Röntgenvisualisatie van intraductale ablatieve infusie op basis van ethanol voor de preventie van borstkanker in konijnenmodellen

Samenvatting

Dit protocol presenteert een procedure voor beeldgeleide infusie in het ductale boomsysteem van de borstklier van het konijn. We demonstreren gecontroleerde infusie van een röntgencontrastmiddel dat ethanol bevat en een ablatieve oplossing op basis van ethanol in alle speenopeningen door middel van real-time beeldvorming met fluoroscopie.

Samenvatting

Borstkanker is de op één na belangrijkste kankergerelateerde doodsoorzaak bij vrouwen. Hoewel er weinig proactieve interventies zijn voor vrouwen met een gemiddeld risico, is profylactische borstamputatie de meest effectieve, risicoverlagende interventie voor vrouwen met een hoog risico. Profylactische borstamputatie is echter een invasieve procedure waarbij alle borstepitheelcellen worden verwijderd, samen met het omringende stroma, vetweefsel en/of spierstelsel. Ons algemene onderzoeksdoel is het ontwikkelen van een niet-invasieve intraductale (ID) toedieningsprocedure die de borstepitheelcellen lokaal doodt door de hele ductale boom te vullen met een ablatieve oplossing. We hebben eerder aangetoond dat ID-afgifte van ethanol als ablatieve oplossing effectief is in knaagdiermodellen (muizen en ratten). Dit protocol presenteert een ID-afgifte van 10-70% ethanoloplossing met iohexol (90-300 mg/ml) als een röntgencontrastmiddel in het multiductale boomsysteem van de borstklier van het konijn. De borstklier van een konijn (Oryctolagus cuniculus) met een meerkanaals systeem lijkt meer op de menselijke borst dan die van andere grote dieren (bijv. koeien, schapen). Dit konijnenprotocol pakt technische uitdagingen aan op het gebied van schaalbaarheid, real-time beeldvorming en ID-levering in een multiductaal boomsysteem in een tussenliggend model met grote dieren. Dit protocol stelt een fluoroscopiegeleide multi-duct ID-levering tot stand met instrumenten, materialen en reagentia die direct in de kliniek kunnen worden toegepast. Weefselanalyse maakt het mogelijk om de concentratie van ethanol te optimaliseren voor maximale epitheliale ablatie en minimale collaterale weefselschade als uitgangspunt voor toekomstige first-in-human evaluatie van deze ablatieve procedure voor primaire preventie van borstkanker.

Inleiding

Borstkanker (BC) is de meest voorkomende en op één na hoogste kankergerelateerde sterfte voor vrouwen in de Verenigde Staten. Prognoses voor 2025 schatten dat er 316.950 nieuwe borstkankers zullen zijn en dat 42.170 vrouwen zullen sterven aan BC¹. Momenteel is bilaterale profylactische borstamputatie de meest effectieve procedure om BC te voorkomen. Dit is echter een zeer invasieve procedure waarbij de epitheelcellen, waaruit borstcarcinoom ontstaat, en het omliggende weefsel volledig worden verwijderd. Vanwege de invasiviteit en de psychologische en sociale impact van deze procedure, ondergaat minder dan 50% van de vrouwen met een hoog risico een risicoverlagende borstamputatie². Wij, en anderen, hebben intraductale (ID) toedieningsprocedures ontwikkeld voor primaire preventie en/of lokale behandeling van borstkanker in knaagdiermodellen ^2,3 als alternatief voor de huidige preventies en behandelingen. Ethanol (EtOH) heeft een laag toxiciteits- en veiligheidsprofiel dat goed ingeburgerd is en wordt gebruikt in meerdere klinische toepassingen, zoals scleroserende middelen voor de behandeling van veneuze misvormingen en als ablatief middel voor de lokale behandeling van sommige vormen van kanker³. Doorgaans wordt bij deze klinische procedures enkele milliliters EtOH toegediend of toegediend in een concentratie van 90-100%. In ons eerdere werk was toediening van 70% EtOH rechtstreeks in het ductale boomsysteem van muis- en rattenmodellen effectief bij het chemisch ableren van borstepitheelcellen met beperkte schade aan aangrenzend normaal weefsel, en bij het voorkomen van borsttumorvorming 4,5,6,7. Aangezien deze procedure wordt opgeschaald naar het grotere ductale boomsysteem van een konijn met een grotere verhouding tussen luminaal volume en luminaal epitheelceloppervlak, onderzoeken we de ablatieve eigenschappen van een oplossing met een lager percentage EtOH (10% tot 70%). Met het oog op klinische vertaling redeneren we dat het laagste percentage ethanol dat effectief is bij het ableren van epitheelcellen, het best wordt verdragen en het beste veiligheidsprofiel heeft.

Bevestiging van volledige ductale boomvulling is nodig om te garanderen dat de ablatieve oplossing in direct contact is gekomen met borstepitheelcellen. In onze eerdere studies in knaagdiermodellen werd na de procedure röntgenvisualisatie van geïnfuseerde ductale boom(en) door middel van microCT-beeldvorming gebruikt. Vanwege het vereiste tijdsverloop om het dier te verdoven, over te brengen, in te stellen en te positioneren voor beeldvorming, waren door de FDA goedgekeurde Omnipaque (iohexol) of vergelijkbare jodiumbevattende snel diffuse contrastmiddelen niet geschikt voor visualisatie van ductale bomen bij knaagdieren ^6,8. We ontdekten dat contrastmiddelen op basis van nanodeeltjes, vooral die met tantaaloxide nanokristal, langzamer diffundeerden en meer geschikt waren voor visualisatie van ductale bomen bij knaagdieren 6,7,8,9. Deze posteriori bevestiging door microCT-beeldvorming stelt ons echter niet in staat om de hoeveelheid geïnfuseerd volume te controleren of te controleren en wijkt af van klinisch vastgestelde diagnostische procedures, zoals ductografie^10,11, voor visualisatie van ductale bomen. Een belangrijke stap om de technische haalbaarheid van het vertalen van deze ID-procedure naar mensen vast te stellen, is dus het demonstreren van real-time fluoroscopievisualisatie van de geïnfuseerde ductale boom in een diermodel met toenemende omvang en complexiteit van zijn borstklieren. Dit protocol schaalt deze ablatieve procedure op van knaagdieren ^4,5 naar konijnenmodellen. Evolutionair, anatomisch en fysiologisch lijken de borstklieren van konijnen meer op menselijke borsten dan die van knaagdieren of andere grote diermodellen, zoals koeien en schapen 12,13,14. Vrouwelijke konijnen hebben vier paar borstklieren, elk met vier ductale bomen, terwijl knaagdieren slechts één ductale boom per borstklier hebben. Konijnenspenen kunnen worden gecanuleerd ^15,16 met behulp van een procedure die vergelijkbaar is met ID-toediening van contrastmiddel in klinische ductografie in first-in-human klinisch onderzoek. Daarom bieden konijnen een praktisch en relevant tussenliggend model voor grote dieren voor de translationele toepassing van deze ID-ablatieve procedure op mensen. Dit protocol pakt technische uitdagingen aan van ID-levering en in vivo beeldvorming van een multiductaal boomsysteem die niet hadden kunnen worden aangepakt in knaagdiermodellen. Dit protocol maakt gebruik van instrumenten, reagentia en materialen die compatibel zijn met de huidige klinische praktijk voor visualisatie van ductale bomen. De beschreven procedure voor fluoroscopiegeleide infusie van iohexol-bevattende ablatieve oplossing op basis van ethanol zou dus gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd en geëvalueerd in eerste klinische onderzoeken bij mensen.

Deze methode is in ons laboratorium geïmplementeerd om met succes alle vier de ductale bomen van een of meer borstklieren bij een konijn in één sessie te cannuleren en achtereenvolgens te infuseren met een ablatieve oplossing op basis van ethanol die een contrastmiddel bevat (Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3). Bij deze methode wordt de ablatieve oplossing rechtstreeks in de gecanuleerde speenopening toegediend met een naald van 27 g met stompe punt van een konijn (maagd van 4 maanden) op een fluoroscopietafel. Deze procedure wordt uitgevoerd op een dier onder algemene anesthesie (isofluraan) met peri- en post-procedure ontstekingsremmende behandeling (ketoprofen, niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel). Fluoroscopiebeeldvorming stelt ons in staat om de vulling van de ductale boom in realtime te volgen, om de snelheid en hoeveelheid van het afgegeven volume te controleren en/of om te bepalen hoe succesvol de ID-afgifte is in elk afzonderlijk boomsysteem (Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3). Deze fluoroscopietechniek benadert de beoogde klinische toepassing voor beeldgeleiding van de ablatieve behandeling beter en kan helpen de totale stralingsdosis die aan de patiënt wordt opgelegd te beperken. Dit protocol toont aan dat het door de FDA goedgekeurde Omnipaque (iohexol) een geschikt contrastmiddel is om de eerste vulling van de ductale boom van het konijn te visualiseren (Figuur 3). Waarnemingen door middel van grof onderzoek en histologische analyse tonen aan dat een ethanolconcentratie van 70% snelle weefselbeschadiging veroorzaakt binnen en buiten de ductale boom en zich uitstrekt tot buiten de borstklierstructuur (Figuur 3). Ethanolconcentratie in het bereik van 10-40% zorgt voor adequate epitheelcelablatie met minder collaterale weefselschade dan 70% ethanol (Figuur 4). Longitudinale onderzoeken waarbij deze procedure wordt gebruikt met de juiste groepsgrootte per ablatieve oplossing en getimede weefselverzamelingen zijn vereist om optimale parameters van de ablatieve oplossing vast te stellen voor de klinische evaluatie bij menselijke patiënten.

Protocol

Alle beschreven experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Michigan State University. Konijnen (Oryctolagus cuniculus) werden verzorgd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de USDA Animal Welfare Act in een AAALAC-geaccrediteerde faciliteit.

OPMERKING: Deze methode werd uitgevoerd bij maagdelijke (nulliparae) en gepensioneerde fokker (multipeerste) Nieuw-Zeelandse blanke dieren, variërend in leeftijd (4 maanden tot > 1 jaar) en gewicht (2,6 tot 4,2 kg) verkregen uit commerciële bronnen. Onze ervaring is dat de grootte van het dier, bepaald door het gewicht, betrouwbaarder is dan de leeftijd van het dier om de grootte van de spenen te voorspellen. Over het algemeen zijn dieren die meer dan 3,3 kg wegen, aanwezig met geschikte spenen voor canulatie. Het hieronder beschreven protocol richt zich op maagdelijke dieren van 4-5 maanden oud en een gewicht van meer dan 3,3 kg, omdat ze geschikter zijn voor onderzoeken naar werkzaamheid op lange termijn, wondgenezing, toxiciteit en veiligheid.

1. Preoperatieve voorbereiding

1. Acclimatiseer dieren in de nieuwe faciliteit gedurende ten minste 1 week bij aankomst, vooral voor dieren die bedoeld zijn voor herstelprocedures en langetermijnstudies. Tijdens deze eerste week moeten de konijnen dagelijks worden gecontroleerd/gecontroleerd en moeten ze traktaties krijgen, voedingsverrijking zoals aanbevolen door de richtlijnen van de instelling, om te helpen bij het acclimatiseringsproces.
2. Koop het konijn (~ 4 maanden oud Nieuw-Zeelandse blank) bij de erkende huisvestingsfaciliteit. Noteer het lichaamsgewicht vóór de ingreep.
   OPMERKING: Het lichaamsgewicht kan de dag voor de ingreep worden geregistreerd om de vereiste berekeningen voor de anesthesie voor te bereiden. Gepensioneerde fokkers (> 1 jaar oud, > 3,5 kg) kunnen ook worden gebruikt omdat ze grotere spenen hebben en een gemakkelijkere canulatie van individuele kanalen mogelijk maken (Figuur 3). Om deze redenen kunnen gepensioneerde fokkers worden gebruikt in eerste experimenten om vertrouwd te raken met de intraductale procedure en deze te optimaliseren.
3. Injecteer 35 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine intramusculair 20 minuten voor toediening van isofluraan om het dier te verdoven.
   OPMERKING: Anesthesie wordt toegediend op basis van het gewicht van het konijn en de bereiken voor elk medicijn zijn als volgt: 15-35 mg/kg voor ketamine en 2-5 mg/kg voor xylazine. Zorg ervoor dat het dier verdoofd is voordat u overgaat tot ontharing en intubatie. Dit is voor het welzijn en de veiligheid van de dieren en het personeel. Na bevestiging van de sedatie kan het konijn vervolgens dorsaal op de beeldvormings-/operatietafel worden gelegd.
4. Injecteer 5 mg/kg ketoprofen subcutaan voor analgesie nadat klinische tekenen van sedatie zijn aangetoond (d.w.z. rustige houding en gedeeltelijk gesloten en roze gekleurde ogen).
   OPMERKING: Analgesie wordt toegediend op basis van het gewicht van het konijn en het bereik voor ketoprofen is 2-5 mg/kg.
5. Intubeer het konijn met de juiste apparatuur (bijv. endotracheale tube of supraglottisch luchtwegapparaat) en sluit het aan op een isofluraanmachine (1-2% isofluraan, 1,0 l/min zuurstof) die voldoende is getest en gecertificeerd om het konijn te verdoven. Houd de ademhaling van het dier zorgvuldig in de gaten om ervoor te zorgen dat de anesthesie op 1-2% isofluraan blijft. Controleer het konijn tijdens de procedure op zuurstofverzadiging via SpO₂, hartslag, ademhalingsfrequentie en temperatuur.
   OPMERKING: De grootte van de intubatieslang is gebaseerd op het gewicht en de grootte van het konijn. Het maatbereik is echter niet altijd nauwkeurig, dus het is handig om verschillende maten te hebben om te zien welke het beste bij dat specifieke konijn past. Een neuskegelmasker kan ook worden gebruikt in plaats van een endotracheale tube voor anesthesiedoeleinden¹⁷, waarbij u zich ervan bewust moet zijn dat dit masker geen bescherming biedt voor de luchtwegen van het dier door intubatie. Warmwatercirculatiedekens (warmwaterdekens) die zijn ingesteld op 37°C worden onder handdoeken gelegd om de lichaamstemperatuur van het konijn op peil te houden.
6. Plaats en bevestig een 25 G veneuze katheter in de marginale oorader om noodtoediening van het geneesmiddel mogelijk te maken.
   OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van de konijnenader kan een meetbereik van 24 tot 26 worden gebruikt.
7. Breng oogglijmiddel aan op beide ogen om oogirritatie en uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
8. Scheer de vacht rond het tweede en derde paar spenen met een elektrisch scheerapparaat. Gebruik een applicator met wattenstaafje om ontharingscrème op de speen te smeren. Laat de crème 15 s in contact komen met het gebied.
   NOTITIE: Wees uiterst voorzichtig om geen spenen met het scheermes te beschadigen. Een draadloze stofzuiger kan ook worden gebruikt om te helpen bij het schoonhouden van een proceduregebied.
9. Maak een gaasje nat met steriele zoutoplossing en gebruik het om de crème af te spoelen en de vacht van het dier los te maken na 15 s ontharingscrème. Controleer of de vacht goed zichtbaar is en of u toegang heeft tot het gebied van de speen waar de vacht is verwijderd. Herhaal indien nodig.
   OPMERKING: De room moet zo kort mogelijk op het konijn blijven zitten, tussen 10 - 30 s en volledig worden verwijderd om chemische brandwonden op de huid te voorkomen.

2. Intraductale infusie

1. Bereid een ablatieve oplossing door de juiste hoeveelheden uit de standaardoplossingen onder steriele omstandigheden in een BSL2-weefselkweekkap te mengen.
   OPMERKING: Iohexol (350 mg jodium/ml) moet vanwege de lichtgevoeligheid in een donkere ruimte worden bewaard. Tijdens dit experiment werd een reeks EtOH-concentraties gebruikt. Voor het testen van andere percentages EtOH verdunt u de stamoplossingen tot de noodzakelijke concentratie van de ablatieve oplossing. Om dezelfde concentratie jodium in ablatieve oplossing met verschillende percentages EtOH, PBS of steriel water te behouden, kan het volumeverschil worden opgevuld.
2. Bereid voor dit voorbeeld een verse ablatieve oplossing van 10% EtOH, 280 mg jodium/ml iohexol, 1% kleurstof voor levensmiddelen in een tube van 5 ml. Voeg voor een eindvolume van 5 ml 4 ml iohexolbouillon (350 mg jodium/ml), 500 μl 100% EtOH (200 proof), 450 μl PBS, 50 μl blauwe kleurstof toe.
   OPMERKING: Elke ductale boom kan worden gevuld met maximaal 400 μL, maar typisch 250-350 μL voor dieren onder de 3.5 kg. Evans Blue tot 0,2% kan worden gebruikt in plaats van voedselkleurstof. Evans Blue kan de voorkeur genieten als er onmiddellijk na de infusie(s) analyses van de hele berg of andere weefselanalyses worden uitgevoerd.
3. Verwijder alle dode huidcellen die de ductale openingen bedekken met een fijne puntige tang.
   OPMERKING: Bij konijnen kan een verhoornde plug uit de speen steken die een succesvolle cannulatie kan voorkomen als deze niet wordt verwijderd. Topische lidocaïne kan ook rond de speen worden aangebracht om irritatie rond de injectieplaats tot een minimum te beperken (Tabel 1).
4. Veeg de infusieplaats af met chloorhexidinegaasjes.
   OPMERKING: Chloorhexidine wordt gebruikt als reinigingsmiddel om de injectieplaats te desinfecteren vóór canulatie (tabel 1).
5. Steek de afschuining van een naald van 28 G (lengte: 12,7 mm) in de zijkant van de speen en injecteer langzaam 200 μl 0,9% zoutoplossing met een snelheid van 200 μl/min. Dit zorgt voor een betere visualisatie van de ductale openingen.
   OPMERKING: Het is mogelijk dat niet alle 200 μL zoutoplossing in de speen hoeft te worden geïnjecteerd; Stop met injecteren zodra u de zoutoplossing uit een of meer ductale openingen ziet komen.
6. Zuig 1 ml bereide ablatieve oplossing op met behulp van een Luer lock-spuit van 1 ml. Bevestig de spuit aan het vrouwelijke, "gevleugelde" uiteinde van de 12-inch mannelijke-vrouw verlenglijn. Bevestig voorzichtig een naald van 27 G met stompe punt (lengte: 12,7 mm) aan het mannelijke uiteinde van de verlenglijn. Bereid de lijn voor met de oplossing. Veeg de naald schoon met een alcoholgaasje. Houd er ook rekening mee dat u de spuit niet met de ablatieve oplossing kantelt, omdat hierdoor luchtbellen kunnen ontstaan.
   OPMERKING: Dit zijn aanbevolen volumes die gericht zijn op het volledig vullen van de ductale boom(en): tot 300 μL in elke boom en tot 1,2 ml per cervicale en/of inguinale borstklieren (1e^en 4e^paar), tot 400 μL in elke boom en tot 1,6 ml per thoracale en/of abdominale borstklieren (2e^en 3e^paar). Voor andere toepassingen kan het aangewezen zijn om kleinere of grotere volumes te gebruiken op basis van experimentele vereisten en/of fluoroscopierichtlijnen om overvulling van de ductale boom te voorkomen. De verlenglijn zorgt voor een betere controle van het debiet en voor gelijktijdige infusie en live fluoroscopiebeeldvorming. Ter vergelijking: de aanbevolen hoeveelheden intraductale infusie in^{muismodellen van} 9-12 weken 4 zijn: tot 30 μl in cervicale en inguinale en tot 50 μl in thoracale en abdominale borstklieren, en rattenmodellen⁵: tot 100 μl in cervicale en liesverbanden en tot 300 μl in thoracale en abdominale borstklieren.
7. Gebruik een 10x vergrootlamp om te helpen bij het lokaliseren van de ductale openingen. Houd de speen voorzichtig vast met de vingers en trek de naald in de ductale opening. Ga voorzichtig door met het inbrengen van de naald met stompe punt van 27 G totdat de punt volledig in de speen zit. Om de naald in de speen te plaatsen, brengt u de speen omhoog naar de naald in plaats van de naald naar beneden in de speen te duwen. Zorg ervoor dat u het pad van de ductale opening volgt.
   OPMERKING: Bij sommige konijnen kunt u weerstand voelen wanneer u probeert de naald in de speenopening(en) te steken. Oefen voorzichtig lichte druk uit om door de bovenste epitheelcellaag te breken. Onze ervaring is dat er een vergrotingsapparaat nodig is om de ductale opening voor cannulatie duidelijk te identificeren. Dit kan een vergrootglas, lens, loep of iets dergelijks zijn.
8. Laat langzaam 300 μl van de oplossing trekken met een constante snelheid van ongeveer 200 μl/min zodra de naald volledig is ingebracht. Wacht 30 s na de infusie om de naald uit de gecanuleerde boom te verwijderen; Dit zorgt ervoor dat het geïnjecteerde volume in de ductale boom blijft en verkleint de kans op lekkage.
   OPMERKING: Meestal is er één onderzoeker die de naald canuleert en vasthoudt, terwijl een tweede onderzoeker de spuit vasthoudt en de zuiger met de gewenste snelheid indrukt. Een spuitpomp kan worden gebruikt om een meer gecontroleerd debiet te hebben, aangezien abrupte veranderingen in de infusiesnelheid kunnen barsten of de ductale bomen kunnen beschadigen.
9. Verwijder gemorste oplossing met bevochtigd gaasje of een EtOH-doekje om vreemde contrastvloeistof in afbeeldingen te voorkomen.

3. Fluoroscopie beeldvorming

1. Maak fluoroscopiebeelden nadat elke ductale boom is toegediend. De parameters van de fluoroscopie zijn: 30 fps, 67 kV en 17,3 mA op een röntgeninstrument voor fluoroscopie. Pas deze echter aan op basis van het experiment en de beeldvormingsbehoeften.
2. Gebruik de fluoroscopiebeelden om te bepalen of er extra volume nodig is om de ductale boom volledig te vullen.
   OPMERKING: Fluoroscopiebeeldvorming kan live plaatsvinden op hetzelfde moment als de infusie van de ablatieve oplossing. Metalen of plastic pincet kan worden gebruikt om de speen vast te houden terwijl beeldvorming plaatsvindt om het personeel te beschermen tegen schadelijke röntgenstralen. Dit maakt het mogelijk om de vulling van de ductale boom(en) te controleren. Live fluoroscopie kan aangeven wanneer de infusie moet worden gestopt op basis van het verhoogde volume aan de uiteinden van de longblaasjes. Fluoroscopie na infusie kan bevestigen of de ductale boom volledig gevuld was of dat er enige lekkage was. Een bevestigende fluoroscopie wordt meestal uitgevoerd na infusie van elk kanaal in dezelfde borstklier.

4. Postoperatieve zorg en herstel

1. Stop de instroom van isofluraan na de laatste intraductale infusie.
2. Injecteer 0,5 mg/kg atipamezol intramusculair.
   OPMERKING: De hersteltijd verschilt van dier tot dier, maar het konijn zou 5-20 minuten na de injectie tekenen van herstel moeten beginnen te vertonen.
3. Geef het dier voortdurende warmteondersteuning op een verwarmende deken totdat het volledig hersteld is van de anesthesie. Houd de zuurstofstroom tot 5 minuten vast voordat u de anesthesie verbreekt.
   OPMERKING: Tekenen van herstel zijn onder meer mondbewegingen zoals kauwen, hoesten, neustrekkingen en/of oogbewegingen. Konijnen moeten een oprichtreflex hebben en in staat zijn om zichzelf in sternale positie te houden voordat ze terug in de hersteldrager worden geplaatst. Herstelmiddel wordt toegediend op basis van het gewicht van het konijn met een bereik van 0,1-1 mg/kg atipamezol.
4. Injecteer 5 mg/kg ketoprofen subcutaan.
5. Verwijder de intraveneuze katheter zodra het konijn zich in een sternale positie kan houden. Houd een gaasje vast op de plek waar de katheter is verwijderd om overmatig bloeden te stoppen.
   OPMERKING: Het verwijderen van de katheter kan plaatsvinden wanneer het konijn in de transportdrager zit.
6. Vervoer het konijn terug naar de juiste huisvesting.
7. Ga door met injecties van 5 mg/kg ketoprofen subcutaan gedurende ten minste 3 dagen na de procedure.
8. Controleer het konijn eenmaal daags gedurende ten minste 3 dagen na de procedure op tekenen van ongemak, angst, pijn en zelfverminking. Als het konijn een van deze klinische symptomen vertoont, kan de behandeling met ketoprofen worden verlengd. Registreer en controleer het lichaamsgewicht om te beoordelen op tekenen van anorexia.
   OPMERKING: Ketoprofen wordt toegediend op basis van het gewicht van het konijn met een bereik van 2-5 mg/kg. Het kan elke 24 uur worden toegediend tot 5 dagen na intraductale infusie om ontstekingen te verminderen en littekens te minimaliseren. Om bijwerkingen van huidzweren of andere problemen met wondgenezing tot een minimum te beperken, brengt u lidocaïne plaatselijk aan op de injectieplaats. Elk dier dat aanhoudende tekenen van ongemak, angst, pijn of letsel vertoont na behandeling met ketoprofen, moet worden geëuthanaseerd.

5. Weefselanalyse

1. Dien euthanasieoplossing (pentobarbitalnatrium en fenytoïnenatrium) intraveneus toe in een dosis van 100 mg/kg. Controleer na 60 s op tekenen van leven door teen/oor knijpen, tekenen van ademhaling of hartslag, hoornvliesreflex en/of pupilstimulatie.
2. Voer een autopsie uit om borstklierweefsel te verkrijgen en verwerk de routinematige paraffine-inbeddingsprocedure na 24-36 uur in 10% neutraal gebufferd formaline¹⁸. Voer vervolgens standaard hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en/of immunohistochemische kleuring uit met celtypespecifieke marker om te helpen bij de gewenste analyse-uitlezingen¹⁸. Verwijder het karkas via het juiste verwijderingsprotocol (bijv. verbranding).
3. Analyseer borstklierweefsel in overleg met een patholoog. Gebruik een computersoftwareprogramma om te helpen bij het kwantificeren van de ablatiesnelheid en collaterale weefselschade.
   OPMERKING: Weefselanalyse werd uitgevoerd op 4 maanden oude Nieuw-Zeelandse witte konijnen binnen een uur na infusies (Figuur 4) met QuPath Open Software for Bioimage Analysis (https://qupath.github.io/). Deze analyse is alleen gebaseerd op H&E-gekleurde weefsels. QuPath of vergelijkbare computersoftware vereist invoer en kalibratie door een patholoog. Sommige cellen kunnen verkeerd worden geclassificeerd met behulp van alleen morfologische kenmerken (Figuur 4). Het gebruik van celtypespecifieke markers zoals cytokeratines en actine in de α-gladde spier kan worden gebruikt om de computerondersteunde classificatie te verbeteren⁶. Uiteindelijk moet de analyse van celclassificatie worden samengesteld en gevalideerd door een patholoog.

Resultaten

Elk van de 8 borstklieren van een vrouwelijk konijn bevat 4 ductale bomen die zich openen bij onafhankelijke speenopeningen (Figuur 2). Vanwege het verschil in grootte en aantal ductale bomen per borstklier tussen knaagdieren (slechts 1 kanaal per borstklier), zijn konijnen een goed tussenmodel voor menselijke vertaling. We kunnen tot 400 μL 10-70% EtOH-oplossing infuseren om de hele ductale boom van elke borstklier van 4 maanden oude Nieuw-Zeelandse witte konijnen te vullen (Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4 ^4,8,9). We kunnen in één sessie tot 4 ductale bomen in maximaal 8 borstklieren infuseren met de ablatieve oplossing. Een typisch experimenteel ontwerp bestaat uit het infuseren van 2-3 ductale bomen in een enkele borstklier in maximaal 4 borstklieren met een bepaalde ablatieve oplossing die op jodium gebaseerd röntgencontrastmiddel bevat (Figuur 2,  Figuur 3). Voor iohexol-bevattende (90-300 mg jodium/ml) ablatieve oplossing wordt fluoroscopie uitgevoerd tijdens en/of na elke infusie om het individuele succes te bepalen van het infuseren van elke ductale boom met een gedeeltelijke of volledige hoeveelheid geïnfuseerde oplossing (Figuur 2, Figuur 3). Door het weefsel van de borstklier te verzamelen, kan worden beoordeeld hoe veranderingen in de formulering de vernietiging van borstepitheelcellen beïnvloeden (Figuur 4). Deze beeldvormingsanalyses bieden informatie om de meest geschikte oplossing te begrijpen om maximale ablatie te bereiken en tegelijkertijd de schade aan het omliggende weefsel te minimaliseren. We hebben vastgesteld dat 10% EtOH-oplossing een vergelijkbare ablatieve snelheid biedt als ablatieve oplossingen die een hoger percentage EtOH bevatten (Figuur 4).

Figuur 1: Workflow van de intraductale procedure. De belangrijkste stappen van de ID-procedure worden gemarkeerd. Zie de video voor meer details. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Belangrijkste stappen van intraductale canulatie en infusie. (A) Injectie van zoutoplossing loodrecht op de speen om de ductale openingen voor canulatie te verwijden (mediaan vlakaanzicht). (B) Cannulatie en vulling van een ductale boom (D1) kan worden gevolgd met blauwe kleurstof in de ablatieve oplossing (mediaan vlakaanzicht). (C) Real-time fluoroscopiebeeldvorming biedt nauwkeurige monitoring met hoge resolutie van ductale boomvulling (D1) met iohexol in de ablatieve oplossing (dorsaal vlakaanzicht). Ductale boomopeningen zijn van links naar rechts genummerd, beginnend in het bovenste kwadrant (D1, linker bovenkwadrant) en eindigend in het onderste kwadrant (D4, rechter onderkwadrant). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Speengrootte en succesvolle toediening van ablatieve oplossing aan meerdere kanalen. Typische presentatie van speenmaten bij Nieuw-Zeelandse witte konijnen. De grootte van de spenen varieert op basis van het gewicht en de leeftijd van het konijn. Borstklieren zijn genummerd van linksboven (L1, links cervicaal) tot rechtsonder (R8, rechter lies). Alle afbeeldingen worden getoond in het dorsale vlak. (A) 2,8 kg vierd konijn (boven) met kleinere spenen, moeilijk te cannuleren, 3,5 kg vierd konijn (midden) met geschikte spenen voor cannulatie, en 4,1 kg meervoudig konijn (onder) met grotere spenen, veel gemakkelijker te cannuleren. (B) Blauwe kleurstof in de toegediende oplossing kan worden gebruikt als in vivo bewijs van intraductale toediening en ductale boomvulling. Mislukte infusie wordt aangegeven met een rode omtrek (toediening van het vetkussentje, bovenaan) en succesvolle infusies met een blauwe omtrek (intraductale toediening, midden en onderkant). Een 70% EtOH-oplossing veroorzaakt minuten na infusie meer schade aan de huid (erytheem) (donkerblauw, middelste paneel) in vergelijking met een 10% -oplossing (lichtblauw, onderste paneel). (C) Fluoroscopie levert in vivo bewijs van intraductale toediening. Mislukte infusie (afgifte van vetkussentjes, bovenpaneel). Succesvolle sequentiële infusie van D1 ductaal eerst en D2 ductaal boom als tweede (paneel linksonder). Live fluoroscopie biedt beeldgeleiding voor het vullen (witte pijlen) van D3 ductale boom (paneel rechtsonder); De verlenglijn gevuld met IOHEXOL-bevattende ablatieve oplossing en een tang om de speen vast te houden zijn ook zichtbaar. Schaalbalken komen overeen met 1 cm in afbeeldingen bij verschillende vergrotingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Weefselanalyse van borstklieren bij Nieuw-Zeelandse witte konijnen na intraductale procedure met ablatieve oplossing op basis van ethanol. (A-B) Representatieve H&E-kleuring van een rechter inguinale borstklier van een dier van 4 maanden oud zonder ablatieve behandeling in vergelijking met een rechter inguinale borstklier van een ander dier met 10% EtOH ablatieve behandeling. Weefselplakjes worden langs het middenvlak gesneden, zodat D1 en D3 (linker ductale bomen) op dezelfde weefselsecties worden weergegeven. Weergave van het hele weefsel (A) en weergave met hoge vergroting (B) tonen morfologische en chromatische effecten van EtOH-ablatie op H&E-kleuring (bovenste panelen) en afgeleide epitheel- en stromale celklassen op basis van computerondersteund getrainde classificator (onderste panelen). Zwarte schaalbalk komt overeen met 1 mm in A en witte schaalbalk met 100 μm in B. (C) De grafiekbalk geeft de celklasseverdeling weer in ductale bomen (n > 4 per groep) die zijn behandeld met verschillende concentraties EtOH of onbehandeld zijn gebleven. Sterretjes geven de p-waarde aan van de ongepaarde Welch's t-test van elke celklasse per groep in vergelijking met de overeenkomende celklasse in de met 10% EtOH behandelde groep (* <0,05, ** < 0,01, **** <0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In onze eerdere studies hebben we aangetoond dat een ID-afgifte van 70% EtOH de borstepitheelcellen ablateert terwijl het minimale schade aan het omliggende weefsel bij knaagdieren veroorzaakt ^6,7. In deze procedure hebben we aangetoond dat een ID-infusie van een ablatieve oplossing kan worden opgeschaald naar een konijnenmodel. In het bijzonder tonen we in dit grotere model met een multiductaal boomsysteem aan dat sequentiële infusie van alle kanalen in een borstklier met succes kan worden toegediend. Dit vertegenwoordigt de volgende fase in het vertalen van deze ablatieve procedure naar een levensvatbaar alternatief voor profylactische borstamputatie voor de primaire preventie bij personen met een hoog risico.

Het door de FDA goedgekeurde röntgencontrastmiddel op basis van jodium Omnipaque (iohexol) stelt ons in staat om het succes van de infusie te beoordelen door live visualisatie van het toedieningsproces van de oplossing door de ductale boom. Het gebruik van fluoroscopie om de geïnfuseerde borstklier te visualiseren, komt nauw overeen met wat waarschijnlijk de apparatuur en instrumenten zijn die worden ingezet om deze beeldgeleide procedure naar de kliniek te brengen^10,11. Deze beeldvormingsmodaliteit stelt ons in staat om te weten wanneer we de infusie moeten staken, waardoor levende fluoroscopie een belangrijk onderdeel wordt van de klinische implementatie van deze ablatieve procedure. We hebben de schaalbaarheid van deze procedure vastgesteld van knaagdier tot ductale bomen van konijnen, maar verder onderzoek is nodig om het percentage EtOH te bepalen dat de borstepitheelcellen het beste ablateert en tegelijkertijd de schade aan het omliggende weefsel in dit grotere diermodel minimaliseert. Dit protocol richtte zich op de haalbaarheid van intraductale infusie en weefselanalyse direct na de procedure. Strategieën voor het oplossen van problemen en nuttige tips worden beschreven in Tabel 1. Hoewel de belangrijkste focus van dit protocol ligt op het leveren van ablatieve oplossingen op basis van ethanol, kan dit protocol in andere toepassingen worden gebruikt om lokaal andere beeldvormingsreagentia, genmodificerende systemen zoals CRISPR/Cas9, lentivirale vectoren, siRNA's, groeifactoren en/of kankerverwekkende stoffen ^2,3 af te leveren om andere aspecten van de ontwikkeling van de borstklier en oncogenese bij konijnen te bestuderen.

Concluderend biedt dit protocol de onderzoeksinstrumenten die nodig zijn om een systematische en longitudinale studie uit te voeren van de lokale en systemische effecten van verschillende ablatieve oplossingen. Deze informatie zal de veiligheid van deze procedure bepalen en eventuele zorgen met betrekking tot verdere ontwikkeling en klinische evaluatie in eerste klinische onderzoeken bij mensen aan het licht brengen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10X vergrootglas met licht en klem, grote zwanenhals	Amazon	B0D982JCZ2	Voor het visualiseren van tepels
Exel International Insuline-spuit	Fisher Scientific	14-841-31	Voor periductale injectie van zoutoplossing
Bulk stompe naalden maat 27 lengte 0,5	SAI Infusion Technologies	B27-50 100 Bulk	Voor intraductale canulering
Evans blauw	Sigma	E2129-50G	Voor visualisatie van borstklieren
Fluoroscopisch röntgenbeeldvormingssysteem	GE HealthCare	DT-C31-01	Voor fluoroscopie beeldverwerving
HotDog veterinaire opwarmingsdeken	HotDog	WC71V	Voor intraductale procedure/preoperatieve voorbereiding
Mannelijk-vrouwelijk verlengsnoeren, lengte 12 inch	SAI Infusion Technologies	EXT-12	Voor intraductale procedure
Omnipaque 500 mL (350 mg Jodium/mL)	GE Healthcare	0407-1414-72	Contrastmiddel voor röntgenvisualisatie (fluoroscopie)
Steriele blauwe voedselkleur	McCormick	930641	Voor visualisatie van borstklieren
Steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)	ThermoFisher	14190250	Voor bereiding van oplossing
Spuiten	BD	309659	Voor intraductale infusie
V-gel	Docsinnovent	D30001 - 30006	Voor intubatie (catalogusnummer hangt af van de grootte van de V-gel)
Ketoprofen	Covetrus	#005488	Voor pijnstilling
ketamine	Covetrus	71069	Voor pijnstilling
Topische lidocaïne	Covertus	70859	Voor pijnstilling
xylazine	Covetrus	80907	Voor anesthesie
Euthasol	Covetrus	#009444	Voor euthanasie
oogsmeer	Covetrus	75848	Voor anesthesie
atipamezole	Covetrus	82124	Voor anesthesie
Bananenchips	Bio-Serv	#F7161	Voor acclimatisatie
Furity Gems	Bio-Serv	#F5136-1	Voor acclimatisatie
Yogurt Drops	Bio-Serv	#F7200-1	Voor acclimatisatie