Methodenartikel

Isolatie, kweek en karakterisering van prostaatkanker-geassocieerde fibroblasten

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68367

⸱

1 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een uitgebreide procedure om fibroblasten te isoleren, uit te breiden en onsterfelijk te maken van radicale prostatectomieën. Bovendien beschrijft het tests die zijn ontwikkeld om de functionele effecten van overspraak tussen fibroblast en tumorcellen te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van zowel behandeling met geconditioneerd medium als co-kweek.

Samenvatting

Tumorstroma kan actief worden gevormd door tumorcellen om pro-tumorigene eigenschappen aan te nemen, waardoor het een brandpunt is van kankeronderzoek. Onder de stromale componenten spelen kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's) - vaak het meest voorkomende celtype in de tumormicro-omgeving (TME) - een cruciale rol bij het bevorderen van kankerprogressie door hun interacties met tumorcellen en andere stromale componenten. Het ophelderen van de mechanismen achter deze interacties vereist robuuste methoden voor het isoleren en karakteriseren van CAF's, die ook de basis kunnen leggen voor de ontwikkeling van nieuwe CAF-gerichte kankertherapieën. Deze studie presenteert een methode voor het isoleren van fibroblasten uit zowel de tumor als de aangrenzende normale regio's van radicale prostatectomiemonsters verkregen van patiënten met prostaatkanker (PCa). Deze benadering maakt de gelijktijdige isolatie van CAF's en hun normale tegenhangers (NF's) van hetzelfde individu mogelijk, waardoor een gekoppeld experimenteel systeem ontstaat. Er worden gedetailleerde protocollen opgesteld voor het onderhoud van primaire CAF's en NF's voor downstream in-vitroanalyses, evenals voor hun onsterfelijkheid om langetermijnstudies te vergemakkelijken. We beschrijven ook functionele assays die zijn ontworpen om de effecten van CAF's en NF's op het gedrag van kankercellen te vergelijken, waaronder proliferatie, migratie en verankeringsonafhankelijke groei. Twee complementaire benaderingen worden beschreven: behandeling van kankercellen met van fibroblasten afgeleide geconditioneerde media (CM) en directe co-cultuur van fibroblasten met tumorcellen. Samen vormen deze methodologieën een uitgebreide toolkit voor het onderzoeken van de dynamische wisselwerking tussen CAF's en tumorcellen, niet alleen in PCa maar mogelijk in een reeks menselijke kankers. Bovendien kan moleculaire karakterisering van deze interacties belangrijke mediatoren van CAF-gestuurde oncogenese onthullen, wat veelbelovende doelen biedt voor therapeutische interventie.

Inleiding

Prostaatkanker (PCa) is de meest gediagnosticeerde vorm van kanker bij mannen in bijna tweederde van de landen wereldwijd. In 2022 werden ongeveer 1.5 miljoen nieuwe gevallen gemeld, resulterend in 3,97,000 doden wereldwijd. Deze cijfers maken PCa de op één na meest voorkomende vorm van kanker en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak door kanker bij mannen1.

PCa is een multifocale en biologisch complexe ziekte, gekenmerkt door substantiële intertumorale heterogeniteit 2,3,4, diverse moleculaire subtypes en variabele klinische uitkomsten 5,6, die allemaal een significante invloed hebben op de prognose en therapeutische respons7.

Hoewel de cruciale rol van de tumormicro-omgeving (TME) bij het ontstaan en de progressie van prostaattumoren goed ingeburgerd is 8,9, blijven de moleculaire interacties tussen tumorcellen en het omringende stromale compartiment onvolledig begrepen. Hoewel het algemeen bekend is dat de micro-omgeving van de prostaattumor (TME) een cruciale rol speelt bij het ontstaan en de progressie van tumoren, blijven de moleculaire interacties tussen tumorcellen en het omringende stroma onvoldoende gedefinieerd. De TME omvat een verscheidenheid aan stromale cellen, waaronder die van mesenchymale en immuunoorsprong, die worden geactiveerd als reactie op tumorafgeleide signalen en vervolgens tumorbevorderende functies krijgen10,11. Hiervan vertegenwoordigen kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's) vaak de meest voorkomende stromale populatie. CAF's dragen bij aan de hermodellering van de extracellulaire matrix (ECM), bevorderen de groei van tumoren en vergemakkelijken de invasie en migratie van kankercellen 4,11,12,13. Door uitgescheiden factoren en directe cel-celinteracties beïnvloeden CAF's ook proliferatie, invasie en therapieresistentie. Met name CAF's zijn een heterogene populatie. Hoewel ze over het algemeen geassocieerd zijn met pro-tumorigene functies, kunnen sommige subtypes een tumoronderdrukkende rol spelen14,15. Belangrijk is dat de afwezigheid van unieke markers voor CAF's een uitdaging vormt voor hun precieze identificatie en de functionele ontleding van hun diverse rollen12,16.

Een robuuste benadering om de functionele overspraak tussen CAF's en tumorcellen te onderzoeken, omvat het isoleren van primaire CAF's en gematchte normale fibroblasten (NF's), en vervolgens hun respectieve invloed op het gedrag van tumorcellen, zoals proliferatie, migratie, kolonievorming en verankeringsonafhankelijke groei 17,18,19. Dit artikel beschrijft een verfijnd, zeer reproduceerbaar protocol voor het isoleren van CAF's en NF's uit radicale prostatectomiemonsters van PCa-patiënten met een hoog risico. Een cruciaal onderdeel van dit protocol is de nauwkeurige identificatie en dissectie van tumor en tumorvrije regio's door een deskundige uropatholoog, waardoor CAF's en NF's van dezelfde patiënt kunnen worden afgeleid. Deze gepaarde steekproefbenadering helpt bij het controleren van intertumorale heterogeniteit en individuele patiëntspecifieke variabelen die fibroblastfenotypes kunnen beïnvloeden 20,21,22. Om ervoor te zorgen dat er voldoende tumorweefsel beschikbaar is, richten we ons op monsters van patiënten met een Gleason-score ≥7.

Betrouwbare fenotypische karakterisering van de geïsoleerde fibroblasten vereist het gebruik van meerdere markers om ze te onderscheiden van andere celtypen, met name epitheelcellen, die overlappende markerexpressie kunnen delen16. Aangezien primaire PCa-fibroblasten doorgaans na 10-15 passages senescentie ondergaan, wat langetermijnanalyses bemoeilijkt, presenteren we ook een protocol voor celonsterfelijkheid via stabiele expressie van de menselijke telomerase reverse transcriptase (hTERT)23.

Om de functionele effecten van CAF's en NF's op tumorcellen te onderzoeken, hebben we verschillende experimentele strategieën getest en geoptimaliseerd. Aangezien CAF's hun invloed uitoefenen via zowel uitgescheiden factoren als direct cel-celcontact24, worden twee complementaire testsystemen ontwikkeld: (1) behandeling van kankercellen met fibroblastgeconditioneerd medium (CM), en (2) directe co-cultuur van fibroblasten en tumorcellen. Deze tests evalueren de belangrijkste eigenschappen van kankercellen, waaronder proliferatie, verankeringsonafhankelijke groei en migratie. Om de invloed van uitgescheiden factoren te standaardiseren, werden geconditioneerde media van CAF's en NF's geconcentreerd en gekwantificeerd (conCM) op basis van het totale eiwitgehalte.

Het aantonen van significante functionele effecten door middel van deze tests kan de identificatie van kritische mediatoren van CAF-gestuurde tumorigenese ondersteunen, wat potentiële doelen voor therapeutische interventie biedt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in volledige overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor het gebruik van klinische monsters, zoals goedgekeurd door het bio-ethisch comité van het Città della Salute Molinette-ziekenhuis in Turijn, Italië. Alle monsters werden verkregen na de ondertekening van de geïnformeerde toestemming door de deelnemende patiënten. Het volgende gedeelte biedt een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor de isolatie van kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's) en hun gematchte normale fibroblast (NF) tegenhangers. Het protocol omvat dissectie van de tumor en aangrenzende niet-tumorachtige gebieden, weefselverwerking, celcultuur en zowel fenotypische als functionele karakterisering van de geïsoleerde cellen. Alle procedures moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een gecertificeerde bioveiligheidskast. De cellen werden gekweekt bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 met behulp van volledig Dulbecco's Modified Eagle Medium (cDMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine, tenzij anders vermeld. Alle centrifugatiestappen worden uitgevoerd met de rem ingeschakeld. Raadpleeg de Materiaaltabel voor een uitgebreide lijst van reagentia, materialen en apparatuur die in het hele protocol worden gebruikt. Deze methodologie is geoptimaliseerd voor prostaatkankermonsters met een hoog risico, met een Gleason-score van 4+3 of hoger.

1. Chirurgische monsterdissectie

OPMERKING: Deze procedure werd uitgevoerd op chirurgische monsters die waren verzameld uit radicale prostatectomieprocedures25 uitgevoerd bij patiënten met hooggradige prostaatkanker (PCa), en beheerd volgens gestandaardiseerde protocollen, gebaseerd op interne institutionele richtlijnen en gevestigde internationale literatuur en best practices 26,27,28.

  1. Plaats de prostaatklier onder een bioveiligheidskap op een steriel laken en oriënteer deze volgens de anatomische oriëntatiepunten.
    OPMERKING: Deze procedure moet worden uitgevoerd door een ervaren uropatholoog.
  2. Gebruik een steriel mes om weefselplakjes weg te snijden uit gebieden die in het preoperatieve biopsierapport zijn geïdentificeerd als neoplastisch of vrij van tumorcellen.
  3. Voer een snelle cryostatische analyse29 uit op beide weefselmonsters, door 2,5 μm dikke weefselcoupes voor te bereiden en deze te kleuren met hematoxyline en eosine (H&E) om de aan- of afwezigheid van tumorcellen in de geselecteerde regio's te verifiëren, in overeenstemming met de diagnostische criteria voor prostaatadenocarcinoom van de laatste editie van de WHO-classificatie30 (zie figuur 1A).
    OPMERKING: Als er discrepanties optreden, herhaal dan het bemonsteringsproces totdat histologische bevestiging van zowel neoplastische als niet-neoplastische gebieden is verkregen.
  4. Snijd ongeveer 10 mm2 monsters weg uit de neoplastische en niet-neoplastische regio's, plaats ze in conische buizen van 15 ml met 7 ml ijskoude weefselopslagbuffer en bewaar ze op ijs voor volgende procedures.
    OPMERKING: Monsters kunnen in deze buffer maximaal 48 uur bij 4 °C worden bewaard.

2. Isolatie van fibroblasten

OPMERKING: Alle volgende verwerkingsprocedures moeten worden uitgevoerd op ijs bij 4 °C, tenzij anders vermeld. Zie figuur 1 A voor een schema.

  1. Dag 1: Weeg de weefselmonsters.
    OPMERKING: Gemiddeld wordt 70-100 mg verkregen.
  2. Verplaats naar schaaltjes van 6 cm en voer vier opeenvolgende wasbeurten uit, twee keer in 4 ml ijskoude PBS en twee keer in 4 ml ijskoude cDMEM, beide aangevuld met 200 E/ml penicilline, 200 μg/ml Streptomycine (2x), met behulp van een steriele tang om het weefsel van de ene schaal naar de andere over te brengen.
  3. Verstoor het weefsel mechanisch door het in een plaat van 6 cm op ijs te leggen, met 1 ml DMEM aangevuld met 100 E/ml penicilline-G en 100 μg/ml streptomycine, en hak het vervolgens in kleine stukjes (<1 mm2) met behulp van een schaar of mesjes.
  4. Breng over naar een conische buis van 15 ml met 5 ml ijskoude cDMEM. Centrifugeer bij 754 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  5. Gebruik een pipet van 10 ml om het bovenstaande voorzichtig te verwijderen en suspendeer de pellet opnieuw in 5 ml ijskoude cDMEM. Centrifugeer opnieuw bij 754 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  6. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellet opnieuw in Collagenase II (1 mg/ml in DMEM) met 1 ml/100 mg weefsel. Ga over op een microbuisje van 1,5 ml.
    OPMERKING: Vanwege de variabiliteit van collagenasebatches, test u verschillende batches en zorgt u ervoor dat ze voldoende hebben om alle voorspelde isolaties uit te voeren.
  7. Bedek de buisjes met paraffinefilm en verteer de monsters O/N (8-12 uur) bij 37 °C met continu schommelen.
    OPMERKING: Voer de volgende stappen uit op dag 2.
  8. Breng de monsters over in conische buisjes van 15 ml en voeg 5 ml ijskoud cDMEM toe aan de celsuspensie om collagenase te inactiveren en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 754 x g bij 4 °C.
    OPMERKING: Collagenase wordt weggegooid door het op te zuigen in een container die wasmiddel bevat.
  9. Zuig het bovenstaande op met behulp van een pipet van 10 ml en resusureer de pellet in 1 ml 0,05% trypsine/EDTA. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C en schud af en toe.
  10. Voeg 1 ml DNase I toe aan de monsters en meng goed. Gebruik een vers bereide oplossing van 25 mg/ml in PBS.
    OPMERKING: DNase I-behandeling in dit stadium helpt bij het verkrijgen van de eencellige oplossing.
  11. Centrifugeer bij 754 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  12. Gebruik een pipet van 10 ml om het supernatant op te zuigen en suspendeer de pellet in 5 ml koud cDMEM. Centrifugeren bij 754 x g gedurende 5 minuten 4 °C.
  13. Resuspendeer cellen in 20% FBS cDMEM. Plaat en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende ten minste 3 dagen. Zorg ervoor dat u de schaal niet verplaatst/kantelt. Verdeel voor 70-100 mg weefsel de celsuspensie in 2 schaaltjes van 3,5 cm, in 2 ml medium. Indien nodig dienovereenkomstig afschalen.
    OPMERKING: Minder dan 50 mg weefsel zal resulteren in inefficiënte celafleiding. Het schema voor splitsen en bevriezen wordt weergegeven in figuur 1B.
  14. Controleer na 3 dagen de cellen op morfologie/levensvatbaarheid en vervang 2/3 van het medium om de door de cellen geproduceerde groeifactoren te behouden. Het duurt ongeveer 7-10 dagen voordat de cellen samenvloeien en het medium om de dag vervangen.
  15. Eenmaal samenvloeiend, passeert u de cellen in een schaaltje van 10 cm in 20% FBS cDMEM.
  16. Vervang het medium om de dag, gebruik twee keer 15% FBS-medium, dan één keer, 12,5%, dan 10%. Voor FACS-analyses volgen RNA- en eiwitextractie- en vriesvoorraden het schema in figuur 1B.
  17. Splits cellen wanneer ze ongeveer 100% confluent zijn (ongeveer 10 dagen). Was 2-3 keer met overvloedige PBS gedurende 5 minuten elk. Voeg 1% trypsine/EDTA (2x) toe en plaats in de incubator, controleer om de paar minuten op celloslating.

3. Conditie kweken

  1. Passage de cellen alleen als ze 100% confluent zijn, niet meer dan 1:3.
  2. Vries aliquots in die overeenkomen met 50% van een confluente schaal van 10 cm in 0,5 ml ijskoud vriesmedium (10% DMSO in FBS). Ontdooi elk aliquot in een schaaltje van 10 cm.
    OPMERKING: De gemiddelde verdubbelingstijd is 80-90 uur.

4. FACS-analyse

OPMERKING: Dit protocol zorgt voor een betrouwbare karakterisering van de fibroblastpopulatie en identificeert mogelijke besmetting door epitheel-, endotheel- of immuuncellen. FACS-analyse wordt uitgevoerd in passage 2, zoals geïllustreerd in figuur 2A.

  1. Oogst cellen en suspendeer ze opnieuw in FACS-buffer (PBS plus 2% FBS) in een concentratie van 106 cellen/ml.
  2. Label flowcytometriebuisjes en voeg in elk van hen 1 x 105 cellen toe in een volume van 100 μL. Voor kleuring met 4 antilichamen, bereid 11 buisjes voor om rekening te houden met zowel kleuring als gating, als volgt (Tabel 1)
    OPMERKING: 1 buisje, geen antilichamen (ongekleurde controle), om autofluorescentie van cellen te beoordelen, 1 buisje met antilichaamisotypecontrole, om aspecifieke binding te beoordelen, 4 buisjes, elk met een enkel antilichaam, ter compensatie; compensatiekralen kunnen cellen vervangen, 4 Fluorescentie Minus One (FMO) buisjes voor gating, elk zonder een van de antilichamen, 1 buisje met alle 4 de antilichamen (daadwerkelijk monster). De volgende fluorescerend gelabelde antilichamen worden gebruikt (zie materiaaltabel): (1) Anti-EpCAM-PE (epitheelcelmarker), (2) Anti-CD31-VioBlue (endotheelcelmarker), (3) Anti-CD45-FITC (immuuncelmarker), (4) Anti-CD90-APC (fibroblastcelmarker). Antilichamen geconjugeerd aan andere fluoroforen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de beschikbare flowcytometerfilters. Voer alle stappen op ijs uit om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden.
  3. Incubeer cellen met fragmentkristalliseerbare receptoren (FcR)-blokkers, zoals gezuiverde anti-CD16/CD32-antilichamen of blokkerende buffer (PBS 1%-2% BSA). Gebruik 1-5 μL FcR-blokkerend reagens per 100 μL celsuspensie en incubeer bij 4 °C gedurende 10-15 minuten.
  4. Ga direct verder met de kleuring zonder te wassen. Voeg de juiste antilichaamverdunningen of de bijbehorende isotypecontroles toe aan de buisjes, zoals aangegeven in tabel 1.
  5. Meng voorzichtig en incubeer 30 minuten bij 4 °C in het donker.
  6. Wassen met 2 ml FACS-buffer.
  7. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g, bij 4 °C.
  8. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen in 1 ml verse FACS-buffer.
  9. Voeg levensvatbaarheidskleurstof (propidiumjodide) toe volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
  10. Verkrijg de monsters op een flowcytometer.
  11. Gebruik compensatiebesturingselementen met één kleuring om de compensatiematrix in te stellen. Pas voor gegevensanalyse de volgende poortstrategie toe op FACS-dichtheidsplots:
  12. Voorwaartse en zijwaartse verstrooiingspoort: plot FSC-A vs. SSC-A en ontwerp een gebied rond de hoofdcelpopulatie om cellulair afval uit te sluiten.
  13. Voor doubletuitsluiting: perceel FSC-A vs. FSC-W (of FSC-H vs. FSC-A) en ontwerp een gebied om klompen cellen uit te sluiten, die een grotere breedte vertonen ten opzichte van het gebied (of een groter gebied ten opzichte van de hoogte). Selecteer de afzonderlijke cellen en voer dezelfde procedure uit, waarbij SSC-A versus wordt uitgezet. SSC-W (of SSC-H vs. SSC-A) om de zuiverheid van de populatie van de afzonderlijke cel te vergroten.
  14. Zet de levensvatbaarheidskleurstof (d.w.z. propidiumjodide) in kaart vs. SSC-A en selecteer negatieve actieve cellen.
  15. Zet op levende cellen CD326 (x-as) vs. CD31 (y-as); gebruik de bijbehorende FMO-samples om poorten nauwkeurig in te stellen. FMO maakt het mogelijk om rekening te houden met de verspreiding van fluorescentie in een specifiek kanaal veroorzaakt door de andere fluoroforen.
    1. Kijk naar het CD326 FMO-monster en teken een kwadrantpoort die alle cellen in de linker kwadranten omvat (d.w.z. negatief voor CD326). Herhaal dezelfde procedure met behulp van het CD31 FMO-monster om de poort aan te passen zodat alle FMO-cellen in de onderste kwadranten zitten (d.w.z. negatief voor CD31). Gebruik dit kwadrant om de monsters te analyseren en selecteer cellen in het kwadrant linksonder (CD31-CD326-).
  16. Herhaal dezelfde procedure door CD326 (x-as) uit te zetten vs. CD45 (y-as), met behulp van de CD326 FMO en de CD45 FMO om de kwadrantpoort in te stellen. Gebruik dit kwadrant om alle monsters te analyseren en selecteer cellen in het kwadrant linksonder (CD45- CD326-).
  17. Perceel CD90 vs. SSC-A en gebruik de CD90 FMO om een gebied in te stellen dat negatieve cellen uitsluit en alleen CD90+ bevat. Gebruik dit gebied om alle monsters te analyseren en het percentage CD90+ -cellen te meten. Representatieve resultaten worden weergegeven in figuur 2A.

5. Fibroblasten onsterfelijkheid

OPMERKING: Onsterfelijkheid van CAF- en NF-populaties wordt bereikt door stabiele transductie met een retrovirale vector die hTERT tot expressie brengt. Hieronder staan de protocollen om infectieuze pseudovirale deeltjes te bereiden en cellen te transduceren.

  1. Productie van retrovirale deeltjes
    1. Dag 1, poly-L-lysinecoating en celbeplating: Smeer een schaal van 10 cm in met 6 ml poly-L-lysineoplossing (0,1 mg/ml in H2O), incubeer 5 minuten onder de TC-kap, aspireer en laat de geopende schaal onder de kap drogen voordat u 3 x 10cellen van 6 HEK293T plateert.
    2. Dag 2: Voeg 30 μL kationlipide-gemedieerd transfectiereagens toe aan 0,75 ml antibioticavrij lipofectie-geoptimaliseerd medium.
    3. Voeg tegelijkertijd 2 μg pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector en 2 μg pBABE-puro-hTERT-plasmiden toe aan nog eens 0,75 ml antibioticavrij lipofectie-geoptimaliseerd medium.
    4. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
    5. Meng de twee verdunningen in een conische buis van 15 ml en incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
    6. Vervang ondertussen het HEK293T medium door 6 ml lipofectie-geoptimaliseerd medium aangevuld met 10% FBS.
    7. Verdeel de DNA-complexen voorzichtig over het oppervlak van de schaal en incubeer gedurende 6 uur tot O/N in een bevochtigde CO2 -incubator.
    8. Dag 3: Vervang het medium door 7 ml cDMEM en incubeer gedurende 48 uur.
      OPMERKING: Vanaf deze stap moet het werk worden uitgevoerd in een weefselkweekfaciliteit van bioveiligheidsniveau 3 (BSL3), volgens de institutionele regels.
    9. Verzamel op dag 5 het virusbevattende medium en filtreer door een spuitfilter van 0,22 μm.
    10. Aliquot en bewaren bij -80 °C.
  2. Virale transductie
    1. Dag 1: Plaat fibroblasten met lage doorgang bij 60% samenvloeiing in 2 putjes van een plaat met 6 putjes.
    2. Dag 2: Vervang het medium door 1 ml van het eerder geproduceerde pBABE-puro-hTERT retrovirale preparaat dat 8 μg/ml polybreen bevat en incubeer gedurende 12-16 uur.
    3. Dag 3: Vervang het virusbevattende medium door 2 ml cDMEM.
    4. Dag 4: Begin na 24 uur met twee rondes van 48 uur met priomycine selectie (2 μg/ml).
      OPMERKING: De concentratie moet empirisch worden bepaald voor elke batch antibioticum en celtype, en de laagste concentratie moet worden geselecteerd om alle cellen binnen 4 dagen na selectie te doden.
    5. Dag 8: Controleer of de niet-geïnfecteerde controlecellen allemaal zijn afgestorven. Vervang het medium door cDMEM en laat geïnfecteerde cellen groeien tot ze samenvloeien voordat je ze 1:3 passeert. Laat cellen samenvloeien en opnieuw 1:3 splitsen. In dit stadium kunnen de cellen de BLS3-faciliteit verlaten.
      OPMERKING: Bereid bevroren aliquots zo snel mogelijk voor. Om er zeker van te zijn dat de onsterfelijkheid heeft plaatsgevonden, moeten de cellen 5-6 keer worden gepasseerd en moet uw morfologie en duplicatiesnelheid worden gescoord, die niet mogen veranderen met de passages. Vergelijk onsterfelijke cellen functioneel met hun primaire tegenhangers, met behulp van de hieronder beschreven methoden.

6. Karakterisering van fibroblasten

  1. Fenotypisch analyseren van de geïsoleerde cellen voor de expressie van CAF/NF-markers en functioneel karakteriseren voor hun potentiële pro-oncogene activiteiten op tumorcellen.
    OPMERKING: De qPCR-oligonucleotiden en antilichamen die zijn geoptimaliseerd om markerexpressieniveaus op zowel RNA- als eiwitniveau te beoordelen, worden gerapporteerd in respectievelijk tabel 2 en tabel met materialen. Houd er rekening mee dat antilichamen tegen fibroblastactiveringseiwit (FAP) vaak niet-specifiek zijn. Zorg ervoor dat de juiste positieve en negatieve controles worden opgenomen31,32. Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om de overspraak tussen fibroblasten en tumorcellen te beoordelen. Hier worden twee alternatieve benaderingen beschreven, bestaande uit het behandelen van tumorcellen met geconditioneerd medium (CM) afgeleid van CAF's of NF's, of het gelijktijdig kweken van fibroblasten en tumorcellen. De werkzaamheid van beide benaderingen om de proliferatie van tumorcellen te verbeteren, wordt beschreven.

7. Bereiding en concentratie van geconditioneerd medium

OPMERKING: Het geconditioneerde medium wordt na afname geconcentreerd en nauwkeurig gedoseerd om de vergelijking tussen verschillende cellen te vergemakkelijken.

  1. Plaat de cellen op 70% confluentie in een schaaltje van 15 cm in cDMEM.
  2. Schakel de volgende dag over op 15 ml hongermedium (DMEM zonder FBS) en incubeer gedurende 48 uur om de CM te produceren.
  3. Verzamel de CM, centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT en filtreer door een filter van 0,22 μm om celresten te verwijderen en steriliseer.
  4. Breng over naar concentreerbuizen (MWCO 10.000 Da) en centrifugeer 20 minuten bij 2000 x g en 4 °C, of volgens de instructies van de fabrikant, om ongeveer 1 ml van de geconcentreerde CM (conCM) te verkrijgen, d.w.z. 15 x concentratie.
  5. Doseer de conCM en bewaar bij -80 °C.
  6. Kwantificeer het eiwitgehalte van de verzamelde conCM met behulp van een colorimetrische eiwittest.
    OPMERKING: De gemiddelde verkregen concentratie is 0,5 en 2 μg/μL. Lagere concentraties kunnen nog steeds worden gebruikt.

8. Proliferatietest

OPMERKING: Celproliferatie (met behulp van DU145- of LNCaP menselijke PCa-cellijnen) werd beoordeeld met behulp van een levend celanalyse-instrument onder twee verschillende instellingen, waarbij de tumorcellen ofwel werden behandeld met conCM, ofwel ze samen werden gekweekt met CAF's of NF's. In dit geval moeten fluorescerende tumorcellen worden gebruikt. Representatieve resultaten worden weergegeven in figuur 3.

  1. Proliferatietest na behandeling met conCM
    OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor DU145-cellen; Verschillende cellen kunnen aanpassingen vereisen.
    1. Plaattumorcellen in cDMEM in een plaat met 96 putjes (750 cellen/putje), rekening houdend met ten minste 3 replicaten per aandoening, en incubeer O/N.
    2. Vervang cDMEM door hongermedium, al dan niet aangevuld, door 50 μg/ml conCM.
    3. Breng de plaat over naar de kamer van het instrument voor analyse van levende cellen in de broedmachine.
    4. Laat 30 minuten opwarmen bij 37 °C en begin dan met de eerste scan.
    5. Gebruik het fasecontrastkanaal, kies een geschikt doel en het aantal gewenste velden/put (10x objectief en 5 velden/put worden aanbevolen) en het standaard scantype. Scan elke 6 uur gedurende 4-5 dagen (duur moet empirisch worden bepaald voor aandoeningen en celtypen).
    6. Voer de analyse uit volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
    7. Bereken voor elke put (technische replica's voor elke voorwaarde) de vouwverandering ten opzichte van de waarde op tijdstip nul. Genereer de bijbehorende grafieken en beoordeel de statistische significantie met behulp van de juiste software.
  2. Proliferatietest bij co-kweek
    1. Plaat 750 RFP-expressie DU145-cellen en CAF's of NF's in een verhouding van 1:3 in cDMEM in een plaat met 96 putjes.
    2. Schakel de volgende dag over op 2% FBS DMEM. Breng de plaat over naar de kamer van het instrument voor live-celanalyse in de incubator en begin gedurende 4 dagen elke 6 uur met standaardscanning, waarbij zowel het fasecontrast als het oranje kanaal worden gebruikt.
    3. Voer een proliferatieanalyse uit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
    4. Bereken voor elke put (technische replica's voor elke voorwaarde) de vouwverandering ten opzichte van de waarde op tijdstip nul. Genereer de bijbehorende grafieken en beoordeel de statistische significantie met behulp van de juiste software.

9. Migratietest voor wondgenezing

OPMERKING: Hier wordt een geautomatiseerde versie van de klassieke scratch-test33 gepresenteerd om celmigratie te meten, met behulp van een live celanalyse-instrument.

  1. Plaat tumorcellen in een plaat met 96 putjes die geschikt is voor het analyse-instrument voor levende cellen om een confluente monolaag te verkrijgen.
  2. Behandel de cellen de volgende dag met 10 μg/ml mitomycine C gedurende 2 uur.
    OPMERKING: Deze stap is essentieel om celproliferatie tijdens de test te voorkomen, wat de resultaten zou verwarren.
  3. Breng de kras aan op de putjes volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
  4. Spoel met 100 μL PBS om losgeraakte cellen te verwijderen.
  5. Voeg hongermedium toe, met 50 mg/ml of zonder (controle).
  6. Plaats de plaat in de analysekamer voor levende cellen in de broedmachine.
  7. Programmeer na 30 minuten het aanbevolen scanprotocol voor wondgenezing, elke 4 uur gedurende 1 dag of langer, afhankelijk van de cellen en omstandigheden.
  8. Analyseer de resultaten volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).

10. Verankeringsonafhankelijke groei door middel van zachte agar-assay

  1. Plaat CAF's of NF's met 70% samenvloeiing in platen met 12 putjes, waardoor er drie lege putten overblijven als controle.
  2. Bereid de volgende dag een 4x zachte agarbouillonoplossing (3,6%) door 0,45 g laagsmeltende agar toe te voegen aan 12,5 ml PBS in een conische buis van 50 ml onder steriele omstandigheden.
  3. Los op in een magnetron. Pas op voor overmatig koken, waardoor de oplossing zich zou concentreren.
  4. Koel af tot 37 °C en bereid vervolgens 1x een werkoplossing door 1:4 te verdunnen met voorverwarmd cDMEM.
  5. Zuig het medium van de plaat met 12 putjes op en voeg aan elk putje 500 μL 1x agaroplossing toe.
  6. Laat 20 minuten stollen bij 4 °C en bewaar de rest van de agaroplossing bij 37 °C.
  7. Probeer ondertussen de tumorcellen en bereid een celsuspensie van 2 x 104 cellen/ml.
  8. Meng gelijke hoeveelheden van de celsuspensie en de agar 1x-oplossing door meerdere keren te pipetteren en doseer 500 μL (d.w.z. 5000 cellen) bovenop de eerste agarlaag in elk putje. Zorg ervoor dat u ten minste 10% overtollige celsuspensie bereidt.
  9. Laat de agar stollen door 20 minuten te incuberen bij 4 °C.
  10. Voeg 1 ml cDMEM toe aan elk putje en vernieuw het om de dag door het medium voorzichtig vanaf de rand van het putje op te zuigen en het verse medium naar het midden toe te voegen, bijna druppelsgewijs om te voorkomen dat de zachte agarlaag wordt verplaatst.
  11. Incubeer totdat er gemakkelijk zichtbare kolonies verschijnen. DU145-cellen hebben meestal ongeveer 12 dagen nodig, met kleine variaties.
  12. Gooi het medium weg en kleuring kolonies door 200 μL nitroblue tetrazolium chloride oplossing (1 mg/ml in PBS) toe te voegen. Incubeer een nacht bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine.
  13. Zodra de kolonies zijn gekleurd, gooit u de kleurstofoplossing weg en maakt u afbeeldingen met behulp van een stereomicroscoop. Plaats de plaat op de microscooptafel en stel de vergroting in op de laagste waarde (0.8x) om ervoor te zorgen dat de hele put zichtbaar is. Gebruik de grove scherpstelknop om de kolonies scherp in beeld te brengen en pas vervolgens de belichtings- en modusinstellingen aan voordat u de foto's maakt.
  14. Gebruik de juiste software34 om het aantal kolonies en het bezette gebied te kwantificeren door de stappen in aanvullend bestand 1 te volgen.
  15. Scoor het aantal en de grootteverdeling van de kolonies (zie figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

CAF- en NF-paren van 7 hoogwaardige PCa-patiënten werden met dit protocol met succes geïsoleerd. De leeftijd van de patiënt bij de operatie en de Gleason-scores zijn samengevat in tabel 3. Om de zuiverheid van de afgeleide fibroblastpopulaties te evalueren, werden passage twee primaire CAF's en NF's losgemaakt en gekleurd met de aangegeven fluorescerende antilichamen of met propidiumjodide om apoptose te beoordelen. Representatieve resul...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De afleiding en analyse van cellen uit PCa-weefsel leveren een relevant experimenteel model op, vooral gezien het feit dat de beschikbare diermodellen de anatomie en ziekteprogressie van de menselijke prostaat niet volledig repliceren37. De prostaatklieren van chimpansees zijn anatomisch vergelijkbaar met die van mensen, maar vertonen een langzame, stochastische ziekteprogressie, naast het impliceren van ethische beperkingen. Honden verschillen aanzienlijk in pros...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Italiaanse Vereniging voor Kankeronderzoek (AIRC), IG16930 en IG24851 aan VP; het Italiaanse Ministerie van Universiteit en Onderzoek (MIUR PRIN 2017 en 2022 tot VP); de Truus en Gerrit van Riemsdijk Stichting, Liechtenstein, donatie aan V.P.; Regio Piemonte (Deflect). A.S. werd gesteund door een postdoctorale beurs van de Italiaanse Cancer Research Foundation (FIRC) en L.A. werd gesteund door Fondazione Umberto Veronesi. Figuur 2 is gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12 well plateSarstedt833921
24 well plateSarstedt833922
6 well plateSarstedt833920
96 well plateSarstedt833924
Anti-GAPDH Mouse mAb (6C5)Sigma AldrichCB1001Source: Mouse; Dilution for WB: 1:1000
aSMASigma AldrichA5228 Source: Mouse; Dilution for WB: 1:3000
CaveolinCell Signalling TechnologyCST3267Source: Rabbit; Dilution for WB: 1:1000
CD31-VioBlueMilteny Biotec130-119-980Flow Cytometry Ab, Endothelial cell marker
CD326-PE (EpCAM)Milteny Biotec130113-826Flow Cytometry Ab, Epithelial cell marker
CD45-FITCMilteny Biotec130-110769Flow Cytometry Ab, Pan leukocyte marker
CD90-APCMilteny Biotec130-114-903Flow Cytometry Ab, Fibroblast marker
Collagen VI (COL6A1)Abcamab182744Source: Rabbit; Dilution for WB: 1:1000
Conical tube 15 mLSarstedt62554502
Conical tube 50 mLSarstedt62547254
Cryopure 2 mL microtubesSarstedt72380992
Culture plate 100 mm diameter Corning353003
Culture plate 100 mm diameter Corning353025
Culture plate 60 mm diameter Corning353002
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldirchD8418Use in a Biological hood
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco11965092Store at 4 °C, use in a Biological hood
FAPAbcamab53066Source: Rabbit; Dilution for WB: 1:500
FcR Blocking Reagent, humanMilteny Biotec130-059-901Fc Blocker
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000044Store at 4 °C, use in a Biological hood
Filtered tips 10 µLSarstedt703010255
Filtered tips 100 µLSarstedt703030255
Filtered tips 1000 µLSarstedt703060255
Filtered tips 20 µLSarstedt703030265
Filtered tips 200 µLSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 µm Sarstedt831826102
Forcep2Biol1102412
FSP1/S100A4Cell Signalling TechnologyD9F9D (13018)Source: Rabbit; Dilution for WB: 1:2000
IL6Abclonal technologyA0286Source: Rabbit; Dilution for WB: 1:1000
ImageJNational Inst. of Healthversion 1.53cSoftware for image analysis
incucyte imagelock 96-well plateSartoriousBA-04857
Incucyte® SX5SartoriousSX5Live cell analysis instrument 
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific11668019cation lipid-mediated transfection reagent
MACS® Tissue Storage SolutionMilteny Biotec130-100-008
Microplate reader (600 nm absorbance)PromegaGM3500
Microtubes 1.5 mL Sarstedt7269001
NcadAbcamab18203Source: Rabbit; Dilution for WB: 1:1000
Nitro Blue Tetrazolium Sigma Aldirchn5514
Parafilm Sigma AldirchHS234526B
pBABE-puro-hTERTAddgene1771Store at -20 °C, use in a Biological hood
pCL-AmphoNovus Biological NBP2-29541Store at -20 °C, use in a Biological hood
PDGFRBSanta Cruzsc-432Source: Rabbit; Dilution for WB: 1:1000
Penicillin-Streptomycin (PS, 10,000 μg/mL) Gibco15140122Store at 4 °C, use in a Biological hood
Phase contrast microscope Olympus BX42
Phosphate Buffered Saline (PBS)HomemadeNaCl, 137 mM; KCl, 2.7 mM; Na2HPO4, 10 mM;KH2PO4, 1.8 mM. Autoclave and Store at RT
Poly-L-lysine solutionSigma AldirchP8920Store at 4 °C, use in a Biological hood
Puromycin dihydrochlorideSigma AldirchP8833
Secura Semi Micro BalanceSartoriusSECURA125-1S
Serological pipette 10 mL Sarstedt861254001
Serological pipette 2 mL Sarstedt861252001
Serological pipette 25 mL Sarstedt861256001
Serological pipette 5 mL Sarstedt861253001
STAT3CST9139Source: Mouse; Dilution for WB: 1:1000
STAT3 Y705CST9131Source: Rabbit; Dilution for WB: 1:1000
stereomicroscopeLeicaMZ125

Referenties

  1. Bray, F. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (6), 229-263 (2024).
  2. Yadav, S. S., Stockert, J. A., Hackert, V., Yadav, K. K., Tewari, A. K. Intratumor heterogeneity in prostate cancer. Urol Oncol. 36 (8), 349-360 (2018).
  3. Owen, J. S., Clayton, A., Pearson, H. B. Cancer-associated fibroblast heterogeneity, activation and function: Implications for prostate cancer. Biomolecules. 13 (1), 67(2023).
  4. Ge, R., Wang, Z., Cheng, L. Tumor microenvironment heterogeneity an important mediator of prostate cancer progression and therapeutic resistance. NPJ Precis Oncol. 6, 1-8 (2022).
  5. Pejčić, T., Todorović, Z., Đurašević, S., Popović, L. Mechanisms of prostate cancer cells survival and their therapeutic targeting. Int J Mol Sci. 24 (3), 2939(2023).
  6. Shoag, J., Barbieri, C. Clinical variability and molecular heterogeneity in prostate cancer. Asian J Androl. 18 (4), 543-548 (2016).
  7. Segura-Moreno, Y. Y., Sanabria-Salas, M. C., Varela, R., Mesa, J. A., Serrano, M. L. Decoding the heterogeneous landscape in the development of prostate cancer. Oncol Lett. 21 (5), 376(2021).
  8. Hägglöf, C., Bergh, A. The stroma-a key regulator in prostate function and malignancy. Cancers (Basel. 4 (2), 531-548 (2012).
  9. Teng, L. K. H., et al. Mast cell-derived SAMD14 is a novel regulator of the human prostate tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13 (6), 1-25 (2021).
  10. Galbo, P. M., Zang, X., Zheng, D. Molecular features of cancer-associated fibroblast subtypes and their implication on cancer pathogenesis, prognosis, and immunotherapy resistance. Clin Cancer Res. 27 (9), 2636-2647 (2021).
  11. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 1-30 (2021).
  12. Pederzoli, F., et al. Stromal cells in prostate cancer pathobiology: Friends or foes. Br J Cancer. 128 (6), 930-939 (2022).
  13. Sasaki, T., Franco, O. E., Hayward, S. W. Interaction of prostate carcinoma-associated fibroblasts with human epithelial cell lines in vivo. Differentiation. 96, 40-48 (2017).
  14. Cirri, P., Chiarugi, P. Cancer-associated fibroblasts, and tumor cells: A diabolic liaison driving cancer progression. Cancer Metastasis Rev. 31 (1-2), 195-208 (2012).
  15. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: A dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
  16. Kahounová, Z. The fibroblast surface markers FAP, anti-fibroblast, and FSP are expressed by cells of epithelial origin and may be altered during epithelial-to-mesenchymal transition. Cytometry A. 93 (9), 941-951 (2018).
  17. Giannoni, E., et al. Reciprocal activation of prostate cancer cells and cancer-associated fibroblasts stimulates epithelial-mesenchymal transition and cancer stemness. Cancer Res. 70 (17), 6945-6956 (2010).
  18. Paland, N., et al. Differential influence of normal and cancer-associated fibroblasts on the growth of human epithelial cells in an in vitro cocultivation model of prostate cancer. Mol Cancer Res. 7 (8), 1212-1235 (2009).
  19. Jaeschke, A., et al. Cancer-associated fibroblasts of the prostate promote a compliant and more invasive phenotype in benign prostate epithelial cells. Mater Today Bio. 8, 100073(2020).
  20. Ellem, S. J., et al. A pro-tumourigenic loop at the human prostate tumor interface orchestrated by oestrogen, CXCL12 and mast cell recruitment. J Pathol. 234 (1), 86-98 (2014).
  21. Lawrence, M. G., et al. Alterations in the methylome of the stromal tumor microenvironment signal the presence and severity of prostate cancer. Clin Epigenetics. 12 (1), 48(2020).
  22. Nguyen, E. V. Proteomic profiling of human prostate cancer-associated fibroblasts (CAF) reveals LOXL2-dependent regulation of the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 18 (7), 1410-1427 (2019).
  23. Smith, M. C., Goddard, E. T., Perusina Lanfranca, M., Davido, D. J. hTERT extends the life of human fibroblasts without compromising type I interferon signaling. PLoS One. 8 (3), e58233(2013).
  24. Kay, E. J., et al. Cancer-associated fibroblasts require proline synthesis by PYCR1 for the deposition of pro-tumorigenic extracellular matrix. Nat Metab. 4 (6), 693-710 (2022).
  25. Huynh, L. M., Ahlering, T. E. Robot-assisted radical prostatectomy: A step-by-step guide. J Endourol. 32, S28-S32 (2018).
  26. Srigley, J. R., et al. Protocol for the examination of specimens from patients with carcinoma of the prostate gland with guidance from the CAP Cancer and CAP Pathology Electronic Reporting Committees. , https://documents.cap.org/protocols/cp-prostate-2017-v4020.pdf (2017).
  27. Goldblum, J. R., Lamps, L. W., McKenney, J. K. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology E-Book. , https://books.google.it/books/about/Rosai_and_Ackerman_s_Surgical_Pathology.html?id=7ZEDwAAQBAJ (2024).
  28. Montironi, R., Beltran, A. L., Mazzucchelli, R., Cheng, L., Scarpelli, M. Handling of radical prostatectomy specimens: Total embedding with large-format histology. Int J Breast. 2012, (2012).
  29. Arcega, R. S., Woo, J. S., Xu, H. Performing and cutting frozen sections. Methods Mol Biol. 1897, 279-288 (2019).
  30. IARC. WHO Classification of Tumors, 5th edition, volume 8: Urinary and male genital tumors. , https://www.iarc.who.int/news-events/who-classification-of-tumours-5th-edition-volume-8-urinary-and-male-genital-tumours/ (2025).
  31. Sfanos, K. S., et al. If this is true, what does it imply? How end-user antibody validation facilitates insights into biology and disease. Asian J Urol. 6 (1), 10-25 (2019).
  32. Brennen, W. N., et al. Overcoming stromal barriers to immuno-oncological responses via fibroblast activation protein-targeted therapy. Immunotherapy. 13 (2), 155-175 (2021).
  33. Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration. J Vis Exp. (133), e58838(2019).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  35. Sauzay, C., Voutetakis, K., Chatziioannou, A. A., Chevet, E., Avril, T. CD90/Thy-1, a cancer-associated cell surface signaling molecule. Front Cell Dev Biol. 7, 444743(2019).
  36. True, L. D., et al. CD90/THY1 is over-expressed in prostate cancer-associated fibroblasts and could serve as a cancer biomarker. Mod Pathol. 23 (10), 1346(2010).
  37. Strand, D. W., Aaron, L. T., Henry, G., Franco, O. E., Hayward, S. W. Isolation and analysis of discreet human prostate cellular populations. Differentiation. 91 (4-5), 139(2015).
  38. Krönig, M., et al. Cell type-specific gene expression analysis of prostate needle biopsies resolves tumor tissue heterogeneity. Oncotarget. 6 (2), 1302-1314 (2014).
  39. Goldstein, A. S., et al. Purification and direct transformation of epithelial progenitor cells from primary human prostate. Nat Protoc. 6 (5), 656-667 (2011).
  40. Kassen, A., et al. Stromal cells of the human prostate: Initial isolation and characterization. Prostate. 28 (2), 89-97 (1996).
  41. Linxweiler, J., et al. Cancer-associated fibroblasts stimulate primary tumor growth and metastatic spread in an orthotopic prostate cancer xenograft model. Sci Rep. 10 (1), 12575(2020).
  42. Liu, A. Y., et al. Cell-cell interaction in prostate gene regulation and cytodifferentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10705-10710 (1997).
  43. Olumi, A., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Res. 59 (19), 5002(1999).
  44. Luthold, C., Hallal, T., Labbé, D. P., Bordeleau, F. The extracellular matrix stiffening: A trigger of prostate cancer progression and castration resistance. Cancers (Basel). 14 (12), 2887(2022).
  45. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  46. Yun, Y. R., et al. Fibroblast growth factors: Biology, function, and application for tissue regeneration. J Tissue Eng. 1 (1), 1-18 (2010).
  47. Baranyi, U., et al. Primary human fibroblasts in culture switch to a myofibroblast-like phenotype independently of TGF beta. Cells. 8 (7), 721(2019).
  48. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer-associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ProstaatkankerfibroblastenIsolatie van fibroblastenTumormicro omgevingGeconditioneerd mediumAnkeronafhankelijke groeiSoft agar assayFibroblast cocultuurTumorstromaFibroblastkarakterisering

Gerelateerde artikelen