Driedimensionale (3D) reconstructie van hartschade bij gerefused acuut myocardinfarct (repAMI) maakt getrouwe kwantificering en co-lokalisatie van geassocieerde ziekte-beïnvloedende patronen mogelijk. Hier wordt een automatiseerbare lichtbladgeleide beeldvormingsbenadering geboden voor gelijktijdige meting van hartschade, risicogebied en immuuncelrespons.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gelijktijdige 3D-analyse van hartbeschadiging en immuunrespons bij recidorsus acuut myocardinfarct met behulp van fluorescentiemicroscopie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Complexe cellulaire interacties bepalen functionele en structurele weefselremodellering tijdens reperfused acuut myocardinfarct (repAMI). Deze processen vertonen een duidelijke ruimtelijke verdeling, aangezien de geblesseerde hartspier is gesegmenteerd in verschillende gebieden (schadegebied, risicogebied (AAR) en afgelegen gebied). Driedimensionale (3D) visualisatie van deze gebieden is essentieel voor de analyse van verschillende interacties tussen residente hartcellen en infiltrerende immuuncellen, waardoor mogelijke behandelingsdoelen kunnen worden geïdentificeerd. Hier wordt een protocol beschreven voor gelijktijdige en automatiseerbare 3D-visualisatie en kwantificering van het hartschadegebied, AAR en infiltrerende immuuncellen (bijv. neutrofielen) na repAMI. Dit omvat intravitale antilichaam-gemedieerde kleuring van het hartschadegebied (CD31neg) en neutrofieleninfiltratie (Ly6G+) na ex vivo visualisatie van AAR door retrograde antilichaamperfusie en verdere niet-toxische weefselopruiming voor lichtbladfluorescentiemicroscopie (LSFM) beeldvorming. Deze techniek maakt de ruimtelijke analyse van doelwitcellen mogelijk, bijvoorbeeld het infiltreren van immuuncellen en beschadigde gebieden in een intact muizenhart na repAMI. Traditionele histologie en immunohistochemie kunnen worden uitgevoerd na het opruimen van niet-toxisch weefsel en beeldacquisitie met computerondersteunde nabewerking. Dit maakt het mogelijk om informatiewinst binnen hetzelfde muishart te multiplexen, waardoor de robuustheid van de gegevens wordt versterkt en vooral belangrijk is bij een zeer complexe verwonding zoals repAMI.
Inleiding
Weefselbeschadiging bij gerefused acuut myocardinfarct (repAMI) is de belangrijkste drijvende factor voor cardiale remodellering en ontwikkeling van hartfalen1. Meerdere lokale mediatoren en residente hartcellen, maar ook infiltrerende immuuncellen beïnvloeden de uitbreiding ervan in een complexe interactie 2,3. Inzicht in de ruimtelijke organisatie van deze processen is essentieel om diepgaande kennis te verwerven voor de identificatie van nieuwe therapiedoelen om weefselbeschadiging na repAMI te beperken en de hartfunctie te verbeteren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproefdierprocedures zijn goedgekeurd door de verantwoordelijke lokale overheidsinstantie (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) en voldoen aan alle relevante ethische voorschriften voor dierproeven en dieronderzoek. Er werden experimenten uitgevoerd met mannelijke C57BL/6J-muizen (9-30 weken oud). De dieren werden gehuisvest en gebruikt onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden in het plaatselijke dierenverblijf op 12 uur/12 uur dag- en nachtcyclus.
OPMERKING: Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd onder intraperitoneale inductie van a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De gepresenteerde aanpak met behulp van light sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) maakt gelijktijdige analyse van AAR, endotheelbeschadiging en neutrofieleninfiltratie na repAMI mogelijk. Figuur 1A illustreert de intravitale en ex vivo antilichaamkleuring van C57BL/6J-muizen 24 uur na inductie van repAMI. Antilichamen voor kleuring van cardiaal endotheelletsel (anti-CD31 gelabeld met AlexaFluor 790) en neutrofieleninfiltratie (anti-Ly6G gelabeld m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende beeldvormende entiteiten om hartweefselbeschadiging te detecteren tijdens repAMI bij muizen. Deze technieken bieden verschillende voordelen, maar hebben ook beperkingen. Het kleuren van verminderde metabolische activiteit van hartcellen met behulp van TTC is de meest gebruikte methode voor het kwantificeren van cardiaal I/R-letsel en kan worden gecombineerd met de blauwe kleuring van Evan voor het onderscheid van AAR 13,14,15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Elias Haj-Yehia rapporteert persoonlijke vergoedingen en andere van AstraZeneca, die buiten het ingediende werk vallen. Simon F. Merz en Lea Bornemann zijn momenteel in dienst van Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG. Matthias Totzeck en Tienush Rassaf rapporteren persoonlijke vergoedingen, en anderen van Edwards en Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo en Astra Zeneca, die buiten het ingediende werk vallen. Tienush Rassaf en Ulrike B. Hendgen-Cotta waren medeoprichters van Bimyo, een bedrijf dat zich richt op de ontwikkeling van cardioprotectieve peptiden. Matthias Günzer ontving algemene onderzoeksfinanciering van Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. Alle andere auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de volgende financieringsbronnen: Duitse Onderzoeksstichting (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) en Duitse Hartvereniging (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Een deel van dit werk werd uitgevoerd in het Imaging Center Essen (IMCES), een Service Core Facility van de Faculteit der Geneeskunde van de Universiteit Duisburg-Essen, Duitsland. We danken de IMCES-medewerkers voor hun voortdurende technische ondersteuning en het gebruik van hun instrumenten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 27 G naald | Becton Dickinson | 305889 | BD Eclipse |
| 3D-beeldverwerking & analysesoftware | Bitplane | Vers. 10.1.0 | Imaris |
| 5-0 hechtdraad | Serag-Wiessner | IC108000 | Zijde |
| 6-0 hechtdraad | Ethicon | EH7814 | Prolene |
| AlexaFluor 546 antilichaamlabelingkit | Invitrogen | A20183 | |
| AlexaFluor 790 antilichaamlabelingkit | Invitrogen | A20189 | |
| Anti-muis Ly6G-antilichaam (AlexaFluor 647) | Biolegend | 127610 | Clone: 1A8 |
| Celzeef (100 μm) | Corning | 431752 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Carl Roth | 7029.1 | |
| Ethanol | Carl Roth | 0911.4 | |
| Ethyl cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Bestandsconversiesoftware | Bitplane | Vers. 10.1.0 | Imaris |
| Gaas | Fuhrmann | 10021 | |
| Gellan gom poeder | Sigma-Aldrich | P8169 | Phytagel |
| Heparine (25.000 IE/5 mL) | LEO Pharma | 15261203 | |
| Waterstofperoxide (H2O2, 30%) | Carl Roth | 8070.2 | |
| Injectiespuit | B Braun | 9161502S | Omnican F |
| Ketamine (100 mg/mL) | bela-pharma | 402581.00.00 | |
| Lichtbladmicroscoopsysteem | Miltenyi Biotec | - | UltraMicroscope Blaze |
| Luer lock spuit | Becton Dickinson | 303172 | BD Plastipak |
| Magneetroerd | VWR | 444-0572 | |
| Neo sCMOS-camera (4,2 MP) | Andor Technology | ZL41 Cell 4.2 | |
| Objectief | Miltenyi Biotec | 130-133-625 | MI Plan 1,1x NA 0,1, WD 17,6 mm |
| Paraformaldehyde (PFA, 4%) | Sigma-Aldrich | 1.00496 | 10% formaline, neutraal gebufferd |
| Petrischaal | Greiner Bio-One | 632181 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | Gibco | 14190-094 | Zonder MgCl2/CaCl2 |
| Polypropyleen buis (15 mL) | Greiner Bio-One | 188261 | |
| Polypropyleen buis (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Zwart |
| Polypropyleen buis (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Voorbereidingsschaal voor muishartcanulerings | Hugo Sachs Elektronik | 73-4327 | Canule inbegrepen |
| Gezuiverde anti-muis CD31-antilichaam | Becton Dickinson | 53369 | Clone: MEC13.3 |
| Rollerpomp | Ismatec | ISM597-230 | |
| Afdichtingsfolie | Bemis | PM-996 | Parafilm |
| Stereomicroscoop | Leica | S6D | |
| Buisrotator | Heidolph | Polymax 1040 | |
| Witte lichtlaser | NKT photonics | SuperK extreme | 200 mW, 480–2400 nm |
| WT-muisstam | Janvier Labs | - | C57BL/6JRj |
| Xylazin (2%) | Ceva Tiergesundheit | 6324464.00.00 |
Referenties
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
- Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
