Methodenartikel

Amplicon Sequencing met behulp van de Long-Read Sequencing-technologieën

DOI:

10.3791/68370

⸱

29 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is geoptimaliseerd voor gerichte diepe sequencing van 18 geneesmiddelresistentieregio's in Mycobacterium tuberculosis met behulp van een long-read sequencing-platform, gevolgd door analyse met een tuberculose-specifieke bio-informaticapijplijn die is ontworpen voor long-read gegevens.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) blijft de dringende noodzaak benadrukken van een snelle, kosteneffectieve en gebruiksvriendelijke diagnostische methode voor tuberculose (tbc) en resistente tuberculose (DR-tbc). Next-generation sequencing (NGS)-technologieën, onderschreven door de WHO, hebben de detectie van DR-TB aanzienlijk verbeterd. Hiervan maakt gerichte NGS (tNGS) gerichte detectie mogelijk van genetische mutaties die verband houden met resistentie tegen geneesmiddelen, waardoor traditionele op cultuur gebaseerde diagnostiek niet meer nodig is. Een veelgebruikte tNGS-test biedt snelle en uitgebreide gevoeligheidstests voor geneesmiddelen, maar is in de eerste plaats geoptimaliseerd voor sequencingplatforms met hoge nauwkeurigheid. De hoge kosten van deze sequencingsystemen hebben echter een beperkte toegankelijkheid in lage- en middeninkomenslanden, met name in Afrika. Draagbare sequencingtechnologieën bieden een veelbelovend alternatief en bieden flexibiliteit en verminderde infrastructuurvereisten. In deze studie werd DNA geëxtraheerd uit rifampicine-resistente tbc (rr-tb)-isolaten, geamplificeerd met behulp van een tNGS-assay en gesequenced op een draagbaar sequencingplatform. Dezelfde versterkingsproducten werden ook gesequenced op een zeer nauwkeurig short-read sequencing-platform om als referentie te dienen. Gegevens van de draagbare sequencer werden verwerkt met behulp van een bio-informaticapijplijn die was ontworpen voor long-read sequencing, terwijl short-read sequencing-gegevens werden geanalyseerd met behulp van een gevestigde webgebaseerde applicatie. De analyse toonde aan dat de long-read sequencing-benadering met succes hoogfrequente resistentie-geassocieerde varianten identificeerde die werden gedetecteerd door short-read sequencing, maar beperkingen vertoonde bij het detecteren van laagfrequente varianten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tuberculose (tbc) blijft wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak en vormt een voortdurende uitdaging voor de volksgezondheid, vooral in lage- en middeninkomenslanden 1,2. Ondanks initiatieven die gericht zijn op het verbeteren van tbc-bestrijdingsmaatregelen, is de vooruitgang traag verlopen, deels als gevolg van moeilijkheden bij het bereiken van snelle, nauwkeurige, kosteneffectieve en uitgebreide diagnostische technieken 3,4,5. Hoewel moleculaire diagnostische methoden zoals line probe assays (LPA's) en geautomatiseerde nucleïnezuuramplificatietests (NAAT's) de identificatie van tuberculose en resistente tuberculose (DR-TB) hebben versneld, beperkt hun beperkte mutatiedetectie grondige gevoeligheidstests voor geneesmiddelen (DST). Deze beperking is vooral belangrijk in landen met een hoge tbc-last 6,7,8,9.

Om deze beperkingen aan te pakken, heeft de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) het gebruik van next-generation sequencing (NGS) -technologieën aanbevolen, die naar voren zijn gekomen als krachtige hulpmiddelen voor tbc-surveillance en resistentiedetectie10,11. Zowel whole genome sequencing (WGS) als gerichte NGS (tNGS)-benaderingen bieden een bredere mutatiedekking, waardoor resistentie-geassocieerde varianten in meerdere geneesmiddelen kunnen worden geïdentificeerd 8,12,13,14,15. Hoewel whole genome sequencing (WGS) een uitgebreid DST-rapport biedt, maakt de afhankelijkheid van cultuur het ongeschikt voor snelle diagnostiek, aangezien cultuur tot zes weken kan duren 15,16,17. Gerichte NGS biedt een beter alternatief omdat het niet afhankelijk is van cultuur; Sequencing kan rechtstreeks worden uitgevoerd vanuit klinische monsters18. Als gevolg hiervan heeft de WHO het gebruik van drie tNGS-assays voor DST aanbevolen: Deeplex Myc-TB-assay: Deze test detecteert resistentie tegen rifampicine, isoniazide, fluoroquinolonen, aminoglycosiden (amikacine, kanamycine, capreomycine), ethambutol, pyrazinamide en ethionamide 19,20,21. Sentinel TB-test: Dit is gericht op resistentie tegen rifampicine, isoniazide, fluoroquinolonen en tweedelijns injecteerbare geneesmiddelen18,20. AQ-TB-test: Dit identificeert resistentie tegen rifampicine, isoniazide, fluoroquinolonen en tweedelijns injecteerbare geneesmiddelen. Deze assays zijn geoptimaliseerd voor gebruik op het short-read-platform vanwege de hoge nauwkeurigheid20. Aan de andere kant bieden long-read-platforms van ONT MinION realtime gegevens, overdraagbaarheid en het potentieel voor kosteneffectieve implementatie22,23. Het wijdverbreide gebruik van NGS wordt echter beperkt door de eisen van infrastructuur en kosten, vooral bij short-read-systemen10.

De Deeplex-test is de meest uitgebreide van de drie aanbevolen tests. De test was oorspronkelijk ontworpen om multiplex-PCR uit te voeren op 18 regio's die geassocieerd zijn met resistentie tegen 13 anti-tbc-geneesmiddelen. De WHO heeft het echter aanbevolen voor 10 anti-tbc-medicijnen, wat wijst op voldoende gevoeligheid en specificiteit. Deze studie optimaliseerde het voor gebruik met de ONT MK1B MinION, een long-read sequencing-platform. Het draagbare en herbruikbare flowcelsysteem van dit platform verlaagt zowel de infrastructuur- als de potentiële sequencingkosten per monster 4,22,23. Hoewel er andere long-read-compatibele assays zijn ontwikkeld, hebben ze meestal een beperkt DST-bereik, meestal gericht op slechts een beperkt aantal resistentiegenen. Daarentegen biedt de test een brede doeldekking, waardoor het een uitgebreider diagnostisch hulpmiddel is voor gedecentraliseerde DST24,25. Een gedetailleerde lijst van de genomische doelen die door de test worden versterkt en de bijbehorende geneesmiddelassociaties wordt gegeven in tabel 1, waarbij de diagnostische mogelijkheden van de test worden benadrukt25.

Voorafgaand aan DNA-extractie moeten monsters worden ontsmet en geïnactiveerd onder bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) omstandigheden, volgens de nodige veiligheidsmaatregelen 25,26,27. In elke run moeten interne versterking en externe controles worden opgenomen, waarbij besmetting wordt gevolgd door middel van negatieve controles en routinematige laboratoriumevaluaties25. Belangrijke kwaliteitsstatistieken, waaronder leesdiepte, dekkingsbreedte en versterkingssucces, moeten na de sequentiebepaling worden beoordeeld. Voor gerichte sequencing adviseert de WHO een minimale leesdiepte van 100x voor elke amplicon en een adequate dekking van alle gerichte geneesmiddelresistentieregio's om de detectie van kleine varianten mogelijk te maken die aanwezig zijn bij ≥5%28. De Wereldgezondheidsorganisatie onderschrijft deze gerichte sequencingmethoden voor het identificeren van resistentie tegen eerste- en tweedelijnsgeneesmiddelen, op voorwaarde dat er kwaliteitsborgingssystemen worden opgezet en dat alle doelregio's voldoende worden bestreken28.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd uitgevoerd als onderdeel van het TS ELiOT-project, dat op 21 oktober 2021 ethische goedkeuring kreeg van de Human Research Ethics Committee (HREC) van de Universiteit van Stellenbosch (N21/09/093). Bovendien kreeg het toestemming van Western Cape Health Research voor het gebruik van overheidsfaciliteiten. Monsters werden verzameld door een samenwerking met de NHLS Green Point en de Universiteit van Stellenbosch, onder het SU HREC-goedkeuringsnummer N09/11/296. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van het monster

  1. Inactivatie van warmte
    1. Incubeer de MGIT-culturen gedurende 1 uur bij 80 °C om volledige warmte-inactivatie onder BSL-3-omstandigheden te bereiken.
    2. Ga verder met DNA-extractie met behulp van de InstaGene-methode29.
  2. DNA-extractie
    1. Doe 5 ml door warmte geïnactiveerde MGIT-cultuur in een tube van 15 ml.
    2. Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    3. Verwijder het bovenstaande voorzichtig door te pipetteren en laat het bezinksel achter.
    4. Voeg 200 μl DNA-extractiereagens op basis van chelatie toe aan het sediment en incubeer gedurende 15 minuten bij 56 °C.
    5. Breng de oplossing over in een buis met schroefdop van 2 ml en voeg aan elk drie glasparels met een diameter van 2 mm toe.
    6. Vortex gedurende 10 s om de cellen te verspreiden en plaats de buizen gedurende 8 minuten in een droogbadincubator bij 100 °C.
    7. Homogeniseer de monsters met behulp van de parelkloppende homogenisator met de volgende instellingen: 3 cycli van 20 s bij 4,0 m/s.
    8. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij RT en breng voorzichtig 130 μL van het bovenstaande (DNA-bevattende vloeistof) over in een buis van 1,5 ml, waarbij sediment en vuil worden vermeden.
    9. Resuspendeer de kralen door te tikken of te vortexen en voeg 156 μL van de kralen toe aan de 1,5 ml buis met het geëxtraheerde DNA.
    10. Pipeter langzaam 10 keer op en neer om te mengen en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
    11. Plaats de buisjes 5 minuten op een magnetisch rek om de DNA-gebonden kralen te scheiden.
      OPMERKING: Een helder supernatans moet verschijnen boven een compacte pellet van donkere magnetische kralen aan de zijkant van de buis die naar de magneet is gericht, wat aangeeft dat het klaar is om het bovenstaande te verwijderen.
    12. Pipetteer het bovenstaande af zonder de kralen te verstoren.
    13. Voeg 100 μL vers bereide 80% ethanol toe aan de kralenkorrel terwijl deze op het rek staat en laat 30 s staan, verwijder dan de ethanol. Herhaal de wasstap.
    14. Laat de kralenkorrel 5 minuten aan de lucht drogen bij RT. Zorg ervoor dat de kralenkorrel er mat uitziet en dat er geen zichtbare vloeistof achterblijft voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    15. Verwijder de buis uit het magnetische rek.
    16. Voeg 25 μL nucleasevrij water (NFW) rechtstreeks toe aan de gedroogde korrels en suspendeer opnieuw door 10 keer zachtjes op en neer te pipetteren.
    17. Incubeer 5 minuten bij RT.
    18. Plaats de buis nog 5 minuten terug in het magnetische rek.
    19. Breng het geëlueerde DNA (supernatant) voorzichtig over in een nieuw buisje van 1,5 ml.
    20. Meet de DNA-concentratie met behulp van het hooggevoelige fluorescentie-gebaseerde dsDNA-kwantificeringsreagens.
      OPMERKING: Het DNA kan worden bewaard in een vriezer van -20 °C of doorgaan met PCR.
  3. Amplificatie (PCR)
    1. Multiplex PCR en post-PCR opruiming, volgens de instructies van de fabrikant25.
    2. Meet de DNA-concentratie met behulp van het hooggevoelige fluorescentie-gebaseerde dsDNA-kwantificeringsreagens.
  4. Gel elektroforese
    1. Bereid een agarosegel van 2% voor door agarosepoeder op te lossen in 1x TAE-buffer door middel van magnetronverwarming tot het volledig gesmolten is.
    2. Voeg 5 μL niet-toxische fluorescerende DNA-gelkleuring toe aan de gesmolten agarose en meng grondig.
    3. Giet het gelmengsel in een gelgietbakje met een kam om putjes te vormen.
    4. Laat de gel stollen bij RT.
    5. Eenmaal gestold, verwijdert u de kam en plaatst u de gellade in de elektroforesetank gevuld met 1x TAE-buffer.
    6. Laad 5 μL van een kb DNA-ladder gemengd met 5 μL laadbuffer in de eerste put.
    7. Meng voor elk PCR-product 5 μl van het product met 5 μl laadbuffer en laad deze in afzonderlijke putjes.
    8. Laat de gel gedurende 1 uur op 100 V draaien.
    9. Visualiseer de DNA-banden met behulp van het geldocumentatiesysteem met transilluminatie.

2. Voorbereiding van de ONT-bibliotheek

  1. Einde voorbereiding
    1. Bereken 100 ng van elk ampliconmonster op basis van de concentratie en breng het vereiste volume over in een schoon PCR-buisje.
    2. Om de totale massa (in ng) van amplicons in een bepaald monster te berekenen, vermenigvuldigt u de concentratie van het monster (ng/μL) met het resterende volume (μL) na kwaliteitscontrole (QC).
      OPMERKING: Als een monster bijvoorbeeld een concentratie heeft van 2 ng/μL en een restvolume van 1 μL post-QC, is de totale ampliconmassa:
      Totale massa = 2 ng/μL × 1 μL = 45 ng
      Gebruik de verdunningsformule om 10 ng amplicons voor sequencing voor te bereiden:
      C1V1 = C2V2
      Waarbij: C1 = 45 ng, V1 = onbekend, C2 = 10 ng, V2 = 1 μL, V1 = (C2 × V2) / C1 = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      Daarom moet μL van het initiële ampliconmonster worden gebruikt om 10 ng DNA te verkrijgen voor sequencing.
    3. Stel het totale volume van elk monster in op 12.5 μL met behulp van NFW.
    4. Meng de monsters voorzichtig door 10 keer op en neer te pipetteren en kort rond te draaien.
    5. Voeg aan elk monster 1,75 μl end-repair en A-tailing reactiebuffer en 0,75 μl endrepair en A-tailing enzymmengsel toe.
    6. Meng grondig door 10 keer op en neer te pipetteren en kort naar beneden te draaien.
    7. Incubeer de buisjes in een thermocycler bij 25 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door 65 °C gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Mocht de gebruiker in dit stadium besluiten het proces te staken, dan is het raadzaam om kralen te gebruiken voor de zuivering van het aan het einde geprepareerde DNA. Het gezuiverde DNA kan vervolgens worden bewaard bij 4 °C voor een maximale duur van zeven dagen.
  2. Native barcode ligatie
    1. Ontdooi en bereid de magnetische kralen voor op DNA-zuivering en grootteselectie, paramagnetische DNA-opruimkralen, EDTA en native barcodes (NB01-96) volgens de instructies van de fabrikant en plaats ze vervolgens op ijs.
    2. Voeg in nieuwe PCR-buisjes achtereenvolgens het volgende toe: 2,75 μL nucleasevrij water, 1 μL eindgeprepareerd DNA, 1,25 μL native barcodes (NB01-96) en 5 μL DNA-ligatie-enzymmengsel.
    3. Meng elke reactie door 10 keer voorzichtig te pipetteren, kort te draaien met een microcentrifuge en gedurende 20 minuten te incuberen bij RT.
    4. Voeg 1 μL EDTA toe aan elk putje, meng grondig door te pipetteren en draai kort.
    5. Monsters met poolbarcodes in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    6. Resuspendeer de DNA-opruimparels door vortex en voeg 0,7x het totale gepoolde monstervolume toe (bijv. voor 23 monsters met een totaal volume van 253 μL, voeg 177,1 μL kralen toe).
    7. Meng de oplossing door pipetteren en incubeer gedurende 10 minuten op een HulaMixer bij RT.
    8. Bereid 2 ml 80% ethanol voor door 1600 μL pure ethanol te mengen met 400 μL NFW.
    9. Plaats de buis 5 minuten op een magnetisch rek totdat het eluaat helder en kleurloos is.
    10. Verwijder het bovenstaande en gooi het weg zonder de korrel te verstoren.
    11. Was de kralen met 700 μL vers bereide 80% ethanol zonder de pellet te verstoren, verwijder vervolgens de ethanol en gooi deze weg.
    12. Herhaal de stap voor het wassen van ethanol.
    13. Centrifugeer de buis kort, plaats terug in het magnetische rek en verwijder de resterende ethanol.
    14. Laat de kralen 30 s aan de lucht drogen.
    15. Haal de buis uit het magnetische rek, suspendeer de kralen opnieuw in nucleasevrij water van 35 μl door zachtjes te tikken en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C.
    16. Plaats de buis terug in het magnetische rek totdat het eluaat helder en kleurloos is.
    17. Breng 35 μl van het eluaat over in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml voor de volgende stappen.
      OPMERKING: De bibliotheek kan in dit stadium 's nachts bij 4 °C worden bewaard.
  3. Adapter ligatie en opruimen
    1. Bereid de snelle DNA-ligatiereagenskit voor volgens de instructies van de fabrikant en plaats deze op ijs.
    2. Meng de Native Adapter (NA) en Quick Ligase door te pipetteren en leg ze op ijs.
    3. Ontdooi de elutiebuffer (EB) bij RT, vortex, centrifuge en plaats deze op ijs.
    4. Ontdooi Short Fragment Buffer (SFB) bij RT, vortex, centrifugeer en plaats op ijs.
    5. Meng het volgende in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met een lage bindingslaag: 30 μl gepoold monster met streepjescode, 5 μl native adapter (NA), 10 μl snelle ligatiereactiebuffer en 5 μl snelwerkend T4 DNA-ligase.
    6. Piket voorzichtig om te mengen, centrifugeer kort en incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
    7. Resuspendeer DNA-opruimkralen door vortexing en voeg 20 μL (0,4x) kralen toe aan de reactie.
    8. Meng voorzichtig door te pipetteren en incubeer op een HulaMixer gedurende 10 minuten bij RT.
    9. Pellet de kralen op een magnetisch rek en zuig het bovenstaande op zonder de pellet te verstoren.
    10. Was de kralen door 125 μL Short Fragment Buffer (SFB) toe te voegen, suspendeer opnieuw door te vegen, centrifugeer kort en keer terug naar het magnetische rek.
    11. Pellet de kralen en aspireer de supernatant op; Herhaal de wasstap één keer.
    12. Centrifugeer kort, plaats de buis terug in het magnetische rek en zuig eventueel achtergebleven supernatant op.
    13. Haal de buis uit het magnetische rek en suspendeer de kralen opnieuw in 15 μL Elution Buffer (EB).
    14. Centrifugeer kort en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C om het DNA te elueren.
    15. Plaats de buis op het magnetische rek, pellet de kralen totdat het eluaat helder en kleurloos is en zuig 15 μL van het eluaat op in een schone microcentrifugebuis van 1.5 ml.
    16. Kwantificeer 1 μL van het eluaat.
    17. Verdun de bibliotheek tot 20 fmol (bereken met de NEB-calculator) en gebruik 12 μL van de 20 fmol bereide bibliotheek voor sequencing op de R10.4.1-flowcel.
      OPMERKING: De bibliotheek kan nu worden opgeslagen bij -20 °C, waardoor herhaald gebruik mogelijk is.
  4. Primen en laden van de nanopore sequencing flowcel
    1. Ontdooi de Sequencing Buffer (SB), Library Beads (LIB), Flow Cell Tether (FCT) en Flow Cell Flush (FCF) bij RT, meng ze door vortex en draai ze naar beneden.
    2. Bereid de drainagemix voor stroomcellen voor door 5 μl runderserumalbumine (BSA, 50 mg/ml), 30 μl flowcelether (FCT) en 1170 μl Flow Cell Flush (FCF) te combineren, de oplossing te mengen door inversie en pipetteren.
    3. Open de aanzuigpoort van de stroomcel, zuig ~20 μL buffer aan om luchtbellen te verwijderen, laad 800 μL van het aanzuigmengsel in de aanzuigpoort zonder luchtbellen toe te voegen en wacht 5 min.
    4. Bereid de bibliotheek voor door 37,5 μl sequencingbuffer (SB), 25,5 μl bibliotheekkralen (LIB) of bibliotheekoplossing (LIS) en 12 μl van de 20 fmol DNA-bibliotheek te mengen in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml, grondig te mengen door te pipetteren.
    5. Vul de stroomcel opnieuw door de dop van de bemonsteringspoort van de stroomcel voorzichtig op te tillen, 200 μl van het aanzuigmengsel in de aanzuigpoort te laden zonder luchtbellen te introduceren en de bibliotheek voor te bereiden op het laden.
    6. Meng de voorbereide bibliotheek voorzichtig door te pipetteren en laad 75 μL van de bibliotheek druppelsgewijs in de monsterpoort van de sequencingstroomcel, waarbij u ervoor zorgt dat elke druppel in de poort stroomt voordat u de volgende toevoegt.
    7. Sluit de dop van de monsterpoort van de stroomcel, zorg ervoor dat de stop in de monsterpoort van de stroomcel komt en sluit vervolgens de aanzuigpoort.
    8. Sluit het draagbare sequencing-apparaat aan op een computer (met een ononderbroken voeding) en start de sequencing met behulp van een besturings- en analysesoftware voor het sequencing-apparaat.
  5. Software parameters
    OPMERKING: Deze softwaretoepassing, ontwikkeld door ONT, wordt gebruikt voor het uitgebreide beheer van sequencing-runs en het genereren van gedetailleerde rapporten.
    1. Om het sequencingproces te starten, selecteert u de optie Start gevolgd door Start sequencing.
      OPMERKING: Men wordt dan gevraagd om een map aan te wijzen voor bestandsopslag en een naam op te geven voor uw sequentierun, bijvoorbeeld 'sequencing_run_1'. Klik daarna op Doorgaan naar instellingen om de juiste kitnaam te selecteren, zoals library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96, en pas de gewenste looptijd aan, bijvoorbeeld 20 uur (de maximale looptijd is 72 uur).
    2. Kies vervolgens het uitvoerbestandstype en kies uit opties zoals POD5 voor het lezen van onbewerkte uitvoer en FASTQ voor basecall-uitvoer. Selecteer vervolgens het FAST-Basecalling-model.
    3. Houd er rekening mee dat sommige van de standaardinstellingen bestaan uit het regelmatig scannen van poriën om de 1,5 uur, een minimale leeslengte van 200 bp en een minimale kwaliteitsscore van 8. Bekijk ten slotte de instellingen en start het leesproces.

3. Analyse na de sequencing

  1. Systeemvereisten
    OPMERKING: Gids voor het opzetten van de omgeving en het analyseren van Mycobacterium tuberculosis amplicon-sequencinggegevens met behulp van de ONT-TB-NF-pijplijn. De instructies zijn geschikt voor zowel Windows- (via WSL) als macOS-gebruikers.
    1. Gebruik het volgende - Besturingssysteem: Windows 10/11 (met WSL2) of macOS; Geheugen: Minimaal 8 GB RAM (16 GB aanbevolen); Opslag: ten minste 50 GB vrije schijfruimte; Internet: Vereist voor het downloaden van pakketten en data; Machtigingen: Mogelijkheid om software te installeren en omgevingen te beheren.
  2. Zorg voor de volgende omgevingsinstellingen: Windows-gebruikers (met WSL2). Schakel WSL2 in.
    1. Open PowerShell als beheerder en voer het volgende uit: wsl - installeren.
    2. Start de computer opnieuw op wanneer daarom wordt gevraagd.
  3. Ubuntu installeren
    1. Start na het opnieuw opstarten de Microsoft Store, zoek naar Ubuntu en installeer de voorkeursversie (bijv. Ubuntu 22.04 LTS).
    2. Start Ubuntu vanuit het menu Start .
    3. Maak een nieuwe UNIX-gebruikersnaam en -wachtwoord wanneer daarom wordt gevraagd.
    4. Update pakket Lijsten: sudo apt update & sudo apt upgrade -y.
  4. macOS-gebruikers
    1. Installeer Homebrew (indien nog niet geïnstalleerd): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".
    2. Installeer de vereiste pakketten: brew install git wget
  5. Conda of Mamba installeren
    1. Ga naar de Miniconda-downloadpagina om het juiste installatieprogramma voor het besturingssysteem te downloaden.
    2. Om Miniconda te installeren, voert u het installatieprogramma uit en volgt u de instructies op het scherm. Nadat de installatie is voltooid, start u de terminal opnieuw op.
    3. Conda-kanalen configureren:
      Conda Config --Kanalen toevoegen Standaardinstellingen
      Conda Config --Kanalen toevoegen Bioconda
      Conda Config --Kanalen toevoegen Conda-Forge
    4. Installatie van Mambaforge (Mamba)
      Voor Linux:
      wget
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      Voor macOS:
      wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
    5. Installeer Mambaforge: bash Mambaforge-*.sh
    6. Volg de aanwijzingen om de installatie te voltooien en start uw terminal opnieuw op om Mamba te activeren.
  6. Opzetten van de ONT-TB-NF-pijplijn
    1. Maak een nieuwe Conda-omgeving: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    2. U kunt ook Mamba gebruiken: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    3. Activeer de omgeving: conda activeert ont_tb_env
    4. Installeer Nextflow: krul -s https://get.nextflow.io | bash, sudo mv nextflow /usr/local/bin/
    5. Kloon de ONT-TB-NF-repository: git-kloon https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
    6. Vereiste Docker-afbeeldingen ophalen (bij gebruik van Docker)
      Docker Pull hkubal/CLAIR3: v0.1-R12
      Docker Pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
  7. De pijplijn uitvoeren
    1. Construeer de Basecalled FASTQ-bestanden van elke sample onafhankelijk met behulp van de volgende opdracht.
      Kat *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      NextFlow uitvoeren run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /pad/naar/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /pad/naar/amplicon_regions.bed \
      draden 16 \
      output_dir /absolute/path/to/output_directory
  8. Uitvoerbestanden en interpretatie
    1. Zorg er bij succesvolle uitvoering voor dat de pijplijn de volgende uitvoer genereert in de opgegeven uitvoermap:
      1. Uitgelijnd leest: *.bam-bestanden.
      2. Variant Calls: *.vcf bestanden die SNP's en indels bevatten.
      3. Samenvattende rapporten: *.csv of *.tsv-bestanden met een overzicht van resistentiemutaties en andere relevante statistieken.
      4. Kwaliteitscontrolerapporten: *.htmL-bestanden gegenereerd door tools zoals MultiQC.
      5. Logboeken: Gedetailleerde logboeken van de uitvoering van de pijplijn.
      6. Tussenliggende bestanden: Opgeslagen in de werkmap (kan worden verwijderd na succesvolle uitvoering).
        OPMERKING: In het geval dat u machtigingsfouten tegenkomt, is het essentieel om te controleren of men over de nodige machtigingen beschikt om bestanden te lezen en te schrijven en om scripts uit te voeren. Met betrekking tot milieukwesties dient u ervoor te zorgen dat de juiste Conda-omgeving is geactiveerd voordat de pijpleiding wordt uitgevoerd. Voor degenen die Docker-profielen gebruiken, is het absoluut noodzakelijk om te bevestigen dat Docker zowel geïnstalleerd als operationeel is. Bovendien moet men de systeembronnen nauwgezet bewaken om geheugen- of opslagbeperkingen tijdens de uitvoering te voorkomen. Een overzicht van deze methodologieën wordt weergegeven in figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gekozen DNA-extractiemethode werd gekozen vanwege de efficiëntie en het superieure rendement in vergelijking met andere snelle technieken. Het produceerde consequent genomisch DNA (gDNA) van hoge kwaliteit, en de integratie van een op kralen gebaseerde opruimstap hielp de verwerkingstijd te minimaliseren en tegelijkertijd de kosten per monster te verlagen. Dit werd bereikt door de noodzaak van aanvullende kwaliteitscontrolebeoordelingen zoals spectrofotometrische metingen te eliminere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het long-read sequencing-platform toonde in deze studie opmerkelijke voordelen aan, met name het vermogen om snelle sequencing te bereiken met een consistent hoge dekkingsbreedte. Over alle succesvol gesequenceerde isolaten werd een dekkingsbreedte van 99,9% bereikt, wat wijst op een bijna volledige vertegenwoordiging van resistentie-geassocieerde genomische regio's. De gemiddelde dekkingsdiepte over alle beoogde genen was 4462X, waarbij het eis-gen de hoogste diepte vertoonde m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen onze oprechte dank betuigen aan het SAMRC Centrum voor Tuberculose aan de Universiteit van Stellenbosch voor het verstrekken van de essentiële middelen en faciliteiten. We zijn de TS ELiOT-studie ook zeer dankbaar voor het leveren van de monsters die een integraal onderdeel waren van deze studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL & 1.5 mL or 2 mL Lo-binding TubesEppendorfEP0030108051-250EA
1kb ladderThermo Fisher ScientificSM0311
2 mL screw cap TubesScientific Specialties IncP2TUB056C-0001.5ST
2 mm sterile glass beadsSigma-AldrichZ273627-1EA
AMPure XP BeadBeckman ColterA63881
Deeplex Myc-TB GenoScreen20090205
Electrophoresis chamberThermo Fisher ScientificA25977
Ethyl alcohol, PureSigma-AldrichE7023-500ML
FastPrep HomogenizerMP Biomedicals116005500
Filter pipette tips (10 µL) Bio-Smart ScientificFT-10-R
Filter pipette tips (1000 µL) Bio-Smart ScientificFT-1000-R
Filter pipette tips (20 µL) Bio-Smart ScientificFT-20-R
Filter pipette tips (200 µL) Bio-Smart ScientificFT-200-R
Flow-cell Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114
Heating-blockEppendorf5382000031
InstaGene MatrixBio-RadBBRD7326030
Magnetic Rack Thermo Fisher Scientific 12321D
MicrocentrifugeEppendorf 5406000046
MinIONOxford Nanopore TechnologiesMK1B
Native-barcoding kit V14 Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367
NEBNext Quick Ligation ModuleNEBE6056
NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing ModuleNEBE7546
Nuclease-free water (NFW)Thermo Fisher ScientificAM9937
Pipettes (P10, P20, P200 and P1000)EppendorfEP3123000918-1EA
Qubit Assay TubesThermo Fisher ScientificQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ33231
Qubit fluorometerThermo Fisher ScientificQ33226
SYBR Safe DNA gel StrainThermo Fisher ScientificS33102
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific17852
Universal Hood III transilluminator (Molecular Imager Gel Doc XR System)Bio-Rad170-8170
Vortex mixerLasecWMBB0L0E0216

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuberculosis report. Baltimore Health News. , WHO. (2022).
  2. WHO Malaria Department report. Report 20-23. , WHO. (2023).
  3. The End Strategy TB. 53 (1), WHO. 1689-1699 (2015).
  4. Cabibbe, A. M., et al. Application of targeted nextgeneration sequencing assay on a portable sequencing platform for culturefree detection of drugresistant tuberculosis from clinical samples. J Clin Microbiol. 58 (10), e0063220(2020).
  5. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culturefree prediction of susceptibility or resistance to 13 antituberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  6. NG, K. C. S., et al. How well do routine molecular diagnostics detect Rifampin. J Clin Microbiol. 57 (1), e0128723(2019).
  7. MacLean, E., Kohli, M., Weber, S. F., Suresh, A. Advances in molecular diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 58 (10), e0158219(2020).
  8. Sibandze, D. B., et al. Rapid molecular diagnostics of tuberculosis resistance by targeted stool sequencing. Genome Med. 14 (1), 42(2022).
  9. Shah, M., Chihota, V., Coetzee, G., Churchyard, G., Dorman, S. E. Comparison of laboratory costs of rapid molecular tests and conventional diagnostics for detection of tuberculosis and drugresistant tuberculosis in South Africa. BMC Infect. Dis. 13 (1), 352(2013).
  10. Hu, T., Chitnis, N., Monos, D., Dinh, A. Nextgeneration sequencing technologies: An overview. Hum Immunol. 82 (10), 801-811 (2021).
  11. Pervez, M. T., et al. A comprehensive review of performance of nextgeneration sequencing platforms. Biomed Res Int. 2022, 3457806(2022).
  12. Tafess, K., et al. Targetedsequencing workflows for comprehensive drug resistance profiling of Mycobacterium tuberculosis cultures using two commercial sequencing platforms: Comparison of analytical and diagnostic performance, turnaround time, and cost. Clin Chem. 66 (6), 809-820 (2020).
  13. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. WHO rapid communication. , WHO. https://www.who.int/publications/i/item/9789240076372 (2023).
  14. Hazra, D., et al. Impact of wholegenome sequencing of Mycobacterium tuberculosis on treatment outcomes for MDRTB/XDRTB: A systematic review. Pharmaceutics. 15 (6), 1408(2023).
  15. Shea, J., et al. Comprehensive wholegenome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State. J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).
  16. Meehan, C. J., et al. Whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis: Current standards and open issues. Nat Rev Microbiol. 17 (10), 533-545 (2019).
  17. Heupink, T. H., Verboven, L., Warren, R. M., Van Rie, A. Comprehensive and accurate genetic variant identification from contaminated and lowcoverage Mycobacterium tuberculosis whole genome sequencing data. Microb Genom. 7 (1), e000555(2021).
  18. Wang, X., et al. Interpretation of the third edition of WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 3: Diagnosis: Rapid diagnostics for tuberculosis detection. Chin J Antituberc. 46 (2), 120-130 (2024).
  19. Kambli, P., et al. Targeted nextgeneration sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drugresistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 127 (1), 102051(2021).
  20. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. Rapid Communication. , WHO. 1-8 (2023).
  21. Nandlal, L., Perumal, R., Naidoo, K. Rapid molecular assays for the diagnosis of drugresistant tuberculosis. Infect Drug Resist. 15 (1), 4971-4984 (2022).
  22. Dippenaar, A., et al. Nanopore sequencing for Mycobacterium tuberculosis: A critical review of the literature, new developments, and future opportunities. J Clin Microbiol. 60 (5), e0123422(2022).
  23. Chan, W. S., et al. Rapid and economical drug resistance profiling with nanopore MinION for clinical specimens with low bacillary burden of Mycobacterium tuberculosis. BMC Res Notes. 13 (1), 123(2020).
  24. Feuerriegel, S., et al. Rapid genomic first and secondline drug resistance prediction from clinical Mycobacterium tuberculosis specimens using DeeplexMycTB. Eur Respir J. 57 (4), 2004784(2021).
  25. GenoScreen product brochure. Deeplex MycTB. , GenoScreen. (2023).
  26. Mtafya, B., et al. A practical approach to render tuberculosis samples safe for application of tuberculosis molecular bacterial load assay in clinical settings without a biosafety level 3 laboratory. Tuberculosis. 138 (1), 102194(2023).
  27. Suganthi, P., Usharani, B., Venkateswari, R., Muthuraj, M. Biosafety practices in mycobacteriology laboratory. Research Advances in Microbiology and Biotechnology. 3, B P International (a part of SCIENCEDOMAIN International). Chennai. 1-39 (2023).
  28. consolidated guidelines on tuberculosis. Module 4: Treatment and care. WHO guideline. , WHO. (2022).
  29. Williams, J., et al. Matrixbased DNA extraction for targeted nextgeneration sequencing on decontaminated sputum samples. J Vis Exp. (181), e68147(2025).
  30. Delahaye, C., Nicolas, J. Sequencing DNA with nanopores: Troubles and biases. PLoS One. 16 (2), e0245534(2021).
  31. Zhao, K., et al. Rapid identification of drugresistant tuberculosis genes using direct PCR amplification and Oxford Nanopore Technology sequencing. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2022, 8845672(2022).
  32. Tagliani, E., et al. Culture and nextgeneration sequencingbased drug susceptibility testing unveil high levels of drugresistantTB in Djibouti: Results from the first national survey. Sci Rep. 7 (1), 15076(2017).
  33. Smith, C., Halse, T. A., Shea, J., Modestil, H., Fowler, R. C. Assessing nanopore sequencing for clinical diagnostics: For Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 59 (7), e0123421(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Long Read SequencingAmplicon SequencingDrug Resistant TuberculosisTargeted NGSPortable SequencingDNA Library PreparationResistance Variant DetectionFlow Cell PrimingGel ElectrophoresisBioinformatics Pipeline

Gerelateerde artikelen