Methodenartikel

Geoptimaliseerd muismodel om colitis-geassocieerde darmkanker te induceren met behulp van azoxymethaan en dextraansulfaatnatrium voor tumorimmunologie en therapiestudies

DOI:

10.3791/68351

⸱

25 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Azoxymethaan (AOM)/dextraansulfaatnatrium (DSS)-geïnduceerde colitis-geassocieerde darmkanker is een gevestigde en kosteneffectieve benadering voor het modelleren van autochtone tumoren van de dikke darm bij muizen. We presenteren een bijgewerkt protocol en bespreken kritische overwegingen voor geslachtsspecifieke DSS-dosisoptimalisatie en de bijdrage van het microbioom aan nauwkeurigheid, robuustheid en reproduceerbaarheid.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Azoxymethaan (AOM, een DNA-beschadigend middel) en dextraansulfaatnatrium (DSS, een colitisbevorderend middel) kunnen tumoren in de dikke darm van muizen met hoge penetrantie veroorzaken. Het door AOM/DSS geïnduceerde model voor colitis geassocieerde darmkanker (CAC) is een gouden standaard bij het onderzoeken van ontstekingsgerelateerde darmkanker, gezien de nauwkeurigheid ervan bij het recapituleren van klinische kenmerken van menselijke CAC. De voordelen van het model zijn onder meer de oorsprong en ontwikkeling uit endogeen weefsel, immuuncompetentie met behoud van een volledig repertoire van tumor-immuuninteracties, aanpassingsvermogen aan talrijke muizenstammen, gemak van een latentie van 3 maanden en relatief lage kosten. Ondanks deze voordelen beperken verschillende uitdagingen de effectiviteit van het protocol. Variabiliteit in DSS-dosering en in tumorpenetrantie tussen onderzoeken leidt tot inconsistente waarnemingen. Bovendien dragen variaties in de darmmicrobiota bij aan een verhoogde experimentele variabiliteit, wat een negatieve invloed heeft op de statistische kracht. Sekseverschillen als reactie op AOM/DSS bemoeilijken de interpretatie van de resultaten verder. Bovendien belemmert de variabiliteit van partij tot partij van DSS de reproduceerbaarheid van bevindingen. Het aanpakken van deze uitdagingen is cruciaal voor het verbeteren van de betrouwbaarheid en toepasbaarheid van dit model in preklinisch onderzoek. Om dit op te lossen, hebben we, met behulp van C57BL/6J-muizen als model, het vastgestelde protocol verfijnd met strategieën voor effectieve optimalisatie om de reproduceerbaarheid en harmonisatie tussen onderzoeken te verbeteren. Deze omvatten aanbevelingen voor DSS-dosistitratie bij zowel mannelijke als vrouwelijke muizen, implementatie van homogenisatie van de microbiota voorafgaand aan elke DSS-cyclus om de heterogeniteit van de darmflora van kooi tot kooi te verminderen. Deze stappen verminderden de variabiliteit aanzienlijk en verbeterden de reproduceerbaarheid, wat resulteerde in een robuuste inductie van CAC. Het protocol erkent de cruciale rol van ontsteking en cellulaire immuunmechanismen bij de ontwikkeling van CAC en beschrijft ook weefselverwerkingsprocedures die geschikt zijn voor isolatie van RNA of eiwit en voor het profileren van inflammatoire cytokines uit darmtumoren en omringend darmweefsel. Uiteindelijk zorgt het gebruik van deze methode voor een rigoureuzere, robuustere en reproduceerbare CAC-productie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Colorectale kanker (CRC) is wereldwijd de derde meest voorkomende vorm van kanker en een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen 1,2. In vergelijking met sporadisch CRC ontstaat colitis-geassocieerde colorectale kanker (CAC) als gevolg van langdurige, herhaalde darmbeschadiging bij patiënten met inflammatoire darmaandoeningen (IBD)3,4, wordt gekenmerkt door een hogere maligne graad en een neiging tot multifocale presentatie op jongere leeftijd. Vanwege deze factoren vereist CAC over het algemeen een agressievere behandeling met minder gunstige klinische resultaten5. Hoewel CAC wordt beschouwd als een afzonderlijke entiteit, ten minste gedeeltelijk vanwege de unieke timing van het verwerven van mutaties en een buitensporige rol van de inflammatoire immuunmechanismen en het microbioom, delen CAC en sporadisch CRC veel overeenkomsten met betrekking tot algemene genomische landschappen en pathogenetische kenmerken. Om ons begrip van CRC in het algemeen en CAC in het bijzonder te vergroten en om therapeutische strategieën te verbeteren, zijn robuuste preklinische modellen essentieel.

Van de verschillende modellen die worden gebruikt om CRC te bestuderen, wordt het AOM/DSS-geïnduceerde CAC-model het meest gebruikt en wordt het beschouwd als de huidige gouden standaard 6,7. Dit model, dat is geïnitieerd met een sterke mutagene belediging door AOM, is gebaseerd op herhaalde DSS-geïnduceerde aanvallen van colitis die nauw lijken op menselijke IBD, zoals de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, die gevestigde risicofactoren zijn voor CAC8. Het AOM/DSS-model biedt een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van andere in vivo benaderingen. In tegenstelling tot methoden die gebaseerd zijn op de injectie van exogeen kankerinitiërend materiaal om flank- of zelfs orthotope tumoren vast te stellen, is AOM/DSS-geïnduceerde CAC autochtoon, wat betekent dat tumorinitiatie endogeen plaatsvindt en kankerprogressie zich ontvouwt in de micro-omgeving van het natuurlijke weefsel, die de biologie en natuurlijke historie beter weerspiegelt. In tegenstelling tot xenotransplantaten van menselijke cellijnen of van van patiënten afgeleid materiaal dat alleen kan worden gekweekt in immuungecompromitteerde muizen, is het immunocompetent, waardoor het onderzoek naar kanker-immuuninteracties mogelijk is. In tegenstelling tot genetisch gemanipuleerde modellen die tumoren produceren met specifieke genetische drivers, is het agnostisch voor vooraf gedefinieerde mutaties, waardoor een bredere modellering van kankersignaleringsroutes en immuuneducatiemechanismen mogelijk is. Ten slotte kan het AOM/DSS-model gemakkelijk worden aangepast aan veel verschillende muizenstammen, waardoor langdurige fokschema's niet meer nodig zijn, waardoor het zowel tijd- als kosteneffectief is. Factoren zoals het geslacht van dieren, de DSS-dosering en verschillen in de darmmicrobiota kunnen echter variabiliteit introduceren, waardoor de reproduceerbaarheid wordt beïnvloed en de toepassing ervan in translationeel onderzoek wordt bemoeilijkt.

We wilden dit protocol verfijnen om de impact van deze factoren te verzachten die ten grondslag liggen aan inconsistenties in de mate van darmontsteking en CAC-tumorigenese. Er is een aanzienlijke variabiliteit in de concentraties van DSS die worden gebruikt om acute ontsteking, colitis of chronische ontsteking te induceren, en CAC 9,10. DSS is een polymeer en het gemiddelde molecuulgewicht kan variëren tussen partijen en fabrikanten, wat de variabiliteit in experimentele resultaten beïnvloedt. Daarom is het essentieel om elke batch DSS te testen om consistentie in alle onderzoeken te garanderen. Bovendien wordt de mate van door DSS geïnduceerde ontsteking sterk beïnvloed door het darmmicrobioom, dat aanzienlijk kan verschillen tussen muizenfaciliteiten over de hele wereld, en zelfs tussen verschillende houderslocaties en kolonies binnen dezelfde instelling 11,12. Deze variabiliteit in microbiële samenstelling kan de resultaten van het model beïnvloeden en bijdragen aan inconsistente resultaten13. Co-housing van dieren uit de verschillende experimentele groepen, waar mogelijk, is van cruciaal belang om de variabiliteit te verminderen, maar is mogelijk niet voldoende om deze verstorende factor aan te pakken, aangezien de microbiële gemeenschappen in de loop van de tijd stochastische drift ondergaan en leiden tot kooi-effecten in chronische ontstekingsmodellen14. Aangezien het AOM/DSS-protocol langdurige behandeling omvat om chronische ontsteking in stand te houden, hebben we microbiota-homogenisatie geïmplementeerd door periodiek het strooisel te mengen van alle kooien waarin AOM/DSS-behandelde dieren zijn gehuisvest. Deze praktijk helpt de microbiota-omgeving te homogeniseren, wat resulteert in verminderde experimentele variabiliteit. Bovendien geven observaties aan dat de effecten van DSS kunnen variëren op basis van het geslacht van het dier15,16, wat mogelijk kan leiden tot differentiële reacties in ontsteking en ontwikkeling van kanker. We hebben het bestaande protocol verfijnd door DSS in vrouwelijke en mannelijke muizen afzonderlijk te titreren om een geschikte dosering DSS voor beide geslachten te kiezen, wat zorgt voor meer uniforme resultaten en kritische input levert voor statistische powerberekeningen om optimale steekproefgroottes te bepalen bij zowel mannelijke als vrouwelijke muizen.

Om de reproduceerbaarheid van het AOM/DSS-model te verbeteren, schetsen we in het algemeen een gestandaardiseerde set protocolrichtlijnen die deze verstorende factoren verklaren en verminderen. We maken gebruik van microbioomhomogenisatietechnieken en beschrijven nauwkeurige DSS-doseringsaanpassing om consistentere en reproduceerbare resultaten te bereiken, waardoor de bruikbaarheid van het AOM/DSS-model en de harmonisatie in verschillende onderzoeken worden verbeterd. Ons protocol onderscheidt zich door het aantonen van verminderde variabiliteit van microbiota-gehomogeniseerde kooien en biedt duidelijke, stapsgewijze instructies voor het implementeren van deze reproduceerbaarheidspraktijken. Als gevolg hiervan leidt de lagere variabiliteit binnen de groep die door deze protocolverfijningen wordt bewerkstelligd, tot een vermindering van de steekproefomvang die nodig is om de gewenste statistische power te bereiken bij het detecteren van verschillen tussen experimentele groepen. Dit geoptimaliseerde protocol is op maat gemaakt voor onderzoekers die het AOM/DSS-model willen aanpassen aan hun eigen muismodellen en experimentele ontwerpen, ongeacht de stam of geslachtsachtergrond, voor het bestuderen van tumorigenesemechanismen, therapeutische doelen of het onderzoeken van de dynamiek van immuuncellen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met een institutioneel goedgekeurd protocol om een humane behandeling en naleving van ethische normen te garanderen. De hier beschreven studies zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Florida.

1. Optimalisatie van DSS-dosering

  1. Zorg voor muizen van de leeftijd, stam en bron die in het hoofdexperiment moeten worden gebruikt, met een gelijke verdeling van mannetjes en vrouwtjes. Label elke muis met oorpons, staartmarkering of een andere goedgekeurde methode voor individuele tracking. Meet en registreer het initiële lichaamsgewicht van elk dier.
    OPMERKING: Mannelijke muizen moeten vóór het spenen samen worden gehuisvest en mogen niet worden herverdeeld over kooien om gevechten tot een minimum te beperken.
  2. Als er automatisch drenkwater wordt gegeven, schakel dan een week voor het begin van een experiment over op waterflessen en blokkeer tegelijkertijd de sproeiers van de kooi (metalen drinkbuisjes in de kooi) met steriele pluggen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat eventuele wijzigingen in de watertoevoer, zoals verstopte geautomatiseerde drinkwatersproeiers, zijn goedgekeurd door IACUC of de bevoegde regelgevende instantie die toezicht houdt op humaan gebruik van dieren. Dierenkooien kunnen dagelijkse controles vereisen om een ononderbroken toegang tot drinkwater te garanderen.
  3. Bereid de DSS-oplossing voor door DSS op te lossen in geautoclaveerd steriel drinkwater in verschillende concentraties van 1,5% tot 5% (w/v), met behulp van een magnetische roerstaaf en een roerplaat. Wacht 30 minuten bij kamertemperatuur totdat het DSS-poeder volledig is opgelost in water. Bereid het DSS-water elke week vers en bewaar het maximaal een week bij 4 °C.
  4. Vul twee conische buisjes van 50 ml met DSS-water in elke concentratie (één voor mannen, één voor vrouwen) en bevestig een geautoclaveerd steriel drinkmondstuk stevig om lekkage te voorkomen.
  5. Dien DSS-water in elke concentratie toe aan vrouwelijke en mannelijke muizen, waarbij 3 muizen in elke kooi dezelfde concentratie krijgen. Gebruik steriel drinkwater zonder DSS als negatieve controle. Vervang DSS-water om de dag.
  6. DSS-water gedurende 7 dagen toedienen. Noteer dagelijks het lichaamsgewicht van elke muis.
  7. Schakel op dag 8 alle dieren weer over op normaal drinkwater.
  8. Beoordeel op dag 8 de ernst van diarree op basis van de consistentie van de ontlasting met behulp van een gestandaardiseerd scoresysteem zoals beschreven17 en noteer scores. Scoor "1" als zachte maar nog gevormde ontlastingskorrel, "2" als zeer zachte ontlastingskorrel en "3" als diarree.
  9. Verzamel op dag 8 2-3 verse ontlastingskorrels en evalueer op de aanwezigheid van occult bloed (zie Materiaaltabel). Noteer de aan- of afwezigheid van bloed in het monster.
  10. Evalueer op darmbloedingen op basis van een combinatie van twee scorecriteria, consistentie van de ontlasting (0-3) en aanwezigheid van bloed in de ontlasting (0-3), voor een totaalscore variërend van 0 tot 6.
  11. Registreer van dag 9 tot dag 12 dagelijks het lichaamsgewicht van elke muis en houd de met DSS behandelde dieren nauwlettend in de gaten voor aanzienlijk gewichtsverlies en ernstige diarree. Dieren die humane eindpunten bereiken of overschrijden onmiddellijk euthanaseren door verstikking door kooldioxide (CO2) of een andere geschikte methode volgens het goedgekeurde protocol voor het gebruik van dieren en de vastgestelde ethische richtlijnen.
  12. Ga van dag 13 tot dag 18 door met het monitoren van dieren en registreer dagelijks het lichaamsgewicht van elke muis totdat deze volledig hersteld is tot het niveau van vóór het experiment.
  13. Bepaal de optimale DSS-concentratie, die resulteert in ca. 20% gewichtsverlies vergezeld van zachte maar nog gevormde ontlasting. De optimale DSS-dosis kan variëren tussen mannetjes en vrouwtjes, muizenstammen, leeftijden, DSS-partijen en dierfaciliteiten.

2. CAC-inductie

  1. Dag 0-6: AOM-behandeling Dag 7-28: 1e cyclus van DSS-behandeling
    1. AOM-bouillonbereiding: Los AOM-poeder op in steriele zoutoplossing om een voorraadconcentratie van 10 mg/ml te bereiken. Filtreer de oplossing door een filter van 0,45 μm, verdeel 1 ml aliquots in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en bewaar deze maximaal een jaar bij -80 °C.
      OPMERKING: AOM is een vluchtige kankerverwekkende stof en moet met voorzichtigheid worden behandeld onder een bioveiligheidskap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), volgens de veiligheidsaanbevelingen van de fabrikant. AOM en alle met AOM verontreinigde materialen moeten worden verwijderd in overeenstemming met de protocollen voor de verwijdering van gevaarlijk chemisch afval van de instelling. Het is de verantwoordelijkheid van de onderzoeker om van tevoren de nodige goedkeuringen voor milieu, gezondheid en veiligheid te verkrijgen.
    2. Als u geautomatiseerde kooiwatergift gebruikt, blokkeert u 1 week voorafgaand aan de start van het experiment het geautomatiseerde drinkwatermondstuk en schakelt u de dieren over op waterflessen om te acclimatiseren, zoals in stap 1.2.
    3. Weeg en registreer op dag 0 het lichaamsgewicht van elke muis om de totale vereiste hoeveelheid AAM te berekenen. Bereken vervolgens het totale volume AOM (1 mg/ml uiteindelijke werkconcentratie) op basis van het gewicht van elk dier om een dosis van 10 mg/kg te bereiken, bijv. 200 μl voor een muis van 20 g.
    4. Ontdooi het vereiste aantal nieuwe aliquots van 10 mg/ml AOM op ijs voor elk gebruik. Verdun elke 1 ml aliquoot AOM met 9 ml steriele zoutoplossing om een werkconcentratie van 1 mg/ml te bereiken.
    5. Dien AOM toe aan muizen via intraperitoneale injectie. Voer deze procedure uit in een bioveiligheidskast terwijl u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, zoals dubbele handschoenen en een N95-masker voor optimale bescherming.
      LET OP: Gooi alle overgebleven AOM-oplossing weg in overeenstemming met de vereisten voor de verwijdering van gevaarlijk chemisch afval.
    6. Breng op dag 3 met OM behandelde dieren over in schone kooien. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van met AOM verontreinigde kooien en andere materialen ter bescherming.
      LET OP: Gooi vuil kooistrooisel en eventueel achtergebleven voedsel weg volgens de door de instelling goedgekeurde procedures voor de verwijdering van gevaarlijk chemisch afval.
      OPMERKING: AOM en zijn metabolieten worden 72 uur na toediening18 uur volledig uitgescheiden, waarna vuil kooistrooisel kan worden weggegooid.
    7. Voer op dag 7 homogenisatie van de darmmicrobiota uit om de variabiliteit tussen kooien te minimaliseren. Om dit te doen, bemonstert u 25% van het strooisel uit elke kooi, mengt u grondig en verdeelt u het opnieuw over elke kooi.
      OPMERKING: Verwissel geen kooien tijdens de week van de DSS-behandeling en gedurende vijf dagen daarna. Coördineer indien nodig met de wisseldienst voor veehouderijkooien van de faciliteit.
    8. Start de inductie van colitis door DSS in drinkwater toe te dienen met behulp van conische buizen van 50 ml die zijn uitgerust met geschikte sproeiers. Controleer muizen dagelijks om te bevestigen dat dieren onbeperkte toegang hebben tot DSS-water. Vervang DSS-water om de dag. Noteer dagelijks het lichaamsgewicht van elke muis.
    9. Vervang op dag 14 DSS-water door normale drinkwaterflessen. Blijf dieren nauwlettend in de gaten houden op pijn en angst.
    10. Weeg op dag 14-19 elke muis dagelijks. Euthanasie van dieren die meer dan 25% van hun lichaamsgewicht verliezen, of als een dier een van de humane eindpunten bereikt die worden beschreven in het goedgekeurde protocol voor dierenverzorging en -gebruik. Controleer bovendien op gevallen van rectale bloedingen en registreer deze.
  2. Dag 7-28: 1e cyclus van DSS-behandeling
    1. Voer op dag 7 homogenisatie van de darmmicrobiota uit om de variabiliteit tussen kooien te minimaliseren. Om dit te doen, bemonstert u 25% van het strooisel uit elke kooi, mengt u grondig en verdeelt u het opnieuw over elke kooi.
      OPMERKING: Verwissel geen kooien tijdens de week van de DSS-behandeling en gedurende vijf dagen daarna. Coördineer indien nodig met de wisseldienst voor veehouderijkooien van de faciliteit.
    2. Start de inductie van colitis door DSS in drinkwater toe te dienen met behulp van conische buizen van 50 ml die zijn uitgerust met geschikte sproeiers. Controleer muizen dagelijks om te bevestigen dat dieren onbeperkte toegang hebben tot DSS-water. Vervang DSS-water om de dag. Noteer dagelijks het lichaamsgewicht van elke muis.
    3. Vervang op dag 14 DSS-water door normale drinkwaterflessen. Blijf dieren nauwlettend in de gaten houden op pijn en angst.
    4. Weeg op dag 14-19 elke muis dagelijks. Euthanasie van dieren die meer dan 25% van hun lichaamsgewicht verliezen, of als een dier een van de humane eindpunten bereikt die worden beschreven in het goedgekeurde protocol voor dierenverzorging en -gebruik. Controleer bovendien op gevallen van rectale bloedingen en registreer deze.
  3. Dag 29-49: 2e cyclus van DSS-behandeling
    1. Herhaal de homogenisatie van de microbiota samen met DSS-toediening, volgens dezelfde procedures als in de stappen 2.2.1-2.2.4. Optioneel: Voer na de tweede en/of derde DSS-cyclus colonoscopie uit zoals eerder beschreven19.
  4. Dag 50-70:3e cyclus van DSS-behandeling
    1. Herhaal de homogenisatie van de microbiota samen met DSS-toediening, volgens dezelfde procedures als in de stappen 2.2.1-2.2.4. Aangezien muizen de neiging hebben om drie dagen na de derde cyclus van DSS het meeste gewicht te verliezen, moeten alle dieren nauwlettend worden gecontroleerd op overmatig gewichtsverlies of op tekenen van rectale bloedingen tijdens deze periode en indien geïndiceerd vochtig voer geven voor ondersteunende zorg.

3. Beoordeling van de ernst van colitis en CAC-grove pathologie

  1. Verzamel op dag 70 2-3 verse fecale pellets van elke muis om te testen op de aanwezigheid van occult bloed en/of ontstekingsmarkers zoals lipocaline-220 om de ernst van colitis te beoordelen. Gebruik geschikte reagentia/kits (zie lijst met materialen en apparatuur) en volg de instructies van de fabrikant om de tests uit te voeren, die hieronder kort worden beschreven.
  2. Om fecale monsters voor te bereiden op de beoordeling van de niveaus van ontstekingsmarker lipocaline-2, plaatst u verse ontlastingspellets in een microcentrifugebuis van 1.5 ml. Los pellets op in 1 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een vortexmixer totdat een uniforme oplossing is bereikt. Centrifugeer de oplossing bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Het bovenstaande kan onmiddellijk worden gebruikt voor lipocaline-2 ELISA of worden bewaard bij -80 °C voor later gebruik.
  3. Voer de muis lipocaline-2 ELISA uit volgens de instructies van de fabrikant van de kit. Voer proefexperimenten uit met seriële verdunning om de optimale verdunning van fecale monsters ten opzichte van de normen te bepalen.
    OPMERKING: Lipocaline-2-spiegels zullen naar verwachting minstens 1000 keer toenemen bij met DSS behandelde muizen in vergelijking met met water behandelde controledieren20.
  4. Beoordeel de ernst van colitis met behulp van een scoresysteemvoor diarree 17 zoals beschreven in de stappen 1.8-1.10.
  5. Euthanasie dieren op dag 70 door CO2 -verstikking of met behulp van een andere goedgekeurde humane methode.
  6. Spuit de buikstreek van elk dier in met 70% ethanol om besmetting tijdens de volgende stappen te minimaliseren.
  7. Gebruik een fijne chirurgische tang om de huid en de peritoneale laag te liften. Maak een horizontale incisie met een schaar om de buikholte bloot te leggen.
  8. Trek de dunne darm naar buiten en identificeer de blindedarm. Til de blindedarm en dikke darm voorzichtig op met een tang. Ontleed de dikke darm zorgvuldig door het mesenterium en het bijbehorende vaatstelsel met een schaar door te knippen en vermijd doorboren of doorsnijden van de dikke darm.
  9. Snijd het bekkenbeen en de huid rond het rectaal-anale gebied door om de volledige distale dikke darm bloot te leggen. Het is belangrijk om de hele dikke darm te ontleden met het distale deel intact, aangezien de meeste tumoren meestal in dit gebied voorkomen.
  10. Plaats de ontlede dikke darm op een schone strook filtreerpapier en trek deze voorzichtig recht.
  11. Meet de lengte van de dikke darm met een liniaal en documenteer deze met een foto. Voeg de liniaal toe aan de foto voor schaal.
  12. Maak de pleisters van Peyer aan de buitenkant van de dikke darm schoon en zorg ervoor dat u het weefsel niet doorboort.
  13. Spoel de dikke darm in koude, steriele PBS.
  14. Bevestig een micropipetpunt van 200 μl (zonder filter) op een spuit van 3 ml met behulp van paraffinefilm. Gebruik deze opstelling om de spuit te vullen met steriel PBS, steek de pipetpunt in het lumen van de dikke darm en spoel de inhoud van de dikke darm 2-3 keer voorzichtig door, zodat de ontlastingskorrels volledig worden verwijderd.
  15. Rek de dikke darm voorzichtig uit op een schone, vooraf bevochtigde strook filtreerpapier. Snijd de dikke darm in de lengterichting open en leg deze plat op het filtreerpapier.
  16. Identificeer grotere tumoren, die zich meestal presenteren als prominente blebs die uit de darmwand steken met een ontstoken, rood uiterlijk.
  17. Wees voor kleinere tumoren extra voorzichtig tijdens de identificatie. Gebruik een steriele bacteriële zaailus om het oppervlak van de dikke darm voorzichtig te onderzoeken op onregelmatigheden of onregelmatigheden. Controleer of de gedetecteerde bultjes geen restanten zijn van lymfeklieren of bloedvaten die zich aan de buitenkant van de dikke darm bevinden.
  18. Gebruik digitale schuifmaten om de breedte en lengte van elke tumor te meten.
  19. Noteer het aantal tumoren en de grootte en locatie van elke tumor op een voorgedrukte dubbele puntkaart.

4. Histologie beoordeling

  1. Gebruik twee tangen met fijne punt om beide laterale uiteinden van de distale dikke darm vast te pakken. Rol de dikke darm van het distale uiteinde naar het proximale uiteinde in een Zwitserse rolvorm zoals elders beschreven21. Zorg ervoor dat het distale uiteinde zich in het midden van de rol bevindt en dat het proximale uiteinde de buitenste laag vormt.
  2. Zet elke Zwitsers gewalste dikke darm vast met een naald van 271/2-G.
  3. Plaats elke vastgezette Zwitsers gewalste dikke darm in een op de juiste manier geëtiketteerde tissuecassette.
  4. Dompel de weefselcassettes met zwitsers gerolde dikke darm onder in 4% paraformaldehyde (PFA) in steriel PBS. Laat de tissues 24 uur in het fixatief blijven.
  5. Breng de tissues na 24 uur over in 70% ethanol. De tissues kunnen tot drie maanden worden bewaard in 70% ethanol bij 4 °C.
  6. De Swiss-roll kan worden gebruikt voor meerdere histopathologische onderzoeken, waaronder conventionele hematoxyline- en eosine (H&E) kleuring, immunohistochemie en immunofluorescentie.

5. Weefseloogst voor eiwit- en RNA-isolatie uit tumoren en de omliggende dikke darm

  1. Werk op ijs en gebruik voorgekoelde buizen en reagentia om de integriteit van het biologische materiaal te behouden.
  2. Ontleed na tumorbeoordeling tumoren en verzamel ze in voorgekoelde, vooraf gelabelde buisjes met de juiste buffer (zie hieronder) op ijs. Afhankelijk van het experimentele ontwerp, voeg je alle tumoren van hetzelfde dier samen of verwerk je ze afzonderlijk. Verzamel desgewenst op dezelfde manier ~ 1 cm stukjes omringend niet-tumor colonweefsel.
  3. Eiwit isolatie
    1. Voeg 0,5 ml 800 μm slijpglasparels en 400 μl lysisbuffer (1% NP-40 in 150 mM NaCl met 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1% protease- en fosfataseremmercocktail toe aan elke weefselhomogenisatiebuis en breng het dikke darm-/tumorweefsel over in elke buis.
    2. Homogeniseer colon-/tumorweefsel met behulp van een weefselhomogenisator op basis van kralen bij 6 M/S gedurende 30 s, herhaal twee keer voor volledige homogenisatie.
      NOTITIE: Plaats de buizen tussen de cycli door op ijs om oververhitting van het monster door mechanische homogenisatie te voorkomen.
    3. Zuig na homogenisatie 150 μl van het lysaat (supernatant) op en breng het over naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    4. Draai het lysaat bij 10.000 g bij 4 °C om onoplosbaar materiaal te pelleteren. Breng het bovenstaande desgewenst over in een schone buis.
    5. Kwantificeer de totale eiwitconcentratie met behulp van bicinchoninezuur (BCA)-assay of een andere geschikte methode.
    6. Pas desgewenst de totale eiwitconcentratie aan op 4 mg/ml voor elk monster met dezelfde lysisbuffer.
    7. Gebruik eiwitlysaten onmiddellijk voor stroomafwaartse tests zoals immunoblotting of cytokineanalyse, of bewaar bij -80 °C voor later gebruik.
  4. RNA-zuivering:
    1. Plaats na dissectie de dikke darm/tumoren in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en dompel ze onder in 200 μl geschikt RNA-conserveringsreagens.
      OPMERKING: Pauzepunt: vers colon-/tumorweefsel kan snel worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden bewaard bij -80°C voor latere verwerking
    2. Dooi colon/tumorweefsel op ijs.
    3. Breng de dikke darm/tumor over in een weefselhomogenisatiebuis met 500 μL geschikte lysisbuffer die geschikt is voor RNA-isolatie en 200 μL slijpglasparels.
    4. Homogeniseer met behulp van een weefselhomogenisator op basis van kralen bij 6 M/S gedurende 30 s driemaal, met een pauze van twee minuten tussen elke cyclus.
      OPMERKING: Breng de buis tussen de cycli door op ijs om te voorkomen dat RNA-afbraak oververhit raakt tijdens mechanische homogenisatie.
    5. Breng 300 μL lysaat over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    6. Isoleer het totale RNA indien nodig met behulp van de juiste RNA-zuiveringsprocedure. Meet de RNA-concentratie, zuiverheid en kwaliteit/integriteit, indien van toepassing voor downstreamgebruik.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben DSS-dosisoptimalisatie uitgevoerd voor onze experimentele omstandigheden. DSS-dosering moet opnieuw worden gekalibreerd voor elke dierfaciliteit, muizenstam, onderzoeksopzet en DSS-partij. Voor deze studie werden C57BL/6J-muizen gehuisvest in een specifiek pathogeenvrij vivarium in geventileerde kooien met ad libitum standaard bestraald 18% eiwit knaagdierdieet. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen beginnen af te vallen vanaf dag 5 nadat ze op DSS-water zijn geplaatst, en bereiken hun laagste gewicht drie dagen na DSS-ontwenning (Figuur 1A,C). Op de dag van het grootste gewichtsverlies vertoonden mannelijke muizen ongeveer 15% gewichtsverlies, terwijl vrouwelijke muizen ongeveer 20% gewichtsverlies vertoonden (Figuur 1B,D). Op basis van deze resultaten hebben we vastgesteld dat de optimale dosis voor onze specifieke experimentele omstandigheden 3,0% was voor vrouwen en 3,25% voor mannen. Het behandelingsschema voor AOM/DSS wordt geschetst in figuur 2A, waarbij microbioomhomogenisatie plaatsvindt aan het begin van elke DSS-behandelingscyclus totdat het experiment is afgerond om kooieffecten en variabiliteit te verminderen. De typische dynamiek van gewichtsverlies en herstel bij dieren gedurende de gehele duur van het experiment wordt weergegeven in figuur 2B. De dieren herstellen volledig naar het oorspronkelijke lichaamsgewicht binnen twee weken na stopzetting van de toediening van DSS. Een goed gekalibreerd DSS-colitismodel resulteert in zachte maar nog steeds gevormde ontlastingskorrels in plaats van diarree (consistentiescore van de ontlasting 1-2), met af en toe detectie van occult bloed in de ontlasting dat wijst op subklinische bloedingen en weinig gevallen van zichtbaar bloed in de ontlasting (bloedaanwezigheidsscore 1-2)17. Om de ernst van colitis verder te beoordelen, werden fecale monsters verzameld om de niveaus van inflammatoire marker lipocaline-2 te analyseren. De aanwezigheid van occult bloed werd tijdens het experiment niet gedetecteerd bij muizen die regelmatig drinkwater kregen, in tegenstelling tot met DSS behandelde dieren (Figuur 2C). Consequent waren de lipocaline-2-spiegels ongeveer 1.000 keer verhoogd bij met AOM/DSS behandelde muizen in vergelijking met AOM/alleen watercontroles (Figuur 2D).

Op het eindpunt hebben we de dikke darmen ontleed en tumoren geteld met behulp van een tumorrecordkaart (Figuur 3A). DSS-colitis resulteert in een significant kortere colonlengte, in tegenstelling tot AOM/controles met alleen water (Figuur 3B). Bovendien ontwikkelen met AOM/DSS behandelde dieren zichtbare darmtumoren, waarvan de meeste zich in het distale uiteinde vormen (Figuur 3C). Histologisch onderzoek van de met H&E bevlekte colonsecties toonde significante erosie van epitheelcellen, immuuninfiltratie en ulceratie bij AOM/DSS-muizen (Figuur 4A). De ernst van de histopathologie van de dikke darm kan worden gekwantificeerd met behulp van gevestigde scoresystemen voor DSS-geïnduceerde muizen-CAC, op basis van vier parameters (Figuur 4B): immuuninfiltratie en oedeem (0-3), ulceratie (0-3), colonepitheliale morfologie (0-4) en neoplasmata (0-4)22,23,24. De resultaten van dergelijke evaluaties, zoals toegepast op histologievoorbeelden in Figuur 4A, worden weergegeven in Figuur 4C. Colon-epitheliale proliferatie werd geëvalueerd via immunohistochemische analyse met behulp van Ki67-kleuring, wat aantoont dat DSS-behandeling de proliferatie van colonepitheelcellen bevordert. Bovendien kunnen de colonsecties worden gebruikt voor immunofluorescerende kleuring van verschillende markers, zoals de angiogenesemarker CD31 (Figuur 4D,E).

We evalueerden verder de effecten van homogenisatie van de microbiota op experimentele eindpunten, zoals de omvang van darmontsteking, gewichtsverlies en cumulatieve tumorbelasting bij elk dier. Eén groep muizen werd gehuisvest in kooien die op dag 0 werden onderworpen aan menging en herverdeling van vervuild strooisel om homogenisatie van de microbiota te bereiken, naast controledieren in kooien waarin deze manipulatie werd weggelaten. Dieren in beide groepen kregen 7 dagen lang 2,5% DSS-water. Hoewel de gemiddelde niveaus van de ontstekingsmarker lipocaline-2 in de ontlasting per kooi op dag 8 niet significant verschilden tussen de groepen (Welch's t-test), zagen we een significant lagere variabiliteit tussen datapunten in kooien die homogenisatie van de microbiota ondergingen (Figuur 5A, Welch's F-test om varianties te vergelijken, p<0.0001). Consequent vertoonden alle dieren op dag 8 een vergelijkbare mate van gewichtsverlies in vergelijking met de basislijn van dag 0. Muizen in de microbiota-homogenisatiegroep vertoonden echter minder variabiliteit in lichaamsgewichtverlies in vergelijking met de controlegroep (Figuur 5B). Verder was in een 10 weken durend CAC-inductieprotocol (Figuur 2A) met (microbiota-homogenisatie) en zonder (controle) kooibeddingmenging voorafgaand aan elke DSS-cyclus, de cumulatieve tumorlast per muis consistenter in de microbiota-gehomogeniseerde groep in vergelijking met controles die significant variabeler waren (Figuur 5C). Over het algemeen leveren deze gegevens sterk bewijs dat homogenisatie van de microbiota de robuustheid en reproduceerbaarheid van het AOM/DSS-model sterk verbetert.

figure-results-1
Figuur 1. DSS-dosistitratie bij mannelijke en vrouwelijke muizen. (A-D) Procentuele verandering van lichaamsgewicht ten opzichte van dag 0 bij 14 weken oude mannelijke (A, B) en vrouwelijke (C, D) C57BL/6J wildtype muizen die op water werden gehouden met aangegeven DSS-concentraties (1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% voor mannen en 2%, 3%, 4% voor vrouwen). (EEN, C) Dieren kregen gedurende 7 dagen DSS toegediend en werden tot 12 dagen gecontroleerd op gewichtsverlies. B en D tonen gewichtsverlies van mannelijke muizen op dag 8 (B) en vrouwelijke muizen op dag 9 (D) vanaf het begin van de DSS-behandeling. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± SEM; n=3 in A & B, n=4 in C & D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. AOM/DSS-geïnduceerde CAC-tijdlijn en monitoring. (A) AOM/DSS-geïnduceerde CAC experimentele tijdlijn. (B) Lichaamsgewicht ten opzichte van dag 0 in experimentele AOM/DSS-behandelde (rood) of controle- (alleen AOM, geen DSS, zwart) vrouwelijke C57BL/6J wildtype muizen. Alle dieren kregen één dosis AOM (10 mg/kg) en werden gerandomiseerd naar drie cycli van 3% DSS (rood) of normaal drinkwater (controle, zwart) gedurende in totaal 70 dagen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± SEM, n=2 en 11. (C) Fecale hemoccult-test van controle- (alleen AOM) of DSS-behandelde (AOM en 1,5% DSS) vrouwelijke muizen. (D) Fecale lipocaline-2-spiegels van 6 controlemuizen (alleen AOM, zwart) of 35 behandelde (AOM en 1,5% DSS, rood) vrouwelijke muizen op dag 70. Gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Macroscopische beoordeling van de dikke darm. (A) Voorbeeld van een tumorrecordkaart. (B) Representatieve colonfoto's van controle- (alleen AOM) of DSS-behandelde (AOM en 1,5% DSS) vrouwelijke muizen op dag 70. Verkorting van de lengte van de dikke darm duidt op een grotere ontsteking bij met DSS behandelde dieren. staaf - 5 mm; , p=0,002, Mann-Whitney rangsomtest; n=12 & 30. (C) Representatieve grove pathologiefoto's van colons met tumoren op dag 70 van vrouwelijke muizen behandeld met AOM en 3% DSS (tumoren zijn omcirkeld en gemarkeerd met zwarte driehoeken). Staaf - 5 mm. Callout - vergrote weergave van distale colongebieden met tumoren; staaf - 1 mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. CAC histologie beoordeling. (A) Representatieve H&E-gekleurde secties van Zwitsers gewalste dikke darmen van met AOM/DSS behandelde en controlemuizen (alleen AOM) op dag 70 met vergrote distale gebieden van 3 dieren weergegeven aan de rechterkant. Controle-dubbele punten tonen een intacte organisatie van de coloncrypte. Dikke darmen van met AOM/DSS behandelde muizen worden gekenmerkt door submucosale verdikking (pijlpunten), immuuninfiltratie (pijlen), verstoring of verlies van cryptearchitectuur (ster), erosie van de epitheellaag, epitheliale hyperplasie of dysplastisch epitheel (cirkels) met adenoom en adenocarcinoomvorming (omlijnd door stippellijn). Bar - 500 μm. (B) Histopathologisch scoresysteem dat wordt gebruikt om de ernst van het CAC-fenotype te beoordelen. (C) Voorbeeld van histologiescores van de dikke darm van muizen die alleen AOM of AOM/DSS hebben behandeld, weergegeven in A. (D) Representatieve immunohistochemische kleuring voor Ki67-proliferatiemarker in Zwitsers gerolde dikke darm van met AOM behandelde dieren na 1 of 3 cycli DSS. Prolifererende Ki67-positieve cellen (bruin) lokaliseren zich op de bodem van de crypten van de dikke darm, maar verspreiden zich naar boven en dringen de crypten binnen met CAC-initiatie en meer geavanceerde pathologie. Staaf - 100 μm. (E). Representatieve immunofluorescerende kleuring ter beoordeling van vascularisatie op basis van CD31-endotheelmarker (rood) en gekleurd met DAPI om kernen (blauw) te visualiseren in colonsecties van met AOM/DSS behandelde muizen. Staaf - 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Homogenisatie van de microbiota vermindert de variabiliteit in darmontsteking en CAC-tumorbelasting. (A) Gemiddelde fecale lipocaline-2-spiegels bij muizen die op dag 8 werden behandeld met 2,5% DSS. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de t-test van Welch om de gemiddelde fecale lipocaline-2-spiegels tussen de twee groepen te vergelijken (p = 0,137, n = 6 en 12 kooien). Daarnaast werd een F-test op varianties uitgevoerd, wat een p-waarde van 0,0001 opleverde, wat wijst op significante verschillen in variantie tussen de twee groepen. (B) Gemiddeld gewichtsverlies bij met AOM/DSS behandelde dieren die op dag 8 DSS-water kregen. Hoewel het gemiddelde gewichtsverlies tussen de twee groepen niet significant verschilt (Welch's t-test, p=0,194, n=6 & 12), is de variantie binnen de groepen significant verschillend (F-test, p=0,027). (C) Tumorlast per muis na 10 weken AOM/DSS-behandeling. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de t-test van Welch om verschillen in gemiddelde tumorlast tussen groepen te beoordelen (p=0,211, n=8 & 18) en een F-test om het verschil tussen varianties te evalueren (p=0,013). (A-C) Blauwe vioolgrafieken tonen de groep die homogenisatie van de microbiota onderging, terwijl groene vioolgrafieken de controlegroep vertegenwoordigen (zonder homogenisatie van de microbiota), ns - niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het AOM/DSS-protocol werd voor het eerst geïntroduceerd in 1996 door Okayasu et al.25 en is sindsdien erkend als een uitstekend model voor het getrouw nabootsen van de initiatie en progressie van darmkanker van normaal weefsel naar adenomateuze veranderingen en uiteindelijk carcinoom, zoals aangetoond door Suzuki et al. in 200626, vooral in de context van darmontsteking. Latere studies evalueerden de effecten van AOM en AOM/DSS op verschillende muizenstammen, evenals de impact van verschillende behandelingsduur op het fenotype en de penetrantie van tumoren 26,27,28. In 2018 publiceerden Christopher Williams en zijn groep een geactualiseerd protocol29 dat een cruciale basis legde voor de ontwikkeling van deze methodologie. Recente ontwikkelingen hebben het nut van het AOM/DSS-model voor de studies van mucosale immuniteit verder aangetoond door methoden te integreren voor isolatie van intestinale immuuninfiltraten en immunofenotypering via flowcytometrie30.

Een van de belangrijkste sterke punten van het AOM/DSS-protocol is het gemakkelijke aanpassingsvermogen aan vrijwel elke muizenstam, wat aanleiding geeft tot onderzoek naar de effecten van verschillende genetische achtergronden. Dus, Suzuki et al. vergeleken de gevoeligheid voor AOM/DSS-geïnduceerde coloncarcinogenese in vier verschillende muizenstammen met behulp van colonadenoompenetrantie als uitlezing, met de volgende resultaten: BALB/c > C57BL/6N > DBA/2N = C3H/HeN26. Aanvullende studies hebben aangetoond dat FVB/N-muizen gemakkelijker darmtumoren ontwikkelen na herhaalde AOM-behandeling in vergelijking met C57BL/6J en 129/SvJ stammen27. Met name de ontwikkeling van goed gedifferentieerd colonadenocarcinoom met bijna 100% penetrantie werd gerapporteerd bij FVB/N-muizen in een 10-weeks AOM/DSS CAC-inductieprotocol31. Deze bevindingen suggereren samen dat verschillende muizenstammen mogelijk niet even vatbaar zijn voor AOM/DSS-behandeling, wat bijdraagt aan variaties in tumorigenese en de noodzaak benadrukt van een consistente reeks richtlijnen voor de harmonisatie en reproduceerbaarheid van het AOM/DSS-protocol voor muizenstammen, huisvestingsfaciliteiten en andere variabelen. Daarvan belemmert een aanzienlijke variabiliteit in het darmmicrobioom de reproduceerbaarheid van onderzoeken gericht op ontsteking en tumorpenetrantie 9,10. Met name de samenstelling van het darmmicrobioom, waaronder Duncaniella muricolitica en Alistipes okayasuensis-soorten, kan een buitensporige invloed hebben op de ernst van DSS-colitis13. Een andere studie benadrukte het belang van de samenstelling van de microbiota bij CAC-inductie door aan te tonen dat NLRP3-deficiënte muizen een verergerd colitisfenotype vertoonden dat werd gekenmerkt door een verhoogde aanwezigheid van de bacteriële phyla Bacteroidetes (met name Prevotellaceae) en TM710.

Ondanks de populariteit van de methode hebben de bestaande AOM/DSS-protocollen geen oplossing geboden voor het significante probleem van de hoge variabiliteit die wordt waargenomen bij dieren binnen experimentele groepen32. Om deze uitdaging aan te gaan, hebben we een reeks aanbevelingen gedaan voor protocoloptimalisatie en harmonisatie door DSS-titratie (rekening houdend met het geslacht van dieren) en homogenisatie van de microbiota te implementeren. Onze aanpak is gericht op het verminderen van de variabiliteit en het verbeteren van de reproduceerbaarheid van het AOM/DSS-model over dierstammen, experimentele ontwerpen en eindpunten. Hoewel we geen specifieke aanbevelingen kunnen doen met betrekking tot steekproefomvang, zal het aantal experimentele replicaten worden bepaald door de specifieke onderzoeksopzet en de verwachte effectgroottes voor elk experiment. De lagere variabiliteit binnen de groep die door deze verfijningen wordt bereikt, vereist minder dieren in elke toestand om dezelfde statistische kracht te bereiken bij het detecteren van deze verschillen. We verwachten dat deze verbeteringen het ethisch gebruik van dieren, verantwoord beheer van onderzoeksfondsen en arbeidsvermindering verder zullen bevorderen, wat zal leiden tot meer efficiëntie.

Het AOM/DSS-model heeft een aanzienlijke translationele waarde bij het bestuderen van menselijke colitis-geassocieerde colorectale kanker. Gezien de uitdagingen van het modelleren van humaan CRC vanwege de complexe etiologie, is het belangrijk om te benadrukken dat hoewel het AOM/DSS-model enig inzicht kan verschaffen in de pathogenese van sporadisch CRC, het het meest geschikt is voor studies naar ontstekingsgeassocieerde maligniteit. Verder heeft de AOM/DSS-geïnduceerde kanker een lage incidentie van metastase33,34 en is daarom ongeschikt voor het bestuderen van metastatische verspreiding. Ondanks deze beperkingen is het AOM/DSS-model zeer penetrant, betrouwbaar, vertoont het voor de mens relevante histopathologie en bootst het nauwkeurig de ziekteprogressie na van ontsteking naar dysplasie naar adenocarcinoom, terwijl het tegelijkertijd kosteneffectief blijft. In dit protocol geven we aanbevelingen voor het genereren van reproduceerbare resultaten en het minimaliseren van verstorende factoren op basis van bestaande workflows 8,35.

Identificatie van de optimale DSS-dosering door middel van dosis-respons pilotexperimenten, waarbij rekening wordt gehouden met het geslacht van dieren als een biologische variabele 16,36,37, is de eerste cruciale stap in de richting van het opzetten van een robuust AOM/DSS-protocol (Figuur 1). We ontdekten dat behandeling met 3% DSS gedurende 7 dagen resulteerde in een meer significante afname van het lichaamsgewicht bij vrouwen (~20%) in vergelijking met mannen (~15%) (Figuur 1B,D). Mannelijke muizen kunnen echter meer, minder of even gevoelig zijn voor DSS in vergelijking met vrouwtjes. Dit kan te wijten zijn aan verschillende muizenstammen en variaties in de samenstelling van het darmmicrobioom in dierfaciliteiten, waardoor de DSS-concentratie opnieuw moet worden aangepast aan elke specifieke reeks experimenten. De optimale DSS-concentratie is een afweging tussen het maximaliseren van darmontsteking en tumorinductie zonder de aanvaardbare toxiciteit te overschrijden. Onze ervaring is dat deze balans hoogstwaarschijnlijk wordt bereikt bij DSS-doses, wat resulteert in een gewichtsverlies van ongeveer 20% na de eerste cyclus. Dieren hebben de neiging om minder gewicht te verliezen in de tweede behandelingscyclus, maar een grotere vermindering van het lichaamsgewicht wordt over het algemeen waargenomen in de derde cyclus van DSS, mogelijk als gevolg van tumorvorming in de dikke darm. Daarom kan 25% gewichtsverlies worden aangenomen als een humaan eindpunt voor institutionele protocollen voor het gebruik van dieren. Bovendien resulteert goed gekalibreerde DSS-colitis in zachte maar nog steeds gevormde ontlastingskorrels in plaats van diarree en af en toe een positieve hemocculte test, maar weinig gevallen van zichtbare bloedsporen in de ontlasting, waarbij dieren naar verwachting binnen twee weken na het stoppen van de DSS-toediening volledig zullen herstellen.

DSS is een polymeer met een molecuulgewicht van 36.000 tot 50.000 Da. Vanwege de variabiliteit van partij tot partij bij de productie van DSS, is het essentieel om DSS-dosisherkalibratie-experimenten uit te voeren voor elke nieuwe batch van het product. Om de consistentie te behouden, is het praktisch om een schatting te maken van de totale hoeveelheid DSS die nodig is voor het hele onderzoek dat van dezelfde partij moet worden gekocht. Verder beschrijft dit protocol ook stappen om de samenstelling van de microbiota te standaardiseren over het gehele experimentele cohort van muizen tijdens CAC-inductie, waardoor mogelijke kooieffecten worden beperkt om de variabiliteit te verminderen. Als extra voorzorgsmaatregel om de effecten op de kooi tot een minimum te beperken, wordt aanbevolen om dieren uit verschillende experimentele groepen waar mogelijk samen te huisvesten. Afhankelijk van de specifieke experimentele doelen en het ethische beleid voor diergebruik, moeten deze overwegingen worden weerspiegeld in pilotexperimenten. Microbiota-drift kan ook worden versneld door veranderingen in het strooisel in een natte kooi met lekkende drinkflessen. Het is het beste om af te zien van kooiwissels tijdens de DSS-levering en gedurende vijf dagen daarna. Het gebruik van slangen van 50 ml voor DSS-watertoediening vermindert het risico op lekkage en minimaliseert DSS-afval. Deze logistieke overwegingen kunnen nauwe samenwerking vereisen tussen onderzoekspersoneel en dierenverzorgingstechnici die kooiverschoon- en houderijdiensten uitvoeren.

In dit protocol bieden we ook een basisworkflow voor het oogsten van weefsels en cellen, evenals het verzamelen van gegevens. Dit omvat het testen op de aanwezigheid van occult bloed (Figuur 2C) en het in kaart brengen van tumoren (Figuur 3A). Het AOM/DSS-model is geschikt voor immunocompetente muizen, waardoor het een ideaal systeem is voor het verkennen van de immuunmicro-omgeving van de tumor vanwege het volledig intacte immuunsysteem38,39, in tegenstelling tot xenotransplantaatbenaderingen. Het is met name vatbaar voor experimentele verstoring van het immuunsysteem of stromale componenten, hetzij via een genetisch Cre-Lox-systeem voor celtype-specifieke gen-knock-ins/outs of reportercassettes, of implantatie of uitputting van specifieke celpopulaties. Door bijvoorbeeld het AOM/DSS-model te combineren met beenmergtransplantatie, hebben we eerder onderzocht hoe mutaties in het hematopoëtische systeem de ernst en belasting van CAC moduleren40. Om te helpen bij dergelijke studies zijn er uitstekende gepubliceerde methoden voor het isoleren van levensvatbare tumor-infiltrerende leukocyten die geschikt zijn voor verdere analyses, zoals immunofenotypering, functionele assays en single-cell multi-omics41. Ten slotte is het AOM/DSS-model vanwege de hoge penetrantie en consistente latentie geschikt voor preklinische therapeutische studies met de totale tumorlast als primaire uitlezing.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door NIH-awards R01 DK121831 (OAG) en R01 AI067846 (DA). OAG werd ook ondersteund door de Edward P Evans Foundation en de Oxnard Family Foundation. DA wordt ondersteund door de Merit Society-prijs. UFHCC is een door het NCI aangewezen kankercentrum (P30 CA247796).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Azoxymethane poederSigma-AldrichCAS 25843-45-2, Cat# A4586Carcinogeen om colontumoren te induceren
Benchtop microcentrifugeNA NAVoor monstervoorbereiding 
C57BL/6J muizenJackson Laboratory000664Stam en leeftijd zoals geschikt voor elk specifiek onderzoek
Conische buisjes, 50 mLFisher14955239Om DSS-water toe te dienen
Dextraansulfaat natriumzout, MW ca 40.000Cayman Chemical 23250Om colonontsteking te induceren 
Ethanol, 70%Fisher 43655223Om werkoppervlakken en dissectiegereedschap te ontsmetten
Slijpglazen kralen, 800 µm VWR12621-148Om de homogenisatie van colon-/tumorweefsel te vergemakkelijken
HemoCue America Beckman Coulter Hemoccult ICT Immunochemisch Fecaal Occulsiebloed Test KitHemoCue America 395065ACatalogusnr.23280010Voor detectie van occulsiebloed in uitwerpselen
Insulinespuit 27GX5/8 1CC BD 3294-12Voor AOM-injecties
Lixit-blokkerNANAOm geautomatiseerde watertoevoer naar muizenkooien te blokkeren, indien aanwezig (geleverd door het dierlaboratorium, steriele) 
Magneetstreep en roerplaat NANAOm DSS op te lossen 
Microbuis Bead Homogenizer, BeadBlaster 24 BenchmarkD2400Om colon/tumor te homogeniseren
Mouse Lipocalin-2/NGAL DuoSet ELISAR&D SystemsCatalogusnr.DY1857Om de lipocaline-2 uit fecesmonsters te detecteren
NP-40-oplossing, 10%Thermo Fisher Scientific85124Voor lysis van tumor-/colonweefsel
Pierce BCA-eiwitanalysekitThermo Fisher ScientificA65453Voor kwantificering van eiwitconcentratie in totale weefselleesbouen, of een andere geschikte methode
Protease- en fosfaatremmercocktail FisherPI78440Om monsters voor cytokine/eiwitanalise voor te bereiden 
RLTplus-bufferQiagen1053393Om RNA te isoleren, of een andere geschikte RNA-isolatiemethode
RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7021Om weefselmonsters te bewaren voor RNA-isolatie
RNeasy Microprep kit QIAGEN74004Om RNA te isoleren, of een andere RNA-isolatie- en zuiveringsmethode zoals gepast
Rodent Water Bottle Nozzle (30mm)VisionType EVoor het toedienen van water of DSS-oplossing
Steriele schaar en pincettenNANAVoor weefseldissectie
Spuitnaalden, 27G x 1/2 inch lengte (kort)BD 305109Voor fixatie van colon swiss-rollweefsel 
Spuiten, Luer lock, 3 mLBD 309657Om colons te spoelen voorafgaand aan dissectie en beoordeling
TapeStationAgilentVoor RNA-concentratie en beoordeling van kwaliteit/integriteit
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15Standaard knaagdierdeetje, 18% eiwit, bestraald
WeefselcassetteVWR#87002-472Om monsters te bewaren voor inbedding
Boventoplabbewaagschaal, 0-220 gNANAOm dieren te wegen
Whatman Blotting PaperVWR InternationalCat# 28298-020Voor het beoordelen van gedissekteerde colons voor grove pathologie en tumortelling

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from globocan. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  2. Siegel, R. L., Wagle, N. S., Cercek, A., Smith, R. A., Jemal, A. Colorectal cancer statistics 2023. CA Cancer J Clin. 73 (3), 233-254 (2023).
  3. Lu, C., et al. Survival outcomes and clinicopathological features in inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis. Ann Surg. 276 (5), e319-e330 (2022).
  4. Porter, R. J., Arends, M. J., Churchhouse, A. M. D., Din, S. Inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: Translational risks from mechanisms to medicines. J Crohns Colitis. 15 (12), 2131-2141 (2021).
  5. Pan, Q., et al. Genomic variants in the mouse model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate improperly mimic human colorectal cancer. Sci Rep. 7 (1), 25(2017).
  6. Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 39-61 (2013).
  7. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9(2011).
  8. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (aom) and dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (67), e4100(2012).
  9. Chen, Y., Zhang, P., Chen, W., Chen, G. Ferroptosis mediated DSS-induced ulcerative colitis associated with Nrf2/Ho-1 signaling pathway. Immunol Lett. 225, 9-15 (2020).
  10. Elinav, E., et al. Nlrp6 inflammasome regulates colonic microbial ecology and risk for colitis. Cell. 145 (5), 745-757 (2011).
  11. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3), G544-G551 (1998).
  12. Bleich, A., Fox, J. G. The mammalian microbiome and its importance in laboratory animal research. ILAR J. 56 (2), 153-158 (2015).
  13. Forster, S. C., et al. Identification of gut microbial species linked with disease variability in a widely used mouse model of colitis. Nat Microbiol. 7 (4), 590-599 (2022).
  14. Mccafferty, J., et al. Stochastic changes over time and not founder effects drive cage effects in microbial community assembly in a mouse model. ISME J. 7 (11), 2116-2125 (2013).
  15. Wagnerova, A., et al. Sex differences in the effect of resveratrol on dss-induced colitis in mice. Gastroenterol Res Pract. 2017, 8051870(2017).
  16. Son, H. J., et al. Effect of estradiol in an azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mouse model of colorectal cancer: Implication for sex difference in colorectal cancer development. Cancer Res Treat. 51 (2), 632-648 (2019).
  17. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  18. Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. Cancer. 40 (5 Suppl), 2436-2445 (1977).
  19. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
  20. Chassaing, B., et al. Fecal lipocalin 2, a sensitive and broadly dynamic non-invasive biomarker for intestinal inflammation. PLoS One. 7 (9), e44328(2012).
  21. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  22. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest. 69 (2), 238-249 (1993).
  23. Arthur, J. C., et al. Intestinal inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota. Science. 338 (6103), 120-123 (2012).
  24. Karrasch, T., Kim, J. S., Muhlbauer, M., Magness, S. T., Jobin, C. Gnotobiotic IL-10-/-;NF-Kappa B(egfp) mice reveal the critical role of TLR/NF-Kappa B signaling in commensal bacteria-induced colitis. J Immunol. 178 (10), 6522-6532 (2007).
  25. Okayasu, I., Ohkusa, T., Kajiura, K., Kanno, J., Sakamoto, S. Promotion of colorectal neoplasia in experimental murine ulcerative colitis. Gut. 39 (1), 87-92 (1996).
  26. Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
  27. Nambiar, P. R., et al. Preliminary analysis of azoxymethane induced colon tumors in inbred mice commonly used as transgenic/knockout progenitors. Int J Oncol. 22 (1), 145-150 (2003).
  28. Arnesen, H., et al. Induction of colorectal carcinogenesis in the C57BL/6J and a/j mouse strains with a reduced dss dose in the aom/dss model. Lab Anim Res. 37 (1), 19(2021).
  29. Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S. AOM/DSS model of colitis-associated cancer. Methods Mol Biol. 1422, 297-307 (2016).
  30. Eich, C., Vogt, J. F., Langst, V., Clausen, B. E., Hovelmeyer, N. Isolation and high-dimensional flow cytometric analysis of tumor-infiltrating leukocytes in a mouse model of colorectal cancer. Front Immunol. 15, 1295863(2024).
  31. Barderas, R., et al. Sporadic colon cancer murine models demonstrate the value of autoantibody detection for preclinical cancer diagnosis. Sci Rep. 3, 2938(2013).
  32. Dzhalilova, D., Zolotova, N., Fokichev, N., Makarova, O. Murine models of colorectal cancer: The azoxymethane (AOM)/dextran sulfate sodium (DSS) model of colitis-associated cancer. PeerJ. 11, e16159(2023).
  33. Rosenberg, D. W., Giardina, C., Tanaka, T. Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
  34. Pothuraju, R., et al. Colorectal cancer murine models: Initiation to metastasis. Cancer Lett. 587, 216704(2024).
  35. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  36. Lee, S. M., et al. The effect of sex on the azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mice model of colon cancer. J Cancer Prev. 21 (4), 271-278 (2016).
  37. Jang, S., Han, H., Oh, Y., Kim, Y. Sex differences in inflammation correlated with estrogen and estrogen receptor-beta levels in azoxymethane/dextran sodium sulfate-induced colitis-associated colorectal cancer mice. Heliyon. 10 (6), e28121(2024).
  38. Xin, B., et al. Enhancing the therapeutic efficacy of programmed death ligand 1 antibody for metastasized liver cancer by overcoming hepatic immunotolerance in mice. Hepatology. 76 (3), 630-645 (2022).
  39. Rivera, M., et al. Patient-derived xenograft (pdx) models of colorectal carcinoma (crc) as a platform for chemosensitivity and biomarker analysis in personalized medicine. Neoplasia. 23 (1), 21-35 (2021).
  40. Feng, Y., et al. Hematopoietic-specific heterozygous loss of dnmt3a exacerbates colitis-associated colon cancer. J Exp Med. 220 (11), (2023).
  41. Mcmanus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. aJ., Pillai, A. B. Isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e. J Vis Exp. (151), e59821(2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Azoxymethaan DSS modeldikkedarmkanker bij muizenontstekinggerelateerde kankerhomogenisatie van microbiotaDSS dosistitratieC57BL 6J muizencytokineprofileringweefselverwerking
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen