Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kanker-geassocieerde fibroblasten van borsttumoren bij muizen als hulpmiddelen voor moleculaire en computationele studies

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68364

⸱

3 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol schetst methoden voor het kweken, manipuleren en analyseren van muizen CAF's, inclusief in vitro/in vivo functionele assays, transcriptomics en computationele analyse. Bovendien beschrijft het een webgebaseerd platform dat is ontwikkeld om de openbaar beschikbare transcriptomen van laseropname van micro-ontlede stromale en epitheliale componenten uit een verzameling menselijke borstkankertumoren te analyseren.

Samenvatting

Een overtuigende hoeveelheid onderzoek heeft de cruciale rol van de tumormicro-omgeving (TME) bij de groei en agressiviteit van borstkanker (BC) bevestigd. Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF), de overheersende celcomponent van de TME, beïnvloeden het gedrag aanzienlijk door complexe overspraak met kanker en andere stromale cellen als reactie op van tumoren afgeleide activeringssignalen. Muismodellen worden uitgebreid gebruikt om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de rol van CAF in BC-progressie, aangezien ze de evaluatie van de endogene TME en de beoordeling van de betrokkenheid van het immuunsysteem mogelijk maken met behulp van syngene xenotransplantaatstudies. Hier presenteren we een reeks methoden voor het kweken van BC-afgeleide CAF's, het manipuleren van genexpressie en het evalueren van hun pro-tumorigene functies met behulp van zowel in vitro als in vivo benaderingen. We beschrijven ook protocollen voor CAF-genexpressieprofilering en transcriptomische analyse, naast een computationele procedure voor het afleiden van transcriptionele handtekeningen in primaire tumoren met behulp van openbaar beschikbare bulk RNA-seq-gegevens. Daarnaast introduceren we een gebruiksvriendelijke, webgebaseerde tool voor het analyseren van de transcriptomen van stromale en epitheliale componenten van lasercapture micro-ontlede BC-tumoren. Uiteindelijk kunnen deze methoden waardevolle inzichten verschaffen in de moleculaire mechanismen die CAF-tumorinteracties aansturen en potentieel bieden voor het identificeren van nieuwe therapeutische doelen.

Inleiding

Borstkanker (BC) is de meest voorkomende maligniteit bij vrouwen en wordt gekenmerkt door significante moleculaire heterogeniteit, met verschillende moleculaire profielen die de diagnose, behandelingsbeslissingen en prognose sturen. De micro-omgeving van de tumor (TME) is ook zeer heterogeen en speelt een cruciale rol in tumorprogressie, immuniteit en behandelingsresultaten.

Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's) zijn het meest voorkomende celtype in de TME en de belangrijkste regulatoren van tumorontwikkeling. Ze dragen bij aan extracellulaire matrixafzetting en -remodellering, angiogenese, immuunontwijking en resistentie tegen geneesmiddelen 1,2,3,4,5,6. CAF's beïnvloeden tumorcellen door direct cel-celcontact, het vrijkomen van extracellulaire blaasjes7 en de afscheiding van verschillende oplosbare factoren 2,5 om tumorgroei, invasie en therapieresistentie te bevorderen 8,9,10. Stroma-gerelateerde gensignaturen hebben inderdaad een voorspellende waarde voor BC-progressie en therapierespons en zijn geassocieerd met resistentie tegen chemotherapie 11,12,13,14. Ondanks substantieel bewijs dat CAF's suggereert als een aantrekkelijk therapeutisch doelwit, hebben klinische onderzoeken gericht op deze cellen grotendeels gefaald15. Een grote uitdaging is het beperkte begrip van de moleculaire mechanismen waarmee CAF's tumorgedrag moduleren. Recente ontwikkelingen in single-cell en ruimtelijke transcriptomische analyses hebben diepere inzichten verschaft in de complexiteit van CAF's in BC 16,17,18,19,20,21, waardoor verschillende CAF-subtypes kunnen worden geïdentificeerd met specifieke functionele programma's 16,22 en hun complexiteit en plasticiteit verder kunnen worden benadrukt23.

Genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's), waarin oncogenen of tumorsuppressorgenen tot overexpressie worden gebracht of geïnactiveerd, zijn gevestigde modellen voor het bestuderen van kanker bij de mens 24,25,26,27. Vergeleken met syngene modellen, waarbij tumorcellen worden geënt in wildtype muizen23,28, bootsen GEMM's nauwkeuriger de meerstapsprogressie van BC en de interacties tussen kankercellen en de TME na. Het manipuleren van de activiteiten van CAF's in GEMM's was echter een uitdaging vanwege hun heterogeniteit, waardoor het moeilijk is om alle CAF-subtypes te targeten zonder off-target effecten op andere stromale of epitheliale componenten5. Het combineren van GEMM's met complementaire benaderingen, zoals in vitro CAF-manipulatie, kan helpen bij het genereren van cellulaire modellen voor experimenten met functieverlies in zowel in vitro als in vivo omgevingen. Het ontwikkelen van stabiele cellulaire modellen om de functionele rollen van specifieke genen te onderzoeken, blijft echter een uitdaging vanwege het snelle begin van veroudering.

Hier beschrijven we een robuust platform voor stabiele experimenten met functieverlies in CAF's, gevolgd door functionele in vitro en in vivo analyse en transcriptionele profilering van de gemanipuleerde cellen; deze benadering biedt een uitgebreide strategie voor het ontleden van de functionele relevantie van genen die CAF tot expressie brengen bij borstkanker, met voordelen op het gebied van specificiteit, reproduceerbaarheid en aanpassingsvermogen ten opzichte van bestaande methoden. Deze aanpak wordt ook aangevuld met een nieuwe webgebaseerde tool voor het verkennen van transcriptomen van laser-capture microdissected stromale en epitheliale compartimenten van menselijke borsttumoren, waardoor vergelijkingen tussen soorten mogelijk worden en het genereren van hypothesen op basis van menselijke gegevens wordt vergemakkelijkt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie voldoet aan alle institutionele richtlijnen met betrekking tot het hanteren van muizen en weefselbemonstering. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met nationale en internationale wetten en beleidslijnen. Muizen werden gehuisvest in een specifiek pathogeenvrije transgene eenheid onder een licht/donkercyclus van 12 uur bij 22 °C met een luchtvochtigheid van 50% en kregen ad libitum voedsel en water. Chirurgische ingrepen moeten de institutionele veterinaire instructies volgen om de juiste anesthesie en analgesie te garanderen, zowel tijdens de procedure als in de postoperatieve periode. De Materiaaltabel geeft details over materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

1. Celcultuur

  1. Kweek cellen bij 37 °C in een 5% CO2 -atmosfeer met 95% relatieve vochtigheid, in DMEM (HEK293T, CAF's en onsterfelijke CAF's (iCAF's)) of RPMI-medium (4T1), aangevuld met 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine (1% pen/streptokok).
    OPMERKING: Volledige media (cDMEM, cRPMI) samenstelling: 10% door warmte geïnactiveerde FBS, hongermedia (sDMEM, sRPMI) samenstelling: geen FBS. Gemiddelde verdubbelingstijden voor cellen: HEK293T en iCAF's zijn 24 uur; 4T1-cellen zijn 12 uur duur.
  2. Passagecellen bij het bereiken van 80% confluentie, met niet meer dan een verhouding van 1:5, nooit meer dan 10 keer na ontdooien om fenotypische drift te voorkomen, zoals hieronder beschreven.
    1. Zuig het medium op en voeg voorzichtig 7 ml PBS toe aan de zijkant van een schotel van 100 mm. Aspireer de PBS, voeg 1 ml trypsine-EDTA toe. Incubeer gedurende 2-3 minuten bij 37 °C.
      LET OP: EDTA staat op de lijst van categorie 2 gevarenstoffen voor oogirritatie. Handvat in een biologische/zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
    2. Inactiveer trypsine-EDTA met 5 ml cDMEM, maak cellen los door op en neer te pipetteren en verzamel ze in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer op 290 x g gedurende 5 min.
    3. Verwijder voorzichtig het bovenstaande middel en suspendeer de celpellet opnieuw in 5 ml cDMEM. Voor een splitsing van 1:5 zaait u 1 ml geresuspendeerde cellen in een schaaltje van 100 mm met 9 ml cDMEM.
  3. Celtelling: Laad 10 μL van de celsuspensie uit stap 1.2.3 aan de zijkant van een Neubauer-telkamer, tel de cellen in de grote vierkanten en vermenigvuldig het verkregen aantal met 1 x 104 om het aantal cellen in 1 ml celsuspensie te berekenen.
  4. Cryopreservatie: Vries 50% van een schaaltje van 100 mm in (ongeveer 3 x 106 cellen) in 0,5 ml ijskoud vriesmedium (10% DMSO in door warmte geïnactiveerde FBS) zoals hieronder beschreven.
    1. Trypsiniseer de cellen uit een schaaltje van 100 mm zoals beschreven in de stappen 1.2.1 en 1.2.2, met dien verstande dat de cellen opnieuw worden gesuspendeerd in 1 ml ijskoud vriesmedium.
    2. Doseer 0,5 ml in elke cryovial en plaats deze bij -80 °C in een container met een afkoelsnelheid van ongeveer 1 °C/min. Elke aliquot kan worden ontdooid in een schaaltje van 100 mm.
  5. Mycoplasma-besmettingstest: Verzamel 1 ml groeimedium van confluente cellen die gedurende ten minste 3 dagen zijn gekweekt. Kook 20 minuten bij 95 °C. Centrifugeer op 16200 x g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur (RT). Voeg 5 μL supernatans toe aan 45 μL PCR-reactiemix (0,15 mM dNTP's, 1,5 mM MgCl2, 1x Reactiebuffer, 1 U Taq polymerase, 0,5 μM primers A en B, zie Tabel 1). Voer PCR uit, inclusief positieve en negatieve controles, en afzonderlijke PCR-producten op een 1% Agarose-gel samen met een DNA-ladder. Met mycoplasma besmette monsters zullen een band van 600 bp vertonen.

2. De isolatie van CAF's van borsttumoren

OPMERKING: Deze stap is geoptimaliseerd voor tumoren in een gevorderd stadium met een diameter van 5-10 mm (zie referentie29 ).

  1. Offer de muis door cervicale dislocatie. Isoleer borsttumoren van minimaal 125 mm3. Snijd de tumor voorzichtig weg en verwijder de omliggende huid, borstweefsel en zichtbare necrotische gebieden. Verzamel met een pincet in een microbuisje van 1,5 ml dat op ijs wordt geplaatst.
  2. Weeg de tumor met een precisieweegschaal, snijd een kubiek stuk van 0,1-0,3 g weg met een scalpel, breng over naar een nieuwe microbuis van 1,5 ml gevuld met ijskoude PBS en bewaar op ijs. Zorg ervoor dat het weefsel ondergedompeld is om uitdroging te voorkomen.
  3. Breng over naar een schaal met een diameter van 60 mm, op ijs. Hak met een scalpel 1 ml PBS fijn tot stukjes van ongeveer 1-2 mm.
  4. Overgebracht naar een conische tube van 15 ml met 5 ml per 0,1 g tumor in cDMEM plus 10 μg/ml collagenase. Spoel de schaal af met 1 ml van hetzelfde medium, met behulp van een P1000-pipet met een afgesneden punt om celbeschadiging te voorkomen. Zet de dop vast met een afdichtingsfilm om lekkage te voorkomen.
  5. Incubeer horizontaal gedurende 1 uur bij 37 °C op een orbitale schudder. Plaats een celzeef van 70 μm op een conische buis van 50 ml en breng het homogenaat over met een serologische pipet van 10 ml. Gebruik de achterkant van een zuiger van een spuit van 5 ml om te malen en duw het monster door het filter.
  6. Gebruik cDMEM (niet meer dan 30 ml eindvolume) om alles uit de zeef te halen. Draai cellen gedurende 10 minuten bij 129 x g bij 4 °C en gooi supernatant weg.
  7. Voeg 3 ml ammoniumchloride-kalium (ACK) lysisbuffer toe om rode bloedcellen (RBC) te verwijderen. Sluit de buizen goed af en meng door inversie. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT op een orbitale schudder.
  8. Stop RBC-lysis door PBS toe te voegen aan een eindvolume van 30 ml. Draai cellen gedurende 10 minuten bij 129 x g bij 4 °C en gooi supernatant weg.
  9. Resuspendeer de celpellet in 1 ml cDMEM en tel levensvatbare cellen zoals in stap 1.3 met behulp van 10 μl methyleenblauw: levende cellen reduceren de kleurstof tot een kleurloos product en worden ongekleurd, terwijl dode cellen blauw worden gekleurd.
  10. Zaai 5 x 10schaaltjes van 5 cellen/schaal van 60 mm in 5 ml cDMEM, incubeer 20 minuten bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 , verzamel niet-aanhangende cellen en leg ze 's nachts opnieuw op plaat.
  11. Voer na 48 uur of 72 uur differentiële trypsinisatie uit. Aangezien fibroblasten sneller loskomen dan epitheel- en myoepitheelcellen30, gaat u te werk zoals beschreven in stap 1.2. Maar houd de celloslating onder een microscoop nauwlettend in de gaten. Fibroblastvormige cellen worden rond en laten los terwijl epitheelcellen gehecht blijven.
  12. Voeg cDMEM toe om trypsine te inactiveren en verzamel losgeraakte CAF's, en breng ze over naar een nieuwe schaal van 60 mm in 5 ml cDMEM. Passage primaire CAF's 1:3 (zie stap 1.2) voor drie passages, bereid vervolgens vroege passage bevroren aliquots voor zoals beschreven in stap 1.4.

3. Onsterfelijkheid door virale transductie

OPMERKING: Sommige van de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een omgeving die geschikt is voor het hanteren van retrovirale vectoren (bijv. BSL2+); Controleer uw institutionele regels.

  1. Preparaat van het recombinante virus
    1. Kweek HEK293T cellen en controleer op mycoplasmabesmetting (zie stap 1).
    2. Smeer een schaaltje met een diameter van 100 mm in door 6 ml van een 0,1 mg/ml oplossing van poly-L-lysine in ddH2O gedurende 5 minuten bij RT te pipetteren, aspireer en laat onder de kap drogen (ongeveer 10 min).
    3. Zaai 3 x 10cellen van 6 HEK293T (lage doorlaat, mycoplasma-negatief) in 10 ml cDMEM in de met poly-L-lysine gecoate schaal uit stap 3.1.2 (zie stap 1.3).
    4. De dag erna, bereid twee tubes voor die 0,75 ml antibioticavrij transfectie-geoptimaliseerd medium bevatten. Voeg aan een van hen 30 μL kationlipide-gemedieerd transfectiereagens (T1) toe. Voeg aan de tweede 2 μg pCL-Ampho (retrovirale verpakkingsvector) en 2 μg retrovirale pBABE-neo largeT cDNA-vector (T2) toe. Voeg T2 toe aan T1, meng voorzichtig en incubeer gedurende 10 minuten.
    5. Verdeel het medium gelijkmatig over de cellen nadat het is vervangen door een antibioticavrij transfectie-geoptimaliseerd medium + 10% door warmte geïnactiveerde FBS. Verplaats de plaat naar een weefselkweekfaciliteit van bioveiligheidsniveau 2+ (BSL-2+). Vervang het medium na 6-12 uur door cDMEM en incubeer de cellen gedurende 24-48 uur.
    6. Filtreer het medium met de pseudovirale deeltjes door een spuitfilter van 0,45 μm en bewaar het enkele dagen bij 4 °C of -80 °C voor langdurige opslag.
  2. De virale transductie van CAF
    1. Zaai 7,5 x 105 CAF's in elk van de twee schaaltjes van 60 mm in 4 ml cDMEM (zie stap 1.3) en kweek ze zoals in stap 1.1.
    2. Vervang de dag erna het medium van een schaaltje door 2 ml van het pseudovirusbevattende medium uit stap 3.1.6 (getransduceerde CAF's), voeg 2 ml cDMEM toe en incubeer gedurende 24 uur. Laat het andere gerecht onaangeroerd (niet-getransduceerde CAF's).
    3. Herhaal de dag erna stap 3.2.2 op de getransduceerde CAF's. Vervang na 24 uur het medium van beide gerechten door 4 ml cDMEM.
    4. Begin na nog eens 24 uur met de selectie door het medium van beide gerechten te vervangen door cDMEM aangevuld met 400 μg/ml G418. Vervang het G418-bevattende medium elke 2-3 dagen totdat er geen levende cellen meer in de controleschaal van niet-getransduceerde CAF's zijn.
      OPMERKING: Niet-getransduceerde cellen zijn gevoelig voor G418 en zullen binnen 7-10 dagen afsterven, wat aangeeft dat alleen G418-resistente getransduceerde cellen zullen hebben overleefd in de getransduceerde CAF-toestand. De optimale antibioticaconcentratie moet voor elk celtype worden bepaald, waarbij dodingscurves worden uitgevoerd (test een bereik van 50 tot 1000 μg/ml G418-concentratie gedurende 7-10 dagen en selecteer de dosis die alle cellen binnen 10 dagen doodt).
    5. Passage de geselecteerde getransduceerde cellen 2x in een verhouding van 1:3 (zie stap 1.2) voordat u de BSL-faciliteit verlaat. Bereid ingevroren aliquots van vroege passages voor zoals in stap 1.4.
    6. Controleer of cellen zich blijven vermenigvuldigen zonder een senescerend fenotype te vertonen gedurende verschillende passages en ga over tot fenotypische en functionele karakterisering (zie stappen 4 en 6-9).

4. Fenotypische karakterisering

OPMERKING: CAF-markers zoals alfa-actine voor gladde spieren (α-SMA), caveolin, fibroblastactiverend eiwit (FAP), N-cadherine, van bloedplaatjes afgeleide groeifactor bèta (PDGFR-β), S100A4 en vimentine29 kunnen worden beoordeeld met RT-qPCR en Western Blot.

  1. RT-qPCR: Extraheer totaal RNA met een monofasische oplossing van fenol en guanidine-isothiocyanaat zoals beschreven in referentie15. Omgekeerd transcriberen van 2 μg totaal RNA in een volume van 20 μl, volgens de instructies van de fabrikant voor reactieomstandigheden. Verdun cDNA 1:20 en gebruik 3 μl om de RT-qPCR-reacties uit te voeren, volgens de instructies van de fabrikant (zie tabel 1 voor primers).
    OPMERKING: We raden aan om het RNA te bereiden uit een gerecht met 12 putjes.
  2. Westerse vlek
    1. Was 2x met PBS zoals beschreven in stap 1.2.1, voeg 0,2 ml ijskoude lysisbuffer toe, maak cellen los met een schraper en verzamel ze in een microbuisje van 1,5 ml zoals beschreven in29. Laat 20 minuten op ijs staan.
    2. Draai de monsters 10 minuten bij 4 °C op 16.000 x g en verzamel het supernatant. Kwantificeer eiwitten door middel van colorimetrische assay volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik ten minste 20 μg eiwit voor de Western blot (zie tabel 2 voor antilichamen).
      LET OP: We raden aan om eiwitten uit maar liefst 6 putjes in een gerecht te bereiden.
  3. Analyse van uitgescheiden eiwitten
    1. Zaai 2 x 106 iCAF's (zie stap 1.3) in een schaal met een diameter van 100 mm in 10 ml cDMEM en kweek ze zoals beschreven in stap 1.1.
    2. Verwijder na 24 uur het medium, was 2x met 10 ml PBS en incubeer gedurende 48 uur met 10 ml sDMEM (zie stap 1.1) om geconditioneerd medium (CM) te genereren.
    3. Filtreer na nog eens 48 uur de CM door een spuitfilter van 0,2 μm in een conische buis van 15 ml. Houd zowel de spuit als de slang stevig vast en wees voorbereid op enige weerstand. CM kan tot 6 maanden bewaard worden bij -80 °C.
    4. Concentraat CM ongeveer 10x met behulp van eiwitconcentrators volgens de instructies van de fabrikant, om geconcentreerde CM (conCM) te genereren. Kwantificeer de conCM, kook en voer Western Blot uit (zie Tabel 2 voor antilichamen).

5. Analyse van genknockdowns

OPMERKING: Om de genexpressie stabiel te verstoren, transduceren we iCAF's met lentivirale deeltjes die speciaal ontworpen shRNA's tot expressie brengen. Deze kunnen worden verkregen door de targetingsequenties te klonen in een geschikte lentivirale vector zoals pLKO.1-Puro, volgens de protocollen die beschikbaar zijn op https://www.addgene.org/protocols/plko/#C. De specifieke targetingsequenties kunnen worden geselecteerd met behulp van openbaar beschikbare shRNA-ontwerptools (d.w.z. GPP-Genetic Perturbation Portal van Broad Institute, https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/). Als alternatief zijn er sets vooraf gemaakte targetingvectoren in de handel verkrijgbaar (https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html, https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started, https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). We raden aan om 4-5 verschillende shRNA's tegen elk gen te ontwerpen en de beste 2 voor experimenten te selecteren. Genereer ook niet-doelgerichte vectoren als negatieve controles. Sommige van de volgende stappen moeten worden genomen in een omgeving die geschikt is voor het omgaan met HIV-afgeleide virussen (bijv. BSL2+). Controleer uw institutionele regels.

  1. Vorming van lentivirale deeltjes
    1. Zaad 3 x 106 HEK293T cellen zoals in de stappen 3.1.1-3.1.3. De volgende dag, bereid de kationlipide-gemedieerde transfectie-reagens-DNA-complexen zoals in stap 3.1.4 voor, gebruikend 9 μg en 3 μg, respectievelijk, van de verpakkende vectoren pCMV-R8.74 en pCMV-VSVG, en 7 μg van het shRNA-bevattende pLKO.1-construct in 0.75 ml antibiotica-vrij transfectie-geoptimaliseerd medium, en ga te werk zoals beschreven in stap 3.1.5 en 3.1.6.
  2. CAF-transductie
    1. Infecteer cellen zoals beschreven in stap 3.2.1, 3.2.2 en 3.2.4. Verwijder na 24 uur het infectiemedium en begin met de selectie met 2 μg/ml puromycine in cDMEM. Zie de opmerking in stap 3.2.5 voor het bepalen van de optimale concentratie.
    2. Vervang puromycine/cDMEM na 48 uur. De selectie is meestal binnen 3 dagen voltooid. Cellen uitvouwen en bevriezen zoals in stap 3.2.6. Beoordeel de knockdown-efficiëntie door zowel RT-PCR als Western blot zoals beschreven in stap 4.1. en 4.2.

6. Super-activatie van iCAF's met CM uit tumorcellen

OPMERKING: De volgende stappen illustreren methoden voor de in vitro karakterisering van iCAF's pro-tumorale activiteiten. Pro-tumorale activiteiten van CAF's kunnen worden verbeterd door ze te incuberen met CM uit BC-tumorcellen van muizen (superactivering, s.a.), zoals hieronder beschreven.

  1. Tel 4T1 muizen BC-cellen zoals beschreven in stap 1.3 en zaai 2 x 106 cellen in een schaaltje met een diameter van 100 mm in 10 ml cRPMI (zie stap 1.1).
  2. Verwijder na 24 uur het medium, was 2x met 10 ml PBS en incubeer gedurende 48 uur met 10 ml sRPMI (zie stap 1.1) om CM te genereren.
  3. Zaai de dag erna 2 x 106 iCAF's op een schaaltje met een diameter van 100 mm, in 10 ml cDMEM (zie stap 1.3) en kweek ze zoals beschreven in stap 1.1. Filtreer de CM door een spuitfilter van 0,2 μm in een conische tube van 15 ml, zoals in stap 4.3.3.
  4. Super-activatie (g.v.): verwijder het medium uit de iCAFs schaal, was 2x met 10 ml PBS en voeg de gefilterde 4T1 CM (8-10 ml) toe. Incubeer gedurende 48 uur om nv iCAF's te verkrijgen.

7. Proliferatie van tumorcellen

  1. Behandel de 4T1-cellen gedurende 48 uur met iCAF's CM, bereid zoals in de stappen 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3.
  2. Probeer ze te trypsineren en tel, zaai vervolgens 4 x 103 cellen/putje van een plaat met 96 putjes in 100 μl cRPMI zoals beschreven in stap 1.3 en kweek zoals beschreven in stap 1.1. Plaat technisch drievoud.
    1. Bereid een plaat met 96 putjes per dag van de tijdskuur voor. Het aantal cellen dat hier wordt voorgesteld, is geoptimaliseerd voor een 4-daags protocol; Schaal het af voor langere tijden.
  3. Verwijder na 4 uur, of zodra de cellen zijn bevestigd, het medium, was met PBS door voorzichtig 100 μL toe te voegen, zorg ervoor dat de cellen niet losraken door de punt tegen de rand van de put te laten rusten, met een meerkanaals pipet en met behulp van een steriel reservoir. Verwijder PBS en voeg vervolgens op dezelfde manier 100 μL sDMEM (controle) of iCAF CM toe, beide aangevuld met 2% door warmte geïnactiveerde FBS (zie stappen 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3).
  4. Stop na 4 uur de dag 0 plaat zoals beschreven in punt 7.5. Vervang voor de andere tijdstippen het medium om de dag tot het einde van het experiment.
  5. Om de celdichtheid te beoordelen, verwijdert u de plaat met 96 putjes uit de incubator en wast u de putjes 2x met 100 μL PBS, zoals beschreven in stap 7.3.
  6. Voeg onder een zuurkast 100 μL 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan elk putje en fixeer de cellen gedurende 10 minuten op RT.
    LET OP: PFA kan ernstig oogletsel en huidirritatie veroorzaken; Het is schadelijk bij inslikken en inademen en wordt ervan verdacht genetische defecten en kanker te veroorzaken. Hanteren in een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
  7. Was 3x met 100 μL PBS zoals in stap 7.3 en laat drogen onder de zuurkast (ongeveer 10 min).
  8. Incubeer met 50 μL 0,1% kristalviolet in 20% methanol gedurende 10 minuten bij RT.
    LET OP: Kristalviolet kan ernstig oogletsel veroorzaken en wordt gerapporteerd als een gevaar van categorie 4 voor orale acute toxiciteit en een gevaar van categorie 2 als kankerverwekkend. Hanteer het in een zuurkast en draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
  9. Was 3x met 100 μL ddH2O, leeg de putjes en tik met de plaat op een absorberend kussentje of keukenpapier om de vloeistof volledig te verwijderen.
  10. Los kristalviolet op in 100 μl 10% azijnzuur gedurende 15 minuten bij RT en meet de optische dichtheid (OD) bij een golflengte van 600 nm in een microplaatlezer, waarbij 100 μl 10% azijnzuur als blanco wordt gebruikt. Normaliseer de OD voor die dag naar 0 per voorwaarde.

8. Migratie en invasie

  1. Pipetteer 700 μL DMEM aangevuld met 1% door warmte geïnactiveerde FBS, 1% Pen/Strepto, in de putjes van een plaat met 24 putjes. Plaats in elk putje een 8 μm poriën transwell-insert, gecoat (invasie) of niet (migratie) met biologisch actieve matrix. Laat de plaat in de broedmachine in evenwicht komen bij 37 °C terwijl u 4T1-cellen verzamelt en telt, zoals in stap 1.3.
  2. Maak 4T1-cellen die gedurende 48 uur zijn voorbehandeld met iCAFs CM los van een schaal met een diameter van 100 mm zoals in de stappen 4.3.1, 4.3.2 en 4.3.3, met behulp van 1 ml 5 mM EDTA in plaats van trypsine-EDTA.
  3. Voeg 5 ml cDMEM toe, oogst de cellen in een conische buis van 15 ml en pellet door te centrifugeren zoals in stap 1.2. Resuspendeer de cellen in sDMEM, tel zoals in stap 1.3 en verdun tot 1 x 105 cellen/100 μl.
  4. Voeg 100 μL van de celsuspensie toe aan de bovenkamer van de transwell. Zaai als uitplatingscontrole 100 μL cellen in een plaat met 24 putjes, in 500 μL cDMEM. Incubeer gedurende 16 uur (migratie) of 24 uur (invasie) en stop het experiment zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: De incubatietijden moeten empirisch worden bepaald als verschillende cellen worden gebruikt.
  5. Label de inzetstukken aan de bovenzijde met een dunne stift en dompel ze onder in een conische buis van 50 ml gevuld met PBS om met een pincet te wassen. Maak het interne deel van de transwell voorzichtig schoon met een wattenstaafje.
  6. Incubeer monsters onder een zuurkast in 700 μl 4% PFA gedurende 10 minuten bij RT (zie stap 7.6).
  7. Was 3x met 700 μL PBS en laat drogen onder de kap (ongeveer 10 min). Incubeer inserts met 700 μL 0,1% kristalviolet in 20% methanol gedurende 10 minuten bij RT (zie stap 6.10).
  8. Was de inserts 3x en dompel ze onder in een conische buis van 50 ml gevuld met ddH2O met behulp van een pincet. Maak het interne deel van de transwell voorzichtig schoon met een wattenstaafje. Bewaar samples bij RT en maak foto's tot 3 dagen later.
  9. Maak met een fasecontrastmicroscoop één foto met een 10x objectief dat het grootste deel van het putoppervlak in beeld brengt en maak vervolgens foto's van 5 onafhankelijke gebieden met een 20x objectief.
  10. Los kristalviolet als volgt op in 10% azijnzuur: voeg voor putjes 100 μL azijnzuur toe en meng op een orbitale schudder gedurende 10 minuten bij RT; leg ze voor transwells met het onderste oppervlak naar boven op een bank, deponeer 50 μL azijnzuur op het oppervlak en meng door te pipetteren tot kristalviolet volledig is opgelost.
  11. Lees de extinctie af bij 600 nm in een plaat met 96 putjes met 50 μl van het opgeloste materiaal uit de bovenstaande stap. Gebruik 10% azijnzuur als blanco.
  12. Normaliseer de optische dichtheid (OD) van de beplatingscontrole uit stap 8.5 en druk migratie of invasie uit ten opzichte van de controletoestand.

9. Primaire tumorgroei en vorming van longmetastasen

OPMERKING: De volgende stap illustreert methoden voor de in vivo karakterisering van de pro-tumorale activiteiten van CAF's. Deze stap is geoptimaliseerd voor het evalueren van de in vivo pro-tumorigene kenmerken van CAF's door co-injectie in syngene muismodellen. Omdat zowel de CAF's als de 4T1-cellen afkomstig zijn van de BALB/c-muisachtergrond, worden BALB/c-muizen gebruikt.

  1. Tel 2 dagen voor de injectie 6 weken oude vrouwelijke BALB/c-muizen met metalen ID-oormerken en scheer het 4e borstkliergebied met een scheerapparaat.
  2. Verzamel en tel 4T1-cellen en s.a. iCAF's, bereid zoals beschreven in stap 6. Meng in een conische buis van 15 ml 1 x 105 4T1-cellen en 3 x 105 s.a. iCAFs/muis, rekening houdend met een overmaat van ten minste 20%. Gebruik 4T1 alleen als besturingselement.
  3. Centrifugeer bij 290 x g gedurende 5 min, suspendeer in een volume PBS berekend om het bovenstaande aantal cellen/muizen in 50 μl te verkrijgen, breng over naar een microbuisje van 1,5 ml en bewaar op ijs.
    OPMERKING: Om bijvoorbeeld 10 muizen te injecteren, mengt u 1.2 x 106 4T1-cellen met 3.6 x 106 s.a. iCAF's, pelletcellen en resuspendeert u in 600 μL PBS. Injecteer 50 μL celsuspensie per muis.
  4. Bereid het werkgebied voor door het oppervlak van een laminaire afzuigkap te reinigen en te desinfecteren. Bedek een schuimoperatiebord met een bankbeschermer.
  5. Verdoof de muizen één voor één, volgens de institutionele procedures (we gebruiken intraperitoneale injectie van tiletamine base/zolazepam base + xylazine 70 mg/kg + 5 mg/kg). Breng veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Desinfecteer de huid met een wattenstaafje met een povidon-jodiumoplossing.
  6. Gebruik de teenknijptest om er zeker van te zijn dat de muizen onder de juiste narcose zijn. Injecteer met een injectienaald 50 μL van de celsuspensie in het4e borstvetkussen. Gebruik de tepel als referentie en injecteer ongeveer 3 mm in de richting van het ipsilaterale been.
  7. Inspecteer de muizen gedurende enkele uren na de injectie en in de dagen daarna. De tumoren worden na 4 dagen voelbaar.
  8. Meet de tumorgrootte elke 48 uur met een schuifmaat en bepaal de maximale en minimale diameters. Bereken het tumorvolume met behulp van de formule: (lengte x breedte2)/2.
  9. Verwijder na 10 dagen injectie de primaire tumoren operatief zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid het operatiegebied voor zoals in stap 9.5. Steriliseer gereedschap door middel van autoclaveren en plaats ze tijdens het werken op een steriel oppervlak. Steriliseer gereedschappen tussen dieren met behulp van een sterilisator met hete kralen.
    2. Verdoof de muizen zoals in stap 9.6 en 9.7. Maak met een scalpelmes een incisie van 5-8 mm dicht bij de tumor en trek de huid voorzichtig weg, waardoor er een klein zakje ontstaat om toegang te krijgen tot de tumor. Schroei elk zichtbaar bloedvat dicht met een cauterisatiepen op lage temperatuur om bloedingen bij het ontleden te voorkomen.
    3. Gebruik de scalpel om de tumor te verwijderen en probeer geen huid te verwijderen. Plaats de huidflappen terug in hun oorspronkelijke positie, hecht ze aan elkaar met behulp van 5-0 chirurgisch garen met een naald van 17 mm 1/2C en voeg chirurgische lijm toe om de wond volledig af te dichten.
    4. Laat de muizen niet zonder toezicht achter totdat ze weer voldoende bewustzijn hebben om de sternale lighouding te behouden. Dieren die een operatie hebben ondergaan, worden pas teruggebracht naar het gezelschap van andere dieren als ze volledig hersteld zijn.
  10. Houd de dieren na de operatie nauwlettend in de gaten en dien de volgende dagen indien nodig een pijnstillende behandeling toe, volgens de protocollen van de instelling. We gebruiken subcutane injecties met Carprofen (3-5 mg/kg).
  11. Weeg de tumor met behulp van een precisiebalans, zoals in stap 2.2. Snijd de tumor in tweeën met behulp van het scalpel. Doe de helft in een microbuisje van 1,5 ml, vries in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C voor moleculaire analyses. Fixeer de andere helft in 5 ml 4% PFA in een conische buis van 15 ml gedurende 24 uur bij 4 °C voor histologische analyse.
  12. Op dag 21 na de injectie offeren de muizen door blootstelling aan CO2 en verzamelen de longen bij intratracheale infusie met 4% PFA zoals hieronder beschreven. Werk onder een zuurkast.
    1. Open de borstholte met een chirurgische schaar. Verwijder de huid van het submandibulaire gebied en de speekselklieren om de luchtpijp duidelijk bloot te leggen.
    2. Bereid een naaldspuit van 22 G voor met 4% PFA-oplossing. Steek de naald in de luchtpijp van de muis en richt deze op de longen terwijl u de luchtpijp naar het hoofd klemt. Injecteer de oplossing totdat de longen opzwellen (ongeveer 2 ml).
    3. Ontleed de longen en plaats ze in een tube van 15 ml met een 4% PFA-oplossing. Keer de tube een paar keer voorzichtig om en laat hem 24 uur fixeren bij 4 °C.
  13. Voer semi-seriële coupes van de longen uit en kleur met hematoxyline en eosine (H&E), één plak om de 50/100 μm totdat het monster is uitgeput, zoals beschreven in referentie31.
  14. Scoor metastasen op softwaregestuurde analyse van microfoto's van de H&E-gekleurde secties.

10. Handtekeningen van genexpressie

  1. Definieer een gensignatuur zoals hieronder beschreven.
    1. Afhankelijk van de experimentele setting en de specifieke biologische vraag die wordt onderzocht, kan op verschillende manieren een gensignatuur worden verkregen. Beoordeel meestal de differentiële expressie tussen twee aandoeningen (bijv. CAF's versus normale tegenhangers, of op verschillende manieren behandeld (bijv. supergeactiveerd of tot zwijgen gebracht) versus onbehandeld.
    2. U kunt ook de meest variabel tot expressie gebrachte of informatieve genen identificeren in de geanalyseerde monsters (bijv. genen met hoge variantie of met hoge belastingen op de eerste componenten van een hoofdcomponentenanalyse). Hier gebruiken we een STAT3-gereguleerde handtekening als voorbeeld. Deze signatuur werd gedefinieerd als de genen die werden gedownreguleerd na STAT3-uitschakeling in BC CAF's29, zoals hieronder beschreven. Voor een grondige beschrijving van RNA-sequencing, zie referenties32,33.
  2. Extraheer het totale RNA in technisch drievoud uit elk monster zoals in stap 4.1.1 en beoordeel de RNA-kwaliteit om de RNA-integriteit te controleren (RIN ≥ 9).
  3. Bereid bibliotheken voor van 2 μg poly(A) geselecteerd RNA en sequentie ze. We gebruikten het NextSeq 500 platform.
  4. Kaart leest naar de Mus musculus mm9-referentieassemblage met behulp van TopHat v2.0. 1034.
  5. Bereken het aantal genen met behulp van de htseq-count-tool uit het HTSeq-pakket (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html).
  6. Voer differentiële expressieanalyse uit met behulp van R en het DESeq2-pakket (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html). Filter neerwaarts gereguleerde genen met FDR-< 0,05 om de STAT3-signatuur te definiëren.

11. Schatting van de expressie van de handtekening in primaire tumoren

OPMERKING: De volgende stappen beschrijven een procedure om de expressie van de STAT3-gereguleerde signatuur29 computationeel te schatten in openbaar beschikbare transcriptomische gegevens van BC primaire tumoren, waarbij de relatie met het geschatte stromale aandeel in dezelfde set monsters wordt getest.

  1. Installeer R (https://cran.r-project.org/) en RStudio (https://posit.co/products/open-source/rstudio/). Start het en installeer de benodigde bibliotheken: GSVA35, TCGAbiolinks36.
  2. Download primaire tumorgenexpressiegegevens, zoals TCGA-gegevens van https://portal.gdc.cancer.gov/, METABRIC-gegevens van http://synapse.org/ (syn1757063) of andere transcriptomische gegevens van de Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) als pre-genormaliseerde expressiematrices. Gegevens moeten worden opgemaakt als een numerieke matrix met rijen als genen en kolommen als monsters, en worden genormaliseerd afhankelijk van het platform en worden geschaald met behulp van een offset van 1.
    1. Download de lijst met muis-menselijke genorthologen van Biomart op https://www.ensembl.org/biomart/martview/, selecteer de database: ensembl genes, kies de dataset voor menselijke genen en klik op de attributenselectie in het linkertabblad.
    2. Open uit de vooraf geselecteerde functies het tabblad EXTERN en markeer het HGNC-symbool, selecteer Homologen in het vak bovenaan de pagina en markeer Muisorthologen / Muisgennaam.
    3. Klik op de knop Resultaten in de linkerbovenhoek, selecteer het CSV-formaat en klik op de knop GO om het bestand te downloaden.
  3. Laad de genexpressiehandtekening (een set genen) in R. In dit geval gebruiken we de lijst van genen die gedownreguleerd zijn bij STAT3-uitschakeling in muizen CAF's.
  4. Laad de lijst met muis-menselijke genorthologen in R en wijs de STAT3-handtekening toe aan de corresponderende menselijke orthologen via de Biomart-tabel.
  5. Laad primaire tumorgenexpressiegegevens in R en roep de GSVA-functie aan met parameters als een ssgseaParam-object, inclusief primaire tumorgegevens, en een lijst met de STAT3-signatuur.

12. Test de relatie tussen de expressie van de gensignatuur en klinische kenmerken

  1. Identificeer de variabelen die van belang zijn. Stromaal percentage vertegenwoordigt het aandeel cellen in het gesequencede tumormonster dat tot tumorstroma behoort. Gebruik de volgende klinische kenmerken die vaak worden geassocieerd met omische gegevens: tumorgrootte, stadium, leeftijd van de patiënt bij diagnose, lymfeklierstatus, metastasestatus, enz. Vooraf berekende stromale percentageschattingen zijn beschikbaar voor TCGA.
    OPMERKING: Specifiek zijn de beschikbare stromale schattingen: EDec Immune/Stromaal = Epigenomische Deconvolutie van stromale/immuunpercentage37; Immuunscore = ssGSEA op basis van genexpressieprofielen van 141 immuungenen38; LUMP = Leukocytenunmethylering voor zuiverheid, die gemiddeld 44 niet-gemethyleerde immuunspecifieke CpG-plaatsen bedraagt39; Stromale score = ssGSEA op basis van genexpressieprofielen van 141 stromale genen38; IHC = geschat door beeldanalyse van hematoxyline en met eosine gekleurde objectglaasjes geproduceerd door de Nationwide Children's Hospital Biospecimen Core Resource40; ABSOLUTE = gebaseerd op somatische gegevens over kopienummers41.
  2. Download EDEc-gegevens van http://genboree.org/theCommons/documents/569, stromale en immuunscores van https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html (RNASeqV2) en gegevens over tumorzuiverheid (LUMP, IHC, ABSOLUTE) van TCGAbiolinks. Bereken voor andere datasets het percentage stroma dat gebruik maakt van het GSVA-pakket, waarbij de ssGSEA voor stroma en immuunsignaturen wordt berekend die zijn verkregen van Yoshihara et al.38.
  3. Bereken de correlatie tussen de numerieke vector van de geschatte stromale verhouding en de numerieke vector van de STAT3-signatuurexpressie over primaire tumormonsters. Dit kan worden bereikt met de cor.test-functie in R.
  4. Download klinische gegevens die verband houden met de transcriptomische dataset van de primaire tumoren als een tabel met monsters in rijen en klinische kenmerken in kolommen.
  5. Laad de klinische gegevens in R en controleer of de samples in de transcriptomische matrix en in de metagegevenstabel in dezelfde volgorde staan als de matchfunctie.
  6. Bereken voor numerieke variabelen (bijv. tumorgrootte) de correlatie tussen de numerieke vector van de STAT3-signatuurexpressie over primaire tumormonsters en de vector van de waarden van klinische kenmerken met de cor.test-functie.
  7. Test voor categorische variabelen (bijv. metastasestatus) het verschil in STAT3-signatuurexpressie tussen twee groepen monsters (bijv. gemetastaseerde versus niet-gemetastaseerde tumoren) met de niet-parametrische Wilcoxon-ranksomtest (ervan uitgaande dat de twee groepen monsters onafhankelijk zijn). Dit kan worden bereikt met de wilcox.test-functie in R.

13. Testen van de regulatie van de handtekening in tumorstroma

OPMERKING: De expressie van een stromale signatuur in primaire tumoren geanalyseerd door middel van bulk-RNA-sequencing heeft het voordeel dat er wordt vertrouwd op grote patiëntencohorten met gedetailleerde klinische annotaties. Aan de andere kant maakt alleen het scheiden van stroma en epitheel het mogelijk om veranderingen in genexpressie in een van de twee cellulaire compartimenten in de tumor te definiëren in vergelijking met normaal weefsel42. MetaLCM is een ShinyApp die de analyse van transcriptomische datasets van laser-capture microdissected borsttumoren mogelijk maakt. Via deze tool kan de gebruiker zoeken naar robuuste differentieel tot expressie gebrachte genen tussen twee aandoeningen in transcriptomische datasets van laser-capture microdissected borsttumoren en de regulatie van eerder gedefinieerde gensignaturen in tumorstroma testen. In de volgende stappen wordt beschreven hoe u MetaLCM kunt gebruiken.

  1. Open de app via de link https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/. Om de analyse te starten, selecteert u de kenmerken van de vergeleken voorwaarden.
  2. Kies de richting voor de vergelijking. Door opgereguleerde genen te kiezen, worden de genen met hogere expressie in conditie 1 getoond.
  3. Kies de drempelwaarde voor de p-waarde voor differentiële expressie en druk op Uitvoeren om de analyse uit te voeren, en telkens wanneer de instellingen worden gewijzigd.
  4. Als u de analyse wilt beperken tot een vooraf gedefinieerde genenlijst, typt u gensymbolen gescheiden door komma's of importeert u een CSV-bestand met gensymbolen in één kolom.
  5. Druk op Genenlijst verzenden om gensymbolen te importeren. Druk op Reset om de analyse te herstellen met alle genen. Bewaar de lijst met differentieel tot expressie gebrachte genen: wanneer een genenlijst wordt verstrekt, wordt alleen op die genen meervoudige testcorrectie uitgevoerd. De tabel bevat de gemiddelde logFC, samengevouwen p-waarde en individuele logFC en p-waarden voor differentiële expressie in elke beschikbare dataset.
  6. Plot een heatmap met de vouwveranderingen van differentieel tot expressie gebrachte genen. De heatmap toont alleen de differentieel tot expressie gebrachte genen met het volledig coherente teken van differentiële expressie in verschillende datasets.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In-vitrobeoordeling van de activiteiten van CAF's
De bijdrage van van borsttumoren afgeleide kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's) aan de agressieve kenmerken van borstkanker (BC) werd bestudeerd met behulp van onsterfelijke CAF's (iCAF's) gegenereerd volgens stap 3. iCAF's werden supergeactiveerd zoals beschreven in stap 6 en vervolgens uitgehongerd in sDMEM om hun CM te verzamelen, die werd gebruikt om 4T1-cellen gedurende 48 uur te beh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie presenteren we geoptimaliseerde protocollen voor de onsterfelijkheid van muizen CAF's en de karakterisering van hun pro-tumorigene activiteiten, zowel in vitro als in vivo. In plaats van selectief specifieke CAF-subtypes te isoleren op basis van markerexpressie, hebben we ervoor gekozen om de hele celpopulatie te behouden om de heterogeniteit te behouden. De cellen werden functioneel gekarakteriseerd als een geheel en hun genexpressieprofielen werden gean...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Italiaanse Vereniging voor Kankeronderzoek (AIRC, IG16930 en IG24851 tot VP); het Italiaanse Ministerie van Universiteit en Onderzoek (MIUR PRIN 2017 en 2022 tot VP); de Truus en Gerrit van Riemsdijk Stichting, Liechtenstein, donatie aan V.P.; Regio Piemonte (Deflect). A.S. werd gesteund door een postdoctorale beurs van de Italiaanse Cancer Research Foundation (FIRC) en L.A. werd gesteund door Fondazione Umberto Veronesi.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1Kb plus DNA ladderThermoFisher Scientific10787018
24 well plateSarstedt833922
96 well plateSarstedt833924
AzijnzuurSigma Aldirch695092
AgeI-HFNew England BiolabsR3552Bewaar bij -20 °C
BetadineMeda Pharma23907076
Bürker telkamer VWR40443703
Cautery Low Temp FineTip DispKeelerAX10339KL
CentrifugeEppendorf5810R
Conische buis 15 mLSarstedt62554502
Conische buis 50 mLSarstedt62547254
Cryopure 2 mL microtubesSarstedt72380992
KristalvioletSigma AldirchC0775Bewaar bij RT, gebruik in een afzuigkap 
Kweekplaat 100 mm diameter Sarstedt833902
Kweekplaat 60 mm diameter Sarstedt833920
ddH20HomemadeBewaar bij RT, gebruik in een biologische kap
Digitale schuifmaatPreciva02-301-2
Digitaal microscoopLeicaDM6B
Dimethyl sulfaatSigma AldirchD8418Gebruik in een biologische kap
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco11965092Bewaar bij 4 °C, gebruik in een biologische kap
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101Bewaar bij -20 °C
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Sigma AldirchE6758Bewaar bij RT, gebruik in een biologische kap
Foetaal runderserum (FBS)Gibco16000044Bewaar bij 4 °C, gebruik in een biologische kap
Gezeefde punten 10 µLSarstedt703010255
Gezeefde punten 100 µLSarstedt703030255
Gezeefde punten 1000 µLSarstedt703060255
Gezeefde punten 20 µLSarstedt703030265
Gezeefde punten 200 µLSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 µm Sarstedt831826102
Filtropur S Plus 0,45 µm Sarstedt831826
Fijne schaar2Biol1406009
Pincet2Biol1102412
GeneticineGibco10131035Bewaar bij 4 °C, gebruik in een biologische kap
Lipofectamine 2000 TransfectiereagensThermoFisher Scientific11668019Bewaar bij 4 °C, gebruik in een biologische kap
Matrigel invasiekamers met 8 μm PET membraan Corning354480
Microplaatlezer (600 nm absorptie)PromegaGM3500
Microtubes 1,5 mL Sarstedt7269001
OptimemGibco31985047Bewaar bij 4 °C, gebruik in een biologische kap
Paraformaldehyde (PFA)Sigma Aldirch158127Bewaar bij RT, gebruik in een afzuigkap
pBABE-neo largeTcDNA Addgene1780Bewaar bij -20 °C, gebruik in een biologische kap
pCL-AmphoNovus Biological 18746853Bewaar bij -20 °C, gebruik in een biologische kap
pCMV-R8.74Addgene22036Bewaar bij -20 °C, gebruik in een biologische kap
pCMV-VSVG Addgene8454Bewaar bij -20 °C, gebruik in een biologische kap
Penicilline-Streptomycine (Pen Strepto, 10.000 μg/mL) Gibco15140122Bewaar bij 4 °C, gebruik in een biologische kap
Phase contrast microscoop Olympus BX42
Fosfaat gebufferde saline (PBS)HomemadeBewaar bij RT, gebruik in een biologische kap
pLKO.1-Puro Addgene10878Bewaar bij -20 °C, gebruik in een biologische kap
Poly-L-lysine oplossingSigma AldirchP8920Bewaar bij 4 °C, gebruik in een biologische kap
Puromycine dihydrochloride van Streptomyces albonigerSigma AldirchP8833
rCutSmart Buffer New England BiolabsB6004Bewaar bij -20 °C
Rodent scheerapparaatAesculapGT416
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)Gibco61870010Bewaar bij 4 °C, gebruik in een biologische kap
Round-tip Thirsty-SwabsSigma AldirchZ744127
ScalpelGima27041
Secura Semi Micro BalanceSartoriusSECURA125-1S
Serologische pipet 10 mL Sarstedt861254001
Serologische pipet 2 mL Sarstedt861252001
Serologische pipet 25 mL 

Referenties

  1. Bhattacharya, S., et al. Group behavior and emergence of cancer drug resistance. Trends Cancer. 7 (4), 323-334 (2021).
  2. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  3. Marusyk, A., et al. Spatial proximity to fibroblasts impacts molecular features and therapeutic sensitivity of breast cancer cells influencing clinical outcomes. Cancer Res. 76 (22), 6495-6506 (2016).
  4. Su, S., et al. Cd10(+)gpr77(+) cancer-associated fibroblasts promote cancer formation and chemoresistance by sustaining cancer stemness. Cell. 172 (4), 841-856.e16 (2018).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Watson, S. S., et al. Microenvironment-mediated mechanisms of resistance to HER2 inhibitors differ between HER2+ breast cancer subtypes. Cell Syst. 6 (3), 329-342.e6 (2018).
  7. Xie, J., et al. Cancer-associated fibroblast-derived extracellular vesicles: Regulators and therapeutic targets in the tumor microenvironment. Cancer Drug Resist. 8, 2(2025).
  8. Du, R., et al. PDPN-positive CAFs contribute to HER2-positive breast cancer resistance to trastuzumab by inhibiting antibody-dependent NK cell-mediated cytotoxicity. Drug Resist Updat. 68, 100947(2023).
  9. Zhang, H., et al. Define cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the tumor microenvironment: New opportunities in cancer immunotherapy and advances in clinical trials. Mol Cancer. 22 (1), 159(2023).
  10. Zheng, S., et al. Dissecting the role of cancer-associated fibroblast-derived biglycan as a potential therapeutic target in immunotherapy resistance: A tumor bulk and single-cell transcriptomic study. Clin Transl Med. 13 (2), e1189(2023).
  11. Bainer, R., et al. Gene expression in local stroma reflects breast tumor states and predicts patient outcome. Sci Rep. 6, 39240(2016).
  12. Farmer, P., et al. A stroma-related gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Nat Med. 15 (1), 68-74 (2009).
  13. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Res. 17 (1), 23(2015).
  14. Xie, J., et al. Turning up a new pattern: Identification of cancer-associated fibroblast-related clusters in TNBC. Front Immunol. 13, 1022147(2022).
  15. Chen, Y., Mcandrews, K. M., Kalluri, R. Clinical and therapeutic relevance of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Clin Oncol. 18 (12), 792-804 (2021).
  16. Bartoschek, M., et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Commun. 9 (1), 5150(2018).
  17. Liu, S. Q., et al. Single-cell and spatially resolved analysis uncovers cell heterogeneity of breast cancer. J Hematol Oncol. 15 (1), 19(2022).
  18. Massa, D., Tosi, A., Rosato, A., Guarneri, V., Dieci, M. V. Multiplexed in situ spatial protein profiling in the pursuit of precision immuno-oncology for patients with breast cancer. Cancers. 14 (19), 4885(2022).
  19. Tietscher, S., et al. A comprehensive single-cell map of T cell exhaustion-associated immune environments in human breast cancer. Nat Commun. 14 (1), 98(2023).
  20. Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999(2022).
  21. Wu, S. Z., et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet. 53 (9), 1334-1347 (2021).
  22. Ning, L., et al. Scrna-seq characterizing the heterogeneity of fibroblasts in breast cancer reveals a novel subtype sfrp4(+) caf that inhibits migration and predicts prognosis. Front Oncol. 14, 1348299(2024).
  23. Salemme, V., et al. The role of tumor microenvironment in drug resistance: Emerging technologies to unravel breast cancer heterogeneity. Front Oncol. 13, 1170264(2023).
  24. Attalla, S., Taifour, T., Bui, T., Muller, W. Insights from transgenic mouse models of pymt-induced breast cancer: Recapitulating human breast cancer progression in vivo. Oncogene. 40 (3), 475-491 (2021).
  25. Ferreira, T., Azevedo, T., Silva, J., Faustino-Rocha, A. I., Oliveira, P. A. Current views on in vivo models for breast cancer research and related drug development. Expert Opin Drug Discov. 19 (2), 189-207 (2024).
  26. Holen, I., Speirs, V., Morrissey, B., Blyth, K. In vivo models in breast cancer research: Progress, challenges and future directions. Dis Model Mech. 10 (4), 359-371 (2017).
  27. Pedroza, D. A., Gao, Y., Zhang, X. H., Rosen, J. M. Leveraging preclinical models of metastatic breast cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (5), 189163(2024).
  28. Nuckhir, M., Withey, D., Cabral, S., Harrison, H., Clarke, R. B. State of the art modelling of the breast cancer metastatic microenvironment: Where are we. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 14(2024).
  29. Avalle, L., et al. Stat3 induces breast cancer growth via angptl4, mmp13 and stc1 secretion by cancer associated fibroblasts. Oncogene. 41 (10), 1456-1467 (2022).
  30. Halaban, R., Alfano, F. D. Selective elimination of fibroblasts from cultures of normal human melanocytes. In Vitro. 20 (5), 447-450 (1984).
  31. Avalle, L., et al. Micrornas-143 and -145 induce epithelial to mesenchymal transition and modulate the expression of junction proteins. Cell Death Differ. 24 (10), 1750-1760 (2017).
  32. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with rna-seq. J Biomed Biotechnol. 2010, 853916(2010).
  33. Ura, H., Togi, S., Niida, Y. A comparison of mrna sequencing (rna-seq) library preparation methods for transcriptome analysis. BMC Genomics. 23 (1), 303(2022).
  34. Kim, D., et al. Tophat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  35. Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. Gsva: Gene set variation analysis for microarray and rna-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 7(2013).
  36. Mounir, M., et al. New functionalities in the tcgabiolinks package for the study and integration of cancer data from gdc and gtex. PLoS Comput Biol. 15 (3), e1006701(2019).
  37. Onuchic, V., et al. Epigenomic deconvolution of breast tumors reveals metabolic coupling between constituent cell types. Cell Rep. 17 (8), 2075-2086 (2016).
  38. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  39. Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nat Commun. 6, 8971(2015).
  40. Liu, J., et al. An integrated tcga pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics. Cell. 173 (2), 400-416.e11 (2018).
  41. Carter, S. L., et al. Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nat Biotechnol. 30 (5), 413-421 (2012).
  42. Savino, A., De Marzo, N., Provero, P., Poli, V. Meta-analysis of microdissected breast tumors reveals genes regulated in the stroma but hidden in bulk analysis. Cancers. 13 (13), 3371(2021).
  43. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral rnai system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  44. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  45. Pfefferle, A. D., et al. Transcriptomic classification of genetically engineered mouse models of breast cancer identifies human subtype counterparts. Genome Biol. 14 (11), R125(2013).
  46. Hahn, W. C., et al. Enumeration of the Simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation. Mol Cell Biol. 22 (7), 2111-2123 (2002).
  47. Counter, C. M., et al. Dissociation among in vitro telomerase activity, telomere maintenance, and cellular immortalization. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14723-14728 (1998).
  48. Ferrari, N., et al. Dickkopf-3 links hsf1 and Yap/Taz signalling to control aggressive behaviours in cancer-associated fibroblasts. Nat Commun. 10 (1), 130(2019).
  49. Herrera, M., et al. Cancer-associated fibroblast-derived gene signatures determine prognosis in colon cancer patients. Mol Cancer. 20 (1), 73(2021).
  50. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  51. Cobos, F. A., et al. Effective methods for bulk RNA-seq deconvolution using scRNA-seq transcriptomes. Genome Biol. 24 (1), 177(2023).
  52. Cheng, P. S. W., Zaccaria, M., Biffi, G. Functional heterogeneity of fibroblasts in primary tumors and metastases. Trends Cancer. 11 (2), 135-153 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Tumormicro-omgevingborstkankergenexpressieprofileringtranscriptoomanalyseinvasie-assaymigratie-assaySTAT3-doelgenenlaser-capture microdissectie
Kanker-geassocieerde fibroblasten van borsttumoren bij muizen als hulpmiddelen voor moleculaire en computationele studies
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.