Methodenartikel

Fluorescentiegeleide matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie met lasergeïnduceerde postionisatiemassaspectrometrie van individuele neurale cellen van ratten

DOI:

10.3791/68376

⸱

23 mei 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Chemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois Urbana-Champaign, 4Neuroscience Program, University of Illinois Urbana-Champaign

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst het gebruik van microMS voor fluorescentiegeleide, eencellige MALDI-2-massaspectrometrie, waardoor verbeterde moleculaire profilering van primaire neuronale cellen van ratten mogelijk is.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metingen van één cel zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de rijke spatiochemische heterogeniteit van de hersenen. Matrix-geassisteerde laser/desorptie-ionisatie (MALDI) massaspectrometrie (MS) is in staat tot labelvrije, high-throughput karakterisering van endogene moleculen in individuele cellen. De recente ontwikkelingen in de ontwikkeling van MALDI-massaspectrometers met lasergeïnduceerde post-ionisatie (MALDI-2) zorgen voor een sterk verbeterde detectiegevoeligheid voor een verscheidenheid aan lipiden en andere kleine moleculen. MS-beeldvorming van grote monsters met MALDI-2 bij cellulaire resolutie is echter onbetaalbaar traag voor de meeste toepassingen. In dit protocol worden primaire cellen geïsoleerd en verspreid op geleidende objectglaasjes. Relatieve cellocaties worden bepaald door fluorescentiemicroscopie van het hele objectglaasje, gevolgd door nauwkeurige coregistratie van de microscopiecoördinaten met de fasecoördinaten van de MALDI-2-massaspectrometer. Gerichte MS-analyse van alleen cellocaties biedt high-throughput, single-cell metingen met een hoge analytdekking en een kleinere gegevensgrootte in vergelijking met MS-beeldvorming van het hele monster. We beschrijven de kritieke stappen die nodig zijn voor de bereiding van één cel, fluorescentiebeeldvorming met hele dia's, matrixtoepassing en MALDI-2-massaspectrometrie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipiden en metabolieten zijn fundamenteel voor de cellulaire functie en dienen als essentiële componenten van membranen, energiebronnen en signaalmoleculen 1,2. Hun samenstelling en overvloed kunnen echter aanzienlijk variëren tussen individuele cellen, wat de verschillen in celtypen en ontwikkelings- en functionele toestanden weerspiegelt 3,4,5. Het analyseren van deze verschillen is cruciaal voor het begrijpen van biologische variabiliteit en het identificeren van verschillende celsubpopulaties. Meettechnieken voor één cel, zoals RNA-sequencing, bieden bruikbare celspecifieke transcriptprofielen6. Deze metingen op transcriptieniveau weerspiegelen echter niet direct de werkelijke cellulaire hoeveelheden lipiden en metabolieten, aangezien genexpressie niet altijd correleert met de werkelijke overvloed van deze analyten. Gespecialiseerde methoden voor directe metingen van lipiden en metabolieten zijn daarom nodig voor een uitgebreide analyse van de chemische samenstelling van afzonderlijke cellen en hun populaties.

Matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie (MALDI) massaspectrometriebeeldvorming (MSI) is een hulpmiddel bij uitstek voor het labelvrij in kaart brengen van endogene biomoleculen in situ 7,8. Typisch, met MALDI, wordt een UV-laser gebruikt om materiaal te ablateren uit een dunne monsterlaag die is gekristalliseerd met een organische matrix, waardoor een pluim van ionen en neutrale moleculen wordt gevormd. De gevormde ionen worden vervolgens gescheiden door een MS-analysator en gedetecteerd in een massaspectrometer. Gezien de nauwkeurige positionering van moderne massaspectrometertrappen, kan de laser worden gepositioneerd om zich te richten op specifieke monstergebieden of over regio's worden gerasterd om moleculaire beelden door MSI te genereren. MSI met cellulaire of subcellulaire ruimtelijke resolutie (< 10 μm), bereikt met een gefocusseerde laserstraal en nauwkeurige podiumbeweging, kan worden gebruikt om chemische informatie over individuele cellen te verkrijgen 9,10. MSI-metingen op deze schaal zijn echter inefficiënt, vooral in het geval van monsters met lage gerichte celdichtheden, vanwege de hoeveelheid tijd die wordt besteed aan het afbeelden van lege gebieden tussen cellen. Verder is de detecteerbaarheid van veel analyten beperkt vanwege het kleine bemonsterde volume. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we een beeldgeleide MALDI MS-benadering ontwikkeld voor high-throughput single-cell analyse 11,12. In deze benadering worden de locaties van verspreide cellen programmatisch bepaald op basis van fluorescentiebeelden van hele dia's en gebruikt om de massaspectrometertrap naar posities te leiden waar individuele cellen met specifieke parameters (bijv. grootte en vorm) zich bevinden en vervolgens worden geanalyseerd via bestraling met de MALDI-laser. Eerder werk met deze gerichte benadering is gebruikt voor het karakteriseren van lipiden, peptiden en andere biomoleculen in heterogene celpopulaties 5,13.

Gezien de massabeperkte aard van afzonderlijke cellen, is het aantal analyten dat in dergelijke monsters wordt gedetecteerd over het algemeen minder dan het aantal dat rechtstreeks uit weefsel wordt waargenomen. Om de analytdekking in single-cell MS-analyse te vergroten, is het daarom van cruciaal belang om de detectiegevoeligheid van de analyt te verhogen. Een recent ontwikkelde benadering die helpt bij het overwinnen van deze detectie-uitdaging is MALDI met laserpost-ionisatie (MALDI-2), waarvan is aangetoond dat het de gevoeligheid voor een breed scala aan analyten verbetert 9,14,15,16. Als gevolg hiervan genereert MALDI-2 uitgebreidere datasets met één cel en biedt het een diepere moleculaire dekking in monsters met een beperkte massa, zoals geïsoleerde cellen.

Het doel van deze methode is om lipidemetingen te verkrijgen van duizenden individuele cellen. Hiertoe beschrijven we een workflow die high-throughput single-cell MALDI-2 massaspectrometrie mogelijk maakt en die over het algemeen kan worden uitgebreid naar elke op sondes gebaseerde massaspectrometriebenadering met nauwkeurige faseregeling17. In deze workflow wordt weefsel uit de hersenregio('s) van belang ontleed en worden individuele cellen uit het weefsel verkregen na een papaïnedissociatieprocedure. De cellen worden vervolgens gelabeld met een nucleaire kleuring en worden verspreid op geleidende glasplaatjes die zijn geëtst met fiduciale markeringen, waar ze mogen hechten. Vervolgens worden hele dia's gemaakt met behulp van fluorescentiemicroscopie. Matrix wordt afgezet door sublimatie, waardoor een herhaalbare homogene kristallaag en een hoge signaal-ruisverhouding ontstaat voor eencellige MS-analyse. Met behulp van de open-source software microMS11 worden de relatieve coördinaten van cellocaties uit het microscopiebeeld in kaart gebracht en uitgelijnd met de coördinaten van de massaspectrometerfase door middel van een puntsetregistratie met behulp van fiduciale markers die op de glasplaatjes zijn geëtst waar de cellen werden afgezet. Ten slotte worden met behulp van deze informatie nauwkeurige, gerichte MS-spectra verkregen van elke individuele cel, waardoor duizenden cellen in één keer kunnen worden geprofileerd (<1 uur)12,13.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven in deze studie werden uitgevoerd in overeenstemming met het protocol voor diergebruik dat is goedgekeurd door de Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (23228) met strikte naleving van zowel nationale als ARRIVE-normen voor de ethische behandeling en verzorging van dieren.

1. Bereiding van materialen en oplossingen

  1. Bereid gemodificeerde Gey's gebalanceerde zoutoplossing (mGBSS) met 1.5 mM CaCl2, 4.9 mM KCl, 0.2 mM KH2PO4, 11 mM MgCl2, 0.3 mM MgSO4, 138 mM NaCl, 27.7 mM NaHCO3, 0.8 mM Na2HPO4 en 25 mM HEPES. Stel de pH in op 7,2 met 3 M NaOH. Het wordt aanbevolen om 1 L mGBSS te bereiden en tot gebruik bij 4 °C te bewaren.
  2. Bereid spuiten van 50 ml voor door ze te vullen met de bereide mGBSS-oplossing en plaats ze op ijs voor de transcardiale perfusie. Bereid 1 spuit voor elke ontleedde rat voor.
  3. Bereid aliquots van papaïne-oplossing volgens het protocol van het Worthington Papain Dissociation System. Dit systeem bevat vier injectieflacons zoals hieronder beschreven, waarbij flacon 4 niet voor dit protocol wordt gebruikt:
    Flesje 1: steriele Earle's balanced salt solution (EBSS) met bicarbonaat en fenolrood
    Flesje 2: papaïne met L-cysteïne en EDTA
    Flesje 3: deoxyribonuclease I (DNase)
    Flesje 4: ovomucoïde proteaseremmer met runderserumalbumine
    1. Voeg 5 ml EBSS (injectieflacon 1) toe aan de papaïneflacon (flacon 2) en plaats deze gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C om de papaïne op te lossen.
    2. Voeg 500 μL EBSS (flacon 1) toe aan de DNase flacon (flacon 3) en meng voorzichtig. Voeg 250 μl van de verdunde injectieflacon DNase (injectieflacon 3) toe aan de injectieflacon papaïne (injectieflacon 2). Dit preparaat bevat een eindconcentratie van 20 eenheden/ml papaïne, 0,005% DNase, 0,5 mM EDTA en 1 mM L-cysteïne.
    3. Vries 250 μL aliquots van deze bereide papaïneoplossing in voor latere dissociaties (maakt ~20 aliquots). Vul deze oplossing aan met de volgende antibiotica: 100 eenheden/ml penicilline G, 100 μg/ml streptomycine en 100 μg/ml gentamicine. Dit kan worden aangepast voor de toepassing van de gebruiker.
  4. Bereid een ammoniumacetaatoplossing van 150 mM en bewaar deze bij 4 °C. Bereid een 33% glyceroloplossing door glycerol te verdunnen tot de bereide mGBSS-oplossing.
  5. Ets fiducials op met indiumtinoxide (ITO) gecoate microscopieglaasjes met behulp van een graveerpen met een wolfraamcarbide of diamantpunt of een CO2 -lasergraveermachine. Ets aan de geleidende zijde van het ITO-glasplaatje 20-40 X-vormige fiduciale markeringen langs de omtrek van het objectglaasje om platformonafhankelijke (bijv. microscoop en massaspectrometer) ruimtelijke registratie mogelijk te maken.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat u niet in één aangesloten lijn rond het monster of de gebieden ervan etst, aangezien dit de geleidbaarheid van het oppervlak tussen het gebied en een glasdia-adapter verstoort.

2. Preparaat van primaire neurale cellen

OPMERKING: Het weefsel van de hippocampus van ratten wordt ontleed, gedissocieerd in individuele cellen met papaïne en afgezet op geleidende glasplaatjes met een lage dichtheid. De isolatie van cellen op deze manier maakt high-throughput single cell massaspectrometrie van endogene lipiden mogelijk.

  1. Ontdooi voorafgaand aan de dissectie van de dieren een hoeveelheid van de bereide papaïneoplossing en plaats deze in een container met een inlaat- en uitlaatbuis zodat CO2 de lucht in de container kan verdringen. Plaats dit systeem in een waterbad dat is ingesteld op 37 °C en ga door met de CO2 -stroom totdat de oplossing de juiste pH heeft, zoals aangegeven door de kleur, met behulp van de pH-kleurenkaart die is opgenomen in het Worthington Papain Dissociation System-pakket. De beoogde pH ligt tussen 7,2 en 7,4.
    OPMERKING: Laat geen CO2 -2 in de enzymatische oplossing borrelen, omdat dit zal leiden tot denaturatie van de DNase en verlies van biologische activiteit. Gebruik een centrifugebuis van 50 ml met twee buizen in het deksel gelijmd, zodat CO2 de buis vanaf de onderkant kan vullen en uit de bovenste uitlaatbuis kan ontsnappen.
  2. Euthanaseer rat(ten) in overeenstemming met de IACUC-protocollen volgens institutionele, lokale en federale richtlijnen. Hier worden 2 tot 3 maanden oude mannelijke Sprague-Dawley-ratten gebruikt en geofferd door CO2 -verstikking.
  3. Transcardiaal perfuseer de rat met ijskoude (4 °C) mGBSS-oplossing om bloed uit het vaatstelsel te verwijderen en het lichaam van het dier snel af te koelen. Een voorbeeld van deze procedure is te vinden in het protocol van We et al.18.
  4. Isoleer de hersenen chirurgisch van de rat en zorg ervoor dat het interessegebied niet wordt beschadigd. Een eerder gepubliceerd overzicht van deze isolatie geeft meer details over enkele van de afzonderlijke stappen19.
  5. Gebruik een weefselhakker of weefselkubus om een dwarsdoorsnede (~2 mm dik) van de hersenen te snijden om het gebied (hippocampus, cortex of striatum) bloot te leggen aan monster.
  6. Gebruik een biopsiepons van 2 mm om het interessegebied van de hersenen te bemonsteren en deponeer het weefselbrokje in het flesje papaïneoplossing.
  7. Incubeer deze weefsel- en papaïneoplossing bij 37 °C onder constant roeren (bv. door een elektrische wip) gedurende 30-90 minuten.
    OPMERKING: De enzymatische behandelingsduur moet worden geoptimaliseerd op basis van het hersengebied, de stam van het dier, de leeftijd en de gewenste celoutput (bijv. neuronen en astrocyten met terminals versus maximale opbrengst van cellen zonder terminals). Voor hippocampusweefsel van ratten is 60-90 minuten typisch. Kortere behandelingen kunnen sommige terminals behouden, maar veel cellen in niet-gedissocieerde clusters achterlaten, terwijl langere behandelingen de opbrengst kunnen verbeteren maar de celbeschadiging kunnen vergroten, waardoor beoordeling met behulp van levende/dode assays nodig is (bijv. LIVE/DEAD levensvatbaarheid/cytotoxiciteitskit). Voor vergelijkende studies moeten de behandelingen consistent zijn voor alle soorten monsters.
  8. Plaats een flesje tissues en papaïne op ijs om af te koelen en de enzymatische activiteit te onderdrukken. Tritureer het weefsel met behulp van een gesneden pipetpunt die is bevestigd aan een P100-pipet met instelbaar volume totdat het grootste deel van het weefsel visueel is afgebroken. Vorm geen luchtbellen tijdens dissociatie om overmatige celbeschadiging te voorkomen.
    OPMERKING: Krachtige trituratie resulteert in een hoge opbrengst van cellen; Ze behouden echter niet de meeste van hun processen. Zachte trituratie zorgt voor meer processen op cellen, maar resulteert in meer niet-gedissocieerde cellen. Pipetpunten van verschillende grootte en andere methoden kunnen ook worden gebruikt en geoptimaliseerd voor ideale dissociatieresultaten20.
  9. Centrifugeer de gedissocieerde cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellet opnieuw in 1 ml mGBSS. Voeg Hoechst 33342 kernbeits toe tot een eindconcentratie van 1 μg/ml.
  10. Pipetteer 100-500 μL van de celsuspensie op geëtste ITO-glasplaatjes en laat ongeveer 5 minuten of langer staan zodat de cellen kunnen bezinken en aan het objectglaasje kunnen hechten.
    1. De verdunning van de celsuspensie moet empirisch worden bepaald. Voeg met behulp van een optische microscoop een druppel van de cellen toe aan het objectglaasje om de ruwe dichtheid te bepalen en verdun van daaruit om ervoor te zorgen dat er voldoende afstand tussen de cellen is (d.w.z. voldoende groter dan de MALDI-bundelgrootte). Deze verdunning kan worden uitgevoerd op het eerste objectglaasje en vervolgens kan de verdunning indien nodig worden aangepast voor volgende objectglaasjes.
  11. Zuig de celsuspensie voorzichtig van de schuif met behulp van een vacuümsysteem dat (in volgorde geplaatst vanaf de vacuümleiding) het volgende bevat: 1) Slang met een in-line gas HEPA-filter, 2) Slang gemonteerd op een filterkolf van 50 ml, 3) Slang aangesloten op een tweede filterkolfinlaat met een bevestigde pipetpunt (bijv. 100 μL). Als u de geplateerde cellen bewaart voor toekomstig gebruik, vervangt u de aangezogen suspensie door 33% glyceroloplossing gedurende 1-2 minuten en verwijdert u deze.
    OPMERKING: Deze stap zorgt voor celstabiliteit. Het doseren van glyceroloplossing aan de ene kant en het zachtjes aanzuigen aan de andere kant is optimaal voor het behoud van de cellulaire structuur. Bewaak altijd visueel alle hier beschreven stappen met behulp van een omgekeerde microscoop tijdens de voorbereiding van het eerste monster.
  12. Breng 100-500 μL ammoniumacetaat aan op de afgezette gebieden, laat ongeveer 1 minuut zitten en aspireer vervolgens op om de objectglaasjes schoon te maken. Herhaal indien nodig om ervoor te zorgen dat de glaasjes vrij zijn van zout of glycerol.

3. Microscopie

OPMERKING: Om de locatie van afgezette cellen te bepalen, wordt elk objectglaasje in beeld gebracht door middel van helderveld-/fluorescentiemicroscopie. Het fluorescentiekanaal maakt het mogelijk om Hoechst-gekleurde cellen nauwkeurig te lokaliseren, terwijl helderveldbeeldvorming morfologische informatie verschaft. Elke microscoop die in staat is tot het verkrijgen van tegelbeelden is geschikt voor dit proces.

  1. Als u dit nog niet eerder hebt gedaan, spoel de objectglaasjes dan af met 2-3 ml 150 mM ammoniumacetaat. Deze stap is van cruciaal belang om glycerol- en zoutkristallen te verwijderen, die de microscopiewaarneming en de toepassing van de MALDI-matrix kunnen verstoren. Droog dia's onder een zachte stroom van N2 of laat aan de lucht drogen.
  2. Laad de dia in de microscooptrap. Stel de microscoop scherp met behulp van ten minste 10 steunpunten die gelijkmatig over het objectglaasje zijn verdeeld.
  3. Gebruik filters die geschikt zijn voor DAPI (excitatie: 335-383 nm, emissie: 420-470 nm) en helderveldbeeldvorming om een betegeld fluorescentiebeeld te verkrijgen met een vergroting van 5x-10x over de hele dia, zodat de fiduciale markeringen (gemaakt in stap 1.5) worden vastgelegd.
    OPMERKING: Een vergroting van 5x is meestal voldoende, vooral wanneer er veel dia's moeten worden afgebeeld. Om fijnere cellulaire morfologie op te lossen, kunnen 10x- of 20x-objectieven worden gebruikt ten koste van een kwadratisch langere beeldvormingstijd en een grotere bestandsgrootte.
  4. Naai de tegelafbeelding met behulp van microscopiesoftware, zoals ZEN (Zeiss). Nauwkeurig naaien is van cruciaal belang, omdat eventuele fouten in deze stap zich doorzetten naar de laatste registratiestap, wat resulteert in onnauwkeurige targeting. Om dit te controleren, moet u ervoor zorgen dat verticaal aangrenzende tegels niet verschoven zijn. Overweeg daarnaast om tegelafbeeldingen te verkrijgen met een grote overlapping van tegels (20%-30%).
  5. Verwerk en exporteer elke afbeelding als een bigTIFF-bestand in de microscopiesoftware. Als het afgebeelde gebied relatief klein is en resulteert in een uiteindelijke afbeeldingsgrootte van minder dan 2 GB, gebruikt u in plaats daarvan een standaard TIFF-bestandsindeling.

4. Matrix toepassing

OPMERKING: Consistente en juiste toepassing van de MALDI-matrix is van cruciaal belang voor het verkrijgen van hoogwaardige single-cell data. Terwijl sublimatie met behulp van een commercieel apparaat hier wordt gebruikt, kan matrixtoepassing ook worden uitgevoerd met behulp van een robotsproeier12, airbrush21 of zelfgemaakte sublimatie-apparatuur22. We hebben ontdekt dat eencellige preparaten minder matrix vereisen dan dunne weefselsecties die doorgaans worden gebruikt voor massaspectrometriebeeldvorming. Om batcheffecten te verminderen, wordt aanbevolen om de matrix toe te passen op alle objectglaasjes die tijdens één sessie worden bestudeerd en om cellen uit verschillende groepen (bijv. hersengebied of behandeling versus controle) waar mogelijk op hetzelfde objectglaasje te deponeren. Matrixselectie is cruciaal voor zowel traditionele MALDI- als MALDI-2-workflows met één cel. Voor eencellige ALDI zijn DHB23, 9-AA24 en CHCA25 met succes gebruikt. In MALDI-2 hebben wij en anderen een significante signaalverbetering waargenomen met DHAP9, terwijl matrices zoals NEDC16 en CHCA26 ook effectief zijn toegepast.

  1. Los 20 mg 2,5-dihydroxyacetofenon (DHAP) op in 1,5 ml aceton. Plaats dia's in de houder van de sublimatiekamer en plaats ze in het sublimatieapparaat.
  2. Pipipet de opgeloste matrixoplossing op de keramische wafel en laat de aceton verdampen. Sluit de sublimatiekamer om deze af te sluiten.
  3. Vul de koelvloeistofkamer met een ijswaterbrij en plaats deze bovenop de kamer.
  4. Zet het vacuüm aan en laat het systeem 5 minuten in evenwicht komen. De druk in het systeem moet minder dan 40 mbar zijn.
  5. Begin met sublimeren door de kamer gedurende 5 minuten te verwarmen tot 200 °C.
  6. Verwijder het ijswaterbad, draai de temperatuur naar 25 °C en plaats een koellichaam bovenop de kamer. Laat het systeem 5 minuten opwarmen tot kamertemperatuur om condensatie te voorkomen.
    NOTITIE: De container met het ijswaterbad kan worden geleegd en gevuld met heet water om als koellichaam te dienen.
  7. Ontlucht het systeem langzaam, open de kamer en verwijder de schuiven.

5. Eencellige MALDI MS

OPMERKING: Single-cell MS-gegevens worden verkregen op een MALDI-2 timsTOF-instrument (timsTOF flex) met behulp van het open-source microMS-pakket om cellen te detecteren en de massaspectrometer te geleiden. Dit vereist dat de optische beeldpixellocaties van de beoogde cellen worden vertaald naar de fysische coördinaten van de massaspectrometertrap.

  1. Open microMS en decimeer de bigTIFF-microscopiebeelden met behulp van de optie Beeldgroep, aangezien er zowel helderveld- als fluorescentiekanalen zijn.
  2. Identificeer met behulp van het hulpprogramma Blobopties de optimale parameters die moeten worden geselecteerd voor de doelcellen. Pas de volgende parameters aan: de maximale en minimale blobgrootte om te selecteren hoe klein of groot blobs moeten worden gevonden; de drempelinstelling, die bepaalt hoe het fluorescentiekanaal moet worden gedrempeld voor blobdetectie; en de circulariteit, die bepaalt hoe circulair de geïdentificeerde cellen moeten zijn om in overweging te nemen. Voor de hier gepresenteerde gegevens hebben we de volgende parameterwaarden gebruikt: maximale circulariteit: geen; minimale circulariteit: 0,6; drempel: 75; min maat: 20; Max Grootte: Geen.
  3. Gebruik de optie Blob zoeken om blobs te zoeken en het pop-upvenster om de bloblijst onder een gewenste naam op te slaan.
  4. Gebruik de afstandsfilter om een specifieke afstand te selecteren die elke cel van elkaar verwijderd moet zijn (voor deze gegevens hebben we met behulp van 5x fluorescentiemicroscopie een afstandsfilter van 35 pixels gebruikt). Dit is om ervoor te zorgen dat cellen ver genoeg van elkaar verwijderd zijn om een analyse van één cel uit te voeren. Dit aantal is in pixeleenheden, dus ken de conversie van pixel naar μm voor de microscoop om het ideale aantal te bepalen. Gebruik de grootte van de diameter van de lasersonde plus ongeveer 20-30 μm om rekening te houden met fouten in de registratie.
  5. Laad de dia's in het instrument met behulp van de MTP Slide Adapter II. Keer terug naar de computer met microMS en gebruik een remote desktop-applicatie om toegang te krijgen tot de massaspectrometercomputer.
  6. Als dit de eerste keer is dat het instrument wordt gebruikt, controleer dan de X-Y-positie van het instrument. Ga hiervoor naar Hulpmiddelen en instrumentinstellingen. Het pop-upvenster toont een reeks coördinaten met hun X- en Y-posities. Selecteer elk van deze specifieke punten op de Slide Adapter II-geometrie op het instrument en werk de X- en Y-posities in het microMS-venster bij.
  7. Navigeer met behulp van de camera en de objecttafel van de massaspectrometer naar een gemakkelijk identificeerbare locatie op de dia en kopieer de coördinaten van het instrument. Zoek in microMS de overeenkomstige locatie in de microscoopafbeelding, klik met de rechtermuisknop op die positie en typ de coördinaten in de tekstlocatie van het pop-upvenster. Rond alle coördinaten af op het dichtstbijzijnde gehele getal en scheid de X- en Y-coördinaten van spatie (d.w.z. 39595 -23232).
  8. Herhaal stap 5.7. om ten minste 12 fiduciale markeringen over de hele dia te registreren. Nadat er drie registratiepunten zijn toegevoegd, wordt een van de cirkels rood, wat aangeeft dat dit de meest afwijkende positie van de registratie is. Als dit gebeurt, verwijdert u het huidige registratiepunt met shift + klik met de rechtermuisknop en probeert u het opnieuw.
  9. Ga onder Bestand naar Opslaan en vervolgens naar Registratie om het registratiebestand (.msreg) op te slaan.
  10. Terwijl de blobs op de dia worden weergegeven, slaat u het bestand met de instrumentpositie (.xeo) op door naar Bestand, vervolgens Opslaan en vervolgens Instrumentposities te gaan. Gebruik remote desktop-software om dit .xeo-bestand over te brengen naar de instrumentcomputer.
  11. Kopieer de tekst uit het aangepaste .xeo-bestand dat is gegenereerd naar het MTP Slide Adapter II .xeo-bestand op het instrument en sla het op. Hiermee wordt dit geometriebestand bijgewerkt met de locaties van de cellen.
  12. Klik op het tabblad Automatisering en selecteer Nieuw... om een automatische uitvoering te starten. Sleep over het weergegeven voorbeeldgebied om de cellen te selecteren en klik met de rechtermuisknop om ze toe te voegen aan de analyselijst. Sla de automatiseringsuitvoering op en klik op Automatisch uitvoeren starten om de acquisitie te starten. De lengte van de run is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder het aantal cellen, laserschoten en laserfrequentie, maar over het algemeen kunnen ongeveer 5-10 cellen worden geanalyseerd in de MALDI-modus (10 kHz laserherhalingssnelheid) en 1-5 cellen kunnen elke seconde worden geanalyseerd in de MALDI-2-modus (1k Hz laserherhalingssnelheid).

6. Gegevensverwerking

OPMERKING: Bestaande commerciële softwarepakketten zijn niet goed geschikt voor het analyseren van single-cell massaspectrometriegegevens met hoge doorvoer. Hoewel individuele spectra kunnen worden gevisualiseerd, vereist het extraheren van zinvolle biologische inzichten gespecialiseerde hulpmiddelen. Om dit aan te pakken, bieden we gratis beschikbare software die single-cell MALDI-2 MS-gegevensanalyse mogelijk maakt. Onze bijgewerkte workflow vergemakkelijkt de directe conversie van gegevens van één cel naar het open-source imzML-formaat27, waardoor compatibiliteit met SCiLS MVS en andere software van leveranciers mogelijk is. Voor meer geavanceerde gegevensanalyse bevat het volledige script ook functionaliteit voor lipidenannotatie, clustering en andere visualisatietools die mogelijk worden gemaakt door Matplotlib (versie 3.7.3). Het parseren en lezen van de onbewerkte gegevens wordt gefaciliteerd door de pyTDFSDK-bibliotheek, een reeks functies die zijn opgenomen in de TIMSCONVERT-workflow28.

  1. Initialiseer de aangepaste Python-bibliotheek SC_MALDI2_Analysis door het bestand in aanvullend bestand 1 te kopiëren naar hetzelfde werkpad als Jupyter Notebook en druk vervolgens op Shift + Enter op het toetsenbord op de eerste codecel. Dit stelt ons in staat om deze functies later aan te roepen en ze te gebruiken om de gegevens te verwerken.
  2. Kopieer het pad naar de verzamelde gegevens (Bruker .d-bestanden). We raden u aan de mappen en namen van elk bestand beschrijvend te noemen, zodat we deze bestandspaden later kunnen parseren om metagegevens voor elk voorbeeld vast te stellen. Voer de Bruker .d-bestanden importeren uit en sla deze op in een lijstcodecel. Hiermee wordt het totale aantal geladen .d-bestanden weergegeven.
  3. Voer de codecel uit met de titel De onbewerkte gegevens verwerken en opslaan in imzML. Hiermee wordt elk geleverd Bruker .d-bestand gelezen, wordt piekpicking op de gegevens uitgevoerd en worden vervolgens 20 ppm aan gegevens rond elke piek opgeslagen in een .imzML-bestand dat in het .d-bestand is geschreven.
    1. Als u de opgeslagen gegevens wilt vinden, opent u de locatie van het eerste .d-bestand en worden de imzML en andere metagegevens in dit pad opgeslagen. In dit stadium kan het opgeslagen imzML-bestand worden geïmporteerd in software van leveranciers, zoals SCiLS Lab MVS. Voor meer geavanceerde gegevensanalyse blijft u het script volgen.
  4. Laad de opgeslagen imzML-gegevens door de Loading uit te voeren in de eerder opgeslagen imzML-bestandscodecel. Hierdoor worden de opgeslagen gegevens in de variabele gegevens geladen.
  5. Voer de gegevensmatrixcel uit om alle gegevens langs een gemeenschappelijke m/z-as samen te voegen, verwijder functies die aanwezig zijn in een lage overvloed (<0,1%) en verwijder waarden die minder zijn dan ruis (100 relatieve intensiteit). Deze functie herbint vervolgens de gegevens door het gemiddelde te nemen van elke piek m/z-waarde binnen elke bin. De resulterende gegevensmatrix wordt opgeslagen als datacube_array, de m/z-opslaglocaties die aan de matrix zijn gekoppeld, worden opgeslagen als valid_mz_bins en een telling van elke opslaglocatie wordt opgeslagen als telling.
  6. Als u de gegevens wilt annoteren, voert u de annotatiecel Pieken exporteren voor LIPID MAPS uit. Hiermee worden alle m/z-pieken in uw datamatrix naar uw klembord gekopieerd. Plak dit in een leeg tekstbestand en sla het op om het te uploaden naar LIPID MAPS.
  7. Open lipidmaps.org en selecteer vervolgens MS Data Bulk Search en Search LMSD om te zoeken naar biologisch relevante lipidensoorten. Upload de pieklijst door het tekstbestand te kiezen en de juiste adducten te selecteren (bijv. [M+H]+, [M+Na]+ en [M+K]+). Selecteer de massatolerantie die geschikt is voor uw massaspectrometer (we hebben +/- 0,01 m/z gekozen), selecteer alle interessante lipideklassen en klik op Zoeken. Download het .tsv-bestand.
  8. Laad de spectrametagegevens in door de Loading uit te voeren in de afzonderlijke celpaden voor metagegevenscellen . Wijzig hier de gesplitste code op basis van de bestandspadstructuren.
  9. Verwerk de gegevens vooraf door de cel Gegevensvoorverwerking en lipidenannotatie uit te voeren. Hiermee wordt het lipidMAPS tsv-bestand gebruikt om de dataset te annoteren tot een fout van 10 ppm, oneven ketenlipiden uit de lipidMAPS-resultaten te verwijderen, de resterende gegevens te normaliseren en functies of cellen te verwijderen die een specifieke drempelwaarde niet overschrijden. Hiermee wordt de nieuwe verwerkte dataset opgeslagen als data2 en de bijgewerkte spectra-metadata als updated_cell_types.
  10. De analyse van de gegevens wordt uitgevoerd door scanpy. Voer de cel UMAP en clusteranalyse voor afzonderlijke cellen uit om interessante gegevens te selecteren (hier hebben we alleen MALDI-2, M2, gegevens geselecteerd), de gegevensset te schalen en deze in een scanpy AnnData-object te laden voor eenvoudige analyses.
    OPMERKING: Hier werden Leidse clustering en dimensionaliteitsreductie (UMAP) uitgevoerd op de dataset, zowel de originele gegevensklassen als de clusters op de UMAP werden gevisualiseerd en enkele van de meest statistisch significante kenmerken van de clusters werden samengevat met behulp van de rank_genes_groups_dotplot functie van scanpy.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een overzicht van de workflow voor fluorescentiegeleide eencellige MALDI-2 MS wordt weergegeven in figuur 1. Eerst wordt het weefsel dat is ontleed uit gerichte hersengebieden (Figuur 1A) gedissocieerd in afzonderlijke cellen en afgezet op geleidende ITO-gecoate microscopieglaasjes (Figuur 1B). De locaties van cellen worden bepaald door fluorescentiebeeldvorming van het hele objectglaasje (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

High-throughput, beeldgeleide eencellige MALDI MS is een waardevol hulpmiddel voor het begrijpen van chemische heterogeniteit op eencellige schaal. De toevoeging van lasergeïnduceerde post-ionisatie (MALDI-2) zorgt voor een diepere analytdekking, wat van cruciaal belang is voor massa- en volumebeperkte monsters zoals geïsoleerde zoogdiercellen.

Terwijl de overgrote meerderheid van de gepubliceerde single-cell lipide en metaboliet MS-workflows gekweekte cellen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende belangen om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.W.C erkent de steun van de Peixin He en Xiaoming Chen PhD4 Fellowship en de University of Illinois Block Grant Fellowship. Dit werk werd ook ondersteund door het National Institute on Drug Abuse onder onderscheiding nr. P30DA018310, het National Institute on Aging onder Award No. R01AG078797, en door het kantoor van de directeur, van de National Institutes of Health onder Award Number S10OD032242.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2',5'-dihydroxyacetofenonSigma AldrichD107603DHAP, 97% zuiverheid
AmmoniumacetaatSigma Aldrich238074ACS reagens, ≥97%
Axio M2 ImagerZeissN/AN/A
Biopsie punch, 2 mmFisher Scientific12-460-399integra miltex standaard biopsie punch, 2mm
CalciumchlorideSigma AldrichC4901watervrij, poeder ≥97%
Eppendorf CentrifugeSigma AldrichEP5405000441centrifuge 5425 met rotor FA-24x2
GentamicineSigma AldrichG1272vloeibaar, BioReagent
Glazen etspenSigma AldrichZ225568carbide time, pkg of 1
GlycerolSigma AldrichG7893ACS reagens, ≥99.5%
HEPES bufferSigma AldrichH3375≥99.5% (titratie)
Hoechst 33258 oplossingSigma Aldrich944031 mg/mL in H2O, ≥98.0% (HPLC)
In-line HEPA filterSigma AldrichWHA67225001VACU-GUARD 60 mm schijf, 0.45 PFTE behuizing
ITO-gecoate microscoopglazenDelta TechnologiesCG-90IN-S11570-100Ω weerstand
MagnesiumchlorideSigma AldrichM8266watervrij, ≥98%
MagnesiumsulfaatSigma Aldrich208094watervrij, ≥97%
MicrocentrifugebuizenSigma AldrichHS4323Kbuiscapaciteit 1.5 mL, pak van 500
Papaine dissociatiesysteemWorthington Biochemical LK003150één doos, 5 flacons voor éénmalig gebruik
Penicilline-StreptomycineSigma AldrichP4458vloeibaar, BioReagent
KaliumchlorideSigma Aldrich529552Molecuulbiologie kwaliteit
Kaliumfosfaat monobasischSigma AldrichP5379Reagent Plus
NatriumbicarbonaatSigma AldrichS6014ACS reagens, ≥99.7%
NatriumchlorideSigma AldrichS9888ACS reagens, ≥99%
NatriumhydroxideSigma Aldrich221465ACS reagens, ≥97%, pellets
Natriumfosfaat dibasischSigma AldrichS9763ACS reagens, ≥99%
SublimaatHTXN/AN/A
timsTOF FleX MALDI-2BrukerN/AmicroGRID ingeschakeld
VacuumslangThermo Scientific8701-0080Nalgene Non-ftalaat PVC-slang
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Curr Opin Lipidol. 28 (5), 408-413 (2017).
  2. Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  3. Cheng, K. W., Su, P. R., Feller, K. J. A., Chien, M. P., Hsu, C. C. Investigating the Metabolic Heterogeneity of Cancer Cells Using Functional Single-Cell Selection and nLC Combined with Multinozzle Emitter Mass Spectrometry. Anal Chem. 96 (2), 624-629 (2024).
  4. Neumann, E. K., Comi, T. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Lipid Heterogeneity between Astrocytes and Neurons Revealed by Single-Cell MALDI-MS Combined with Immunocytochemical Classification. Ange Chem. 131 (18), 5971-5975 (2019).
  5. Bhaduri, A., Neumann, E. K., Kriegstein, A. R., Sweedler, J. V. Identification of Lipid Heterogeneity and Diversity in the Developing Human Brain. JACS Au. 1 (12), 2261-2270 (2021).
  6. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nuc Acid Res. 42 (14), 8845-8860 (2014).
  7. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  8. Croslow, S. W., Trinklein, T. J., Sweedler, J. V. Advances in multimodal mass spectrometry for single-cell analysis and imaging enhancement. FEBS Lett. 598 (6), 591-601 (2024).
  9. Bien, T., Bessler, S., Dreisewerd, K., Soltwisch, J. Transmission-Mode MALDI Mass Spectrometry Imaging of Single Cells: Optimizing Sample Preparation Protocols. Anal Chem. 93 (10), 4513-4520 (2021).
  10. Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  11. Comi, T. J., Neumann, E. K., Do, T. D., Sweedler, J. V. microMS: A Python Platform for Image-Guided Mass Spectrometry Profiling. J Am Soc Mass Spec. 28 (9), 1919-1928 (2017).
  12. Xie, Y. R., et al. Multiscale biochemical mapping of the brain through deep-learning-enhanced high-throughput mass spectrometry. Nat Methods. 21 (3), 521-530 (2024).
  13. Neumann, E. K., Ellis, J. F., Triplett, A. E., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Lipid Analysis of 30 000 Individual Rodent Cerebellar Cells Using High-Resolution Mass Spectrometry. Anal Chem. 91 (12), 7871-7878 (2019).
  14. Soltwisch, J., et al. Mass spectrometry imaging with laser-induced postionization. Science. 348 (6231), 211-215 (2015).
  15. Barré, F. P. Y., et al. Enhanced Sensitivity Using MALDI Imaging Coupled with Laser Postionization (MALDI-2) for Pharmaceutical Research. Anal Chem. 91 (16), 10840-10848 (2019).
  16. McKinnon, J. C., et al. MALDI-2-Enabled Oversampling for the Mass Spectrometry Imaging of Metabolites at Single-Cell Resolution. J Am Soc Mass Spec. 35 (11), 2729-2742 (2024).
  17. Comi, T. J., Makurath, M. A., Philip, M. C., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. MALDI MS Guided Liquid Microjunction Extraction for Capillary Electrophoresis-Electrospray Ionization MS Analysis of Single Pancreatic Islet Cells. Anal Chem. 89 (14), 7765-7772 (2017).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac Perfusion of the Mouse for Brain Tissue Dissection and Fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  19. Aboghazleh, R., et al. Rodent brain extraction and dissection: A comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
  20. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Adv Med Sci. 61 (1), 78-84 (2016).
  21. Chan-Andersen, P. C., Romanova, E. V., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Profiling 26,000 Aplysia californica neurons by single cell mass spectrometry reveals neuronal populations with distinct neuropeptide profiles. J Biol Chem. 298 (8), 102254(2022).
  22. Castro, D. C., Xie, Y. R., Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Sweedler, J. V. Image-guided MALDI mass spectrometry for high-throughput single-organelle characterization. Nat Methods. 18 (10), 1233-1238 (2021).
  23. Castro, D. C., et al. Single-Cell and Subcellular Analysis Using Ultrahigh Resolution 21 T MALDI FTICR Mass Spectrometry. Anal Chem. 95 (17), 6980-6988 (2023).
  24. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proc Natl Acad Sci. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  25. Krestensen, K. K., et al. Molecular Profiling of Glioblastoma Patient-Derived Single Cells Using Combined MALDI-MSI and MALDI-IHC. Anal Chem. 97 (7), 3846-3854 (2025).
  26. Niehaus, M., Soltwisch, J., Belov, M. E., Dreisewerd, K. Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).
  27. Xie, Y. R., et al. Data-Driven and Machine Learning-Based Framework for Image-Guided Single-Cell Mass Spectrometry. J Proteome Res. 22 (2), 491-500 (2023).
  28. Luu, G. T., et al. TIMSCONVERT: a workflow to convert trapped ion mobility data to open data formats. Bioinformatics. 38 (16), 4046-4047 (2022).
  29. Vandergrift, G. W., et al. Experimental and Computational Evaluation of Lipidomic In-Source Fragmentation as a Result of Postionization with Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization. Anal Chem. 96 (41), 16127-16133 (2024).
  30. Zhang, Y., Parmigiani, G., Johnson, W. E. ComBat-seq: batch effect adjustment for RNA-seq count data. NAR Genom Bioinfo. 2 (3), lqaa078(2020).
  31. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Single-Cell Metabolomics: Changes in the Metabolome of Freshly Isolated and Cultured Neurons. ACS Chem Neurosci. 3 (10), 782-792 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Massaspectrometrie van enkelcellenMALDI massaspectrometriefluorescentiemicroscopiematrixapplicatieanalyse van neurale cellenlipidprofileringhigh throughput analyseruimtelijk opgeloste analyseUMAP clustering

Gerelateerde artikelen