Op fluorofoor gebaseerde genetisch gecodeerde biosensoren voor ratiometrische fluorescentiebeeldvorming in microben

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de toepassing van op fluorofoor gebaseerde genetisch gecodeerde biosensoren in microben voor kwantitatieve ratiometrische fluorescentiebeeldvorming onder gecontroleerde omstandigheden. Door deze biosensing-strategieën te integreren met geavanceerde beeldvormingstechnieken, maakt de methode real-time analyse met hoge resolutie op eencellig niveau mogelijk, waardoor een dieper inzicht wordt verkregen in de dynamiek van kleine moleculen.

Samenvatting

Het onderzoeken van de dynamiek van kleine moleculen in microben is essentieel voor uitgebreide studies van de microbiële functie. Zowel de dynamiek van kleine moleculen binnen als tussen organismen speelt een cruciale rol in microbiële fysiologie, symbiose en ziekte. Het monitoren van deze dynamiek blijft echter een grote uitdaging met behulp van de meeste bestaande technieken. Op fluorofoor gebaseerde genetisch gecodeerde biosensoren zijn krachtige hulpmiddelen voor het volgen van de dynamiek van kleine moleculen in vivo en hebben een groot potentieel voor het stimuleren van nieuwe ontdekkingen. Deze biosensoren worden het meest gebruikt bij fluorescentiebeeldvorming, vaak in combinatie met perfusieapparaten die een nauwkeurige controle van de omgevingsomstandigheden mogelijk maken. Wanneer geïntegreerd met geavanceerde beeldvormingstechnieken, biedt deze benadering ruimtelijk en temporeel opgeloste gegevens met een hoge resolutie, waardoor inzicht in microbiële reacties van één cel mogelijk wordt. Ondanks hun belofte blijft het implementeren van dergelijke biosensoren technisch uitdagend. Inzicht in de belangrijkste stappen is cruciaal voor een bredere acceptatie. Hier presenteren we een protocol dat is ontworpen om de effectieve inzet van nieuw ontwikkelde biosensoren in microben te ondersteunen voor kwantitatieve ratiometrische fluorescentiebeeldvorming onder gecontroleerde omstandigheden.

Inleiding

Biosensoren op basis van enkelvoudige fluorofoorintensiteit en dubbele fluorofoor worden veel gebruikt door onderzoekers voor een verscheidenheid aan toepassingen¹. Sommige studies hebben multiplex-biosensoranalyses gebruikt om tegelijkertijd meerdere signalen binnen dezelfde cellen te volgen². Veel van deze biosensoren vertrouwen op ligandbindende domeinen, waar bindingsgebeurtenissen conformationele veranderingen veroorzaken die de fluorescentie-eigenschappen veranderen ^3,4. Genetisch gecodeerde biosensoren zijn essentiële hulpmiddelen geworden voor in vivo beeldvorming in een reeks systemen⁵, waardoor ionen- en metabolietniveaus in ruimte en tijd met hoge resolutie kunnen worden gemonitord¹. Vroege biosensoren waren echter beperkt in dynamisch bereik en signaal-ruisverhouding (SNR)⁶. Recente ontwikkelingen in intensiometrische biosensoren met enkelvoudige fluorofoor op basis van conformationeel gevoelige fluorescerende eiwitten (csFP's) hebben de prestaties aanzienlijk verbeterd. Desalniettemin kunnen variaties in eiwitexpressieniveaus van invloed zijn op in vivo metingen met behulp van genetisch gecodeerde biosensoren op basis van fluorofoor⁶, die vaak worden gebruikt om signaalmoleculen en metabolieten in levende cellen te visualiseren ^7,8. Enkelvoudige fluorofoor intensiometrische biosensoren staan geen normalisatie toe voor de expressieniveaus van biosensoren, die in vivo kunnen fluctueren. Het opnemen van een referentie-fluorescerend eiwit kan echter biosensoren met één fluorofoor omzetten in versies met een dubbele fluorofoorverhouding, waardoor betrouwbaardere kwantificeringen mogelijk zijn⁹. Als gevolg van energieverlies door niet-stralingsprocessen wordt het fluorescerende emissiespectrum verschoven ten opzichte van het absorptiespectrum, een fenomeen dat bekend staat als de Stokes-verschuiving¹⁰. Large Stokes Shift Fluorescent Protein (LSSFP's) zijn gebruikt als optimale referentiefluoroforen in biosensoren^met dubbele fluorofoorverhouding ^9,11. Een recente vooruitgang is de ontwikkeling van monochromatisch prikkelbare Green-Apple (GA) Matroesjka-biosensoren, bekend als GA-MatryoshCaMP6s, die een rode LSSFP bevat, LSSmApple¹² genaamd. In combinatie met microapparaten zoals microfluïdische systemen, bieden op fluorofoor gebaseerde genetisch gecodeerde biosensoren een minimaal invasieve benadering voor kwantitatieve ratiometrische beeldvorming met behulp van technieken zoals confocale microscopie. Deze integratie maakt snelle beeldvorming en real-time monitoring van de dynamiek van kleine moleculen in afzonderlijke cellen onder omgevingsstress mogelijk. Zo zijn cAMP- en glucosebiosensoren met succes toegepast in gist. Wanneer ze worden gebruikt in combinatie met gemuteerde stammen, hebben deze biosensoren geholpen bij het ophelderen van belangrijke regelgevende netwerken voor de opname van suiker^13,14. Ondanks aanzienlijke vooruitgang hebben deze technologieën nog niet hun volledige potentieel bereikt voor het onderzoeken van kritieke biologische vragen met betrekking tot de dynamiek van kleine moleculen in vivo¹⁵. Als gevolg hiervan blijft de wijdverbreide acceptatie ervan in laboratoria beperkt en ontbreken er nog steeds gestandaardiseerde methodologieën voor een bredere implementatie.

Vergeleken met traditionele methodologieën die gebaseerd zijn op niet-ratiometrische biosensoren met één fluorofoor of metingen op bulkniveau, maakt ons protocol op basis van GA Matryoshka-biosensoren beeldvorming met één cel met hoge resolutie mogelijk met kwantitatieve ratiometrische analyse. Door de grote Stokes-verschuivingsfluorofoor als interne referentie te integreren, compenseert de methode de variabiliteit in biosensorexpressie, een belangrijke beperking van eerdere ontwerpen. Bovendien maakt de combinatie met microfluïdische apparaten een nauwkeurige regeling van de omgevingsomstandigheden mogelijk, wat een verbetering biedt ten opzichte van conventionele perfusiekamers of statische cultuursystemen¹². Deze benadering biedt ook duidelijke voordelen voor het bestuderen van dynamische interacties tussen microben en hun gastheren, zoals plant-pathogeen interacties en symbiotische associaties zoals mycorrhiza's, waarbij ruimtelijke en temporele resolutie op cellulair niveau essentieel is voor het blootleggen van de moleculaire mechanismen van communicatie en uitwisseling van voedingsstoffen.

In deze context presenteren we een gedetailleerd stap-voor-stap protocol voor ratiometrische biosensorbeeldvorming in microben. Hoewel dit protocol specifiek is geoptimaliseerd voor de implementatie in gist, kan het worden aangepast voor gebruik in andere microben, waaronder bacteriën, en worden uitgebreid tot niet-modelorganismen zoals plant-geassocieerde microben. Biosensoren kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in combinatie met microfluïdische systemen voor kwantitatieve fluorescentiebeeldvorming van calciumsignalering in gist, waardoor real-time monitoring van calciumreacties onder omgevingsstress mogelijk is¹⁴.

Dit protocol is bedoeld om onderzoekers te begeleiden bij het effectief inzetten van nieuw ontworpen biosensoren, waardoor de verkenning van biologische processen wordt bevorderd door middel van op biosensoren gebaseerde fluorescerende beeldvorming in microbiële systemen. Het bevat praktische aanbevelingen over gistcultuuromstandigheden, optimale excitatie-/emissie-instellingen en compatibiliteit met veelgebruikte giststammen (bijv. K601 en W303-1A MAT-a). Opmerkelijke beperkingen zijn onder meer fotobleken tijdens langdurige beeldvormingssessies en uitdagingen met betrekking tot biosensorexpressie in biologische monsters. Aangezien tal van factoren de uitkomst van in vivo biosensorbeeldvormingsexperimenten kunnen beïnvloeden, is dit stapsgewijze protocol ook bedoeld om onderzoekers te helpen anticiperen op mogelijke uitdagingen en deze te overwinnen, waardoor reproduceerbare implementaties worden vergemakkelijkt.

Protocol

1. Rationeel ontwerp van ratiometrische biosensoren (Figuur 1)

OPMERKING: Het bindende eiwit van belang wordt geselecteerd als het sensorische domein op basis van relevante criteria, waaronder (i) specificiteit, (ii) affiniteit, (iii) structurele informatie en (iv) conformatieherschikking bij ligandbinding. Specificiteit zorgt ervoor dat de biosensor selectief reageert op het doelmolecuul zonder kruisreactiviteit. Affiniteit wordt geacht overeen te komen met het verwachte concentratiebereik van het doelmolecuul in de biologische context. Structurele informatie, afgeleid van experimentele gegevens of computationele modellen zoals die gegenereerd door AlphaFold, geeft inzicht in de driedimensionale organisatie van het sensorische domein en de ligand-geïnduceerde conformatieveranderingen. Deze inzichten worden gebruikt om geschikte invoegpunten voor de fluoroforen te identificeren. Vervolgens wordt een validatiestrategie ontwikkeld om het reactievermogen en het dynamisch bereik van de biosensor te beoordelen, afhankelijk van de beoogde toepassingen.

1. Construeer het Matroesjka-ontwerp in silico door de Green-Apple Matroesjka^12-cassette op zo'n manier in het sensorische domein te plaatsen dat het circulair gepermuteerde Groene Fluorescerende Eiwit (cpGFP), dat gevoelig is voor conformatieveranderingen, reageert op door ligandbinding geïnduceerde herschikkingen van het sensorische domein.
   1. Gebruik moleculaire visualisatiesoftware, zoals Chimera, om de structuur van het bindingsdomein te analyseren. Als de driedimensionale structuur niet beschikbaar is, gebruikt u AlphaFold om een betrouwbaar model te genereren.
   2. Identificeer flexibele lussen in de eiwitstructuur als zwakke punten en mogelijke invoegplaatsen voor de dubbele fluorofoorcassette, gekozen om te voorkomen dat de algehele functie of stabiliteit van het eiwit wordt verstoord.
   3. Gebruik AlphaFold opnieuw om de structuur te voorspellen van het chimere eiwit dat de ingebrachte dual-FP-cassette bevat, en bevestig dat de insertie geen ongunstige structurele veranderingen introduceert.
   4. Kloon: de biosensor bouwt op tot plasmide-DNA dat expressie in gistcellen mogelijk maakt. In het bijzonder wordt het gen dat codeert voor de nieuw ontworpen biosensor ingebracht in de gistshuttlevector pAG416, die de juiste elementen bevat voor gistexpressie, met behulp van een geschikte kloontechniek 12,13,14.
   5. Transformeer na het klonen het recombinante plasmide in bacteriële cellen voor amplificatie van het plasmide-DNA. Gebruik gezuiverd plasmide-DNA voor gisttransformatie.
   6. Introduceer het gezuiverde plasmide in gistcellen door middel van polyethyleenglycol (PEG)-gemedieerde transformatie zoals gepubliceerd¹⁶. Plaat getransformeerde gistcellen op uracil-deficiënte media, die selecteren op positieve klonen die het plasmide bevatten dat de URA3-selectiemarker draagt.

2. Voorbereiding van het monster

1. Streep gisttransformatoren die GA-Matroesjka-biosensoren tot expressie brengen uit op selectieve mediumplaten (d.w.z. SC-Ura) en incubeer gedurende 2-3 dagen bij 30 °C om koloniegroei mogelijk te maken.
   OPMERKING: De giststam draagt een ura3-auxotrofie, die wordt aangevuld met het URA3-gen op het plasmide, waardoor selectie op uracil-deficiënte media mogelijk is. Het plasmide dat codeert voor de biosensor bevat een cassette die de auxotrofie aanvult (bijv. pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6's).
2. Genereer gisttransformatoren van de stam K601/W303-1A MAT-a (genotype: ade2-1, ura3-1, his3-11, trp1-1, leu2-3, leu2-112, can1-100). Voer transformatie uit met een expressievector die vaak wordt gebruikt voor Saccharomyces cerevisiae, zoals pAG416¹².
3. Na transformatie worden gistcellen gekweekt bij 30 °C op SC-Ura-medium, als volgt per liter bereid, totdat onafhankelijk getransformeerde kolonies verschijnen: 0,77 g CSM-Ura, 6,7 g Giststikstofbasis (YNB) met ammoniumsulfaat, 20 g glucose, 20 g agar en adenine toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 150 μM.
4. Bereid competente gistcellen voor en voer PEG 3350-gemedieerde transformatie uit volgens een vastgesteld protocol¹⁶.
5. Voor experimenten met het vangen van microfluïdische cellen, strooi 25% glycerolvoorraden op SC-Ura-platen en incubeer gedurende 2 dagen bij 30 °C om de groei van onafhankelijke afzonderlijke kolonies mogelijk te maken. Resuspendeer individuele kolonies in 5 ml vloeibaar SC-Ura-medium en incubeer bij 30 °C met schudden totdat de OD600 0,5-1,0 bereikt, waardoor ze geschikt zijn om in het perfusiesysteem te worden geladen.

3. Voorbereiding van het perfusiesysteem (figuur 2)

1. Bereid de microfluïdische plaat voor op haploïde gistcellen door deze te laden met 50 μL gistcellen die GA-Matroesjka-biosensoren tot expressie brengen, samen met de uiteindelijke SC-Ura-media voor groei en gebufferde oplossing voor behandelingen (bijv. NaCl of sorbitol).
   1. Verwijder de bewaarvloeistof uit de putjes 1-8. Zuig de fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) uit de putten op en voeg 400 μL steriel water toe.
   2. Was de putten 1-6 en 8. Was 1: Zuig de steriele wateroplossing op uit de putten 1-8 en voeg 400 μL steriel water toe. Wassen 2: Herhaal de wasbeurt door 400 μL steriel water op te zuigen en toe te voegen. Was 3: Herhaal nog een keer met 400 μL steriel water.
   3. Eindvulling voor putten 1-6: Zuig de wateroplossing op en voeg 300 μL uiteindelijke perfusie-/groeioplossingen toe, zoals SC-Ura voor gistgroei, of een gebufferde oplossing met de analyten die van belang zijn voor behandeling.
   4. Celbelasting in put 8: Voeg 50 μL gistcelsuspensie toe (OD600=0,5-1,0).
2. Sluit de platen af met het temperatuurgeregelde verdeelstuk van het microfluïdische platform en sluit het aan op het live-cell beeldvormingssysteem. De spruitstukken behouden een stabiele thermische omgeving bij een temperatuur van 28 °C, terwijl slangen en een pomp zorgen voor een goede afdichting en continue perfusie.
   1. Lijn de plaat uit op het spruitstuk. Zet de stofzuiger aan. Schakel het microfluïdische platform in.
   2. Druk op Seal en wacht tot het groene lampje brandt. Open de software van het microfluïdische platform, maak een nieuw experiment en selecteer de Geschikte gistplaat in de vervolgkeuzelijst.
   3. Klik op de knop Run Liquid Priming Sequence . Klik op de Run Cell Loading Sequence om gistcellen van put 8 in de kweekkamer te laden, waar ze worden opgevangen en 's nachts worden gekweekt onder continue perfusie van het selectieve medium SC-Ura bij 10 kPa bij 28 °C.
   4. Klik op het tabblad Handmatige modus op Een aangepaste reeks uitvoeren of gebruik de protocoleditor om experimentele parameters in te stellen, zoals temperatuur bij 30 °C, debiet bij 10 kPa, stapduur (bijv. 10 min) en kanalen die moeten worden geopend voor perfusie.
3. Kweek de cellen 's nachts in de kweekkamer onder continue perfusie met selectief medium SC-Ura bij 28 °C en een druk van 10-17 kPa.

4. Ratiometrische fluorescentiebeeldvorming (Figuur 3, Figuur 4 en Video 1)

1. Beoordeel celgroei en fluorescentie door middel van een snelle microscopische visualisatie.
   1. Plaats de microfluïdische plaat op het podium van een omgekeerde microscoop. Stel scherp op het midden van het weergavegebied om de cellen te lokaliseren.
   2. Gebruik helderveld- en/of fluorescentiemicroscopie om de celmorfologie, levensvatbaarheid en biosensorexpressie te beoordelen.
2. Onderzoek de dynamiek van calciumsteady-state onder nauwkeurig gecontroleerde omstandigheden met behulp van het microfluïdische systeem en compatibele microfluïdische platen 4,12,13,14.
3. Voer live-cell beeldvorming uit met behulp van een omgekeerde confocale laserscanmicroscoop met een vergroting van 100x en een numerieke apertuur (NA) van 1,40. Bewaak de biosensoren met dubbele fluorofoor door GFP en LSSmApple op 488 nm op te wekken met behulp van een argonlaser. Verzamel emissiesignalen bij 520 nm voor GFP en 610 nm voor LSSmApple (Figuur 5) en voer ratiometrische fluorescentiebeeldvormingsexperimenten uit om de dynamische responsen van de biosensor te kwantificeren. Meet de verhouding van emissie-intensiteiten (GFP/LSSmApple) in de loop van de tijd om door analyten geïnduceerde veranderingen te volgen.

5. Beeldanalyse met behulp van open-source software (Figuur 6)

1. Haal de CellProfiler of een andere soortgelijke software uit de officiële repository en installeer deze op een lokaal werkstation.
2. Organiseer de time-lapse fluorescentiemicroscopiebeelden in sequentiële volgorde (bijv. img_001.tif, img_002.tif, enz.) om compatibiliteit met geautomatiseerde batchverwerking te garanderen.
3. Start de software en initialiseer een nieuwe analysepijplijn door Nieuw project te selecteren. Importeer de time-lapse-afbeeldingsreeks in de pijplijnwerkruimte.
4. Neem de module IdentifyPrimaryObjects op om afzonderlijke cellen binnen elk frame te detecteren op basis van fluorescentiesignaal of morfologische criteria.
5. Voeg de TrackObjects-module toe om tijdelijke overeenkomsten tussen cellen in verschillende frames tot stand te brengen, waardoor het mogelijk is om één cel in de loop van de tijd te volgen.
6. Voeg de module MeasureObjectIntensity toe om de parameters voor fluorescentie-intensiteit (bijv. gemiddelde, mediaan en geïntegreerde intensiteit) voor elke gevolgde cel te kwantificeren.
7. Gebruik de ExportToSpreadsheet-module om kwantitatieve gegevens samen te stellen en te exporteren naar een tabelformaat (bijv. CSV) voor downstreamanalyse.
8. Analyseer de geëxporteerde gegevens met behulp van statistische of gegevensvisualisatietools zoals spreadsheetsoftware.

Resultaten

Om tot een succesvolle ratiometrische beeldvorming van biosensoren in microbiële systemen te komen, moeten verschillende technische uitdagingen worden aangepakt.

Expressiesysteem: De eerste uitdaging ligt in de selectie van het expressiesysteem; of het nu gaat om plasmide, chromosomaal geïntegreerd, aangestuurd door constitutieve of induceerbare promotors, en met of zonder subcellulaire targetinglabels. Deze factoren kunnen de stabiliteit, toxiciteit en lokali...

Discussie

Genetisch gecodeerde biosensoren op basis van fluorofoor maken het mogelijk om intracellulaire analytconcentraties in levende cellen in real-time te monitoren¹. Deze biosensoren werken meestal door conformationele veranderingen om te zetten in optische signalen, die zowel ratiometrisch als intensiometrisch kunnen worden gedetecteerd. Intensiometrische biosensoren vertrouwen op veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van een enkele FP, waardoor ze gevoelig zi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar	Sigma-Aldrich Co.	A5306-250G
CellASIC ONIX plate voor haploïde gistcellen	Merck KGaA	Y04C-02-5PK
CellASIC ONIX2	Merck KGaA	CAX2-S0000
CSM-Ura	Thermo Fisher Scientific	11387899
D-glucose	Sigma-Aldrich Co.	G8270-100G
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich Co.	S1876-10MG
NaCl	Sigma-Aldrich Co.	S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s	NA	7	Voor expressie van de GA-MatryoshCaMP6s in gist
TCS SP8 STED	Leica	NA
Giststam K601/ W303-1A MAT-a	NA	8	ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNB	BocaScientific	GCM16.0500
α-Paringsfactor acetaat zout	Sigma-Aldrich Co.	T6901-.5MG