnen de ROI voor elk frame van de opname te extraheren. Exporteer deze gegevens als een CSV-bestand.
  3. Open de gegevens in MATLAB of een ander gegevensanalyseprogramma om ΔF/Fo-waarden voor elk geurspoor te berekenen. Combineer de gegevens om de gemiddelde ΔF/Fo totale individuele vliegopnames te krijgen en maak een grafiek van de gemiddelde geurresponssporen voor en na de training (Figuur 2E,F).

Resultaten

Hier wordt in vivo beeldvorming van volwassen Drosophila zonder verdoving gebruikt om aversieve olfactorische conditionering te onderzoeken die plasticiteit induceert in een goed gekarakteriseerd Mushroom Body Output-neuron (MBON γ2α'1)12. De calciumindicator GCaMP6f2, samen met het rode fluorescerende eiwit TdTom, worden tot expressie gebracht in een MB-outputneuron, waarvan de dendrieten het compartiment van de MB-γ en de α'-lobben innerveren en genetisch gericht zijn op de MBON γ2α'1 met behulp van de split-Gal4-lijn MB077C34 (Figuur 2A,B).

Om plasticiteit na aversieve olfactorische conditionering waar te nemen, wordt de vlieg onder de confocale microscoop geplaatst, met zijn buik en poten uitgelijnd met het midden van het schokrooster en de geurafgiftepipet gericht op de antenne van de vlieg. Eerst werden calciumgeurreacties geregistreerd op een puls van 5 s van 4-methylcyclohexanol (MCH), gevolgd door een puls van 5 s van 3-octanol (OCT), gescheiden door een interstimulusinterval van 30 s. Vijf minuten later werden vliegen getraind door de gelijktijdige presentatie van een 1 min OCT (CS+) puls samen met 12, 90 V-schokken. Dit associatieve conditioneringsschema produceert een robuust gedragsaversief geheugen. Ten slotte werden 5 minuten en 15 minuten na de conditionering calciumresponsen op MCH en OCT geregistreerd als voorafgaand aan de training. MBON γ2α'1 reageert robuust door calciumtransiënten op zowel MCH als OCT vóór conditionering (Figuur 2D-F). Desalniettemin, overeenkomend met eerdere bevindingen12, 5 minuten na de conditionering, zijn de calciumresponsen op CS+ (OCT) volledig depressief (Figuur 2D-F). Bovendien waren de reacties op de CS- (MCH) significant versterkt. Vijftien minuten na de training lieten vergelijkbare resultaten zien, aangezien de calciumrespons op de CS+ significant depressief was en CS- werd versterkt. Deze resultaten geven aan dat het geheugenspoor dat in beide geuren wordt waargenomen, ten minste 15 minuten aanhoudt (Figuur 2D-F). Deze reacties werden gekwantificeerd met behulp van de gemiddelde geurrespons tijdens de puls van 5 s en vergeleken binnen de vlieg. Deze veranderingen in geurreacties kunnen ook worden gevisualiseerd door een pseudo-kleurenweergave van de verandering in GCaMP6-fluorescentie pre- en post-aversieve training (Figuur 2E). Daarentegen vertoont het verdoven van de vlieg tijdens de bereiding een verminderde plasticiteit voor zowel CS+ als CS-. Slechts gedeeltelijke depressie tot CS+ wordt waargenomen bij verdoofde dieren, aangezien reacties na de training nog steeds aanwezig zijn. Bovendien zijn de CS-responsen niet significant verschillend na de training (Figuur 2G,H). Om dit beter te kunnen waarnemen, hebben we de geïnduceerde plasticiteit berekend als de verhouding van CS+/CS- en hebben we aangetoond dat niet-verdoofde vliegen een significant verhoogde plasticiteit vertonen in vergelijking met verdoofde dieren (Figuur 2I). Deze representatieve resultaten geven aan dat dit protocol geschikt is voor het bestuderen van leren en geheugen onder de microscoop en de gezondheid van de vlieg garandeert tijdens beeldvorming van neuronen gedurende een lange periode. Dit protocol is veelzijdig genoeg en kan worden toegepast op andere soorten in vivo beeldvorming en andere interessante neuronen.

figure-results-1
Figuur 1: In vivo beeldvormingsbereiding van Drosophila zonder het gebruik van anesthesie. (A) Bovenpaneel: Diagram ter illustratie van de stappen die nodig zijn voor de bereiding van de aspirator. Onderste paneel: Diagram van de kamer die in een micromanipulator wordt gehouden tijdens het positioneren van de vlieg. De slurf van de vlieg wordt geplaatst bij de opening van metalen buizen die zijn aangesloten op een vacuüm van 500 ml/min met behulp van een aspirator. De kamer wordt vervolgens boven de vlieg geplaatst. (B) De zijkanten van de ogen en de thorax worden verlijmd met myristinezuur met behulp van een op maat gemaakte platinaweerstand. (C) De slurf van de vlieg wordt uit de metalen buis verwijderd en de kamer wordt omgekeerd zodat de slurf op zijn plaats kan worden gelijmd, waardoor beweging tijdens opnames tot een minimum wordt beperkt. (D) De kamer is bevestigd aan een glazen glijbaan. Tape wordt aangebracht op de bovenkant van de kamer, die de antennes bedekt, en op de achterkant om te voorkomen dat zoutoplossing lekt. (E) Twee verticale sneden worden gemaakt langs de nagelriem bij de samengestelde ogen, gevolgd door een derde snede over de nagelriem bij de thorax, waardoor een "venster" naar de hersenen ontstaat. (F) Tussen 100-200 μL zoutoplossing wordt toegevoegd aan de kop van de vlieg op de plaats van de sneden. (G) Het nagelriemvenster wordt opgetild, getrokken en losgemaakt met behulp van een scherpe, fijne tang om de hersenen bloot te leggen. (H) Vet en tracheaal weefsel worden verwijderd om een duidelijke visualisatie van hersencellen onder de microscoop mogelijk te maken. (I) De geprepareerde vlieg wordt onder de microscoop geplaatst en met zijn lichaam uitgelijnd op het schokrooster geplaatst. (J) Pseudo-kleurenafbeelding met het expressiepatroon van MBON γ2α'1. Het interessegebied wordt omlijnd met een stippellijn rond het dendritische prieel. Schaal balk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Door leren geïnduceerde plasticiteit in MBON γ2α'1 na aversieve olfactorische conditionering. (A) Expressiepatroon van de MB077C-splitGal4-driver die GCaMP tot expressie brengt. Hersenen werden ontleed en gekleurd met anti-GFP en tegengekleurd met anti-nc82. Schaalbalk: 50 μm. (B) Pseudo-kleurenbeeld van MBON γ2α'1 met de nadruk op het cellichaam, het uitbreidingsproces en het dendritische prieel. Het dendritische gebied vertegenwoordigt het gebied waaruit calciumreacties werden verzameld. Schaal balk: 50 μm. (C) Schema van het aversieve trainingsprotocol. Vliegen werden blootgesteld aan 5-s pulsen van MCH en OCT met 30 s schone lucht ertussen. Na een interval van 5 minuten werden vliegen getraind om OCT te associëren met twaalf elektrische schokken van 90 V. Opnames van calciumresponsen op MCH en OCT werden 5 minuten en 15 minuten na de training uitgevoerd. (D) Sporen van geurrespons naar MCH (bovenpaneel) en OCT (onderpaneel) worden getoond voor pre-training en 5 minuten en 15 minuten na de training. Dikke zwarte balken geven de timing van de geurpresentatie aan. (E) Pseudo-kleurenbeelden van het dendritische prieel van MBON γ2α'1 vóór de training en 5 minuten en 15 minuten na de training, als reactie op zowel MCH als OCT. Potentiëring van fluorescentie wordt waargenomen voor de CS- (MCH), terwijl fluorescentie wordt afgeschaft voor de CS+ (OCT). Schaal balk: 20 μm. (F) De gemiddelde geurrespons op MCH is significant versterkt 5 minuten en 15 minuten na de training, terwijl de respons op OCT (CS+) significant wordt onderdrukt. Niet-parametrische Wilcoxon-gepaarde test, N = 12. (G) Geurresponssporen naar MCH (bovenpaneel) en OCT (onderpaneel) worden getoond voor verdoofde vliegen voor en 5 minuten na de training. Dikke zwarte balken geven geurafgifte aan. (H) Bij verdoofde dieren vertonen de gemiddelde geurreacties op MCH geen significante potentiëring na de training, en vertonen reacties op OCT slechts gedeeltelijke onderdrukking in vergelijking met niet-verdoofde dieren. (I) De door training geïnduceerde plasticiteit, berekend als de CS+/CS-ratio, is significant lager bij verdoofde vliegen in vergelijking met vliegen die zonder verdoving zijn bereid. Niet-parametrische Wilcoxon-gepaarde test, N = 8-12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: Grid_holder (STL). STL-bestand van het op maat ontworpen onderdeel dat wordt gebruikt om het elektriciteitsnet vast te houden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Grid_holder (OBJ). OBJ-bestand van het op maat ontworpen onderdeel dat wordt gebruikt om het elektriciteitsnet vast te houden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Chamber_LaserCut. Adobe Illustrator-bestand dat wordt gebruikt voor het lasersnijden van het bovenste onderdeel van de opnamekamers voor zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 4: Recording_chamber (STL). STL-bestand van de op maat ontworpen opnamekamer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 5: Recording_chamber (OBJ). OBJ-bestand van de op maat ontworpen opnamekamer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 6: Recording_chamber_animation. MP4-video met een animatie van de geassembleerde opnamekamer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het begrijpen van de neurale circuits achter leren en geheugen is een centraal doel op het gebied van neurowetenschappen. De genetische toolkit die beschikbaar is in Drosophila, gecombineerd met de eenvoud en veelzijdigheid van gedragstesten, maakt het een ideaal modelorganisme voor het bestuderen van deze processen. Gepubliceerde studies van verschillende laboratoria hebben verschillende protocollen beschreven voor het voorbereiden van vliegen op functionele beeldvorming zonder het gebruik van anesthesie44,45. Deze protocollen variëren echter sterk en zijn vaak afhankelijk van zeer gespecialiseerde, op maat gemaakte tools met beperkte richtlijnen voor het bouwen of gebruiken ervan. In dit protocol wordt een methode gepresenteerd voor het uitvoeren van in vivo functionele beeldvorming bij vliegen die de verstorende effecten van algemene anesthesie vermijdt. Bovendien maakt deze benadering het mogelijk om real-time neuronale activiteit binnen dezelfde vlieg vast te leggen, waardoor directe vergelijkingen van neurale reacties voor en na blootstelling aan verschillende stimuli mogelijk zijn.

Bij het voltooien van dit protocol zijn kritieke stappen onder meer ervoor zorgen dat de slurf van de vlieg correct in de vacuümslang wordt geplaatst. Deze stap zorgt ervoor dat het lijmen op de juiste plekken plaatsvindt en zorgt ervoor dat het hoofd in de juiste hoek staat om de neuronen van belang te visualiseren. Minimale lijmtoepassing is essentieel om de gezondheid van vliegen te behouden; Het is ideaal om de kleinste hoeveelheid te gebruiken die nodig is om de vlieg op zijn plaats te houden. Dit protocol maakt ook enkele aanpassingen mogelijk om aan specifieke behoeften te voldoen, zoals het lijmen van alleen de zijkanten van de ogen zodat het hele lichaam vrij is. Op dezelfde manier kan een perfusiekamer aan de bovenkant van de opnamekamer worden bevestigd om belperfusie of medicijnafgifte te vergemakkelijken. Ten slotte kan een roterende zwevende loopband onder de vlieg worden geplaatst, zoals eerder gemeld, waardoor de analyse van de voortbewegingsrichting 46,47 mogelijk is.

Dit protocol heeft enkele beperkingen, waaronder de stress waaraan de vliegen worden blootgesteld tijdens de microchirurgie om de vliegen voor te bereiden op live beeldvorming. Het hanteren van de kleine vliegjes, het spaarzaam aanbrengen van lijm en het voorzichtig openen van de hoofdcapsule zonder hersenweefsel of lichaam te beschadigen, vereist aanzienlijke expertise, die alleen kan worden verkregen door nauwgezette oefening en herhaling. Hoewel deze methode bijzonder nuttig is voor het bestuderen van cognitieve processen op cellulair niveau, heeft in-vivobeeldvorming nog steeds enkele beperkingen in vergelijking met elektrofysiologische opnames. Bovendien, hoewel ons protocol het gebruik van anesthesie voorafgaand aan beeldvorming vermijdt, is de vlieg nog steeds beperkt tot een fysieke kamer, die altijd cellulaire reacties kan veranderen. Desalniettemin biedt onze methodologie de beste manier om de gezondheid van de vlieg te behouden voor optimale in vivo beeldvorming. Vergeleken met bestaande methoden die anesthesie gebruiken en de vlieg beperken, is onze methode erop gericht de vlieg zo vrij mogelijk te laten bewegen en tegelijkertijd met minimale beweging beelden te kunnen maken van cellen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het National Institute for General Medical Science voor 1R01GM147917-01A1 en de Brain and Behavior Research Foundation voor 30442.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.102 mm PlatinumdraadSurepure Chemetals2690
0.25 OD, 0.125 ID, platina-geharde siliconen slangVWR89068-474
0.3 mm ID Siliconen slang Fisher Scientific11-189-14
BanaanstekkersAmazon
Zwarte acrylplaat voor kamer 0,0125 inchPrecision Brand44250
Calcium ChlorideSigma-Aldrich746495
Koperen schokrasterOp maat gemaakt
DC voeding voor platina weerstandFisher ScientificS35740
Dremel gereedschap 3000-1Dremel3000-N/18
Drosophila melanogaster / ;;uas-tdtomBDSC36328
Drosophila melanogaster / ;uas-gcamp6f;BDSC42747Deze uas-lijn werd gecombineerd met ;;uas-td-tom om een stock te genereren die beide inserts bevat
Drosophila melanogaster/ ;;MB077C-gal4BDSC68287
Epoxylijm Gorilla4200102
Gas flowmeter 1,5 LPMAmazonB01N0UWZ2T
Glas 1 mL serologische pipette Fisher Scientific50-232-9516
GlijplatenFisher Scientific 12-550-A3
GlucoseSigma-AldrichG7528
HEPESSigma-AldrichH4034
Hypodermisch 12TW gauge slangMicrogroup316H12TW
Hypodermisch 22X gauge slangMicrogroup304H22X
Magnesium Chloride HexahydraatSigma-AldrichM9272
MyristinezuurAcros Organics156961000
Neodymium magneten 3X2 mmAmazonB0CXSQ387M
P1000 tipsGenesee Scientific 23-165RL
P200 tipsGenesee Scientific 23-150RL
Pneumatisch push-connector 6mm ODAmazonB07ZHG8Y1Y
Kalium ChlorideSigma-AldrichP3911
PTFE slang 6mm ODAmazon
Veiligheidsmesjes AmazonB08LYD6645
Natrium BicarbonaatSigma-AldrichS5761
Natrium ChlorideFisher ScientificS271-500
Natriumfosfaat dibasischSigma-AldrichS0876
SucroseSigma-AldrichS9378
TrehaloseSigma-AldrichT0167

Referenties

  1. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  2. Chen, T. W., Wardill, T. J., Sun, Y., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  3. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  4. Akerboom, J., Chen, T. W., Wardill, T. J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  5. Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  6. Sun, F., Zeng, J., Jing, M., et al. A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  7. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  8. Wang, L., Wu, C., Peng, W., et al. A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging. Nat Commun. 13 (1), 5363(2022).
  9. Jing, M., Zhang, P., Wang, G., et al. A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies. Nat Biotechnol. 36 (8), 723-737 (2018).
  10. Yu, D., Akalal, D. B. G. B., Davis, R. L. Drosophila alpha/beta mushroom body neurons form a branch-specific, long-term cellular memory trace after spaced olfactory conditioning. Neuron. 52 (5), 845-855 (2006).
  11. Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic plasticity underlies aversive olfactory learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
  12. Berry, J. A., Phan, A., Davis, R. L. Dopamine neurons mediate learning and forgetting through bidirectional modulation of a memory trace. Cell Rep. 25 (3), 651-662 (2018).
  13. Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L., Berry, J. A. Rac1 impairs forgetting-induced cellular plasticity in mushroom body output neurons. Front Cell Neurosci. 14, 258(2020).
  14. Martinez-Cervantes, J., Shah, P., Phan, A., Cervantes-Sandoval, I. High order unimodal olfactory sensory preconditioning in Drosophila. Elife. 11, 79107(2022).
  15. Faber, T., Joerges, J., Menzel, R. Associative learning modifies neural representations of odors in the insect brain. Nat Neurosci. 2 (1), 74-78 (1999).
  16. Yu, D., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Davis, R. L. Detection of calcium transients in Drosophila mushroom body neurons with camgaroo reporters. J Neurosci. 23 (1), 64-72 (2003).
  17. Yu, D., Keene, A. C., Srivatsan, A., Waddell, S., Davis, R. L. Drosophila DPM neurons form a delayed and branch-specific memory trace after olfactory classical conditioning. Cell. 123 (5), 945-957 (2005).
  18. Yu, D., Ponomarev, A., Davis, R. L. Altered representation of the spatial code for odors after olfactory classical conditioning: Memory trace formation by synaptic recruitment. Neuron. 42 (3), 437-449 (2004).
  19. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophilamelanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  20. Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophilamelanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (3), 708-712 (1974).
  21. Quinn, W. G., Dudai, Y. Memory phases in Drosophila. Nature. 262 (5569), 576-577 (1976).
  22. Tempel, B. L., Bonini, N., Dawson, D. R., Quinn, W. G. Reward learning in normal and mutant Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (5), 1482-1486 (1983).
  23. Turner, G. C., Bazhenov, M., Laurent, G. Olfactory representations by Drosophila mushroom body neurons. J Neurophysiol. 99 (2), 734-746 (2008).
  24. de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1979).
  25. Schwaerzel, M., Monastirioti, M., Scholz, H., Friggi-Grelin, F., Birman, S., Heisenberg, M. Dopamine and octopamine differentiate between aversive and appetitive olfactory memories in Drosophila. J Neurosci. 23 (33), 10495-10502 (2003).
  26. Kim, Y. C., Lee, H. G., Han, K. A. D1 dopamine receptor dDA1 is required in the mushroom body neurons for aversive and appetitive learning in Drosophila. J Neurosci. 27 (29), 7640-7647 (2007).
  27. Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Curr Biol. 15 (21), 1953-1960 (2005).
  28. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: Anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3 (5), 1-17 (2009).
  29. Liu, C., Plaçais, P. Y., Yamagata, N., et al. A subset of dopamine neurons signals reward for odour memory in Drosophila. Nature. 488 (7412), 512-516 (2012).
  30. Burke, C. J., Huetteroth, W., Owald, D., et al. Layered reward signaling through octopamine and dopamine in Drosophila. Nature. 492 (7429), 433-437 (2012).
  31. Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
  32. Gervasi, N., Tchenio, P., Preat, T. PKA dynamics in a Drosophila learning center: Coincidence detection by rutabaga adenylyl cyclase and spatial regulation by dunce phosphodiesterase. Neuron. 65 (4), 516-529 (2010).
  33. Séjourné, J., Plaçais, P. Y., Aso, Y., et al. Mushroom body efferent neurons responsible for aversive olfactory memory retrieval in Drosophila. Nat Neurosci. 14 (7), 903-910 (2011).
  34. Aso, Y., Sitaraman, D., Ichinose, T., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, 04580(2014).
  35. Pai, T. P., Chen, C. C., Lin, H. H., et al. Drosophila ORB protein in two mushroom body output neurons is necessary for long-term memory formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (19), 7898-7903 (2013).
  36. Owald, D., Felsenberg, J., Talbot, C. B., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
  37. Perisse, E., Owald, D., Barnstedt, O., Talbot, C. B., Huetteroth, W., Waddell, S. Aversive learning and appetitive motivation toggle feed-forward inhibition in the Drosophila mushroom body. Neuron. 90 (5), 1086-1099 (2016).
  38. Aso, Y., Rubin, G. M. Dopaminergic neurons write and update memories with cell-type-specific rules. Elife. 5, 16135(2016).
  39. Hige, T., Aso, Y., Rubin, G. M., Turner, G. C. Plasticity-driven individualization of olfactory coding in mushroom body output neurons. Nature. 526 (7572), 258-262 (2015).
  40. MacMillan, H. A., Nørgård, M., MacLean, H. J., Overgaard, J., Williams, C. J. A critical test of Drosophila anaesthetics: Isoflurane and sevoflurane are benign alternatives to cold and CO2. J Insect Physiol. 101, 97-106 (2017).
  41. Margulies, C., Tully, T., Dubnau, J. Deconstructing memory in Drosophila. Curr Biol. 15 (17), R700-R713 (2005).
  42. Amiri, A., Karvandian, K., Ramezani, N., Amiri, A. Short-term memory impairment in patients undergoing general anesthesia and its contributing factors. Saudi J Anaesth. 14 (4), 454-458 (2020).
  43. Wang, R., Zhang, L., Wang, X., et al. Electrophysiological activity pattern of mouse hippocampal CA1 and dentate gyrus under isoflurane anesthesia. Front Cell Neurosci. , 18(2024).
  44. Berry, J. A., Cervantes-Sandoval, I., Chakraborty, M., Davis, R. L. Sleep facilitates memory by blocking dopamine neuron-mediated forgetting. Cell. 161, 1656-1667 (2015).
  45. Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Sci Rep. 10, 1-15 (2020).
  46. Moore, R. J. D., et al. FicTrac: A visual method for tracking spherical motion and generating fictive animal paths. J Neurosci Methods. 225, 106-119 (2014).
  47. Seelig, J. D., Chiappe, M. E., Lott, G. K., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Functionele beeldvorminggeheugenverliesconfocale microscopiecalciumbeeldvormingmushroom bodypreparaat van wakker vliegsynaptische plasticiteit
In vivo Beeldvorming van neurale activiteit bij onverdoofde Drosophila-volwassen vliegen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.