Methodenartikel

Herbruikbaar leverbeeldvormingsapparaat: een herbruikbaar 3D-geprinte hulpmiddel voor leverintravitale microscopie

DOI:

10.3791/68337

⸱

17 maart 2026

 ,  ,  , 
1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol introduceert een geavanceerd, herbruikbaar hepatisch beeldvormingshulpmiddel (RHIT) voor intravitale microscopie (IVM) van levende muizen, wat de weefselstabiliteit verbetert voor snelle en acute experimenten. Het 3D-geprinte ontwerp van de RHIT biedt kosteneffectieve productie, schaalbaarheid en veelzijdigheid, waardoor langdurige observatie van metabole processen bij muizen van verschillende groottes mogelijk is.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leverfunctie en -disfunctie kunnen worden beoordeeld door direct de dynamische processen van de lever te visualiseren met behulp van confocaal-gebaseerde intravitale microscopie (IVM). In het bijzonder kan uitstekende ruimtelijke en temporele precisie worden bereikt bij het extraheren van zowel kwalitatieve als kwantitatieve informatie. Op de microscoopfase blijft het behouden van fysiologische weefselcondities terwijl stabiliteit en herhaalbaarheid worden bereikt, een uitdaging. Een verhoogd gewicht en het leverlipidengehalte hebben een nadelig effect op dit proces in diermodellen van type II diabetes (T2D) en niet-alcoholische leververvetting (MAFLD). Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we RHIT ontwikkeld, een revolutionair beeldvormend instrumentontwerp dat de toegang en stabiliteit van weefsels verbetert. RHIT is een herbruikbaar, schaalbaar leverbeeldvormingsapparaat dat wordt vervaardigd met 3D-printen in een efficiënte eenstapsprocedure. De afmetingen kunnen worden aangepast om muizen van verschillende maten te passen. Kort gezegd is RHIT een 3D-geprint apparaat voor het positioneren en stabiliseren van laboratoriumdieren tijdens intravitale levermicroscopie, gebruikt na een korte chirurgische voorbereiding om hantering, stress en variabiliteit te minimaliseren. Het herbruikbare, gestandaardiseerde ontwerp is eenvoudig te produceren en aan te passen, en ondersteunt een reeks maten en potentiële experimentele ontwerpen. De eerste resultaten tonen een opmerkelijke verbetering aan in de stabiliteit en betrouwbaarheid van leverintravitale beeldvorming, waardoor subcellulaire structuren, zoals lipidedruppels, gedetailleerd kunnen worden weergegeven. Deze verbeterde precisie faciliteert metabole en fysiologische studies met meer helderheid, reproduceerbaarheid en potentieel voor longitudinale ontwerpen. Het protocol biedt een gestandaardiseerde, toegankelijke aanpak die langdurige technische uitdagingen bij hepatische IVM aanpakt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intravitale microscopie is een krachtig hulpmiddel om biologische processen in vivo dynamisch te visualiseren 1,2,3, in tegenstelling tot de traditionele immunofluorescentie-histologie met vaste weefsel- of levende celbeeldvorming en flowcytometrie-analyse van geïsoleerde cellen. Voor leverinspectie is IVM gebruikt om galsecretie en -stroom 4,5 te onderzoeken, glucosemobilisatie 6,7, nonparenchymale cellen 8,9,10 en leverziekten11,12. Bovendien maakt IVM met betrekking tot het onderzoek naar lipidenaccumulatie realtime informatie mogelijk over de dynamiek van lipidendruppelvorming, groei en degradatie in levende weefsels, zoals het visualiseren en kwantificeren van lipidendruppels met hoge ruimtelijke resolutie, en voor de directe correlatie van lipidendruppelophoping met andere cellulaire en fysiologische processen13. Ondanks deze voordelen is IVM technisch nog steeds uitdagend: het vereist gespecialiseerde apparatuuren expertise, kan weefselschade veroorzaken, het cellulaire gedrag veranderen en invasieve procedures vereisen. Traditionele in vivostudies die vertrouwen op gedragsobservatie, fysiologische monitoring en genetische analyse leveren waardevolle informatie, maar missen de ruimtelijke en temporele resolutie die intravitale microscopie biedt.

De eerste grote uitdaging bij IVM is het beheersen van de instabiliteit van de artefacten veroorzaakt door hartslag en ademhaling van het geïnspecteerde dier, wat de beeldkwaliteit kan aantasten en resulteert in verduisterde of vervormde beelden van de biologische processen die worden waargenomen15. Pogingen om dit te corrigeren met beeldverwerking leiden vaak tot het verlies van belangrijke ruimtelijke en temporele informatie of het vereisen van geavanceerde chirurgische apparatuur en onderhoud16,17. Ten tweede zijn muismodellen voor leverziektestudies, zoals MAFLD en T2D, vaak obesitas en daardoor moeilijker te stabiliseren vanwege hun grotere omvang en weefsellipidengehalte16,18. In obese NAFLD- en T2D-muismodellen vormt een verhoogde lichaamsmassa mechanische uitdagingen voor intravitale beeldvorming doordat de laadcapaciteit van standaard microscoopfasen wordt overschreden en de dierstabilisatie19 bemoeilijkt. Dit extra gewicht verhoogt het risico op bewegingsartefacten en weefselcompressie, die beide de beeldvormingsprecisie20 verminderen.

Tegelijkertijd verhoogt een verhoogd leverlipidengehalte de weefselopaciteit en lichtverstrooiing, wat de beeldresolutie en het contrast vermindert. Deze effecten worden vaak versterkt door metabole comorbiditeiten zoals veranderde perfusie en ontsteking, wat de kleurstofverdeling en signaalhelderheid verder vermindert. Ten slotte kan het moeilijk zijn en de herhaalbaarheid belemmeren om tijdens de beeldvorming een stabiele lichaamstemperatuur te behouden om de weefselfysiologie en biologische activiteiten te ondersteunen. Daarnaast is een stabiele positie van de lever in het microscoopstadium tijdens IVM cruciaal om mechanische stress ofweefselschade te voorkomen. Het blootleggen van het leverweefsel is een delicate procedure die technische precisie vereist om ernstige bloedingen en leverparenchymschade te voorkomen7. Om bewegingsartefacten te verminderen, werd de ribbenkast van de muis eerder van het microscooppodium getild met karton, waardoor de zwaartekracht de lever van de rest vanhet lichaam kon wegtrekken. Hoewel deze aanpak succesvol bleek in het produceren van kwantificeerbare gegevens, is het kartonmateriaal onhoudbaar omdat het vorm verliest en moeilijk schoon te maken is. Daarnaast is het moeilijk om de afmetingen van het kartonnen inzetstuk aan te passen aan obese muismodellen.

In de afgelopen jaren zijn verschillende geavanceerde hepatische intravitale microscopietechnieken ontstaan, waaronder scanning light field microscopie en computationeel verbeterde optische systemen, die verbeteringen hebben aangetoond in ruimtelijke resolutie23, verminderde fototoxiciteit24, grotere beelddiepte25,26 en bewegingsartefactonderdrukking27. Deze ontwikkelingen, zoals aangetoond in recente studies 28,29,30, vertegenwoordigen belangrijke technologische vooruitgang op dit gebied. Dit artikel presenteert het Hergebruikbare Hepatische Beeldvormingshulpmiddel (RHIT), een innovatief hulpmiddel voor IVM van de muislever. RHIT draagt bij aan dit veranderende landschap door een schaalbaar en herbruikbaar hulpmiddel aan te bieden dat de mechanische stabiliteit en de toegankelijkheid van weefsels verbetert bij diverse diermodellen, waaronder die met metabole ziekten. Het ontwerp pakt de aanhoudende uitdagingen van beweging, variabiliteit en opstellingscomplexiteit aan door anatomische pasvorm, staging-reproduceerbaarheid en gebruiksgemak te integreren. De compatibiliteit van RHIT met zowel conventionele als geavanceerde beeldvormingsmethoden vergroot het nut van deze opkomende technieken, waardoor betrouwbare en fysiologisch stabiele intravitale leverbeeldvorming wordt bevorderd.

Hoewel verschillende benaderingen zijn voorgesteld om het weefsel tijdens IVM te stabiliseren, zoals een chirurgisch venster 9,31,32,33,34,35,36 en een op maat samengestelde acrylfase 6,37, brengen deze methoden ook tal van beperkingen en complexiteiten met zich mee wat betreft schaalbaarheid, reproduceerbaarheid en chirurgische vaardigheden. In vergelijking daarmee is RHIT functioneel onderscheidend in zijn doel en ontwerp. Het is niet afhankelijk van directe compressie of gel-gebaseerde embedding38. In plaats daarvan dient RHIT als een schaalbaar, herbruikbaar, anatomisch gevormd hulpmiddel dat leverisolatie ondersteunt via zwaartekrachtpositionering, waarbij fysiologische oriëntatie behouden blijft zonder het weefsel te beperken of te vervormen. Cruciaal is dat RHIT de reproduceerbaarheid van gegevens, beeldkwaliteit en procedurele consistentie verbetert over een breed scala aan muisgroottes. Het elimineert de noodzaak van gels, lijmen of complexe chirurgische interfaces, terwijl het de weefseluitlijning en temperatuurregeling vereenvoudigt. Bovendien is RHIT een gespecialiseerd hulpmiddel dat de interface tussen het dier en de microscoop overbrugt, ontworpen om zowel fysiologische ondersteuning als beeldvormingsprecisie te ondersteunen.

RHIT pakt direct de mechanische en optische uitdagingen van metabolisch gecompromitteerde modellen aan via zijn schaalbare geometrie, die grotere diergroottes accommodereert terwijl het gewicht gelijkmatig verdeelt om platforminstabiliteit te minimaliseren. De teruggetrokken leveropening stabiliseert het weefsel met behulp van zwaartekracht zonder drukkracht, waardoor consistente toegang mogelijk wordt en beweging tijdens beeldvorming wordt verminderd. Het herbruikbare, chemisch inerte ontwerp zorgt voor compatibiliteit met biologisch weefsel en ondersteunt hygiënisch hergebruik. Door consistente positionering mogelijk te maken, bewegingsartefacten te minimaliseren en weefselintegriteit te behouden, biedt RHIT een fundamentele vooruitgang in intravitale microscopieworkflows. De aanpasbaarheid en beschikbaarheid van open source bevorderen verder brede bruikbaarheid in laboratoria en diermodellen, en zetten een nieuwe standaard voor beeldvormingstools die zowel het monster als het beeldvormingssysteem ondersteunen.

Bovendien kunnen commercieel verkrijgbare verwarmde microscooptrappen geavanceerde microscoopopstellingen en het hanterenvan 39 vereisen. Ze zijn niet schaalbaar op het specimen en over het algemeen duurder, waardoor ze voor veel onderzoekers minder toegankelijk zijn. Daarom is een herbruikbare schaalbare insert belangrijk om IVM te standaardiseren voor verschillende diermodellen. 3D-geprinte technologie, ook wel additive manufacturing genoemd, is steeds populairder geworden in wetenschappelijke laboratoria40 en heeft de protocollen van biochemie, natuurkunde en biologie getransformeerd. Voor IVM is 3D-technologie gebruikt om lichtgewicht beeldvormende optische vensters41,42 te produceren, de toegankelijkheid van weefselste verbeteren en weefselreparatie en reconstructie te faciliteren44. Dus een op maat gemaakt hulpmiddel voor weefselstabilisatie, dat naar zover wij weten niet is beschreven, biedt een uitstekende kans om 3D-printen toe te passen om enkele van de uitdagingen van hepatische IVM te overwinnen.

RHIT is gemaakt met behulp van een eenstaps 3D-printmethode en verbetert de weefselstabilisatie aanzienlijk gedurende een langere periode. RHIT is zeer toegankelijk en geschikt voor acute IVM-experimenten die minimale chirurgische expertise vereisen. Daarnaast is RHIT gemakkelijk schaalbaar naar diergrootte en heeft het lage productiekosten. Tot slot tonen we aan dat RHIT stabiele timelapse-fluorescentiebeeldvorming mogelijk maakt en de weefselstabiliteit verbetert ten opzichte van de eerder gebruikte kartonnen inzet. RHIT vereenvoudigt IVM van de hepatische lipidehomeostase zonder direct contact of meetbare invloed op fysiologische omstandigheden. Daarom biedt RHIT een concurrentievoordeel als een versnelde, herbruikbare en aanpasbare bijdrage aan IVM34, 36, 45.

figure-introduction-1
Figuur 1: RHIT-ontwerp. (A) Ontwerp en afmetingen van een 3,0 mm RHIT, geschaald voor een zwaarlijvige muis. De enface-weergave (links) toont de afmetingen, positie en grootte van de weefselopening, evenals de oriëntatie van de muis tijdens de beeldvorming. Het zijbeeld (rechts) bevat afmetingen en geeft de positie van het warmtekussen en het inzetstuk voor de temperatuurprobe aan. Schaalparameters voor verschillende muisgroottes zijn weergegeven in Tabel 1. (B) 3D-enface-weergave van RHIT gegenereerd uit het open-source STL-bestand, waarop wordt getoond waar de rectale probe-draad via de aangepaste poort wordt ingebracht (gelabeld rectale probe insert-afmetingen rechtsboven weergegeven). (C) Technische assemblage van RHIT die integratie toont van het verwarmingsapparaat en de aangepaste structurele inzetstukken voor verschillende RHIT-maten; de draad wordt in de rectale probe-inzet geplaatst voor toegang tot de temperatuurprobe. Afkorting: RHIT = Herbruikbare Leverbeeldvormingstool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

RHIT werd oorspronkelijk ontworpen als een eencomponentige assemblage met ABS (Acrylonitrile Butadiene Styreen), een veelgebruikt thermoplastisch polymeer in fused deposition modeling 3D-printen45. ABS biedt verschillende voordelen voor deze toepassing: het is lichtgewicht, hittebestendig (smeltpunt ~200 °C) en heeft een goede slagbestendigheidvan 46,47,48. Het ontwerp van RHIT maakt gebruik van de afstembare dichtheid van ABS, waardoor het fysiologische bewegingen zoals hartslag en ademhaling kan absorberen. Een verhoogde infilldichtheid verbetert de bewegingsdemping, wat resulteert in een grotere beeldstabiliteit en een betere beeldkwaliteit.

RHIT is ontworpen om beweging te absorberen door aanpassingen aan de dichtheid van een chemisch inert materiaal zoals ABS. In deze context verwijst dichtheid specifiek naar het interne invulpercentage dat wordt gebruikt tijdens 3D-printen, wat de stijfheid en het vermogen van het platform om trillingen te dempen beïnvloedt. Het verhogen van de dichtheid van ABS is waargenomen dat het de overdracht van beweging veroorzaakt door hartslag en ademhaling vermindert, wat resulteert in een stabiel platform voor beeldvorming en verbeterde beeldkwaliteit. We testten RHIT-constructen met wisselende interne vuldichtheden (20-100%) en observeerden kwalitatief dat hogere dichtheidsconfiguraties leidden tot zichtbaar verminderde bewegingsartefacten tijdens leverintravitale beeldvorming bij muizen. Formele kwantificatie werd niet uitgevoerd, omdat de hoogdichtheidsconfiguratie voldoende stevig en effectief bleek over alle geteste RHIT-groottes en consequent betrouwbare prestaties leverde onder routinematige beeldvormingsomstandigheden. Voor de meeste gebruikers zal deze standaarddichtheid zonder verdere aanpassing geschikt zijn. Voor experimenten die specifieke mechanische eigenschappen vereisen, kunnen echter de invuldichtheid en ontwerpparameters worden aangepast, en zijn volledige 3D-printinstructies beschikbaar om dergelijke aanpassing te ondersteunen.

Alternatieve materialen kunnen worden gebruikt voor het drukken; ABS is echter het voorkeursmateriaal voor RHIT-fabricage omdat het verschillende belangrijke voordelen biedt. Het is chemisch inert, waardoor het risico op interactie met weefsel of lichaamsvloeistoffen wordt geminimaliseerd, en het is onoplosbaar in water, waardoor het efficiënt schoonmaken, opslaan en hergebruiken mogelijk is. Deze eigenschappen maken ABS een betrouwbare en duurzame keuze voor experimenteel gebruik. Wanneer de toegang tot een fused deposition modeling printer beperkt is, kunnen andere 3D-printtechnieken en materialen worden gebruikt. Stereolithografie, selectief lasersinteren en multi-jet fusie zijn geschikte opties met materialen zoals nylon, fotopolymeerharsen of composietpoeders. Nylon biedt duurzaamheid en flexibiliteit, terwijl stereolithografieharsen een hoge resolutie bieden voor toepassingen die fijne structurele details vereisen. Het RHIT-ontwerp kan gemakkelijk worden aangepast aan de toleranties en beperkingen van verschillende materialen, waardoor het compatibel is met verschillende drukplatforms. Gebruikers moeten materialen kiezen op basis van mechanische stabiliteit, biocompatibiliteit, compatibiliteit met beeldvormingsworkflows en beschikbare printbronnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd in de dierenfaciliteiten van de National Institutes of Health in overeenstemming met richtlijnen en protocollen die zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven (protocol nr. LCMB-037). Alle medewerkers moeten correct getraind zijn voordat ze doorgaan met de volgende protocollen. Het hanteren van dieren werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.

Het RHIT-protocol beschrijft de voorbereiding van herbruikbare hepatische beeldvormingsinstrumenten (RHITs) voor gebruik in intravitale microscopie (IVM)-experimenten. De experimentele procedures worden uitgevoerd in een gesteriliseerde microscoopkamer, of kap, en bestaan uit een reeks stappen: eerst het afdrukken van RHIT, anesthesie en fluorescerende labeling van de muis, daarna het opstellen van de microscoop, vervolgens de chirurgische ingreep en tenslotte de toepassing van RHIT-ondersteunde IVM. Figuur 1 en Figuur 2 illustreren de benodigde componenten voor het beelden van levende monsters met een confocale microscoop, waaronder een metalen inzetstuk 5,6,7 (microscoopadapter voor het beelden van levende monsters) voor het plaatsen van RHIT, evenals RHIT's voor gebruik bij geavanceerde of gecontroleerde steatose. Voor het testen van het systeem werden mannelijke C57BL/6J Mus musculus van 6-10 weken oud verkregen en voorafgaand aan het experiment een standaard of westerse voeding toegediend.

1. Ontwerp van RHIT met aanpassingen

  1. Om RHIT na te maken, gebruik je 3D-productontwerpsoftware (zie de Materiaaltabel). Open de ontwerpsoftware en maak een nieuw standaardonderdeel. Bewaar het bestand met een passende beschrijving.
  2. Maak de schets van RHIT op het voorvlak met behulp van de Create 2D Sketch-functie .
    1. Klik op het rechthoekige icoon en plaats de linkerbenedenhoek bij de oorsprong van het schetsvlak.
    2. Teken een tweede rechthoek binnen de eerste om het beeldvenster van RHIT weer te geven.
    3. Voeg dimensies toe aan beide rechthoeken met behulp van de Dimensie-functie , zodat alle lengtes en breedtes verwezen zijn naar de oorsprong en relatief tot elkaar.
    4. Pas de RHIT-afmetingen aan volgens de muisgrootte.
    5. Voeg dikte toe aan RHIT door alleen de buitenste rechthoek te selecteren en op extruderen te klikken. Wanneer er een pop-up verschijnt, selecteer je de schets met de Extrude-tool om een opening in het midden te laten.
    6. Selecteer het onderste vlak van de geëxtrudeerde RHIT en begin een nieuwe 2D-schets met de Start 2D Sketch-functie .
  3. Teken een rechthoek om het vakje voor het warmtekussen te definiëren. Pas de verkregen dimensies toe met behulp van de Dimensie-functie .
    1. Verlaat de 2D-schets en voer een materiaalverwijdering uit met het Cut Extrude-gereedschap om een diepe holte voor het warmtekussen te creëren.
  4. Begin een nieuwe schets voor de temperatuurprobe op hetzelfde vlak als de holte. Klik op Start a 2D sketch en selecteer het cirkel-icoon . Plaats de cirkel op het vlakke oppervlak en meet deze dienovereenkomstig. Verlaat de sketch-modus .
    1. Klik op extruderen en selecteer de schets van de cirkel. In dextrusiemodus klik je op 'snijd extruderen' en wacht je tot er een pop-up verschijnt met een optie om materiaal te verwijderen. Klik OK. Verlaat de extrusiemodus .
    2. Voeg afrondingen toe aan de randen van het venster door op het afrondingsicoon te klikken en alle acht scherpe randen te selecteren. Voeg filletgrootte toe en sluit filletmodus af.
      OPMERKING: Als extra bewegingsabsorptie gewenst is, kunnen gebruikers de interne infilldichtheid verhogen tijdens de voorbereiding van 3D-printen.
  5. Bereid het model voor op 3D-printen door naar het tabblad omgeving te navigeren en 3D Print-tabblad te selecteren.
    1. Gebruik de Set Orientation-functie om ervoor te zorgen dat het model plat op het printbed ligt en niet verticaal georiënteerd.
    2. Klik op Printopties om de eenheidsinstellingen te configureren en de schaal indien nodig aan te passen.
    3. Bewaar het definitieve model erin. STL-formaat met de STL-exportfunctie .
    4. Verlaat het tabblad omgeving en klik op opslaan om RHIT als een solide onderdeel op te slaan.
  6. Sluit het ontwerpprogramma.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de printer compatibel is met de . STL-bestandsformaat of converteer naar het juiste formaat zoals vereist door de 3D-printersoftware.

2. Het uploaden en printen van RHIT vanuit STL-bestanden

  1. Importeer het .stl-bestand van Figuur 1A of Supplemental File 1 in 3D computerondersteund ontwerp (CAD) door op Importeren te klikken en het .stl-bestand te selecteren. Klik op de knop Voorbereiden om het model in dunne lagen te snijden voor 3D-printen.
  2. Selecteer de juiste 3D commerciële printer en klik op Printen. Vervolgens monitor je de printvoortgang en verwijder en verwijder en schoon wanneer de print klaar is, het 3D-geprinte object indien nodig.
MuizengrootteMuis Lichaamsgewicht (g)RHIT-dikte (mm)Beeldraammaat L X W (mm)
Klein (S)17-201.517 x 17
Medium (M)22-252.521 x 21
Groot (L)35-40326 x 26

Tabel 1: Schaalgrootte van de muis naar RHIT. Het muisgewicht wordt geschaald naar de dikte van RHIT, waarbij een gewicht groter dan 30 g (pijlpunt) overeenkomt met de grootste RHIT (3,0 mm). De lichtste muis komt overeen met de dunste RHIT, en de zwaarlijvigste muizen worden vertegenwoordigd door de dikste RHIT. Deze afmetingen kunnen worden aangepast in CAD-software. De lengte van RHIT en de beeldopeningen kunnen variëren afhankelijk van de orgaanlocatie van het gebruikte monster; constante lengte en beeldopeningen voor alle drie de RHITS waren geschikt voor deze studie. Afkortingen: RHIT = Herbruikbaar Hepatisch Beeldvormingsinstrument; CAD = computerondersteund ontwerp.

3. Voorbereiding van de microscoop en gebruik van RHIT

figure-protocol-1
Figuur 2: IVM van de lever met de RHIT-techniek. (A) Schema van de omgekeerde confocale microscoopopstelling met een verdoofde muis. (B) Een metalen microscoopadapter (inzetstuk) werd gebruikt om de muis op het microscooppodium te positioneren voor live beeldvorming. (C) De 3D-geprinte RHIT werd gebruikt met een gaasstrook om leverparenchym gemakkelijk te manipuleren. (D) Afbeelding van de voor-exterioriseerde lever vóór RHIT-positionering. De neuskegel werd gebruikt voor de narcose vóór en tijdens de operatie. (E) Afbeelding van de buitenste lever vóór RHIT-positionering tijdens een acute procedure. Scheren was niet nodig. (F) Afbeelding van de omgekeerde muis in de uiteindelijke face-down positie op de RHIT voor beeldvorming. (G) RHIT stevig bevestigd aan het microscooppodium. (H) Een muis geplaatst op RHIT en metalen adapter. (I) Slanke (blauwe pijl) en obese (groene pijl) muizen, getoond met respectievelijk geschubde RHIT-inzetstukken in J-L, tonen grof anatomische beelden van respectievelijk de obese en magere lever. De hoogresolutie IVM beeldt M,N van lever van obese en slanke muizen, gelabeld met BODIPY (groen, weergegeven met een roze pijl) om lipidendruppels te labelen, en Hoechst 33342 (wit, weergegeven met een cyaanblauwe pijl) om respectievelijk kernen te labelen. Afkortingen: RHIT = Herbruikbaar Hepatisch Beeldvormingsinstrument; IVM = intravitale microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Bereid een conventionele omgekeerde confocale microscoop voor voor lever-IVM zoals weergegeven in Figuur 2.
    1. Plaats een stage-adapter om het monster te kunnen accommoderen. Om dit protocol te volgen, gebruik je een op maat gemaakte metalen inzetplaat met een ronde opening van 35 mm en een glas van 40 mm.
    2. Maak beide zijden van het afdekglas grondig schoon voor en na elke beeldvorming met 70% ethanol indien nodig.
  2. Bevestig de juiste RHIT op basis van muisgrootte (Tabel 1) met tape (optioneel) door het RHIT-diafragma uit te lijnen met de objectieflens en parallel over de beelddeklaag (Figuur 2G) op het metalen inzetstuk met tape over het afdekglas.
  3. Kies een objectief voor beeldvorming op basis van de grootte op het gebied, de ruimtelijke resolutie en de beeldtijd, zoals een 25x/0,95 waterobjectief.
    OPMERKING: Hoewel hogere vergroting de resolutie verbetert, vergroot het ook de kans op bewegingsartefacten.
    1. Richt het objectief dicht bij het afdekglas.
  4. Bevestig een strook gaas (ongeveer 1 x 8 cm, Figuur 2C, D) met tape over het RHIT-venster om het weefsel te positioneren en te scheiden van andere buikorganen (Figuur 2C).
  5. Verwarm RHIT met een warmtepad dat in de gleuf wordt geplaatst en de warmteprobe naast de RHIT bevestigt (Figuur 2G, H) om de lichaamstemperatuur van de muis tijdens de beeldvorming te behouden.

4. Fluorescerende etikettering en muizenanesthesie

  1. Verminder de stress van de muis door de inductiekamer van de anesthesie te desinfecteren om eventuele laatste sporen van dierlijke stank te verwijderen.
  2. Zet de zuurstofcondensor, een milieubeschermingssysteem (EPS) en de isofluranverdamper aan.
  3. Plaats de muis in de inductiekamer en doof de muis met 2-3% isofluraan gedurende ongeveer 3-5 minuten, of totdat het dier stabiele ademhaling vertoont en verlies van rechtstaande en trapreflexen vertoont.
    1. Na verdoving breng je de muis over naar het verwarmingskussen en houd je de anesthesie vast met 1-2% isoflurane toegediend via de neuskegel (Figuur 2D), waarbij je indien nodig aanpast om een stabiel chirurgisch vlak van anesthesie gedurende de procedure te garanderen.
    2. Beoordeel de diepte van de anesthesie door een teenknietest te doen om willekeurige bewegingen te observeren.
  4. Om lipidenrijke structuren te labelen, injecteer je 200 nmol BODIPY 665/676, verdund in PBS (totaal volume 200 μL), via de staartader met een 31 G insulinespuit.
    1. Voor een optimaal signaal dien je BODIPY één keer per dag toe gedurende twee opeenvolgende dagen voorafgaand aan de beeldvorming. Wacht minstens 3-4 uur na de tweede injectie om systemische verwijdering van achtergrond en stabilisatie van het weefselsignaal te waarborgen.
  5. Om nucleair contrast te verkrijgen, injecteer je Hoechst 33342 (2 μg/g lichaamsgewicht) verdund in 1x heparineoplossing (bereid door 120 μL heparine te mengen met 180 μL zoutoplossing voor 400 U/mL) via de retro-orbitale sinus met een 31 G insulinespuit.
    OPMERKING: Hoechst wordt apart toegediend om neerslag te voorkomen wanneer het met andere kleurstoffen wordt gemengd.
  6. Om de bloedvaten te visualiseren, injecteer je 18 μg/g lichaamsgewicht fluorescerende dextran (70 kDa) verdund in dezelfde 1x heparineoplossing zoals beschreven in stap 4.5, via de contralaterale retro-orbitale sinus met een 31 G insulinespuit (Tabel 2).
    OPMERKING: Heparine wordt toegevoegd om de vorming van stolsels te verminderen en een consistente bloedstroom tijdens beeldvorming te bevorderen.
  7. Wacht 10-15 minuten na Hoechst en Dextran-injecties voordat je met de operatie en beeldvorming begint.
Fluorescerende verslaggeverDoelDosis per gewicht (of concentratie)
Hoechst 33342Kleuringskernen2 μg/g: injectievolume toevoegen tot 50 μl met heparineoplossing
Bodiby 665/676Kleurige lipidedruppels0,8 μg/g: injectievolume toevoegen aan 200 μl in zoutoplossing
2M tetramethylrhodamine-dextran (Dextran)Kleurvaaten18 μg/g: injectievolume toevoegen tot 50 μl met heparineoplossing

Tabel 2: Fluorescerende reporteropties. Deze tabel geeft een gedetailleerde beschrijving van de methoden die worden gebruikt om muisweefsel te labelen voor in vivo imaging. De heparineoplossing wordt eerst bereid en vervolgens gebruikt om de DAPI-heparine- en dextran-heparineoplossingen7 te maken. Hoechst 33342 wordt retro-orbitaal in één oog geïnjecteerd, terwijl BODIPY direct in de staartader wordt geïnjecteerd 2-3 dagen eerder, met een hogere concentratie bij obese muizen. Dextran wordt retro-orbitaal in het andere oog geïnjecteerd. Het is belangrijk om retro-orbitale injecties apart in elk oog uit te voeren. Afkorting: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol.

5. Muizenoperatie

  1. Scheer de buikvacht met een haarknipper en/of ontharingscrème. Verwijder haarresten en gebruik 70% ethanol om de blootgestelde huid schoon te maken.
    OPMERKING: Afhankelijk van de institutionele IACUC-vereisten kan afwisselend een scrub van betadine en ethanol worden gebruikt om een passende voorbereiding op de chirurgische locatie te waarborgen.
  2. Beoordeel de diepte van de narcose opnieuw vóór de operatie.
  3. Maak de lever bloot door een horizontale, halvemaanvormige incisie van 2-3 cm onder de ribbenkast te maken met chirurgische schaar van de xiphoïde, eindigend aan de linkerzijde van de bovenbuik.
  4. Na de eerste incisie maakt u voorzichtig een kleinere secsie in de spierlaag om de linker leverkwab bloot te leggen, cauteriseer (optioneel) indien nodig om bloedingen te voorkomen (Figuur 2E).
    1. Voorkom hitteschade aan de lever tijdens het gebruik van de cauterizer door een met zoutoplossing doordrenkt gaas tussen de lever en de spierlaag te plaatsen om de uitstralende warmte van de spierlaag op te nemen.
    2. Vermijd overmatig bloedverlies, chirurgisch of mechanisch trauma, of externe compressie.
  5. Zodra de lever is blootgesteld, breng je de muis over naar de microscoopfase.

6. Plaatsing van de muis op het microscooppodium

  1. Plaats de buik van de verdoofde muis met het gezicht naar beneden bovenop het RHIT-platform van de microscoop.
    1. Stel de neuskegel zo aan dat de muis onder narcose blijft.
    2. Gebruik een zoutwaterbevochtigde applicator met katoenen tip om de linker laterale lob van de lever voorzichtig tegen de deklaag te bewegen terwijl er zachte externe druk op de thoracale holte wordt uitgeoefend.
      OPMERKING: Maak gebruik van de zwaartekracht om de lever voorzichtig naar buiten te manoeuvreren en op het afdekglas te plaatsen.
    3. Gebruik een gaasstrook om de lever voorzichtig van het lichaam van de muis te scheiden (Figuur 2E-H).
  2. Controleer de neuskegel opnieuw om te zorgen dat de muis onder narcose blijft tijdens de beeldvorming.
  3. Voorkom weefseluitdroging door een watergebaseerde gel aan te brengen rond de randen van de blootgestelde holte en direct contact met het warmtekussen te vermijden.
    OPMERKING: Het handhaven van temperatuur en luchtvochtigheid kan ook worden geholpen met een microscoop met een afgesloten luchtvochtigheidskamer 5,6,7.
  4. Breng oogzalf aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
  5. Stel time-lapse IVM in om beeldvorming 7,52 te starten.
    1. Open laserluiken, evalueer fluorescentielabeling en identificeer een stabiel interessegebied met een opvallende bloedstroom. Selecteer geschikte beeldopnameparameters, waaronder beeldformaat, verwervingssnelheid, beeldintervallen, totale opnameduur en lijn/frame-gemiddelde (512 × 512 pixels; 1-5 frames s⁻¹ per regio; beeldintervallen van 5-30 seconden; totale verwervingstijd van 5-20 minuten; lijn/frame-gemiddelde van 2-8, afhankelijk van de experimentele vereisten). Optimaliseer de fluorescentieflitsblootstelling om de gebruikte fluoroforen te accommoderen.
    2. Definieer de bovenste en onderste grenzen voor Z-stacks door Z-Stack te selecteren in het acquisitiepaneel , de boven- en onderste brandpuntsvlakken aan te passen met de Z-positieregelaars en het bereik te bevestigen met Set First/Set Last; start vervolgens de time-lapse opname door op Start Experiment (of Start Acquisition) te klikken. Na afloop van beeldvorming euthanaseert u het dier volgens de door de institutionele dierverzorging goedgekeurde protocollen en gebruikt u de door de commissie goedgekeurde protocollen.

figure-protocol-2
Figuur 3: Meting van de verbeterde lever-IVM-stabiliteit van RHIT met SSIM. Hepatische IVM van de onderste linker leverkwab onder drie stabilisatiecondities: (A) geen inzet (GEEN), (B) kartonnen inzetstuk en (C) RHIT. Weefsels zijn gelabeld met BODIPY (magenta, lipiden), Hoechst 33342 (groen, kernen) en Dextran (cyaan, vasculatuur); panelen A en B tonen zichtbare vervorming en bewegingsartefacten, terwijl C verbeterde helderheid toont met RHIT. (D) De structurele gelijkenisindex (SSIM) werd berekend om beeldstabiliteit te kwantificeren. Balken tonen gemiddelde ± SEM, en elke gekleurde stip vertegenwoordigt een individuele biologische replicatie: RHIT (n = 14), Karton (n = 10), Geen Insert (n = 8). Deze groepen zijn subsets afkomstig uit de totale experimentele cohort van ongeveer 50-70 muizen. Alleen sessies die aan specifieke beeldcriteria voldeden (bijv. consistente frame-uitlijning en beeldkwaliteit) werden via SSIM geanalyseerd. RHIT leverde consequent hogere SSIM-waarden op (gemiddelde 0,511 ± SEM), wat wijst op verbeterde stabiliteit en resolutie onder beeldvormingsomstandigheden. Schaalbalken = 15 μm. Representatieve afbeeldingen worden getoond; SSIM weerspiegelt seriële IVM-sessies zonder waarneembare weefselschade of verstoring. Afkortingen: RHIT = Herbruikbaar Hepatisch Beeldvormingsinstrument; IVM = intravitale microscopie; SSIM = structurele gelijkenisindex; CARD = kartonnen inzetstuk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RHIT is ontworpen met behulp van een CAD-applicatie (Figuur 1). RHIT-afmetingen zijn geschaald om kleine, middelgrote en zware muizen te accommoderen (Tabel 1). Het RHIT-ontwerp bestaat uit een 107,50 mm lang ABS vlak materiaal met een opening die geschikt is voor leverbeeldvorming. IVM werd uitgevoerd onder optimale (RHIT) en suboptimale (geen inzet- of karton) omstandigheden (zie Figuur 3A-C)....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leverintravitale microscopie is uitgebreid bestudeerd, maar eerdere methoden vereisen vaak zeer invasieve en niet-gestandaardiseerde chirurgische procedures voor gestabiliseerde terminale beeldvorming 5,6,7,9,31,32. Beweging is waarschijnlijk de meest uitdagende barrière die reproduceerbare b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Intramural Research Program van de US National Institutes of Health, het National Cancer Institute en de NIH-bibliotheek. H. Sanchez Cornejo bedankt het Peruaanse agentschap CONCYTEC voor financiële steun via subsidie nr. PE501087367-2024-PROCIENCIA. We willen de leden van het Porat-Shliom-lab en de medewerkers van de University of Cambridge Quantum Physics-groep bedanken voor kritisch lezen, het NIH-bibliotheekpersoneel en Geneti Gaga voor de technische ondersteuning. De 3D-gerenderde afbeelding in Figuur 2A is gemaakt met Biorender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
½-inch masking tape3M General Purpose Masking Tape:b40069428
40-mm coverslipsBioptech40-1313-03191
70% (v/v) ethanolThermo Fisher ScientificBP2818-470% ethanol in volume en 30% water in volume
Anesthesia machine: AMD-3 PlusSomniAMD-17106
Aquasonic 100 ultrasound transmission gelParker Laboratories 01 08
BODIPY 665/67Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)B3932Zie Tabel 2
CAD software (Autodesk Inventor of gelijkwaardig) Autodesk (representatief CAD-software)n/aSoftware
Cautery SystemGeminiGEM 5917
Clidox ontsmettingsmiddelPharmacal Research Laboratories Inc.VWR, MSPP-96118F
Confocal microscoop (Leica SP8 of gelijkwaardig)LeicaSP8
Applicateurs met katoenen puntPuritan Medical Products25-806 1WC
Op maat gemaakte aluminium stagestuk (3 mm dik, 35 mm verdieping)N/AN/A
FORANE (isofluraan, USP) vloeistof voor inhalatie, 250 mLBaxter10019-360-60
Haarclip (optioneel)Onyx Fine InstrumentsASWRHC
Verwarmingskussen met rectale sondeALA Scientific InstrumentsHEATINGPAD-1/2
Heparine natrium, 1000 USP U/mLHikma0641-0391-12
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)62249Zie Tabel 2
Muis verwarmingskussenALA Scientific InstrumentsHEATINGPAD-1/2
Mus musculusThe Jackson LaboratoryC57BL/6Laboratoriummuis
Normale zoutoplossing (0,9% natriumchloride)Thermo Fisher Scientific7210-16
RHIT (herbruikbare leverbeeldvormingstool) toepasbare grootteAangeleverdN/AZie Tabel 1
Chirurgische pincetten, gebogen puntFine Science Tools11251-23
Chirurgische gaasMckesson6939
Chirurgische schaarFine Science Tools14001-14
Tetramethylrhodamine DextranThermo Fisher Scientific (Invitrogen)D7139Zie Tabel 2
Ultra Fine U-100 Insulinespuiten, 31 GBetty MillsBD326730

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).
  2. Hor, J. L., Germain, R. N. Intravital and high-content multiplex imaging of the immune system. Trends Cell Biol. 32 (5), 406-420 (2022).
  3. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  4. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Syst. 4 (3), 277-290.e9 (2017).
  5. Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
  6. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  7. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  8. Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (2), 232-240 (2000).
  9. Gola, A., et al. Commensal-driven immune zonation of the liver promotes host defence. Nature. 589 (7840), 131-136 (2021).
  10. Kamoun, W. S., Schmugge, S. J., Kraftchick, J. P., Clemens, M. G., Shin, M. C. Liver microcirculation analysis by red blood cell motion modeling in intravital microscopy images. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (1), 162-170 (2008).
  11. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2020).
  12. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  13. Soulet, D., Lamontagne-Proulx, J., Aube, B., Davalos, D. Multiphoton intravital microscopy in small animals: motion artefact challenges and technical solutions. J Microsc. 278 (1), 3-17 (2020).
  14. Mempel, T. R., Bauer, C. A. Intravital imaging of CD8+ T cell function in cancer. Clin Exp Metastasis. 26 (4), 311-327 (2009).
  15. Lee, S., Courties, G., Nahrendorf, M., Weissleder, R., Vinegoni, C. Motion characterization scheme to minimize motion artifacts in intravital microscopy. J Biomed Opt. 22 (3), 036005(2017).
  16. Rhodes, G. J. Surgical preparation of rats and mice for intravital microscopic imaging of abdominal organs. Methods. 128 (1), 129-138 (2017).
  17. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  18. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2019).
  19. Dawson, C. A., et al. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nat Protoc. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  20. Murphy, K. J., Reed, D. A., Trpceski, M., Herrmann, D., Timpson, P. Quantifying and visualising the nuances of cellular dynamics in vivo using intravital imaging. Curr Opin Cell Biol. 72 (1), 41-53 (2021).
  21. Pereira, E. N. G. dS., et al. Hepatic microvascular dysfunction and increased advanced glycation end products are components of non-alcoholic fatty liver disease. PLoS One. 12 (6), e0179654(2017).
  22. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  23. Lu, Z., et al. Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy. Nat Biotechnol. 43 (4), 569-580 (2025).
  24. Lu, Z., et al. A practical guide to scanning light-field microscopy with digital adaptive optics. Nat Protoc. 17 (8), 1953-1979 (2022).
  25. Zhang, Y., et al. Computational optical sectioning with an incoherent multiscale scattering model for light-field microscopy. Nat Commun. 12 (1), 6391(2021).
  26. Zhao, Z., et al. Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue. Cell. 186 (11), 2475-2491.e22 (2023).
  27. Lu, Z., et al. Virtual-scanning light-field microscopy for robust snapshot high-resolution volumetric imaging. Nat Methods. 20 (5), 735-746 (2023).
  28. Chen, S., et al. Hepatocyte-specific Mas activation enhances lipophagy and fatty acid oxidation to protect against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. J Hepatol. 78 (3), 543-557 (2023).
  29. Chen, S., et al. Myeloid-Mas signaling modulates pathogenic crosstalk among MYC+CD63+ endothelial cells, MMP12+ macrophages, and monocytes in acetaminophen-induced liver injury. Adv Sci. 11 (1), 2306066(2024).
  30. Wu, J., et al. Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale. Cell. 184 (12), 3318-3332 (2021).
  31. Benechet, A. P., Ganzer, L., Iannacone, M. Intravital microscopy analysis of hepatic T cell dynamics. Methods Mol Biol. 1514 (1), 49-61 (2017).
  32. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following Leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics. J Vis Exp. 98 (1), e52303(2015).
  33. Heymann, F., et al. Long-term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (98), e52607(2015).
  34. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128 (1), 12-19 (2017).
  35. Wang, J., Kubes, P. A reservoir of mature cavity macrophages that can rapidly invade visceral organs to affect tissue repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  36. Wang, Y., Wang, J. Intravital imaging of inflammatory response in liver disease. Front Cell Dev Biol. 10 (1), 922041(2022).
  37. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  38. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  39. Liu, T. W., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, D. Multi-modal multi-spectral intravital microscopic imaging of signaling dynamics in real time during tumor-immune interactions. Cells. 10 (3), 499(2021).
  40. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  41. Kuss, M., Crawford, A. J., Alimi, O. A., Hollingsworth, M. A., Duan, B. Three-dimensional printed abdominal imaging windows for in vivo imaging of deep-lying tissues. Machines. 10 (8), 697(2022).
  42. Xie, W., et al. 3D-printed lightweight dorsal skin fold chambers from PEEK reduce chamber-related animal distress. Sci Rep. 12 (1), 11599(2022).
  43. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  44. Urciuolo, A., et al. Intravital three-dimensional bioprinting. Nat Biomed Eng. 4 (8), 901-915 (2020).
  45. Dul, S., Gutierrez, B. J. A., Pegoretti, A., Alvarez-Quintana, J., Fambri, L. 3D printing of ABS nanocomposites: comparison of processing and effects of multi-wall and single-wall carbon nanotubes on thermal, mechanical and electrical properties. J Mater Sci Technol. 121 (1), 52-66 (2022).
  46. Stansbury, J. W., Idacavage, M. J. 3D printing with polymers: challenges among expanding options and opportunities. Dent Mater. 32 (1), 54-64 (2016).
  47. Ligon, S. C., Liska, R., Stampfl, J., Gurr, M., Mulhaupt, R. Polymers for 3D printing and customized additive manufacturing. Chem Rev. 117 (15), 10212-10290 (2017).
  48. Das, A., et al. Current understanding and challenges in high-temperature additive manufacturing of engineering thermoplastic polymers. Addit Manuf. 34 (1), 101218(2020).
  49. Turaka, S., Jagannati, V., Pappula, B., Makgato, S. Impact of infill density on morphology and mechanical properties of 3D-printed ABS/CF-ABS composites using design of experiments. Heliyon. 10 (9), e29920(2024).
  50. Ahmad, M. N., Yahya, A. Effects of 3D printing parameters on mechanical properties of ABS samples. Designs. 7 (6), 136(2023).
  51. Nguyen, T. T., Tran, V. T., Nguyen, V., Nguyen, V. T. T. Effect of infill ratios in SLA 3D printing on mechanical properties of castable wax patterns for molded shells in investment casting. PLoS One. 20 (2), e0311245(2025).
  52. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  53. Wang, Z., Bovik, A. C., Sheikh, H. R., Simoncelli, E. P. Image quality assessment: from error visibility to structural similarity. IEEE Trans Image Process. 13 (4), 600-612 (2004).
  54. Madhav, B. T. P., Rao, M. V. G., Pisipati, V. G. K. M. Identification of liquid crystalline phases in 7O.O9 compound based on structural similarity index measure. Liq Cryst. 42 (2), 198-203 (2015).
  55. Zhou, W., Bovik, A. C. A universal image quality index. IEEE Signal Process Lett. 9 (1), 81-84 (2002).
  56. Winkler, S. Human Vision and Electronic Imaging IV. , 175-184 (1999).
  57. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Front Cell Dev Biol. 8 (1), 620471(2020).
  58. Matsumoto, S., Kikuta, J., Ishii, M. Intravital Imaging of Dynamic Bone and Immune Systems: Methods and Protocols. Ishii, M. , 137-143 (2018).
  59. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  60. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (5), 551-558 (2013).
  61. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  62. de Paz, J. L., et al. Profiling heparin-chemokine interactions using synthetic tools. ACS Chem Biol. 2 (11), 735-744 (2007).
  63. Taqueti, V. R., Jaffer, F. A. High-resolution molecular imaging via intravital microscopy: illuminating vascular biology in vivo. Integr Biol (Camb). 5 (3), 278-290 (2013).
  64. Freund, J. B., Goetz, J. G., Hill, K. L., Vermot, J. Fluid flows and forces in development: functions, features and biophysical principles. Development. 139 (7), 1229-1245 (2012).
  65. Tabira, K., et al. An in vitro study of digital impressions and three-dimensional printed models of orbital defects using mobile devices and monoscopic photogrammetry. J Oral Sci. 65 (2), 127-130 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D geprint instrumentleverbeeldvormingherbruikbaar beeldvormingsapparaatweefselstabilisatieconfocale microscopielipidendruppelbeeldvormingmuischirurgiebeeldreproduceerbaarheidstructurele overeenkomstindex

Gerelateerde artikelen