Methodenartikel

De druppeloverdrachtsmethode gebruiken om op betrouwbare wijze gigantische unilamellaire blaasjes te bereiden

DOI:

10.3791/68340

⸱

19 september 2025

 ,  ,  , 
1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze beginnershandleiding presenteert een algemeen protocol voor de bereiding van Giant Unilamellaire blaasjes (GUV's) via de druppeloverdrachtsmethode, bespreekt de kritieke stappen en biedt inzichten om mogelijke aanpassingen te helpen die nodig zijn voor verschillende toepassingen, waaronder synthetische biologie en microrobotica.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen twee decennia is de druppeloverdrachtsmethode, ook bekend als omgekeerde emulsie, dubbele emulsie, faseoverdracht of emulsieoverdracht, voordelig gebleken voor de bereiding van Giant Unilamellaire blaasjes (GUV's) en in het bijzonder voor het laden ervan met verschillende ladingen, en speelt zo een cruciale rol in de synthetische biologie. Vanwege de efficiëntie van de inkapseling en de eenvoud van uitvoering is het breed gebruikt voor de ontwikkeling van kunstmatige cellen. In de literatuur wordt een grote variabiliteit in verschillende parameters waargenomen, wat leidt tot uiterst variabele uitkomsten. Dit is deels te wijten aan de aanpassingen die nodig zijn voor verschillende behoeften en toepassingen van deze veelzijdige methode, maar het kan desoriënterend zijn voor onderzoekers die deze techniek voor het eerst benaderen.

Om beginners een basiskennis te geven van de methode en de rol van kritische parameters, wordt een protocol gepresenteerd met tips over de fundamentele fysisch-chemische principes die ten grondslag liggen aan de vorming van GUV's door druppeloverdracht. Deze stap-voor-stap handleiding voor de voorbereiding van GUV's bevat daarom overwegingen en praktische suggesties op basis van literatuur en directe ervaring.

Gezien mogelijke bronnen van variabiliteit, worden enkele aspecten als cruciaal geïdentificeerd: de gevoeligheid van fosfolipiden voor licht, oxidatie en hydrolyse; de keuze van de olie om fosfolipiden op te lossen (de lipidenoplossing of LS); en het terugwinnen van GUV's na centrifugatie. Er worden kosteneffectieve maatregelen voorgesteld om de interferentie van zuurstof en vochtigheid in de atmosfeer te minimaliseren. Om geschikte combinaties van olie en fosfolipiden te helpen identificeren, wordt het algemene protocol aangevuld met een bespreking van de relevante fysisch-chemische eigenschappen van de LS. Ten slotte, om onpraktische procedures te voorkomen, wordt een eenvoudige en veilige methode voorgesteld om de oliefase onmiddellijk volledig te verwijderen en een schone GUV-dispersie te herstellen. Deze maatregelen versnellen de implementatie van aanpassingen aan nieuwe GUV-samenstellingen, waardoor hun acceptatie in de synthetische biologie en aangrenzende gebieden, waaronder microrobotica, mogelijk wordt verbreed.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door een eerder beschreven techniek toe te passen om liposomen1 te produceren, hebben Pautot et al. een protocol opgesteld voor de productie van lipideblaasjes met diameters variërend van 0,1 tot 1 μm in diameter2. De druppeloverdrachtsmethode is snel effectief gebleken bij de productie van nog grotere blaasjes (diameters van meer dan 1 μm)3, en wint steeds meer aan populariteit vanwege de eenvoud van uitvoering en de hoge inkapselingsefficiëntie. In vergelijking met zwelmethoden (zoals zwelling van de gel of elektroformatie) vermindert dit protocol inderdaad het volume van de ladingoplossing dat nodig is om een vergelijkbaar aantal blaasjes en het bijbehorende afval te vormen4. GUV's kunnen worden samengesteld uit vloeistofinterfaces via alternatieve methoden met een vergelijkbare inkapselingsefficiëntie. In vergelijking met die op basis van microfluïdische chips 5,6 of continue druppelinterface-kruisende inkapseling (cDICE)7, biedt de druppeloverdracht echter de eenvoudigste opstelling die betaalbaar is in elk laboratorium met basisapparatuur. Bovendien kunnen microfluïdische methoden leiden tot GUV's met ongewenste olie-insluitsels in het membraan. Om deze redenen is de druppeloverdracht de voorkeursmethode geweest voor het laden van GUV's met waardevolle ladingen op het gebied van kunstmatige cellen 3,8,9,10 en, recentelijk, microrobotica 11,12.

De methode is gebaseerd op de vorming van vliezenblaadjes door de stabilisatie van water/olie-interfaces gemedieerd door fosfolipiden. Eerst worden fosfolipiden opgelost in een olie (lipide-oplossing, LS), vervolgens wordt een water-in-olie-emulsie bereid met de waterige oplossing die de gewenste GUV-lading (binnenoplossing, IS) in de olieachtige LS bevat. De emulsie wordt vervolgens overgebracht naar een buis waar een andere waterige oplossing (de zogenaamde buitenoplossing, OS) eerder in evenwicht is gebracht met LS om een water-olie-interface te vormen. GUV's worden gevormd wanneer waterdruppels door centrifugatie worden gedwongen deze OS/LS-interface te passeren: de binnenste folder van GUV's wordt gevormd op het oppervlak van IS-druppels, terwijl de buitenste leaflet wordt gevormd tussen OS en LS (Figuur 1).

Er zijn veel protocolvarianten beschreven met parameters die zijn aangepast aan de voorwaardelijke experimentele behoeften. Een eerste uitgebreide poging om het proces te optimaliseren werd beschreven door Moga et al.13, terwijl Zhang et al. de meeste relevante voorbeelden verzamelden in een recente review14. Ondanks de vele beschreven parameters die van invloed zijn op het protocol, is er geen indicatie van hoe een optimalisatieproces zou kunnen worden uitgevoerd voor een nieuwe GUV-formulering, noch de best practices voor het terugwinnen en manipuleren van GUV na productie. Op basis van de beschikbare wetenschappelijke literatuur en onze directe ervaring bieden we hier een algemeen protocol voor het produceren van GUV's en bespreken we de basisprincipes. Door dit te doen, geven we indicaties die nuttig zijn voor de optimalisatie van nieuwe GUV-formuleringen en twee voorzorgsmaatregelen die altijd van toepassing zijn op het protocol: de bereiding van LS in een gecontroleerde omgeving en een methode om de bovenste oliefase gemakkelijk te verwijderen voor het terugwinnen van een schoon GUV-monster. We hebben twee voorbeelden gekozen: een met 240 mM sucrose als IS en 0,2 mM DOPC in siliconenolie AR20 als LS (voorwaarde E [leeg], zie Tabel 1) en de andere samengesteld uit 0,2% 1,1 μm polystyreen microdeeltjes in 240 mM sucrose als IS en 3,18 mM DOPC in minerale olie als LS (voorwaarde P [met deeltjes], zie tabel 1). Beide monsters werden geproduceerd met 240 mM glucose als OS. We hebben voor deze osmolariteit gekozen om GUV's te verkrijgen die in fysiologische omstandigheden een ontspannen lipidemembraan hebben (lage membraanspanning).

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematische weergave van de druppeloverdrachtsmethode. (A) Drie oplossingen worden in afzonderlijke injectieflacons bereid: fosfolipiden in olie (gele fase) om een lipideoplossing te vormen, een sucrosehoudende oplossing (in cyaan) als binnenoplossing en een equiosmolaire glucoseoplossing (wit) als buitenoplossing. (B) LS wordt vervolgens gemengd met de IS om een stabiele emulsie te vormen, vervolgens (C) wordt een interface tussen OS en LS in evenwicht gebracht voordat (D) de emulsie erop wordt gegoten. (E) Waterdruppels worden door middelpuntvliedende kracht gedwongen de LS/OS-interface te passeren om (F) de vorming van GUV's mogelijk te maken. Het cijfer is niet op schaal en is alleen bedoeld om een schema van de methode te geven. Afkortingen: LS = lipideoplossing; IS = innerlijke oplossing; OS = uitwendige oplossing; GUV = gigantisch unilamellair blaasje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Tenzij anders vermeld, worden de processen uitgevoerd bij kamertemperatuur.

1. Bereiding van oplossingen

  1. Bereiding van waterige oplossingen (IS en OS)
    1. Weeg in twee verschillende weegboten 2,16 g glucose en de in tabel 1 aangegeven hoeveelheid sacharose af. Voeg de poeders toe aan twee bekerglazen van 150 ml, voeg 40 ml ultrapuur water toe en meng al roerend.
    2. Breng de oplossingen over in twee cilinders van 50 ml en voeg ultrapuur water tot 50 ml toe om 240 mM glucoseoplossingen en sacharoseoplossingen te verkrijgen met concentraties aangegeven in tabel 1. Dek de cilinders af met een stuk parafilm en meng de oplossingen door de cilinders een paar keer om te keren.
    3. Filtreer de oplossingen met spuiten van 50 ml en filters van 0,22 μm om besmetting door micro-organismen te voorkomen.
    4. Bereid voor toestand P het volgende mengsel: 2 μl 100 mg/ml dispersie van 1,1 μm polystyreendeeltjes, 24 μl sacharoseoplossing bereid in stap 1.1.1 en ultrapuur water tot 100 μl (eindsuspensie: 0,2% microdeeltjes in 240 mM sacharoseoplossing). Bewaar de oplossingen maximaal 1 week bij +4 °C of bereid 1 ml aliquots in tubes van 1,5 ml en bewaar bij -20 °C voor langdurige opslag.
  2. Opzetten van een handschoenkamer om LS in een gecontroleerde omgeving te bereiden
    1. Snijd vijf stukken siliconen buis met een inwendige diameter van 7 mm, een uitwendige diameter van 13 mm en de in tabel 2 aangegeven lengtes (buizen 1 tot en met 5).
    2. Snijd vier stukken siliconen buis met een inwendige diameter van 3 mm, een uitwendige diameter van 7 mm en de in tabel 2 aangegeven lengtes (buizen 6 tot en met 9).
    3. Sluit het ene uiteinde van leiding 1 aan op een tweewegklep en het andere uiteinde op een driewegverbinding (Figuur 2A).
    4. Sluit leiding 2 aan op de andere uiteinden van de tweewegklep en sluit vervolgens leiding 3 en leiding 4 aan op de driewegverbinding, waarbij leiding 3 is aangesloten op het uiteinde tegenover leiding 1 (Figuur 2A).
    5. Sluit het vrije uiteinde van pijp 4 aan op de inlaat van de handschoenkamer (inlaatpijp, Figuur 2B).
    6. Sluit de driewegklep die bij de handschoenenkamer is geleverd aan op de uitlaat en sluit vervolgens de klep aan op leiding 5 (uitlaatpijp, afbeelding 2C).
    7. Sluit het ene uiteinde van pijp 6 aan op een naald van 18 G en het andere uiteinde op een tweerichtingsverbinding. Herhaal dit met pijp 7 en de naald 21 G (Figuur 2D).
    8. Steek de twee naalden in een dop met septum: deze dop met naalden zorgt voor een gecontroleerde instroom van stikstof en uitstroom van stikstof en chloroform. Bewaar de dop in een lege tube van 50 ml zonder dop om contact met de naalden te vermijden (Figuur 2D).
    9. Knijp de pijpen 8 en 9 respectievelijk in de inlaat- en uitlaatopeningen vanaf de binnenkant van de handschoenkamer en plaats deze (Afbeelding 2E).
  3. Bereiding van LS
    1. Verplaats de handschoenkamer naar binnen of naast een chemische kap. Open de handschoenkamer en plaats een kristallizator gevuld met silicadeeltjes op de bodem van de kamer (Figuur 2F). Bedek de kristallisater met het witte steunvlak en bedek deze met keukenpapier.
    2. Breng alle benodigde materialen in de handschoenkamer (Figuur 2G): een hygrometer, de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) in chloroformoplossing, de olie(s) (Tabel 1), reinig 20 ml donkere glazen injectieflacons (geopend en met de respectievelijke doppen), een Hamilton-spuit (Tabel 1), een P10000 micropipet en tips. Plaats de glazen injectieflacon met de chloroformoplossing op een kurken ringhouder, een bekerglas van 150 ml of een andere geschikte houder zo dicht mogelijk bij de zijde van de bediener.
      NOTITIE: Deze voorzorgsmaatregel voorkomt dat flessen kantelen als gevolg van het opblazen en leeglopen van handschoenen tijdens cycli van vacuüm en stikstofstroom.
    3. Sluit de handschoenenkamer, zorg ervoor dat de twee helften niet kunnen verschuiven en sluit ze af met de plastic schroeven die bij de handschoenenkamer zijn geleverd.
    4. Sluit de uitlaatklep en dompel pijp 5 onder in een bekerglas van 500 ml dat voor de helft met water is gevuld (figuur 2H).
    5. Sluit het klepgeregelde uiteinde van de inlaatleiding (leiding 2) aan op de vacuümleiding en het andere uiteinde op stikstof (leiding 3, afbeelding 2A). De handschoenkamer is nu volledig ingesteld zoals weergegeven in figuur 2J.
    6. Open het ventiel en de vacuümleiding totdat de drukverlaging de handschoenen zo opblaast dat ze te stijf zijn om te buigen. Sluit de vacuümleiding en de klep.
    7. Open de stikstof totdat de druk de handschoenen zo laat leeglopen dat ze uit de handschoenenkamer komen. Sluit de stikstofleiding.
    8. Herhaal stap 1.3.6 t/m 1.3.7 minimaal 10x en zorg ervoor dat de inwendige luchtvochtigheid onder de 40% komt.
    9. Regel de inwendige druk met vacuüm en stikstof om het dragen van handschoenen voor de bediener te vergemakkelijken.
    10. Breng met behulp van de Hamilton-spuit het volume DOPC in chloroformoplossing zoals aangegeven in tabel 1 over in een injectieflacon met donker glas. Sluit de injectieflacon met de naalddragende dop die in stap 1.2.9 is voorbereid.
    11. Sluit leiding 6 aan op leiding 8 en leiding 7 op leiding 9 via de tweerichtingsverbindingen (Figuur 2I).
    12. Trek de handschoenen uit en open de uitlaatklep.
      OPMERKING: Een tweede operator kan helpen van stap 1.3.13 tot 1.3.15 om het proces te versnellen.
    13. Open de stikstofstroom zeer langzaam en controleer de gasstroom door te kijken naar bellen in het bekerglas waar eerder leiding 5 was geplaatst (stap 1.3.4). Pas de stikstofstroom geleidelijk aan totdat deze een relatief hoge snelheid bereikt waarbij individuele bellen waarneembaar blijven. Laat de stikstof 3 minuten stromen en sluit dan de stikstofleiding.
      OPMERKING: Overmatige stikstofdruk kan ertoe leiden dat de DOPC-oplossing in chloroform zich door de injectieflacon verspreidt, waardoor de hoeveelheid fosfolipide die beschikbaar is voor de daaropvolgende lipideoplossing (LS) afneemt. Bovendien verhoogt hoge druk het risico dat de naalden uit de injectieflacon worden verdreven. Daarom is het essentieel om de stikstofstroom zorgvuldig aan te passen aan een optimaal niveau dat de chloroform voorzichtig roert zonder ongecontroleerd spatten te veroorzaken.
    14. Maak intussen een waterbad in een kristallizator en verwarm het op 80 °C op een hete plaat.
    15. Wacht tot de laatste luchtbel in de beker zit en sluit dan de uitlaatklep. Draag de handschoenen opnieuw en koppel de leidingen 8 en 9 los van de tweerichtingsverbindingen.
    16. Controleer of alle chloroform uit de donkere injectieflacon is verdampt, open deze en plaats de dop terug in de tube van 50 ml. Open de oliefles, doe de benodigde hoeveelheid olie (tabel 1) in de donkere injectieflacon en sluit deze af met de dop. Trek de handschoenen uit en open de handschoenenkamer.
    17. Sluit de LS af met parafilm. Draai de injectieflacon krachtig gedurende ten minste 30 s. Incubeer gedurende 30 minuten bij 80 °C in het waterbad dat in stap 1.3.14 is voorbereid. Draai de injectieflacon krachtig gedurende ten minste 30 s. Incubeer een nacht bij kamertemperatuur.
    18. Ga verder met de bereiding van GUV's of bewaar ze maximaal 1 week bij +4 °C.
      OPMERKING: In asymmetrische GUV-preparaten kunnen twee verschillende LS worden gebruikt voor de interface en emulsie om twee verschillende membraanblaadjes15 te verkrijgen.

2. GUV-productie

  1. Opzetten van een container voor het eenvoudig verwijderen van olie
    1. Knip met een schaar de dop van een tube van 5 ml. Boor een gat van ~8 mm in het midden van de dop en controleer of het gat breed genoeg is om een P1000-punt te laten passen en vergrendelen (Figuur 3A). Als het gat te smal is, herhaal dan de twee voorgaande stappen; Als de dop te breed is, gooit u de dop weg en start u opnieuw met een nieuwe uit stap 2.1.1.
    2. Knip een stuk schuurpapier van 2 x 5 cm af en schuur het gat. Plaats de dop met gaten terug op de buis van 5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 3.000 × g om al het resterende plastic vuil uit het gat te verwijderen. Verwijder de dop en gooi de tube weg.
    3. Knip de dop van een nieuwe tube van 5 ml en vervang deze door de dop met gaten. Plaats een O-ring op de bovenkant van de dop en steek een P1000 tip door het gat. Vergrendel de O-ring tussen de punt en de dop en controleer of de punt niet verder door de buis kan worden geduwd (Figuur 3B). Vul de tube van 5 ml met 5,5 ml OS via de punt.
  2. Vorming van OS/LS-interface
    1. Bereid een waterbad voor in een kristallisator en verwarm het op 50 °C op een hete plaat.
    2. Draai de LS-injectieflacon die in sectie 1.3 is voorbereid, krachtig gedurende ten minste 30 s. Verwarm de LS 30 minuten op 50 °C in het waterbad.
    3. Breng de in punt 1.1 bereide wateroplossingen gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht.
    4. Pipetteer 300 μL OS in een buis van 1.5 ml of een buis van 5 ml aangepast volgens stap 2.1. Pipetter langzaam 100 μL LS bovenop het besturingssysteem en zorg ervoor dat er twee verschillende en continue fasen in de buis worden gevormd. Laat de interface 10 minuten in evenwicht zijn.
      OPMERKING: Om de vorming van een homogene monolaag van fosfolipiden mogelijk te maken, moet de LS homogeen over het besturingssysteem worden verdeeld (Figuur 4A). Als de LS-laag niet ononderbroken is, verdeel dan het volume LS opnieuw met een micropipet of verhoog het volume LS (dit kan zeer nuttig zijn bij zeer viskeuze oliën zoals paraffine).
  3. Vorming van een water-in-olie-emulsie
    1. Piket in een buisje van 2 ml, in deze volgorde, 250 μl LS en 6,25 μl IS voor een emulsie van 2,5% water in olie.
      OPMERKING: Onze ervaring is dat deze water-in-olieverhouding hoogstwaarschijnlijk zorgt voor een stabiele emulsie, waardoor het slagingspercentage van het protocol toeneemt (Figuur 5). Om de GUV-opbrengst te verhogen, raden we aan om het emulsievolume te verhogen in plaats van de IS/LS-verhouding.
    2. Meng de twee fasen met behulp van een of meer van de volgende methoden totdat het mengsel homogeen en stabiel lijkt: vortex, mechanisch roeren over een standaard microbuisrek of met een vinger op de buis tikken (zie figuur 5 voor voorbeelden van homogene emulsie).
    3. Breng 200 μL van de emulsie over op de OS/LS-interface die in paragraaf 2.2 is voorbereid.
    4. Als u een slang van 1.5 ml gebruikt, sluit u de buis gewoon; als u de gewijzigde buis van 5 ml uit sectie 2.1 gebruikt, plaatst u een rubberen dop op de punt en brengt u de buis voorzichtig over in een conische buis van 50 ml.
  4. Druppeloverdracht via centrifugeren
    1. Centrifugeer de buisjes bij kamertemperatuur volgens de aanwijzingen in tabel 1. Controleer aan het einde van de centrifugatie de aanwezigheid van een ondoorzichtige pellet op de bodem van de buis en een heldere oliefase in het bovenste gedeelte.

3. GUV-herstel

  1. Olie verwijderen
    OPMERKING: Afhankelijk van de experimentele behoeften kan de olie in drie verschillende alternatieve stappen worden verwijderd.
    1. Als GUV's zijn bereid in standaard buisjes van 1,5 ml, verwijder dan langzaam de olie met behulp van een P1000-pipet en een P200 voor de laatste druppels, en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord.
      OPMERKING: Smallere punten helpen bij het verwijderen van de olie, dus het inbrengen van een punt voor kleinere volumes (10-200 μL) in een P1000-punt zal de nauwkeurigheid van deze stap verbeteren.
    2. Als u te maken heeft met meerdere GUV-preparaten in verschillende tubes van 1,5 ml, verwijder dan de olie met behulp van een Büchner-kolf. Sluit een stuk van een dikke siliconen buis (binnendiameter 7 mm, uitwendige 13 mm) aan op de vacuümleiding en plaats een andere pijp op de opening van de kolf en sluit deze af met een rubberen pakking. Plaats aan het andere uiteinde van deze buis een P1000-tip, wikkel deze in parafilm, snijd ongeveer 3 mm van de tip af en steek deze in een P200-tip. Open het vacuüm en zuig de olie op met de P200-tip, sluit vervolgens het vacuüm en verwijder de laatste druppels via een P200-pipet.
    3. Als GUV's zijn bereid in de container beschreven in stap 2.1, verwijdert u de punt van de buis en zorgt u ervoor dat de rubberen dop niet loskomt (Figuur 3D). Gooi vervolgens de punt weg en bewaar de rubberen dop, de O-ring en de dop met gaten voor hergebruik.
    4. Verwijder met behulp van een P1000-micropipet het besturingssysteem uit de buis (Figuur 3E), laat ongeveer 50 μL van het volume over, en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord.
    5. Vervang de tip, suspendeer de pellet opnieuw in het overgebleven volume en doe deze in een schone tube van 2 ml.
  2. GUV wast
    OPMERKING: Het doel van deze stappen is om sporen van de oliefase te verwijderen die niet zijn verwijderd in stap 3.1. Indien nodig moeten de stappen 3.2.1 en 3.2.2 worden herhaald totdat er geen oliedruppel in de buis wordt waargenomen.
    1. Vul de buis met 2 ml OS en centrifugeer op 1.500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Verwijder het besturingssysteem, laat ongeveer 50 μL van het volume over en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord.
    3. Herhaal de laatste twee stappen.
  3. Volume evenwicht
    OPMERKING: We nemen dit gedeelte op om een vergelijking van de opbrengsten tussen verschillende GUV-preparaten mogelijk te maken.
    1. Resuspendeer met een P200-micropipet de pellet in de 50 μl van het resterende volume van de laatste herhaling van stap 3.2.2.
    2. Meet dit volume door de pipet op 20 te zetten en het volume te vergroten met de punt in de GUV-dispersie gedompeld zonder de wand van de buis aan te raken om de vloeistof in de punt te laten stromen.
    3. Voeg OS toe om het uiteindelijke volume van 100 μL te bereiken.

4. Waarneming en dimensionale analyse

  1. Microscopische beeldacquisitie
    1. Meng de GUV-dispersie voorzichtig door met een vinger op de tube te tikken.
    2. Laad een Burker-kamer met 10 μL van het GUV-monster en wacht ten minste 5 minuten zodat GUV's op de bodem van de kamer kunnen bezinken.
    3. Bekijk het monster onder een fasecontrastmicroscoop. Gebruik de Burker-lijnen als referenties, beweeg over het monster en verkrijg ten minste 20 afbeeldingen, waarbij u ervoor zorgt dat observatiegebieden elkaar niet overlappen.
  2. Dimensionale analyse
    1. Laad de afbeeldingen op ImageJ.
    2. Om de pixel/μm-conversiefactor te berekenen, kiest u een afbeelding met een vierkant van 50 x 50 μm van de Burker-kamer (raadpleeg het gegevensblad van de fabrikant voor de juiste identificatie), selecteert u vervolgens het hulpmiddel voor het selecteren van een rechte lijn , trekt u een lijn tussen twee opeenvolgende hoeken van het vierkant en meet u de lijn door te klikken op Analyseren | Meten. Herhaal 3x en bereken de gemiddelde waarde.
    3. Stel de conversiefactor in door te klikken op Analyseren | Schaal instellen. Voer de waarde uit stap 4.2.2 in het vak Afstand in pixels in en vul vervolgens de waarde 50 in bij Bekende afstand en μm in Lengte-eenheid.
    4. Klik op Analyseren | Stel afmetingen in en selecteer het vakje Gebied . Selecteer het ovale selectiegereedschap , klik vervolgens op de linkermuisknop en houd de Shift-toets ingedrukt om de resulterende cirkel rond een GUV te overlappen. Meet de diameter door te klikken op Analyseren | Meten. Herhaal dit voor elke GUV in elke afbeelding.
    5. Klik in het venster Resultaten op Bestand | Opslaan als... om het csv-bestand van het gebied van GUV te exporteren en analyseer vervolgens de grootteverdeling met het script dat beschikbaar is op GitHub16.
      OPMERKING: Het is mogelijk om stap 4.2.3 over te slaan en het script uit te voeren dat de pixel/μm-conversiefactor specificeert. Om deze waarde te berekenen, deelt u de waarde verkregen in stap 4.2.2 door 50.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een optimaal GUV-preparaat wordt gekenmerkt door de vorming van een heldere oliefase en een duidelijke pellet (Figuur 4A). In gevallen waarin waterdruppels niet worden omgezet in GUV's, storten ze meestal in en laten ze fosfolipideresten achter op de OS/LS-interface (Figuur 4C). Dit effect wordt hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt door de aggregatie van fosfolipiden en andere moleculen uit de oliefase, als gevolg van onvoldoende evenwicht van fosfolipiden op het grensvlak tussen water en olie. Desalniettemin, ondanks de afwezigheid van een zichtbare pellet of de aanwezigheid van vuil op het grensvlak, kunnen GUV's zich nog steeds vormen, waardoor het proces kan doorgaan. Hoewel wasstappen niet helemaal effectief zijn bij het verwijderen van alle fosfolipideresten, helpen ze aanzienlijk bij het verwijderen van oliedruppels, waardoor de algehele monsterkwaliteit wordt verbeterd (vergelijk Figuur 6A en Figuur 6B).

Het gebruik van oude LS of LS bereid in omstandigheden met een hoge luchtvochtigheid resulteert vaak in verminderde GUV-dispersies met een lagere opbrengst en een hoger gehalte aan ongeordende aggregaten die hoogstwaarschijnlijk worden gevormd door fosfolipiden en andere moleculen uit de oliefase (Figuur 6C). Voor LS bereid in omstandigheden met een hoge luchtvochtigheid zagen we variatiecoëfficiënten van meer dan 0,8 in de productie van GUV's (met monsters die zeer weinig GUV's bevatten), terwijl voor LS bereid in de aangepaste handschoenkamer de variatiecoëfficiënt lager was dan 0,5.

Verschillende centrifugatieomstandigheden kunnen van invloed zijn op de GUV-opbrengst en -kwaliteit. Uit een kwalitatieve analyse bleek dat 20 minuten bij 3.300 × g een goede conditie was voor met sucrose beladen GUV's (monster E). Het verlagen van de snelheid (45 min bij 500 × g) resulteerde in een verminderde opbrengst, terwijl een toename (5 min bij 16.600 × g) leidde tot een hogere vorming van ongeordende fosfolipidenaggregaten. Een zwakke middelpuntvliedende kracht kan voorkomen dat veel druppels de OS/LS-interface passeren, vandaar de verminderde opbrengst, terwijl een sterke kracht mogelijk niet genoeg tijd biedt voor de organisatie van fosfolipiden op de buitenste folder tijdens de kruising van het grensvlak (Figuur 7). De inkapseling van microdeeltjes kan ook worden geoptimaliseerd met aanpassingen aan de centrifugatieparameters, op voorwaarde dat de massadichtheid van de microdeeltjes ongeveer overeenkomt met die van de IS. Daartoe zorgt het verlagen van de centrifugatieversnelling (en op zijn beurt het verlengen van de centrifugatietijd) voor een meer homogene inkapseling van deeltjes, door te voorkomen dat het fosfolipidenmembraan breekt als gevolg van de kracht die door de vaste deeltjes wordt uitgeoefend (een voorbeeld van goede inkapseling wordt getoond in figuur 6D , terwijl het onderzoek naar optimale centrifugatieparameters nog aan de gang is17).

Omdat de diffusie van fosfolipiden kan worden beïnvloed door de oliefase, kan een eenvoudige kwalitatieve test worden uitgevoerd om de stabiliteit van de emulsie te evalueren (Figuur 5). Met behulp van een in de IS opgeloste kleurstof (Brilliant Blue FCF) om de visualisatie te verbeteren, kunnen emulsies met verschillende water/olieverhoudingen in de loop van de tijd worden bereid en waargenomen. Het verlies aan stabiliteit kan worden gevisualiseerd door de aggregatie van waterdruppels en de daaruit voortvloeiende scheiding van de oliefase. Omdat grote druppels (zichtbaar voor het blote oog) minder snel worden omgezet in GUV's, raden we aan om de emulsievoorwaarde te gebruiken die de minste fasescheiding biedt.

Het effect van variaties in het protocol kan worden geverifieerd door middel van een analyse van de grootteverdeling zoals beschreven in protocolsectie 4: de diameters van GUV's kunnen worden gemeten met behulp van ImageJ van fasecontrastmicroscoopbeelden en de grootteverdeling kan worden geanalyseerd met een script dat beschikbaar is op GitHub16. Volgens dit protocol was het bijvoorbeeld mogelijk om een toename van GUV's met grotere diameters waar te nemen wanneer minerale olie werd gekozen boven siliconenolie AR20 (Figuur 8).

figure-results-1
Figuur 2: Opstelling van de handschoenkamer. Deze afbeelding toont de belangrijkste wijzigingen aan de handschoenkamer voor de bereiding van de lipidenoplossing. (A) Inlaatverbinding met stikstof en vacuüm; (B) inlaatverbinding met de handschoenkamer; (C) uitlaatklep; (D) naalddragende dop voor het verdampen van oplosmiddelen; (E) dunne pijpen voor het verdampen van oplosmiddelen; (F) silicadeeltjes om vocht te absorberen; (G) items die in de handschoenenkamer moeten worden geplaatst: digitale thermo-hygrometer (1), lipideoplossing in organisch oplosmiddel (2), kurkringhouder (3), glazen spuit (4), open dop met septum en naalden (5), olieoplossing (6), open donkere injectieflacon met dop (7), tips van 10 ml (8), P10000 pipet (9); (H) uiteinde van de uitlaatpijp gedrenkt in water; (I) injectieflacon afgesloten met een naalddragende dop die is aangesloten op de inlaat en uitlaat; (J) schema's van de gewijzigde handschoenkamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Afbeelding 3: Reservoir voor eenvoudige olieverwijdering. Belangrijkste stappen bij de bereiding van GUV's in een container voor eenvoudige verwijdering van de olie volgens protocol paragraaf 2.1. (A) Er wordt een gat geboord in een buisdop van 5 ml om een P1000-punt te laten passen; vervolgens (B) wordt de dop op een lege buis van 5 ml geplaatst met de punt via een O-ring in het gat gestoken. (C) De oplossingen worden in de buis geplaatst volgens de protocolparagrafen 2.2 en 2.3, de punt wordt afgedekt en de buis wordt in een buis van 50 ml geplaatst. GUV's bereid uit 0,2 mM DOPC in siliconenolie werden geladen met 230,7 mM sucrose en 3,1 mM Brilliant Blue FCF om de visualisatie te verbeteren. (D) Na het centrifugeren wordt de bovenste oliefase opgesloten in de punt, samen met een deel van de GUV-buffer (die cyaan lijkt omdat een deel van de druppels niet in GUV's kan worden omgezet en de kleurstof in het besturingssysteem vrijkomt). Dankzij de rubberen dop kan de punt samen met de vloeistofinhoud eenvoudig uit de buis van 5 ml worden verwijderd, waardoor de hele oliefase snel en gemakkelijk kan worden verwijderd. (E) De GUV-pellet kan gemakkelijk van de bodem van een buis worden verzameld in een heldere dispersie, zonder duidelijke olieverontreiniging, zoals geverifieerd (F) door fasecontrastmicroscopie. Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: LS = lipideoplossing; IS = innerlijke oplossing; OS = uitwendige oplossing; GUV = gigantisch unilamellair blaasje; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4: GUV-formatie. Voorbeelden van (A) OS/LS-interface, (B) een schone GUV-pellet met een heldere oliefase, en (C) een GUV-pellet met puin op de OS/LS-interface (het puin en de pellet zien er roodachtig uit omdat de IS van deze GUV-populatie werd aangevuld met 1,65 mM nieuwe coccinekleurstof om de visualisatie te verbeteren). Afkortingen: LS = lipideoplossing; IS = innerlijke oplossing; OS = uitwendige oplossing; GUV = gigantisch unilamellair blaasje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 5: Emulsiestabiliteit met verschillende olie- en water-in-olieverhoudingen. De figuur toont de stabiliteit van emulsies in de tijd, afhankelijk van het type olie en de gebruikte water/olie-verhouding (m/d). De IS is samengesteld uit 230,7 mM sucrose en 3,1 mM Brilliant Blue FCF om de visualisatie van de emulsies te verbeteren. Emulsies bereid met minerale olie zijn minder stabiel dan hun tegenhangers gemaakt met siliconenolie AR20. Dit effect wordt verder versterkt met toenemende z/o-verhoudingen. Hoewel emulsies in siliconenolie AR20 aanzienlijk stabieler zijn, neemt hun stabiliteit ook af naarmate de w/o-verhouding toeneemt, waarbij de fasescheiding onmiddellijk na emulgering zichtbaar is (siliconenolie AR20 op 10%). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 6: Waarneming van GUV's met een fasecontrastmicroscoop. Een 20x vergroting van met sucrose beladen GUV's bereid uit een LS bestaande uit 3,18 mM DOPC in minerale olie. (A) Monster dat is teruggewonnen na de verwijdering van de olie; (B) monster dat na de wasstappen wordt teruggewonnen; (C) slechte GUV-opbrengst verkregen uit een LS die is bereid in omgevingen met niet-gereguleerde zuurstof en vochtigheid; (D) GUV's die met microdeeltjes zijn beladen. Schaalbalk = 10 μm; Oliedruppels zijn omcirkeld en voorbeelden van ongeordende aggregaten van fosfolipiden en oliemoleculen zijn aangegeven met een pijl. Afkortingen: LS = lipideoplossing; GUV's = gigantische unilamellaire blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 7: Effect van verschillende centrifugatiecondities op GUV-vorming. Fasecontrastbeelden van met sucrose beladen GUV's bereid met een LS samengesteld uit 0,2 mM DOPC in siliconenolie AR20. De figuur toont een kwalitatieve vergelijking van GUV's bij (A) 16.600 × g gedurende 5 minuten, (B) 3.300 × g gedurende 20 minuten en (C) 500 × g gedurende 45 minuten. Terwijl een hoge centrifugatiesnelheid resulteert in een hogere aanwezigheid van fosfolipidenaggregaten, leidt een lage centrifugatiesnelheid tot een verminderde opbrengst. Schaal balk = 50 μm. Afkortingen: LS = lipideoplossing; GUV = gigantisch unilamellair blaasje; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 8: Analyse van de grootteverdeling. Vergelijking van twee met sucrose beladen GUV-monsters verkregen uit (A) 0,2 mM DOPC in minerale olie en (B) 0,2 mM DOPC in siliconenolie AR20 (*het monster werd 10x verdund om een duidelijk onderscheid van GUV's onder een fasecontrastmicroscoop mogelijk te maken). De analyse die is uitgevoerd volgens protocolsectie 4 toont een grootteverdeling die is verschoven naar hogere diameters voor het mineraaloliemonster ten opzichte van siliconenolie AR20-monsters. De opbrengst van het siliconen monster is echter bijna 20x hoger. Afkortingen: GUV = gigantisch unilamellair blaasje; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

StapVoorwaarde EVoorwaarde PBeschrijving
1.1.14,11 gr17,11 grMassa van sacharose
1.1.12,16 gr2,16 grMassa glucose
1.1.2240 mM1000 mMConcentratie van sacharose
1.1.2240 mM240 mMConcentratie van glucose
1.3.2Siliconen olieMinerale olieOliefase voor LS
1.3.2Glazen spuit van 0,1 mlGlazen spuit van 0,5 mlGlazen spuit om DOPC over te brengen in chloroformoplossingen
1.3.1063 μL500 μLVolume DOPC in chloroformoplossing
1.3.1610 ml5 mlOlie volume
2.4.13300 g 20 minuten500 g 45 minutenCentrifugatie conditie

Tabel 1: Variaties in het protocol. De tabel rapporteert variaties voor verschillende stappen van het protocol (aangegeven in de eerste kolom) om twee verschillende GUV-populaties te bereiden: met sucrose beladen GUV's (voorwaarde E) en met microdeeltjes beladen GUV's (voorwaarde P).

LEGITIMATIEBEWIJSBetrokken stappenBinnendiameter (mm)Buitendiameter (mm)Lengte (mm)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

Tabel 2: Leidingen voor gas- en vacuümaansluitingen in de handschoenkamer. De tabel geeft de afmetingen weer van de siliconen buizen die zijn gebruikt om de handschoenkamer aan te sluiten op de stikstof- en vacuümleidingen. Referentie-ID's worden verstrekt om het assemblageproces te vergemakkelijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methoden voor de productie van GUV's kunnen worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen: methoden die gebaseerd zijn op zwelling van substraten door hydratatie en methoden die gebaseerd zijn op assemblage van vloeistofinterfaces. Methoden uit de eerste groep zijn zeer efficiënt in het leveren van grote GUV-populaties voor biofysische karakteriseringen van lipidemembranen of transmembraaneiwitten. Daarentegen worden methoden zoals druppeloverdracht voornamelijk gekozen voor het inkapselen van vracht vanwege het verminderde verbruik van ladingen en de hogere inkapselingsefficiëntie18.

Om deze reden is een overvloed aan verschillende ladingen ingekapseld in GUV's, waardoor de druppeloverdracht een referentieproces is voor kunstmatige cellen 3,8,9,10 en een mogelijke oplossing voor het bouwen van nieuwe biomimetische microrobots11,12. Om de fysisch-chemische eigenschappen van GUV-membranen te moduleren, kunnen verschillende moleculen worden opgenomen, zoals ionische fosfolipiden10, vetzuren19, polymeren zoals PEG20 of cholesterol21 (hoewel hydrofobe moleculen zoals cholesterol een hoge affiniteit hebben voor olie, wat resulteert in een lagere controle van de membraansamenstelling met betrekking tot zwelmethoden22). Het protocol is veelzijdig genoeg om deze wijzigingen mogelijk te maken, maar sommige stappen hebben een grotere impact dan andere.

Om de kritieken van de methode te bespreken, hebben we hier een protocol beschreven voor de bereiding van twee verschillende GUV-populaties: een preparaat van GUV's met een sacharoseoplossing en een preparaat van GUV's die microdeeltjes inkapselen. De verschillen in het protocol worden in Tabel 1 beschreven als voorwaarde E (leeg) en voorwaarde P (met deeltjes). Deze methode maakt de vorming van GUV's mogelijk door waterdruppels over te brengen van een oliefase naar een waterfase in een bistabiel proces dat wordt aangedreven door fosfolipiden23 en wordt beïnvloed door de fysisch-chemische eigenschappen van alle drie de betrokken fasen: IS, OS en LS.

Van de drie is LS het meest gevoelig vanwege de gevoeligheid van fosfolipiden voor licht, oxidatie en hydrolyse 24,25,26. Om deze reden moet de eerste stap van het verdampen van het organische oplosmiddel dat wordt gebruikt voor de langdurige opslag van fosfolipiden bij -20°C (meestal chloroform of methanol) worden uitgevoerd in amberflesjes onder stikstof- of argonstroom. Als er in de laboratoriumomgeving geen lage luchtvochtigheid wordt gegarandeerd, kunnen fosfolipiden beschadigd raken13, 14, 27. Daarom moet LS worden voorbereid in een besloten omgeving, zoals een handschoenenkastje of de kosteneffectieve aangepaste handschoenkamer die in dit protocol wordt beschreven. Zodra de olie aan de lipidenfilm is toegevoegd, kan de LS uit de handschoenkamer worden verwijderd en wordt de volledige oplossing van fosfolipiden uitgevoerd door vortexen en verwarmen van de oplossing.

Hoewel sommige protocollen sonicatie in deze stap13 omvatten, kunnen plaatselijke temperatuurstijgingen leiden tot nog onbeschreven schade voor sommige LS-formuleringen. Om deze reden kan het verwarmen van de oplossing in een waterbad zorgen voor een beter gecontroleerd en homogeen proces. Om de kans op beschadiging van de LS verder te verkleinen, stelt dit protocol het gebruik van twee verschillende temperaturen voor: aangezien het oplossen van een nieuw bereide LS meer energie vereist dan een eerder opgeloste LS (vanwege een dichtere pakking van fosfolipidemoleculen in de film die op het oppervlak van de glazen injectieflacon wordt verspreid), wordt 80 °C aangenomen voor het eerste oplossen van de lipidefilm en 50 °C om fosfolipiden eenvoudig opnieuw op te lossen vlak voor hun gebruik. Omdat een toename van de prestatievariabiliteit in de loop van de tijd over het algemeen wordt waargenomen voor 3,18 mM DOPC in minerale olie (Figuur 4C), is het gebruik van LS binnen een week een algemeen aanbevolen praktijk. Desalniettemin kunnen sommige combinaties van olie en fosfolipiden een langere levensduur hebben, en het gebruik van een handschoenkamer lijkt ook de stabiliteit van LS in de loop van de tijd te verbeteren.

Het aanpassen van GUV-membranen met specifieke combinaties van fosfolipiden kan op maat gemaakte implementaties van het protocol vereisen. Om te navigeren tussen alle mogelijke variaties, kan men zich laten leiden door de fysisch-chemische eigenschappen van de LS. De kritische micellaire concentraties (CMC) en de diffusie van fosfolipiden in LS worden beïnvloed door de chemische interacties met de moleculen in oplossing28. De vorming van waterdruppels in de IS/LS-emulsie wordt daarom beïnvloed door hoe snel fosfolipiden in de oliefase kunnen diffunderen en water/olie-interfaces kunnen bereiken om een stabiele monolaag te vormen (het binnenste blad van het membraan). Verschillen in diffusiteit werden waargenomen voor de twee oliën die in dit protocol worden geëxploiteerd, waarbij siliconenolie AR20 een hogere stabiliteit van IS/LS-emulsie biedt (Figuur 6). Omdat de meest stabiele emulsie voor beide oliën werd waargenomen wanneer water werd gedispergeerd in een verhouding van 2,5% (in overeenstemming met eerdere waarnemingen in minerale olie13), hebben we dit als een algemeen geldende verhouding vastgesteld.

Desalniettemin, aangezien hogere verhoudingen nuttige eigenschappen kunnen bieden (bijv. POPC in minerale olie vertoonde een verschuiving naar grotere GUV's13), raden we aan om een voorlopige kwalitatieve test uit te voeren zoals beschreven in figuur 6 om inzicht te krijgen in de stabiliteit van de emulsie en dus de verwachte efficiëntie van de inkapseling. Hier raden we de lezers aan om niet te vertrouwen op precieze timing of iteraties van procedures voor de vorming van de emulsie, omdat de werkzaamheid strikt afhangt van de operator of het gekozen instrument. In plaats daarvan bieden we een controlepunt om de operator te helpen begrijpen wanneer de kwaliteit van de emulsie goed genoeg is om - althans theoretisch - de kans te maximaliseren om druppels om te zetten in GUV's. De diffusie van fosfolipiden in olie beïnvloedt ook hun vermogen om zich tijdens de druppeloverdracht te herschikken en de buitenste folder van het GUV-membraante vormen 2,7,18,29. Deze stap wordt bevorderd door een goede balans van de LS/OS-interface. Hoewel de incubatietijd die door dit protocol wordt aangenomen in overeenstemming is met algemene aanbevelingen18, met metingen van de grensvlakspanning uit eerdere rapporten7 en onze voorlopige experimenten, kunnen GUV's die met verschillende LS zijn bereid, baat hebben bij een langere incubatietijd.

De vorming van de buitenste folder wordt ook beïnvloed door de snelheid van waterdruppels die de LS/OS-interface doorkruisen, een stap die verband houdt met de dichtheid en viscositeit van de drie fasen30. De dichtheidsverschillen moeten altijd de volgorde aanhouden: IS > OS > LS. Dit is essentieel om eerst de sedimentatie van IS-druppels naar de LS/OS-interface mogelijk te maken, vervolgens de kruising van de interface voor omzetting in GUV's en hun sedimentatie naar de bodem van de buis. Hoewel het proces spontaan kan optreden, zelfs wanneer gedeïoniseerd water wordt gebruikt als zowel IS als OS23, werd een verschil in dichtheid tussen IS en OS geïntroduceerd om de vorming van GUVte bevorderen 31. Het meest voorkomende paar voor dit doel is sucrose in de IS en glucose in de OS: bij equiosmolaire concentraties die nodig zijn om schade aan de vormende GUV's als gevolg van osmotische stress te voorkomen, biedt sucrose een dichtere oplossing dan glucose. Omdat het verschil in dichtheid toeneemt met de osmolariteit van deze oplossingen, varieert de opbrengst van GUV's dienovereenkomstig, zonder dat er verdere verbetering wordt waargenomen na 600 mOsm13.

Optimale centrifugatieomstandigheden zijn nauw verbonden met de dichtheid en viscositeit van de drie fasen en de diffusie van fosfolipiden. Bij gebrek aan een volledige karakterisering van de drie fasen, moeten meerdere omstandigheden worden gescreend. Uit kwalitatieve tests (Figuur 4E en Figuur 5) en voorlopige systematische analyse17 was het mogelijk om goede centrifugatieomstandigheden te definiëren voor de twee monsters die in dit protocol worden beschreven; Toch is de kwaliteit van de monsters voor verbetering vatbaar als er meer omstandigheden worden gescreend. Wanneer het evenwicht tussen de fosfolipidendifusiviteit in de LS en de dichtheid en viscositeit van de drie fasen niet goed wordt gehandhaafd, hebben fosfolipiden onvoldoende tijd om in evenwicht te komen op de LS/OS-interface en om correct te herschikken als waterdruppels naar het besturingssysteem bewegen. Dit leidt vaak tot de vorming van een witachtig neerslag op of net onder het grensvlak, waarschijnlijk bestaande uit fosfolipiden en andere oliefasemoleculen die worden meegesleurd door druppeltjes die er niet in slagen zich tijdens het centrifugeren tot GUV's te verzamelen.

De inkapseling van een homogene oplossing kan worden aangedreven door de IS-dichtheid te verhogen met behoud van een osmotisch evenwicht met de OS (zoals voor het sucrose-glucosepaar), maar de inkapseling van een dispersie van microdeeltjes vereist dat de dichtheid van de waterige fase overeenkomt met die van microdeeltjes32. De efficiëntie van het inkapselen van de lading wordt ook beïnvloed door de chemische samenstelling van de ladingoplossing/dispersie. Eerdere rapporten toonden een negatief effect op de GUV-opbrengst aan, veroorzaakt door veel alkalimetaalhalogeniden33 of pH-variaties13, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van interacties of verschuivingen in de nettolading van zwitterionische hydrofiele koppen van fosfolipiden. Daarom vereist het inkapselen van biologische reacties (zoals enzymatische of celvrije eiwitsynthese) vaak een compromis, omdat pH- en zoutconcentraties (zoals KCl of NaCl) moeten worden aangepast aan niveaus die suboptimaal zijn voor de reactie zelf. Desalniettemin kunnen zelfs complexe reactiemengsels zoals celvrije eiwitsynthese worden gemodificeerd om functionele op GUV gebaseerde kunstmatige cellen te leveren34.

Vanuit praktisch oogpunt kan het herstel van GUV's uit het besturingssysteem, hoewel de methode voor het overbrengen van druppels een zeer eenvoudig proces biedt, enkele beperkingen met zich meebrengen. Om de olie na de centrifugatiestap uit de bovenste fase te verwijderen, is het mogelijk om twee pipetpunten te gebruiken voor een fijnere verwijdering (protocolstap 3.1.1) of een Buchner-kolf voor snellere verwijdering wanneer meerdere monsters worden voorbereid (protocolstap 3.1.2). Aangezien de olie echter niet volledig is verwijderd, is het noodzakelijk om een wasstap uit te voeren om een schone GUV-dispersie te verkrijgen (protocol stap 3.2). Hoewel de wasstappen resulteerden in de effectieve verwijdering van resterende oliedruppels zonder noemenswaardig verlies van GUV's (Figuur 4A,B), kan deze doorgang minder eenvoudig zijn bij zeer viskeuze olie, en het kan zeer tijdrovend zijn wanneer meerdere GUV-formuleringen worden bereid. Er werd een alternatieve methode beschreven om de olieverwijdering te omzeilen en de GUV van de bodem van de buis terug te winnen via een gat dat met behulp van een naald35 is doorboord. Dit proces maakt echter mogelijk geen volledige terugwinning van de GUV-pellet mogelijk als de buis niet in de juiste positie wordt doorboord en is bovendien potentieel schadelijk voor de bediener.

Om het herstel van de GUV te bevorderen, introduceren we hier een nieuwe en eenvoudige aanpak om de oliefase snel te verwijderen. Dit is gebaseerd op het opvangen van de bovenste, minder dichte oliefase in een afgedekte pipetpunt, zodat na het centrifugeren de punt zodanig kan worden verwijderd dat er geen vloeistof druppelt. Deze eenvoudige strategie maakt het mogelijk om snel en gemakkelijk de hele oliefase in één keer te verwijderen, waardoor deze tijdrovende stap consequent wordt vereenvoudigd.

Om de efficiëntie van het protocol te evalueren, zijn enkele methoden geïmplementeerd voor de automatische detectie van GUV's om het tellen en de analyse van de grootteverdeling te versnellen. Het labelen van GUV's met fluorescerende sondes biedt een eenvoudige en effectieve strategie die wordt toegepast op zowel flowcytometrie36,37 als microscoopbeeldvorming in combinatie met cirkeldetectiealgoritmen 13,37,38,39. Meer recentelijk worden op AI gebaseerde tools voor objectdetectie onderzocht om dit proces te verbeteren40,41. Fluorescerende kleurstoffen kunnen echter mogelijk de eigenschappen van GUV beïnvloeden, waardoor artefacten in de analyse worden geïntroduceerd. Als detecteerbaar fluorescerend signaal buiten beschouwing wordt gelaten, blijft microscopie de meest betrouwbare optie, waarbij fasecontrastmicroscopie de voorkeursmethode is voor optimale visualisatie18 en toepassing van cirkeldetectiealgoritmen38.

Als alternatief is het mogelijk om bijzondere eigenschappen van specifieke formuleringen te benutten voor unieke detectiestrategieën. Hadorn et al., bijvoorbeeld, maakten gebruik van de aanwezigheid van elektrolyten in IS om GUV's te detecteren met een op impedantie gebaseerde celteller33. Wanneer geen van deze geautomatiseerde of formuleringsspecifieke methoden haalbaar is, blijft handmatige cirkelannotatie een universeel toepasbare terugval. In dergelijke gevallen biedt ImageJ een praktisch hulpmiddel om het proces te versnellen en eenvoudig ruwe diametermetingen te extraheren zoals beschreven in dit protocol.

Ondanks de brede toepassing van de druppeloverdrachtsmethode, wordt er weinig aandacht besteed aan de optimalisatieprocessen die nodig zijn voor nieuwe GUV-formuleringen. In dit werk hebben we de beschikbare informatie uit de literatuur verzameld om een systematisch protocol te implementeren om deze optimalisatie te sturen en te vereenvoudigen. Deze praktische gids gaat in op de onderliggende principes die betrokken zijn bij de productie van nieuwe GUV-formuleringen en bij het terugwinnen van een minimaal met olie verontreinigd monster, een vaak over het hoofd gezien aspect van het protocol13,14. Hoewel het niet mogelijk is om de optimalisatie te voorspellen die een GUV-formulering vereist, biedt deze gids nuttige tips en inzichten om de implementatie van nieuwe GUV's te versnellen, wat mogelijk kan leiden tot toepassingen zoals kunstmatige cellen en microrobots.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze resultaten maken deel uit van het project CELLOIDS (Cell-inspired particle-based intelligent microrobots) dat financiering heeft ontvangen van de European Research Council (ERC) in het kader van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 948590). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Europese Commissie via het NextGenerationEU BRIEF-project. We danken Michele Ibrahimi voor de technische ondersteuning bij het opzetten van de handschoenkamer en voor de nuttige discussie over het implementeren van de container voor het gemakkelijk verwijderen van olie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm mixed cellulose esters membrane  syringe filtersMerckSLGSVR255F
1.5 mL tubesBioclass06.0279.00
100 μL glass syringeMerck20737
150 mL beakerAvantor 213-1123At least 3
20 mL dark glass vials ND24Avantor 548-9001A
2 mL tubesBioclass07.3534.99
50 mL cylinderAvantor 612-3843
500 μL glass syringeHamilton549-1166
50 mL Falcon tubeMerckCLS352070
50 mL Syringe Fisher Scientific8SS50L1
5 mL tubesGreiner bio-one622201
600 mL beakerAvantor 213-1126
Büchner flaskMerckZ740682
Cork rings for round bottom flasksAvantor 217-1000
CrystallizerDutscher080474A
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
D-(+)-SucroseSigma-AldrichS9378
Digital thermo-hygrometerBohlenderV1863-07
DOPCAvanti Research850375C
DrillDremel4000
Erioglaucine disodium salt (Brilliant Blue FCF)Sigma-Aldrich861146
G18 syringe needleTerumoAN1838R1
G21 syringe needleTerumoAN2138R1
Glove chamberBel-ArtF50030-0000If available a glove box can be used but in laboratories with low humidity levels it may not be necessary
Hot plate magnetic stirrerLLG Labware6.263 448
Light mineral oilSigma-Aldrich330779
New coccineSigma-Aldrich199737
Nitrile Rubber O-Ring O-Ring, 8mm Bore, 12mm Outer DiameterRS196-4863
Open screw caps with septum ND24Avantor 548-0031A
P1000 micropipetteFisher Scientific12346132
P10000 micropipetteAvantor 89079-978
P200 micropipetteFisher Scientific12326132
Paper towelsAvantor KIMB6657
ParafilmAvantor 291-1214
Pipette tips (1000)Eppendorf0030000919
Pipette tips (10000)Eppendorf0030000765
Pipette tips (200)Eppendorf0030000870
Polystyrene particles, 1.1 µmSigma-AldrichLB11-1ML
Rubber capBioclass S.r.l.12.2300.05
Rubber conical gasketAvantor 217-0211
Screw caps  ND24Avantor 548-0161A
Silicone oil AR20Sigma-Aldrich10836
Silicone pipe (internal diameter 1.6 mm external diameter 3 mm)RS667-8441
Silicone pipe (internal diameter 6 mm external diameter 12 mm)RS273-2541At least 6 m
Three-ways junctionRS795-405
Two-ways junctionRS419-7287
Two-ways valveClaber91280
Ultrapure waterThermo Fisher Scientific 22934When available, this product can be replaced with water purified through Milli-Q systems
Universal ScissorsBochem4154

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Träuble, H., Grell, E. Carriers and specificity in membranes. IV. Model vesicles and membranes. The formation of asymmetrical spherical lecithin vesicles. Neurosci Res Program Bull. 9 (3), 373-380 (1971).
  2. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  3. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
  5. Ernits, M., et al. Microfluidic production, stability and loading of synthetic giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 14 (1), 14071(2024).
  6. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), (2011).
  8. Elani, Y., Law, R. V., Ces, O. Vesicle-based artificial cells as chemical microreactors with spatially segregated reaction pathways. Nat Commun. 5 (1), 5305(2014).
  9. Heili, J. M., et al. Controlled exchange of protein and nucleic acid signals from and between synthetic minimal cells. Cell Syst. 15 (1), 49-62.e4 (2024).
  10. Shimane, Y., Kuruma, Y. Rapid and facile preparation of giant vesicles by the droplet transfer method for artificial cell construction. Front Bioeng Biotechnol. 10, 873854(2022).
  11. Sato, Y., Hiratsuka, Y., Kawamata, I., Murata, S., Nomura, S. M. Micrometer-sized molecular robot changes its shape in response to signal molecules. Sci Robot. 2 (4), eaal3735(2017).
  12. De Remigis, E., et al. Infiltration of cell-inspired ultra-deformable magnetic microrobots in restrictive environments. IEEE Trans Med Robot Bionics. 7 (1), 123-129 (2024).
  13. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  14. Zhang, Y., Obuchi, H., Toyota, T. A practical guide to preparation and applications of giant unilamellar vesicles formed via centrifugation of water-in-oil emulsion droplets. Membranes. 13 (4), 440(2023).
  15. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  16. Palagi, S. GUV-dimensional-analysis. , https://github.com/microrobotlab/GUV-dimensional-analysis/tree/v1.0 (2025).
  17. De Remigis, E., et al. Optimisation of encapsulation technique for confining microparticles in lipid membranes. Zenodo. 2023, DOI: 10.5281/zenodo.8069819 (2023).
  18. Dimova, R., Stano, P., Marques, C. M., Walde, P. Preparation methods for giant unilamellar vesicles. Giant Vesicle Book. , 3-20 (2019).
  19. Tyler, A. I. I., Greenfield, J. L., Seddon, J. M., Brooks, N. J., Purushothaman, S. Coupling phase behavior of fatty acid containing membranes to membrane bio-mechanics. Front Cell Dev Biol. 7, (2019).
  20. Hamada, S., et al. Giant vesicles functionally expressing membrane receptors for an insect pheromone. Chem Commun. 50 (22), 2958(2014).
  21. Roberti, E., Petrocelli, E. L., Cecchi, D., Palagi, S. Dimensions, stability, and deformability of DOPC-cholesterol giant unilamellar vesicles formed by droplet transfer. Open Res Eur. 5 (77), (2025).
  22. Weakly, H. M. J. Several common methods of making vesicles (except an emulsion method) capture intended lipid ratios. Biophys J. 123 (19), 3452-3462 (2024).
  23. Ito, H., et al. Dynamical formation of lipid bilayer vesicles from lipid-coated droplets across a planar monolayer at an oil/water interface. Soft Matter. 9 (40), 9539-9547 (2013).
  24. Reis, A., Spickett, C. M. Chemistry of phospholipid oxidation. Biochim Biophys Acta BBA Biomembr. 1818 (10), 2374-2387 (2012).
  25. Storage and handling of lipids. , https://avantiresearch.com/tech-support/storage-handling-of-lipids (2025).
  26. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  27. Faizi, H. A., Tsui, A., Dimova, R., Vlahovska, P. M. Bending rigidity, capacitance, and shear viscosity of giant vesicle membranes prepared by spontaneous swelling, electroformation, gel-assisted, and phase transfer methods: a comparative study. Langmuir. 38 (34), 10548-10557 (2022).
  28. Lehtinen, O. -P., et al. Effect of temperature, water content and free fatty acid on reverse micelle formation of phospholipids in vegetable oil. Colloids Surf B Biointerfaces. 160, 355-363 (2017).
  29. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  30. Whittenton, J., Harendra, S., Pitchumani, R., Mohanty, K., Vipulanandan, C., Thevananther, S. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  31. Hamada, T., Miura, Y., Komatsu, Y., Kishimoto, Y., Vestergaard, M., Takagi, M. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
  32. Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
  33. Hadorn, M., Boenzli, E., Hotz, P. E. A quantitative analytical method to test for salt effects on giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 1 (1), 168(2011).
  34. Toparlak, ÖD., et al. Artificial cells drive neural differentiation. Sci Adv. 6 (38), eabb4920(2020).
  35. Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoc. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  36. Matsushita-Ishiodori, Y., Hanczyc, M. M., Wang, A., Szostak, J. W., Yomo, T. Using imaging flow cytometry to quantify and optimize giant vesicle production by water-in-oil emulsion transfer methods. Langmuir. 35 (6), 2375-2382 (2019).
  37. Caliari, A., Hanczyc, M. M., Imai, M., Xu, J., Yomo, T. Quantification of giant unilamellar vesicle fusion products by high-throughput image analysis. Int J Mol Sci. 24 (9), 8241(2023).
  38. van Buren, L., Koenderink, G. H., Martinez-Torres, C. DisGUVery: a versatile open-source software for high-throughput image analysis of giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 12 (1), 120-135 (2023).
  39. Pazzi, J., Subramaniam, A. B. Nanoscale curvature promotes high yield spontaneous formation of cell-mimetic giant vesicles on nanocellulose paper. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (50), 56549-56561 (2020).
  40. Ekosso, C., Liu, H., Glagovich, A., Nguyen, D., Maurer, S., Schrier, J. Accelerating the discovery of abiotic vesicles with AI-guided automated experimentation. Langmuir. 41 (1), 858-867 (2025).
  41. Lee, I. -H., Passaro, S., Ozturk, S., Ureña, J., Wang, W. Intelligent fluorescence image analysis of giant unilamellar vesicles using convolutional neural network. BMC Bioinformatics. 23 (1), 48(2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Emulsieoverdrachtsynthetische biologievesikelinkapselinglipidsuspensieverwijdering van oliefasemicroroboticacentrifugatieprotocolfosfolipidenmembraan

Gerelateerde artikelen