Methodenartikel

Gelijktijdige 3D-analyse van hartbeschadiging en immuunrespons bij recidorsus acuut myocardinfarct met behulp van fluorescentiemicroscopie

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68347

⸱

26 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Driedimensionale (3D) reconstructie van hartschade bij gerefused acuut myocardinfarct (repAMI) maakt getrouwe kwantificering en co-lokalisatie van geassocieerde ziekte-beïnvloedende patronen mogelijk. Hier wordt een automatiseerbare lichtbladgeleide beeldvormingsbenadering geboden voor gelijktijdige meting van hartschade, risicogebied en immuuncelrespons.

Samenvatting

Complexe cellulaire interacties bepalen functionele en structurele weefselremodellering tijdens reperfused acuut myocardinfarct (repAMI). Deze processen vertonen een duidelijke ruimtelijke verdeling, aangezien de geblesseerde hartspier is gesegmenteerd in verschillende gebieden (schadegebied, risicogebied (AAR) en afgelegen gebied). Driedimensionale (3D) visualisatie van deze gebieden is essentieel voor de analyse van verschillende interacties tussen residente hartcellen en infiltrerende immuuncellen, waardoor mogelijke behandelingsdoelen kunnen worden geïdentificeerd. Hier wordt een protocol beschreven voor gelijktijdige en automatiseerbare 3D-visualisatie en kwantificering van het hartschadegebied, AAR en infiltrerende immuuncellen (bijv. neutrofielen) na repAMI. Dit omvat intravitale antilichaam-gemedieerde kleuring van het hartschadegebied (CD31neg) en neutrofieleninfiltratie (Ly6G+) na ex vivo visualisatie van AAR door retrograde antilichaamperfusie en verdere niet-toxische weefselopruiming voor lichtbladfluorescentiemicroscopie (LSFM) beeldvorming. Deze techniek maakt de ruimtelijke analyse van doelwitcellen mogelijk, bijvoorbeeld het infiltreren van immuuncellen en beschadigde gebieden in een intact muizenhart na repAMI. Traditionele histologie en immunohistochemie kunnen worden uitgevoerd na het opruimen van niet-toxisch weefsel en beeldacquisitie met computerondersteunde nabewerking. Dit maakt het mogelijk om informatiewinst binnen hetzelfde muishart te multiplexen, waardoor de robuustheid van de gegevens wordt versterkt en vooral belangrijk is bij een zeer complexe verwonding zoals repAMI.

Inleiding

Weefselbeschadiging bij gerefused acuut myocardinfarct (repAMI) is de belangrijkste drijvende factor voor cardiale remodellering en ontwikkeling van hartfalen1. Meerdere lokale mediatoren en residente hartcellen, maar ook infiltrerende immuuncellen beïnvloeden de uitbreiding ervan in een complexe interactie 2,3. Inzicht in de ruimtelijke organisatie van deze processen is essentieel om diepgaande kennis te verwerven voor de identificatie van nieuwe therapiedoelen om weefselbeschadiging na repAMI te beperken en de hartfunctie te verbeteren.

Aangezien de hartspier zelf uit verschillende celtypen bestaat, is een gedetailleerde analyse van hartschade een uitdaging, aangezien elk celtype zijn eigen specifieke weerstandscapaciteit vertoont tijdens ischemie en reperfusieschade 4,5. Een belangrijk kenmerk in de context van repAMI is een groot verlies van het vaatstelsel dat gepaard gaat met een verslechtering van de endotheelcelfunctie6. De meest gevestigde marker die wordt gebruikt voor de weergave van de vasculaire structuur en de analyse van endotheeldisfunctie bij muizen en mensen is CD31 (ook bekend als PECAM-1), een adhesiemolecuul dat tot expressie komt op het oppervlak van de endotheelcel7. In verschillende ischemie/reperfusiemodellen bleek verlies van CD31 een goede surrogaatmarker te zijn voor het onderscheid van endotheelweefselbeschadiging 8,9,10. Bovendien worden tijdens repAMI drie grote letselcompartimenten door het hele hart onderscheiden. Hartweefsel dat niet is aangetast door ischemie/reperfusie (I/R) vertegenwoordigt het afgelegen gebied. Myocardium stroomafwaarts van een vaatocclusie wordt gedefinieerd als een risicogebied (AAR)11,12. Na het begin van de reperfusie kan een duidelijk gebied van hartweefsel worden gedifferentieerd in de AAR, dat is beschadigd door voorafgaande ischemie (beschadigingsgebied)13. Conventionele beoordeling van cardiale I/R-beschadiging bij muizen maakt gebruik van trifenyltetrazoliumchloride (TTC) in seriële dikke secties die een verminderde metabolische activiteit van beschadigde hartcellen vertonen13,14. Tegelijkertijd kan ex vivo Evan's blauwe kleuring worden toegevoegd voor de bepaling van AAR15. Deze gevestigde methoden hebben echter verschillende beperkingen, waaronder de verminderde mogelijkheid van co-beoordeling van infiltratie van immuuncellen, onderscheid van celtypespecifiek letsel en nauwkeurige 3D-weefselreconstructie.

Light sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) maakt het mogelijk om intacte hele muizenorganen te visualiseren met een fluorescentiesignaalresolutie tot op cellulair niveau. Onlangs is een verbeterde niet-toxische weefselopruimingsmethode geïntroduceerd met behulp van ethylkaneel (ECi) voor 3D-visualisatie van intacte muizenharten8. Om de beperkingen van de blauwe kleuring van TTC/Evan aan te pakken, werd intravitale op antilichamen gebaseerde CD31-fluorescentiekleuring gebruikt, waarbij cardiaal endotheelletsel werd onthuld als gebieden zonder CD31-kleuring (CD31neg) tijdens repAMI8. Aanvullende toediening van ex vivo retrograde aorta-injectie met een fluorofoor-geconjugeerd anti-CD31-antilichaam met een ander fluorescentiespectrum zoals voor intravitale kleuring is verantwoordelijk voor gelijktijdige 3D-weergave van AAR. Bovendien kan deze methode worden uitgebreid door neutrofielenkleuring toe te voegen, waardoor celdistributieanalyse mogelijk is, gescheiden door afgelegen gebied, AAR en cardiaal endotheelletselvolume om het begrip van de neutrofielenfunctie tijdens repAMI te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproefdierprocedures zijn goedgekeurd door de verantwoordelijke lokale overheidsinstantie (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) en voldoen aan alle relevante ethische voorschriften voor dierproeven en dieronderzoek. Er werden experimenten uitgevoerd met mannelijke C57BL/6J-muizen (9-30 weken oud). De dieren werden gehuisvest en gebruikt onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden in het plaatselijke dierenverblijf op 12 uur/12 uur dag- en nachtcyclus.

OPMERKING: Alle chirurgische ingrepen werden uitgevoerd onder intraperitoneale inductie van anesthesie met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) met onderhoud met isofluraan (1,5 Vol%). Om dierenleed te verminderen, kregen alle dieren overdag subcutane injecties van 0,1 mg/kg buprenorfine voor en na de anesthesie in combinatie met buprenorfinehoudend drinkwater 's nachts. Het chirurgische protocol voor het induceren van repAMI is eerder elders beschreven 16,17. Voordat u begint met de injectie van intravitale antilichamen, bereidt u twee petrischalen van 6 cm voor die worden gebruikt voor ex vivo retrograde antilichaaminjectie in de latere stappen die hieronder worden beschreven. Een ondiepe petrischaal met PBS op ijs is nodig voor de ruwe verwijdering van overtollig omringend weefsel uit het hart (het wordt aanbevolen om op maat gesneden stukjes gaas in de schaal te gebruiken om het latere hanteringsproces te vergemakkelijken). Een ander schaaltje is nodig voor aortacanulatie met een 20 G stompe stalen canulenaald ondergedompeld in PBS op ijs met een losse knoop van 5-0 hechting over de canule-inkeping. Vermijd of verwijder luchtbellen in de canule, omdat deze kransslagaders kunnen blokkeren en totale perfusie kunnen voorkomen.

1. Intravitale injectie van antilichamen

  1. Verdoof de muis met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg).
  2. Injecteer 10 μg elk direct geëtiketteerde muis anti-CD31 (kloon: MEC13.3; fluorofoor: AlexaFluor 790) en muis anti-Ly6G (kloon: 1A8; fluorofoor: AlexaFluor 647) antilichamen in PBS met een totaal volume van 5 μL per g lichaamsgewicht (100 μL voor een muis van 20 g) via intraveneuze staartaderinjectie.
    OPMERKING: Deze antilichaaminjectie labelt al het endotheel in het hart en is bedoeld om de grootte van de repAMI-verwonding te kwantificeren.
  3. Laat de geïnjecteerde antilichamen 10 minuten circuleren voordat u de procedure voortzet.

2. Hart oogsten

OPMERKING: Secties 2 en 3 zijn tijdkritisch en moeten in minder dan 6 minuten worden voltooid.

  1. Offer het dier door cervicale dislocatie 10 minuten na injectie van het antilichaam. Controleer de dood door reflexen te beoordelen.
    OPMERKING: Als er bloedmonsters nodig zijn, neem deze dan voordat u doorgaat naar de volgende stap.
  2. Plaats de muis onder een stereomicroscoop.
  3. Open de borstholte en snijd de blootgestelde vena cava superior dicht bij de uitgang van het bloedvat van de ribbenkast naar de nek.
    OPMERKING: Houd de aorta intact, want deze is nodig voor ex vivo retrograde antilichaaminjectie.
  4. Bevochtig harten in situ via de rechter en linker atriumoorschelp met PBS bevattende heparine (20 IE/ml) met behulp van een naald van 27 G met een rolpomp (70 μL/s) gedurende in totaal 3 min. Voldoende hartbloedafname wordt merkbaar door het vervagen van de oppervlakkige vasculaire tekening van het hart en het witter worden van de long en lever.
    OPMERKING: Vermijd hartperfusie via de rechter- of linkerventrikel, omdat dit beeldvormingsartefacten kan veroorzaken tijdens fluorescentiemicroscopie van lichtplaten.
  5. Snijd het hart en ten minste 5 mm van de resterende aorta samen met het omliggende longweefsel weg.
    OPMERKING: Houd de hartspier niet direct vast tijdens excisie om weefselbeschadiging en beeldvormingsartefacten tijdens fluorescentiemicroscopie te voorkomen.

3. Ex vivo injectie van retrograde antilichamen

  1. Breng het hart over naar een petrischaaltje van 6 cm met ijskoude PBS en eerder bereid gaasje.
  2. Snijd het resterende omliggende long-, vet- en vaatweefsel af totdat alleen het hart met ongeveer 5 mm aorta overblijft.
  3. Breng het hart over naar de voorbereide schaal voor aortacanulatie.
  4. Trek de resterende aorta over de 20 G stompe stalen canule en ligate deze met de pre-knot 50 hechtdraad aan de canule-inkeping.
    OPMERKING: De canulepunt moet dicht bij de aortaklep worden geduwd om ervoor te zorgen dat er geen perfusievloeistof lekt.
  5. Re-ligate de linker voorste dalende slagader (LAD) permanent met een 6-0 hechting op de exacte locatie die eerder werd gebruikt voor de inductie van repAMI.
  6. Injecteer 400 μL PBS met 20 μg muis anti-CD31 (kloon: MEC13.3) antilichaam, gelabeld met AlexaFluor 546, retrograde via ingebrachte canule.
    OPMERKING: Sluit de verbinding tussen de injectiespuit en de ingebrachte canule af met afdichtingsfilm om volledige antilichaamperfusie via kransslagaders te garanderen. Deze antilichaaminjectie kleurt alleen endotheel buiten de AAR en kan dus worden gebruikt voor AAR-kwantificering.
  7. Trek de ingebrachte canule uit de aorta.
  8. Breng het hart over in een polypropyleen reactiebuis van 15 ml met 10 ml 4% paraformaldehyde (PFA) en incubeer zonder te roeren een nacht bij 4 °C in het donker.

4. Monsterverwerking en opruiming

  1. Was het gefixeerde hart in drie wisselingen van 5 ml PBS gedurende elk 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) in het donker, altijd roerend met bijna bovenhandse rotatie in polypropyleen reactiebuizen van 5 ml.
  2. Gedehydrateerd gefixeerd hart in 5 ml oplopende ethanolserie van 50%, 70% en 100% in gedeïoniseerd water, elk gedurende ten minste 2 uur bij RT in het donker, altijd agiterend met bijna bovenhandse rotatie in polypropyleen reactiebuizen van 5 ml.
    OPMERKING: De incubatie in 50% en 70% ethanol kan worden verlengd tot de volgende dag, terwijl de incubatie in 100% ethanol kan worden verlengd tot 3 dagen.
  3. Bleekmiddel gedehydrateerd hart in 15 ml polypropyleen reactiebuisjes met 10 ml 100% ethanol met 5% DMSO en 5% H2O2 zonder te roeren gedurende 4 uur bij 4 °C in het donker.
    NOTITIE: Tijdens het bleekproces kan er druk in de buis worden opgebouwd; Wees voorzichtig bij het openen van de tube daarna.
  4. Was het gebleekte hart in 5 ml 100% ethanol driemaal gedurende 12 uur elk bij RT in het donker, altijd roerend met bijna bovenhandse rotatie in polypropyleen reactiebuizen van 5 ml.
    OPMERKING: Elke incubatiestap kan met maximaal 3 dagen worden verlengd.
  5. Breng het hart over naar een polypropyleen reactiebuis van 5 ml met 4 ml ethylcinnemaat (ECi) voor het opruimen van weefsel en incubeer zonder te agiteren gedurende 3 dagen bij RT in het donker.
    OPMERKING: Een gezuiverd hart kan ten minste 3 maanden in ECi blijven zonder een afname van de fluorescentie-intensiteit bij correcte opslag in het donker bij RT. Bewaar geen ECi of monsters die zijn opgeslagen in ECi onder 6 °C, aangezien ECi bij deze temperatuur bevriest en het monster tijdens het proces beschadigt.

5. Bereiding van gellangomblokken

  1. Meng 1 g gellangompoeder in 100 ml verwarmd kraanwater (50-60 °C).
  2. Laat mengen tot het volledig is opgelost met behulp van een magnetische roerder.
    OPMERKING: Als het poeder niet goed oplost, verwarm de oplossing dan tot het kookt in een magnetron.
  3. Filtreer de gellangomoplossing door een celzeef van 100 μm.
  4. Plaat gefilterde oplossing in een ondiepe petrischaal van 10 cm.
  5. Laat afkoelen tot de gel is uitgehard.
  6. Snijd de gel in blokken van 15 mm, 15 mm, 5 mm.
  7. Dehydrateerblokken in 50 ml oplopende ethanolserie bij 50% en 70% in gedeïoniseerd water, elk gedurende ten minste 2 uur bij RT, altijd roerend met bijna bovenhandse rotatie in één polypropyleen reactiebuis van 50 ml.
    OPMERKING: Vul de reactiebuis met ethanol na het toevoegen van gelblokken. Vul de reactiebuis slechts voor de helft met gelblokken.
  8. Incubeer gedehydrateerde blokken in 50 ml 100% ethanol driemaal gedurende 12 uur elk bij RT, altijd roerend met bijna bovenhandse rotatie in een polypropyleen reactiebuis van 50 ml.
    OPMERKING: Vul de reactiebuis met ethanol na het toevoegen van gelblokken. Vul de reactiebuis slechts voor de helft met gelblokken. Gelblokken kunnen gedurende langere tijd in de laatste reactiebuis met 100% ethanol blijven totdat ze in ECi zijn geklaard.
  9. Breng de blokken over naar een polypropyleen reactiebuis van 50 ml die 25 ml ECi bevat en incubeer zonder te roeren gedurende 3 dagen bij RT.
    OPMERKING: Plaats slechts een paar blokken in één reactiebuis met ECi om te voorkomen dat artefacten worden opgeruimd. Gewiste blokken kunnen minimaal 6 maanden in ECi blijven en bij RT worden opgeslagen.

6. Beeldvorming

  1. Snijd de geruimde gellangomblokken op de grootte die nodig is om het geklaarde hart in de houder van het microscoopmonster te stabiliseren.
    OPMERKING: Gellangomblokken kunnen meerdere keren worden hergebruikt.
  2. Detecteer interessante fluorescentiesignalen (autofluorescentie, AAR-kleuring [anti-CD31-antilichaam gelabeld met AlexaFluor 546], AlexaFluor647-gekoppeld anti-Ly6G-antilichaam en CD31-neg-kleuring [anti-CD31-antilichaam gelabeld met AlexaFluor 790]) met de juiste excitatie- en emissiefilterinstellingen. Gebruik voor de acquisitie een 0,1 NA objectieflens met een werkafstand van 17,6 mm.
    OPMERKING: Detecteer signalen met een witlichtlaser (200 mW; 480-2400 nm). Gebruik voor de detectie van van bindweefsel afgeleide autofluorescentie een 470/30 nm banddoorlaatexcitatiefilter en een 525/50 nm banddoorlaatemissiefilter; CD31-kleuring met een AlexaFluor 546-gekoppeld antilichaam wordt gedetecteerd met een 520/40 nm banddoorlaatexcitatiefilter en een 585/40 nm banddoorlaatemissiefilter; Ly6G-kleuring met een AlexaFluor 647-gekoppeld antilichaam wordt gedetecteerd met een 630/30 nm banddoorlaatexcitatiefilter en een 680/30 nm banddoorlaatemissiefilter; CD31-kleuring met een AlexaFluor 790-gekoppeld antilichaam wordt gedetecteerd met een 740/40 nm banddoorlaatexcitatiefilter en een 824/55 nm banddoorlaatemissiefilter. Verlichtingstijden en laserdempingspercentage moeten worden aangepast aan de signaalkwaliteit.
  3. Kies de volgende instellingen voor beeldvorming met lichtbladmicroscopie:
    1. Kies voor plaat NA van 0,079, wat resulteert in een lichte plaatdikte van 5 μm.
    2. Kies 10 μm als de afstand tussen twee individuele z-vlakken.
      OPMERKING: Dit resulteert in onderbemonstering en vervolgens verlies van precisie voor tracering en volumemetingen. Om dit te voorkomen, moet een afstand tussen twee individuele z-vlakken gelijk zijn aan de helft van de lichte plaatdikte, dus in dit geval 2,5 μm. In deze studie werd ervoor gekozen om de gegevens te onderbemonsteren, omdat de voordelen van een kortere beeldvormingstijd en de grootte van de gegevensstapel opwegen tegen het minimale verlies aan analyseprecisie.
    3. Gebruik een plaatbreedte van 100% om een homogene verlichting van het monster te krijgen.

7. Nabewerking van afbeeldingen

OPMERKING: De verkregen digitale beeldgegevens werden verder verwerkt met behulp van een wetenschappelijke 3D-beeldverwerkings- en analysesoftware die wordt vermeld in de materiaaltabel.

  1. Start de Imaris file converter 10.1 software en laad de onbewerkte dataset in de software door de map met de afbeeldingsbestanden naar het Imaris file converter venster te slepen en neer te zetten of door op Bladeren te klikken en naar de map met de afbeeldingsbestanden te navigeren.
  2. Selecteer de uitvoermap via Map selecteren.
  3. Klik op Alles starten en wacht tot de bestanden zijn geconverteerd naar .ims Imaris-bestanden.
  4. Start de software en selecteer Surpass in de linkerbovenhoek.
  5. Open afbeeldingsstapels door Openen te kiezen en selecteer het bijbehorende IMS-gegevensbestand.
  6. Als u een automatisch gegenereerd oppervlak van het hele hart wilt maken, selecteert u 3D-weergave en Oppervlakken.
  7. Kies Alleeneen interessegebied scheiden, Ten slotte de hele afbeelding verwerken en Object-objectstatistieken terwijl u Oppervlakken classificeren uitschakelt in het gedeelte Algoritme-instellingen .
    OPMERKING: Als u Object-Objectstatistieken inschakelt, kunt u de overlay-berekening van verschillende oppervlakken en spotfuncties mogelijk maken.
  8. Klik op de blauwe pijlknop in de rechterbenedenhoek van het werkblad Maken om verder te gaan met de volgende stappen.
  9. Bepaal het driedimensionale interessegebied met behulp van de manipulatoren die in de afbeeldingsweergave verschijnen.
  10. Ga verder met de volgende stap door het bronkanaal te kiezen (Autofluorescentiekanaal).
  11. Schakel Smooth in en kies de standaardinstelling van 11,8 μm.
  12. Ga verder met de volgende stap en bepaal de drempel die nodig is om een optisch bevredigend driedimensionaal oppervlak te creëren dat in de afbeeldingsweergave verschijnt.
  13. Pas in de laatste stap het oppervlaktefilter aan, kies Aantal voxels als filtertype en bepaal 10 als drempelwaarde.
  14. Maak een oppervlak door op de groene pijlknop in de rechterbenedenhoek van de sectie Maken te klikken. Door het kleurenblad te gebruiken, wijzigt u het materiaal en de kleur van het gemaakte oppervlak indien nodig.
  15. Genereer twee extra handmatig gemaakte oppervlakken voor AAR (CD31neg volume in het AlexaFluor 546 kanaal) en cardiale endotheliale letselvolume (CD31neg volume in het AlexaFluor 790 kanaal) door nogmaals 3D View en Surfaces te kiezen.
  16. Kies Alleen een interessegebied segmenteren, Ten slotte de hele afbeelding verwerken en Object-objectstatistieken terwijl u Oppervlakken classificeren uitschakelt in het gedeelte Algoritme-instellingen en klik op Automatisch maken overslaan, handmatig bewerken.
  17. Selecteer in het bordblad XY voor oriëntatie, Geen voor zichtbaarheid en stel de resolutiecontroller handmatig in op maximaal.
  18. Ga naar het werkblad Model , klik op het pictogram Afstand en stel de afstand tussen het hoekpunt in op 100 μm.
  19. Schakel CD31-negatiegebieden in het AlexaFluor 546-kanaal of het AlexaFluor 790-kanaal in om de 10 afbeeldingssegmenten tekenen en omcirkelen.
  20. Nadat u klaar bent met het omcirkelen van alle bijbehorende gebieden, kiest u Autofit en Autofit uitvoeren.
  21. Klik op Oppervlak maken en pas het materiaal en de kleur van de gegenereerde oppervlakken in het kleurblad aan.
  22. Om neutrofielen weer te geven als Ly6G+ -vlekken, genereert u een spotfunctie door 3D-weergave en Vlekken te kiezen.
  23. Selecteer Alleen een interessegebied segmenteren, Ten slotte de hele afbeelding verwerken en Object-objectstatistieken terwijl u Spots classificeren uitschakelt in de sectie Algoritme-instellingen .
  24. Ga verder met de volgende stappen met behulp van de blauwe pijlknop in de rechterbenedenhoek van het werkblad Maken .
  25. Bepaal het driedimensionale interessegebied met behulp van de manipulatoren die in de afbeeldingsweergave verschijnen, zoals hierboven vermeld.
  26. Ga verder met de volgende stap door het bronkanaal (AlexaFluor 647-kanaal) te gebruiken.
  27. Stel de geschatte XY-diameter in op 10 μm, schakel model-PSF-rek langs de Z-as in en stel de geschatte Z-diameter in op 20 μm.
  28. Schakel aftrekken op de achtergrond uit.
  29. Ga verder met de volgende stap, selecteer Intensiteit Min als filter en stel een geschikte drempel in.
    OPMERKING: Om het drempelniveau te schatten, klikt u op Slice in het bovenste gedeelte van het programmavenster en selecteert u het AlexaFluor 647-kanaal. Beweeg de cursor over verschillende plekken in het onbewerkte afbeeldingssegment dat een positieve Ly6G-kleuring vertegenwoordigt en lees de intensiteitswaarde af in de linkerbenedenhoek van het programmavenster.
  30. Genereer spots door op de groene pijlknop in de rechterbenedenhoek van het werkblad Maken te klikken.
  31. Stel de schaal van de straal in op 3,0 in de sectie Puntenstijl/kwaliteit van het werkblad Maken .
  32. Ga naar het kleurenblad om de steunkleur naar wens aan te passen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De gepresenteerde aanpak met behulp van light sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) maakt gelijktijdige analyse van AAR, endotheelbeschadiging en neutrofieleninfiltratie na repAMI mogelijk. Figuur 1A illustreert de intravitale en ex vivo antilichaamkleuring van C57BL/6J-muizen 24 uur na inductie van repAMI. Antilichamen voor kleuring van cardiaal endotheelletsel (anti-CD31 gelabeld met AlexaFluor 790) en neutrofieleninfiltratie (anti-Ly6G gelabeld m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn verschillende beeldvormende entiteiten om hartweefselbeschadiging te detecteren tijdens repAMI bij muizen. Deze technieken bieden verschillende voordelen, maar hebben ook beperkingen. Het kleuren van verminderde metabolische activiteit van hartcellen met behulp van TTC is de meest gebruikte methode voor het kwantificeren van cardiaal I/R-letsel en kan worden gecombineerd met de blauwe kleuring van Evan voor het onderscheid van AAR 13,14,15.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Elias Haj-Yehia rapporteert persoonlijke vergoedingen en andere van AstraZeneca, die buiten het ingediende werk vallen. Simon F. Merz en Lea Bornemann zijn momenteel in dienst van Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG. Matthias Totzeck en Tienush Rassaf rapporteren persoonlijke vergoedingen, en anderen van Edwards en Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo en Astra Zeneca, die buiten het ingediende werk vallen. Tienush Rassaf en Ulrike B. Hendgen-Cotta waren medeoprichters van Bimyo, een bedrijf dat zich richt op de ontwikkeling van cardioprotectieve peptiden. Matthias Günzer ontving algemene onderzoeksfinanciering van Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. Alle andere auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen de volgende financieringsbronnen: Duitse Onderzoeksstichting (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) en Duitse Hartvereniging (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Een deel van dit werk werd uitgevoerd in het Imaging Center Essen (IMCES), een Service Core Facility van de Faculteit der Geneeskunde van de Universiteit Duisburg-Essen, Duitsland. We danken de IMCES-medewerkers voor hun voortdurende technische ondersteuning en het gebruik van hun instrumenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
27 G naaldBecton Dickinson305889BD Eclipse
3D-beeldverwerking & analysesoftwareBitplaneVers. 10.1.0Imaris
5-0 hechtdraadSerag-WiessnerIC108000Zijde
6-0 hechtdraadEthiconEH7814Prolene
AlexaFluor 546 antilichaamlabelingkitInvitrogenA20183
AlexaFluor 790 antilichaamlabelingkitInvitrogenA20189
Anti-muis Ly6G-antilichaam (AlexaFluor 647)Biolegend127610Clone: 1A8
Celzeef (100 μm)Corning431752
Dimethylsulfoxide (DMSO)Carl Roth7029.1
EthanolCarl Roth0911.4
Ethyl cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich112372
BestandsconversiesoftwareBitplaneVers. 10.1.0Imaris
GaasFuhrmann10021
Gellan gom poederSigma-AldrichP8169Phytagel
Heparine (25.000 IE/5 mL)LEO Pharma15261203
Waterstofperoxide (H2O2, 30%)Carl Roth8070.2
InjectiespuitB Braun9161502SOmnican F
Ketamine (100 mg/mL)bela-pharma402581.00.00
LichtbladmicroscoopsysteemMiltenyi Biotec-UltraMicroscope Blaze
Luer lock spuitBecton Dickinson303172BD Plastipak
MagneetroerdVWR444-0572
Neo sCMOS-camera (4,2 MP)Andor TechnologyZL41 Cell 4.2
ObjectiefMiltenyi Biotec130-133-625MI Plan 1,1x NA 0,1, WD 17,6 mm
Paraformaldehyde (PFA, 4%)Sigma-Aldrich1.0049610% formaline, neutraal gebufferd
PetrischaalGreiner Bio-One632181
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Gibco14190-094Zonder MgCl2/CaCl2
Polypropyleen buis (15 mL)Greiner Bio-One188261
Polypropyleen buis (5 mL)Carl RothEKY9.1Zwart
Polypropyleen buis (50 mL)Greiner Bio-One227261
Voorbereidingsschaal voor muishartcanuleringsHugo Sachs Elektronik73-4327Canule inbegrepen
Gezuiverde anti-muis CD31-antilichaamBecton Dickinson53369Clone: MEC13.3
RollerpompIsmatecISM597-230
AfdichtingsfolieBemisPM-996Parafilm
StereomicroscoopLeicaS6D
BuisrotatorHeidolphPolymax 1040
Witte lichtlaserNKT photonicsSuperK extreme200 mW, 480–2400 nm
WT-muisstamJanvier Labs-C57BL/6JRj
Xylazin (2%)Ceva Tiergesundheit6324464.00.00

Referenties

  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
  2. Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol. 30 (3), 240-245 (2015).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction: from inflammation to fibrosis. Circ Res. 119 (1), 91-112 (2016).
  4. Koch, A., et al. Capillary endothelia and cardiomyocytes differ in vulnerability to ischemia/reperfusion during clinical heart transplantation. Eur J Cardiothorac Surg. 20 (5), 996-1001 (2001).
  5. Singhal, A. K., Symons, J. D., Boudina, S., Jaishy, B., Shiu, Y. T. Role of endothelial cells in myocardial ischemia-reperfusion injury. Vasc Dis Prev. 7, 1-14 (2010).
  6. Robbers, L. F., et al. Magnetic resonance imaging-defined areas of microvascular obstruction after acute myocardial infarction represent microvascular destruction and haemorrhage. Eur Heart J. 34 (30), 2346-2353 (2013).
  7. DeLisser, H. M., Newman, P. J., Albelda, S. M. Molecular and functional aspects of PECAM-1/CD31. Immunol Today. 15 (10), 490-495 (1994).
  8. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10 (1), 2312(2019).
  9. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  10. Zhong, X., et al. Tubular epithelial cells-derived small extracellular vesicle-VEGF-A promotes peritubular capillary repair in ischemic kidney injury. NPJ Regen Med. 7 (1), 73(2022).
  11. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).
  12. Arai, A. E. Magnetic resonance imaging for area at risk, myocardial infarction, and myocardial salvage. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 313-320 (2011).
  13. Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Res Cardiol. 113 (5), 39(2018).
  14. Rassaf, T., et al. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circ Res. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  15. Haj-Yehia, E., et al. CD47 blockade enhances phagocytosis of cardiac cell debris by neutrophils. IJC Heart Vasculature. 48, 101269(2023).
  16. Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., French, B. A., Rassaf, T. A practical approach to remote ischemic preconditioning and ischemic preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury. J Biol Methods. 3 (4), e57(2016).
  17. Michel, L., et al. Real-time pressure-volume analysis of acute myocardial infarction in mice. J Vis Exp. (137), e57621(2018).
  18. Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2435-H2443 (2008).
  19. Clasen, L., et al. Cardiac ischemia and reperfusion in mice: a comprehensive hemodynamic, electrocardiographic and electrophysiological characterization. Sci Rep. 13 (1), 5693(2023).
  20. Lang, C. I., et al. Expedient assessment of post-infarct remodeling by native cardiac magnetic resonance imaging in mice. Sci Rep. 11 (1), 11625(2021).
  21. Coolen, B. F., et al. Three-dimensional T1 mapping of the mouse heart using variable flip angle steady-state MR imaging. NMR Biomed. 24 (2), 154-162 (2011).
  22. Zhong, X., et al. Comprehensive cardiovascular magnetic resonance of myocardial mechanics in mice using three-dimensional cine DENSE. J Cardiovasc Magn Reson. 13 (1), 83(2011).
  23. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  25. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nat Commun. 10 (1), 1944(2019).
  26. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy. J Vis Exp. (123), e55450(2017).
  27. Taki, J., et al. 14C-Methionine uptake as a potential marker of inflammatory processes after myocardial ischemia and reperfusion. J Nucl Med. 54 (3), 431-436 (2013).
  28. Michel, L., et al. PD1 deficiency modifies cardiac immunity during baseline conditions and in reperfused acute myocardial infarction. Int J Mol Sci. 23 (14), 7533(2022).
  29. Park, K. C., Gaze, D. C., Collinson, P. O., Marber, M. S. Cardiac troponins: from myocardial infarction to chronic disease. Cardiovasc Res. 113 (14), 1708-1718 (2017).
  30. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Curr Protoc Neurosci. 81 (2), 28.21-28.28 (2017).
  31. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using light sheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  32. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nat Protoc. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  33. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  34. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  35. Merz, S. F., et al. High-resolution three-dimensional imaging for precise staging in melanoma. Eur J Cancer. 159, 182-193 (2021).
  36. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Front Immunol. 11, 599495(2020).
  37. Pichardo, A. H., et al. Optical tissue clearing to study the intra-pulmonary biodistribution of intravenously delivered mesenchymal stromal cells and their interactions with host lung cells. Int J Mol Sci. 23 (22), 14171(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Light sheetmicroscopieanalyse van hartschadeimmuunrespons hartmyocardinfarct 3Dweefselclearingneutrofieleninfiltratierisicogebiedantilichaamskleuringendotheelschade3D beeldvorming van het hart

Gerelateerde artikelen