Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Milieubemonstering van fotosynthetische microben en hun virussen: van veld tot laboratorium

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68379

⸱

3 juli 2025

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we methoden voor bemonstering uit de eufotische zones van mariene en zoetwaterecosystemen om cyanofagen (en hun gastheren) te isoleren en post-bemonsteringsprocessen die afzonderlijke genotypen verrijken en de dynamiek van virus-gastheerinteractie karakteriseren.

Samenvatting

Milieubemonstering van fotosynthetische micro-organismen en hun virussen speelt een cruciale rol bij het begrijpen van de hedendaagse biodiversiteit en ecosysteemdynamiek van zee en zoet water, evenals de effecten van klimaatveranderingsgerelateerde factoren (bijv. stijgende temperaturen en verzuring) op evolutionaire trajecten van soorten en gemeenschapssamenstelling. Helaas ondersteunt de diversiteit van de virosfeer geen enkele universele bemonsterings- en experimentele workflow. Elk virussysteem heeft inderdaad unieke kenmerken, die wijzigingen in standaardprotocollen in de virologie vereisen om onderzoeksdoelen te bereiken. Hoewel het ontdekken en karakteriseren van virussen benaderingen vereist die specifiek zijn voor het doelsysteem, zijn de onderzoeksdoelen voor alle virussen vergelijkbaar: isoleer het virus; het hostbereik bepalen; productieve infectie bevestigen; en karakteriseer het virus, de gastheer en de dynamiek van het virus en de gastheer. Robuuste beschrijvingen van virus-gastheersystemen bestaan minimaal uit het ophelderen van morfologie, fysiologie, biochemie en omics-profielen. Verdere informatie kan worden verkregen door het systeem te manipuleren door factoren zoals de veelheid van infectie, temperatuur, pH, gastheer-omschakeling, gerichte evolutie te veranderen of door medicijnen toe te passen om de reactie van het virus-gastheersysteem te observeren. Ons laboratorium bestudeert virussen in verschillende levensdomeinen (Archaea, Bacteriën en Eukarya). In dit rapport beschrijven we methoden voor het bemonsteren van fotosynthetische microben uit de eufotische zone van zoetwater- en mariene milieus met de nadruk op het isoleren van bacteriofaag (d.w.z. cyanofaag) van cyanobacteriën. Cyanobacteriën zijn hoeksteensoorten die cruciaal zijn voor de primaire productie en de nutriëntenkringloop in deze aquatische ecosystemen. De beschreven workflow strekt zich uit van het bemonsteren van water op verschillende diepten tot het karakteriseren van kenmerken van het virus-gastheersysteem met behulp van vloeibare en vaste mediacultuur, geavanceerde moleculaire/genetische methoden en analytische benaderingen. De beschreven methoden zijn aanpasbaar aan bacteriofaag en virusontdekking in virusgastheersystemen in verschillende levensdomeinen.

Inleiding

Het karakteriseren van infectiedynamiek en evolutionaire relaties van cyanofagen en hun gastheren is de sleutel tot het begrijpen van de huidige en toekomstige toestanden van mariene en zoetwaterecosystemen. Geavanceerde high-throughput sequencingtechnieken en moderne analytische methoden maken snelle sequentiebepaling van cyanofagen (en gastheer) genomen mogelijk om de relaties tussen virus en gastheer te bestuderen 1,2. Workflows beginnen echter met omgevingsbemonstering om virussen en hun gastheren te isoleren en te identificeren 3,4,5. Vanwege de diversiteit van de virosfeer is er geen enkel protocol voor het bemonsteren en karakteriseren van alle virussen en bacteriofagen. Elk virus-hostsysteem heeft inderdaad zijn unieke kenmerken. Desalniettemin zijn de basisdoelstellingen vergelijkbaar, ongeacht het virussysteem dat wordt onderzocht: isoleer het virus; het hostbereik bepalen; productieve infectie aantonen in een of meer gastheren; karakteriseer de dynamiek van virus-, gastheer- en virus-gastheerinfectie met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve benaderingen. Een geavanceerd begrip van het virussysteem kan worden onderzocht door het systeem te verstoren. Het veranderen van parameters zoals multipliciteit van infectie (MOI)6, temperatuur, pH, de gastheerstam of door de toepassing van medicijnen om te bepalen hoe het systeem reageert, geeft extra inzicht in de aard van de dynamiek van virus-gastheer. Meer geavanceerde manipulatie, zoals gerichte evolutie, kan aanvullende informatie verschaffen over het potentiële evolutionaire traject van het systeem en hoe co-evolutionaire eindpunten de grotere microbiële gemeenschap en het ecosysteem kunnen beïnvloeden.

In deze studie presenteren we een model (maar gemakkelijk aanpasbaar) protocol voor milieubemonstering van fotosynthetische microben zoals cyanobacteriën en microalgen, die een cruciale rol spelen in de nutriëntenkringloop en primaire productie in mariene, zoetwater- en andere aquatische ecosystemen 7,8,9,10,11 . De workflow richt zich op het isoleren van gastheren uit de eufotische zones van mariene en zoetwateromgevingen en hun virussen en bacteriofagen, die belangrijke aanjagers zijn in deze ecosystemen12. Zowel virussen als bacteriofagen hebben een invloed op zowel eukaryote als prokaryote populatiestructuren en hebben een grote invloed op de diversiteit en productiviteit van ecosystemen13. Het doel hier is dus om een bemonsteringsprotocol en een workflow na bemonstering te bieden die de verrijking van gastheren en virussen vergemakkelijkt voor het onderzoeken van: single-virus/single-host, multi-virus/single-host, single-virus/multi-host en multi-virus/multi-host; -omics-substraten die ten grondslag liggen aan de dynamiek van virus-gastheerinfectie; en mogelijke co-evolutionaire trajecten en evolutionaire eindpunten die van invloed zijn op het bestudeerde virus-gastheersysteem en het grotere ecosysteem waaruit de virussen en gastheer zijn geëxtraheerd.

Concreet beschrijven we een workflow voor omgevingsbemonstering, voorverwerking van monsters in het veld (d.w.z. voordat ze het laboratorium bereiken), nabewerking voor isolatie van bacteriofaag (en virussen), verrijking van culturen van micro-organismen van gemengde soorten voor het identificeren van permissieve gastheren, het ontwikkelen van isolaten met één kolonie van vermeende gastheren, wat een bonafide virus-gastheerrelatie (d.w.z. productieve infectie) en karakterisering van fundamentele infectie-eigenschappen (bijv. virulentie). Infectietesten maken niet alleen de berekening van relatieve virulentie (VR)14 en gastheerveerkracht (RR)15 mogelijk, maar omvatten ook stappen voor het extraheren van kweekmonsters op belangrijke tijdstippen voor het onderzoeken van -omics-substraten die ten grondslag liggen aan de waargenomen fysiologie (d.w.z. de dynamiek van de interactie tussen virus en gastheer). Ten slotte bespreken we mogelijke valkuilen, probleemoplossing en oplossingen, evenals manieren om bepaalde stappen aan te passen om specifieke taxa te targeten. De workflow is van toepassing op cyanofaag-cyanobacteriën, phycodnavirus-microalgen en thermofiele fusellovirus-archaeale systemen16,17, wat het nut ervan aantoont bij het karakteriseren van virussen in alle drie de domeinen van het leven: bacteriën, eukarya en archaea.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bemonstering in de omgeving

OPMERKING: Dit protocol beschrijft offshore bemonstering voor fotosynthetische microben uit de eufotische zone binnen 5 mijl van de kustlijn voor de kust van Zuid-Californië. Het protocol is echter aangepast om monsters te nemen uit meren, bevroren meren of geothermische warmwaterbronnen (Figuur 1).

  1. Milieubemonstering voor de kust langs de kustlijn van Zuid-Californië
    OPMERKING: Een 6 m, diep-V, middenconsole schip (d.w.z. boot) met dubbele 150 pk buitenboordmotoren was geladen met onderzoeksapparatuur (Materiaaltabel). Drie locaties werden geselecteerd voor bemonstering in de eufotische zone: (a) Site 1: N 30° 15.436, W 117° 31.551; b) Terrein 2: N 33° 12.521, W 117° 25.275; en (c) Locatie 3: N 32° 59.914, W 117° 17.058. Op elke locatie werden 's middags 20 liter watermonsters genomen op drie verschillende dieptes op elke locatie: < 3 m (oppervlaktemonster), 6 m en 14 m.
    1. Transferpomp: Bij het bereiken van elke monsterlocatie zet u het bootanker uit en registreert u de GPS-coördinaten van het navigatiesysteem. Zet het bemonsteringssysteem in elkaar.
      1. Kortom, monteer het ene uiteinde van de 2,54 cm I.D. flex-plus blauwe PVC-slang (50 ft.) op een zuigzeef van 2,54 cm om te voorkomen dat groot vuil in het pompsysteem terechtkomt. Zet de zeef-buisverbinding vast met ducttape. Monteer het andere uiteinde van de slang op het inlaatspruitstuk van de 1 pk roestvrijstalen transferpomp.
      2. Bevestig een 10 ft sectie van 2.54 cm ID-instortbestendige rubberen flexibele slang aan de uitlaat van de pomp. Sluit het netsnoer van de overdrachtspomp aan op de invertergenerator van 3800 W op gas. Eenmaal gemonteerd, vult u de transferpomp en test u of het pompsysteem operationeel is (Figuur 1, bovenste rij).
    2. Verzwaren van de transferbuis: Bevestig het ene uiteinde van een 25 m lang nylon scheepstouw met een diameter van 1,25 cm aan het oog van een paddenstoelanker van 14 kg. Gebruik ducttape om het touw om de 3 m aan de blauwe PVC-buis te bevestigen met de zuigzeef ongeveer 1 m boven het anker om te voorkomen dat de zeef in het zand blijft steken of rotsen onder water raakt. Gebruik het anker om de transferbuis (blauwe PVC-buis) onder te dompelen en om te voorkomen dat sterke onderstromen een grote hoek tussen de boot en de buis creëren, wat onnauwkeurige monsterdieptes zou opleveren. Laat het anker/touw en de buis op diepte zakken.
    3. Zeewatermonsters extraheren: Zodra de buispunt met de zeef op de gewenste diepte is, schakelt u de generator en pomp in. Vul de pomp opnieuw of schud de transportslang om het water uit de diepte te laten pompen. Zodra een gestage waterstroom van de diepte werd overgebracht, loost u 1-2 buisvolumes terug in de oceaan om ervoor te zorgen dat water van de gewenste diepte door de pomp stroomt. Verzamel watermonsters in waterkannen van 20 L (Figuur 1, bovenste rij, uiterst rechts).
    4. Monstertransport naar het veldstation: Vul waterkannen van 20 L tot ongeveer 18 L om gasuitwisseling (bijv. O2/CO2) tussen watermonsters en vrije ruimte tijdens transport mogelijk te maken. Voordat u waterkannen afdekt, registreert u de temperatuur, pH en het zoutgehalte van monsters van onbehandeld water. Sluit vervolgens de waterkannen af en plaats ze op een ijsbed in een ondergrondse opslag en dek ze af met een licht laken om overmatige blootstelling aan zonlicht en hoge temperaturen te voorkomen.
  2. Voorbehandeling van watermonsters in het veld
    OPMERKING: Bij aankomst in een onshore-faciliteit (bijv. hotelkamer/conferentieruimte/veldstation) werd een reeks voorverwerkingsstappen uitgevoerd om de microbiële inhoud in de watermonsters te beschermen en om verschillende fracties van de zeewatermonsters te scheiden op basis van deeltjesgrootte.
    1. Filtratiesysteem: Bevestig het ene uiteinde van een 1 m lang stuk 9.525 mm ID. doorzichtige vinylslang aan de slangpilaarinlaat op de vacuümpoort van een draagbare vacuümpomp met luchtmembraan. Bevestig het andere uiteinde van dezelfde slang aan een vacuümbeker met een filter van 1.0 l, 0.45 μm. Gebruik zowel de filterbekers van 0.45 μm als de filterbekers van 0.22 μm in volgorde om verschillende fracties van het zeewatermonster te scheiden, zoals hieronder beschreven.
    2. Om het systeem te testen op lekken of defecte/gescheurde filters, filtert u 0,25 l zeewater door de 0,45 μm polyethersulfon (PES) membraanfilterbeker. Een niet-lekkend systeem zal zuigkracht vertonen tussen het filter en het rooster zodra het zeewatermonster volledig is gefilterd.
    3. Filtratie door 0,45 μm PES-membraanfilterbeker: Om fotosynthetische micro-organismen (bijv. microalgen en cyanobacteriën) te isoleren, is het doel om 2 L zeewatermonster door de 0,45 μm PES-membraanfilterbeker te filteren met behulp van twee filterbekers van 1 L (of vier filterbekers van 500 ml). Etiketteer alle filtraatflessen op de juiste manier met de filtergrootte, de diepte waaruit het monster is genomen, de datum en de aanduiding van de bemonsteringsplaats. Schroef ten slotte de dop vast en dek de flessen met 0,45 μm af met een semi-transparante doek of hoes om overmatig zonlicht te voorkomen.
      OPMERKING: Laat het filter in de filterbeker niet drooglopen. Houd altijd een dun laagje vloeistof op het filter. Het filter zal biologisch afval (bijv. cellen) ophopen. Als het filter verstopt raakt met vuil, schroef dan voorzichtig de beker los en zet de gebruikte filterbeker opzij, maar gooi de verstopte beker niet weg. Bevestig een nieuw filter van 0,45 μm en ga verder.
    4. Filtratie door 0,22 μm PES-membraanfilterbeker: Om grote eukaryote virussen te isoleren, gebruikt u 1 L van het 0,45 μm filtraat uit de vorige stap (stap 1.2.3) en filtert u door een filterbeker van 0,22 μm. Etiketteer de ultrafiltraatfles op de juiste manier met de filtergrootte, de diepte waaruit het monster is genomen, de datum en de aanduiding van de bemonsteringsplaats. Schroef ten slotte de dop en dek het flesje met 0,22 μm ultrafiltraat af (van het filteren van het 0,45 μm filtraat).
      OPMERKING: Laat het filter in de filterbeker niet drooglopen. Houd altijd een dun laagje vloeistof op het filter. Het filter verzamelt biologisch afval, dat biologische monsters bevat. Als het filter verstopt raakt, schroeft u de beker los en zet u de gebruikte filterbeker opzij. Gooi de verstopte beker niet weg. Bevestig een nieuw filter van 0,22 μm en ga verder.
    5. Concentraat biomassa van 0,45 μm filter: Giet 48 ml filtraat (van 0,22 μm filtratie) in elk van de twee steriele 50 ml conische polypropyleen centrifugebuisjes. Gebruik een steriel scalpel om gelijkmatig langs de buitenste rand van het gebruikte filter van 0.45 μm in de beker te snijden. Gebruik een steriele tang om het met biomassa beladen en vochtige filter te verwijderen. Snijd het doormidden. Rol de helft van het filterpapier op tot een conische buis van 50 ml. Herhaal dit met de tweede helft van het filtermembraan en de tweede buis. Schroef de buisdoppen vast en zet ze vast met transparante folie. Label de tube.
    6. Concentraat grote virusbiomassa uit een filter van 0,22 μm: Giet 14 ml ultrafiltraat in elk van de twee steriele conische polypropyleen centrifugebuisjes van 15 ml. Gebruik een steriel scalpel om langs de buitenrand van het gebruikte 0,22 μm filter in de beker te snijden. Gebruik een steriele tang om het met biomassa beladen en vochtige filter te verwijderen. Snijd het doormidden. Rol het filtreerpapier op en steek de ene helft in een van de conische buizen van 15 ml. Herhaal dit voor de tweede helft van het filtermembraan en de tweede conische buis van 15 ml. Schroef de buisdoppen vast en zet ze vast met transparante folie (bijv. Parafilm). Label elke buis met filtergrootte (d.w.z. 0.22 μm), locatie, diepte en datum.
    7. Bewaar het resterende filtraat van 0,45 μm en het resterende filtraat van 0,22 μm voor verzending terug naar het laboratorium. Herhaal dit hele filtratieproces (stappen 1.2.2 tot en met 1.2.6) voor elke diepte en bemonsteringsplaats.
      OPMERKING: Ultrafiltraat wordt in het laboratorium gebruikt als mediabasis (met natuurlijke mineralen en andere voedingsstoffen).
      Ruwe monstermicroscopie (optioneel): Neem een conische buis van 50 ml met een filter van 0,45 μm erin en schud voorzichtig. Gebruik een plastic druppelaar (of pipettor) om 30-50 ml zeewater uit de conische buis van 50 ml te halen en bereid een glazen microscoopglaasje voor met het monster en een dekglaasje. Bekijk met een veldmicroscoop en een computer de inhoud van het microscoopglaasje om de kenmerken van waargenomen micro-organismen te detecteren en vast te leggen (Figuur 2D).

2. Monsterverwerking om virussen/bacteriofagen te concentreren en gastheren te verrijken

OPMERKING: Dit protocol beschrijft de eerste verwerkingsstappen die nodig zijn zodra de monsters vanaf de veldlocatie het laboratorium bereiken. Vervoer per vliegtuig versus wegvoertuig kan verschillende overwegingen vereisen. De levensvatbaarheid van milieumonsters zal afnemen bij abrupte veranderingen in temperatuur, pH, zoutgehalte, blootstelling of gebrek aan blootstelling aan licht, concentratie van opgelost gas (bijv. CO2 en O2) en tijd tussen extractie in het milieu en laboratoriumverwerking.

  1. Spin concentreert en bewaart virussen en bacteriofagen
    OPMERKING: Zodra monsters in het laboratorium zijn aangekomen, kan verwerking binnen 8 uur na aankomst het verlies van levensvatbare microben minimaliseren als gevolg van het tijdsverloop tussen de extractie van de monsterlocatie en aankomst in het laboratorium. De onderstaande stappen zullen aliquots van geconcentreerde bacteriofaag (of virus) suspensie (d.w.z. werkvoorraden) opleveren voor langdurige opslag en gebruik.
    1. Concentreren van ultrafiltraat: Voor elke bemonsteringsdiepte per locatie wordt de resterende ~800 ml ultrafiltraat naar het laboratorium verzonden. Gebruik een 3K NMWL 15 ml centrifugaalspinfilter en centrifugeer op 6000 x g gedurende 10-20 minuten om 50-100 ml ultrafiltraat te concentreren tot 1,0-1,5 ml. Bereid rasters voor TEM-beeldvorming voor zoals eerder beschreven16 om te beoordelen of er virusachtige deeltjes (VLP's) in het resulterende geconcentreerde ultrafiltraat zitten. Als VLP's worden gedetecteerd, verdeel het concentraat dan in 100 ml aliquots. Bewaren bij 4 °C (of -20 °C voor langdurige opslag).
    2. Deeltjes concentreren uit het filter van 0,22 μm: Gebruik een steriel scalpel om het vuil van de filters van 0,22 μm voorzichtig in het ultrafiltraat te schrapen in de buisjes van 50 ml waarin de filters werden getransporteerd. Gebruik een 10K NMWL spin-concentratorbeker om 50-200 ml suspensie te concentreren tot een volume van ~3 ml monsterretentaat. Bereid rasters voor op TEM-beeldvorming zoals eerder beschreven16 om te bepalen of er VLP's van het 0,45 μm-filtraat zijn die mogelijk op het oppervlak van het 0,22 μm-filter zijn opgevangen. Als VLP's worden gedetecteerd, verdeel het concentraat dan in hoeveelheden van 100 ml en bewaar het bij 4 °C (of -20 °C voor langdurige opslag).
  2. Centrifugeren, concentrerende en verrijkende retentaat uit 0,45 μm filters.
    OPMERKING: Gemengde culturen van micro-organismen kunnen gastheren bevatten voor de virussen en bacteriofaag die hierboven zijn geïsoleerd (stappen 2.1.1 en 2.1.2). Spinconcentratie en verrijking van gemengde culturen leveren werkvoorraden op waaruit zuivere culturen van vermeende gastheren kunnen worden ontwikkeld (zie stap 3).
    1. Concentreren van gemengde suspensies: Stuur voor elke bemonsteringsdiepte per locatie ~100 ml ultrafiltraat terug met een met celpuin beladen filter van 0,45 μm naar het laboratorium. Gebruik een steriel scalpel om vuil van het 0,45 μm-filter in het ultrafiltraat te schrapen in de buisjes van 50 ml waarin ze werden vervoerd. Centrifugeer het monster bij 2000 x g gedurende 10 min, 4 °C om de biomassa te pelleteren. Resuspendeer de pellet in 5 ml 1:8 verdunde BG-11 media18 door zachte trituratie met een pipet.
    2. Verrijkend retentaat uit een filter van 0,45 μm: Bereid zes parallelle culturen voor in erlenmeyers van 250 ml met verschotten met: 50 ml BG-11-media (3 kolven) en een mengsel van ultrafiltraat van de monsterplaats (40 ml) plus BG-11 (10 ml). Inoculeer elke kolf met 0,5 ml celconcentraat (uit stap 2.2.1). Incubeer met licht schudden in een fotobioreactor gedurende minimaal 7-10 dagen bij 25 °C met lichtintensiteit ingesteld op 20-40 mmol fotonen/m2/s.19 Zodra de groei robuust is (bijv. OD730nm = 0,8), centrifugeer dan bij 2000 x g, 10 min, 4 °C tot pellet. Resuspendeer de pellet in 10 ml 1:8 verdunde BG-11 media door zachte trituratie met een pipet. Bereid 10-20 aliquots van 0,5 ml celsuspensie voor in cryobuizen met schroefdop voor opslag bij -80 °C.

3. Ontwikkeling van zuivere culturen van microbiële gastheren met één genotype

OPMERKING: Dit protocol beschrijft procedures voor het isoleren en zuiveren van vermeende microbiële gastheren voor virussen en bacteriofagen uit gemengde culturen die zijn verwerkt uit verzamelde omgevingsmonsters. Fenotypes van meerdere gastheren kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd, waardoor de kans op het detecteren van permissieve gastheren voor de virussen en bacteriofaag die aanwezig zijn in opgeslagen watermonsters toeneemt (stappen 2.1.1-2.1.2).

  1. Uitstrepen van platen en selecteren van isolaten met één kolonie
    OPMERKING: Uit gemengde culturen worden zuivere culturen met meerdere enkelvoudige genotypen ontwikkeld om de kans te vergroten dat een vatbare en tolerante gastheer van virussen of bacteriofaag die tijdens milieubemonstering zijn gevangen, wordt geïsoleerd en om het gastheerbereik van virussen en bacteriofaag te onderzoeken.
    1. Ontwikkel single colony isolaten (SCI) zoals hieronder beschreven.
      1. Bereid BG-11 agarplatenvoor 20. Ontdooi op ijs, een hoeveelheid van de gemengde suspensie die bij -80 °C is bewaard (uit stap 2.2.2). Gebruik een steriele lus om celconcentraten op de BG-11-agarplaten te strepen met behulp van standaardtechnieken20. Incubeer gestreepte platen in een fotobioreactor gedurende ~10 dagen bij 25 °C met lichtintensiteit bij 20-40 mmol foton/m2/s of totdat kolonies op platen verschijnen.
      2. Bereid ~10 zaadculturen voor in kweekbuizen van 20 ml met 5 ml BG-11-media en/of 5 ml van een mengsel van ultrafiltraat van de monsterlocatie en BG-11. Pak een dwarslaesie van de plaat met een steriele tandenstoker en inoculeer elk buisje afzonderlijk door één tandenstoker in elk buisje te laten vallen. Incubeer met licht schudden in een fotobioreactor gedurende minimaal 10-15 dagen bij 25 °C met lichtintensiteit ingesteld op 20-40 mmol foton/m2/s of totdat groei wordt gedetecteerd (bijv. OD730nm = 0,4-0,8).
        OPMERKING: Als er meerdere koloniefenotypes (bijv. morfologie, transparantie, kleur) op de eerste streepplaat staan, selecteer dan individuele kolonies voor inoculatie uit een reeks koloniefenotypes.
    2. Ontwikkeling van zuivere culturen van werkende dieren: Zodra een positieve groei van de zaadcultuur is gedetecteerd, herhaalt u de streak-procedures totdat er slechts één koloniefenotype op de platen verschijnt (Figuur 3B en Figuur 4B). Schaal zaadculturen op naar culturen van 50 ml in kolven van 250 ml met verveling (figuur 3C en figuur 4C) zoals hierboven beschreven (stap 2.2.2). Bereid ~20 aliquots van 0,5 ml SCI-celsuspensie voor en pipetteer in cryobuisjes met schroefdop van 1,0 ml voor opslag bij -80 °C.
      OPMERKING: Voor het ontwikkelen van zuivere culturen van cyanobacteriën kunnen antibiotica of antischimmelmiddelen nodig zijn (bijv. imipenem, cycloheximide) om kweekbesmetting te verminderen21. De platingprocedure is een draaipunt waar isolatie van cyanobacteriën of microalgen kan worden gericht. Lichtparameters tijdens de incubatie kunnen variëren in termen van lichtintensiteit of aan-uitcycli.
  2. Karakterisering van enkelvoudige genotypen en opslag van werkvoorraden
    OPMERKING: Om de isolatie en verrijking van individuele vermeende gastheergenotypen te bevestigen, worden zuivere culturen morfologisch en genetisch gekarakteriseerd.
    1. Morfologische karakterisering: Zodra cycli van vloeistofcultuur en plaatwerk met vaste media resulteren in een fenotype van één cel, karakteriseren microbiële morfotypes door zowel lichtmicroscopie (Figuur 2A-C) als, indien beschikbaar, transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en/of scanning-elektronenmicroscopie (SEM; Figuur 3A en Figuur 4A). Onder lichtmicroscopie (bijv. 60x-100x vergroting) kan een groene, lichtbruine of transparante eencellige, koloniale, filamenteuze, spiraalvormige, vertakte of trichoom cellulaire organisatie worden waargenomen. Dit geeft een mogelijke taxonomische toewijzing aan.
    2. Genetische karakterisering: Valideer de isolatie van een enkel micro-organismaal genotype door DNA-extractie uit de vermeende zuivere culturen, gevolgd door gedeeltelijke genoomsequencing. In cyanobacteriën is het 16S rRNA-gen vaak een doelwit (Figuur 5A)22. Een 16S fylogenetische analyse kan taxonomische groepering identificeren22. In microalgen is 18S rRNA vaak het doelwit23. Voor interessante isolaten of nieuwe isolaten kan sequentiebepaling van het hele genoom worden nagestreefd.

4. Ontwikkeling van enkelvoudige genotype virus/bacteriofaaguspensuspensies

OPMERKING: Dit protocol beschrijft procedures voor het isoleren en zuiveren van meerdere virale en bacteriofaaguspensuspensies van meerdere single-genotype uit omgevingsmonsters.

  1. Verdunning en TEM van VLP-concentraten
    OPMERKING: Met behulp van TEM en plaque-assays24 op plaat wordt bevestigd dat VLP's bonafide bacteriofaag (of virussen) zijn die gastheercellen infecteren.
    1. Transmissie-elektronenmicroscopie van filtraten (0,45 μm en 0,22 μm): Gebruik concentraten van 0,45 μm en 0,22 μm filtratie van ruwwatermonsters (zie stap 2.1) om TEM-roosters16 en afbeelding voor te bereiden om de heterogeniteit van virusdeeltjes (d.w.z. diversiteit van morfotypes) te onderzoeken. Verdun monsters die resulteren in rasters met een hoge vloeiendheid (bijv. 90%) voordat u de volgende stappen voltooit om een vloeiendheid van 30%-50% te bereiken. Handmatige deeltjestelling of het gebruik van beeldvormingssoftware kan worden gebruikt om de samenvloeiing van cellen op rasters te schatten.
      OPMERKING: Hoge samenvloeiing op roosters kan resulteren in het vrijmaken van gastgazons op vaste mediaplaten in plaats van het verschijnen van individuele plaques die kunnen worden geselecteerd. Het verdunnen van monsters voorafgaand aan plaquetests kan dus tijd besparen. Als alternatief kunnen meerdere gastheergazonplaten worden getest op gastheer-virusinteracties met behulp van seriële verdunningen van VLP-concentraten.
    2. Bacteriofaagactiviteit (of virus) detecteren op gastheergazons: Kweek op BG-11-agarplaten vermeende gastheergazons van cyanobacteriën (of microalgen) uit werkvoorraden (stap 3.1.2). Pipetteer 0,5 ml VLP-suspensie in 4,5 ml media op gazons (Figuur 6A, links) en draai voorzichtig rond totdat het hele oppervlak van het gazon bedekt is met suspensie. Incubeer in een fotobioreactor gedurende 3-10 dagen bij 25 °C met een lichtintensiteit van 20-40 mmol fotonen/m2/s of totdat plaques zichtbaar zijn op platen (Figuur 6A, rechts).
  2. Het schrapen van plaques en het ontwikkelen van enkelvoudige genotype virus- of bacteriofaaguspensuspensies
    OPMERKING: Door individuele plaquefenotypes te schrapen en bacteriofaag te vermeerderen in vloeibare culturen van de gastheer, worden bonafide gastheer-bacteriofaag (of gastheer-virus) interacties bevestigd, waardoor bacteriofaag (of virus) werkvoorraden kunnen worden ontwikkeld voor infectietesten. Werkvoorraden bacteriofaag (of virus) moeten worden getiterd met een van de verschillende methoden (bijv. qPCR, plaque-assays) om door te gaan met infectietesten bij een gedefinieerde multipliciteit van infectie (MOI).
    1. Isoleren en vermeerderen van één bacteriofaag (of virus) genotype: Zodra individuele plaques op platen te zien zijn (als gevolg van voldoende verdunning van VLP-concentraat), gebruikt u een steriele lus om een enkele plaque te schrapen. Draai de lus rond in een zaadcultuur van 10 ml van de gastheer (Figuur 6B, links). Incubeer met licht schudden (bijv. 70-120 rpm) in een fotobioreactor gedurende 3-10 dagen bij 25 °C met lichtintensiteit ingesteld op 20-40 mmol foton/m2/s of totdat OD730nm daalt of celresten worden gedetecteerd op de bodem van de buis, wat wijst op celdood/lysis (Figuur 6B, rechts)25.
      OPMERKING: Als er plaques worden gevormd op gastgazons, maar er zijn geen tekenen van infectie in de vloeibare cultuur, kunnen plaques zijn gevormd door een bacteriocine26 in plaats van een bacteriofaag (of virus). TEM kan plaattesten ondersteunen door celdood door bacteriofaag (of virale) infectie aan te geven.
    2. Kwantificering van de titer voor bacteriofaag (of virus) werkvoorraden: Bacteriofaag (of virus) isolatie wordt bereikt met behulp van de hierboven beschreven filtratie- en spinconcentratiemethoden. Kwantificeer titers voor bacteriofaag (of virus) suspensies door middel van seriële verdunningstagtesten27. Als alternatief kunt u DNA-extractie en sequencing van het hele virusgenoom en fylogenetica uitvoeren (Figuur 5B) om primers te ontwikkelen voor het uitvoeren van op qPCR gebaseerde titerering van bacteriofagen om werkvoorraden vast te stellen voor daaropvolgende infectietests.
      OPMERKING: De vermeerdering van enkelvoudige bacteriofaag- (of virus)genotypen kan worden opgeschaald naar culturen van 50 ml of 100 ml als de titer- of werkvoorraadvolumes te laag zijn voor experimentele behoeften. Houd rekening met de aard van het virus-gastheersysteem (bijv. hoge virulentie of lage virulentie), de multipliciteit van infectie (MOI) die is gepland voor infectietesten en hoeveel infectietesten voor een project zullen worden voltooid bij het ontwikkelen van werkvoorraden van bacteriofaag (of virussen). Het is niet aan te raden om virusvoorraden te ontdooien en opnieuw in te vriezen. Ontdooi en gebruik voor elk experiment een volledige virusvoorraad van replicaten van hetzelfde preparaat met dezelfde titer. Andere titertechnieken kunnen een aanvulling vormen op de beschreven methoden, waaronder elektrospray-ionisatie/massaspectrometrie (ESI/MS)28.

5. Infectie testen

OPMERKING: Dit protocol beschrijft gastheer-faag (of gastheer-virus) infectietesten die worden gebruikt om: virulentie, gastheerbereik en infectiefenotype (een indicator van replicatiestrategie) op vaste media kwalitatief te karakteriseren; en beoordeel kwantitatief de groeikinetiek, virusvirulentie14 en gastheerveerkracht15 in vloeibare cultuur.

  1. Bepaling van relatieve bacteriofaag (of virus) virulentie en gastheerbereik op vaste media
    OPMERKING: Alle tests met vaste media, inclusief spot-on-lawn-assays, single-plate seriële verdunningsplaque-assays en hostresistentieplaattesten, leveren kwalitatieve gegevens over bacteriofaag-gastheerinfectieparameters zoals virusvirulentie, gastheerbereik en replicatiestrategie. Groeitesten voor vloeibare cultuur maken meer kwantitatieve metingen en modellering van de dynamiek van virussen en gastheren mogelijk.
    1. Spot-on-lawn-assays: Om het gastheerbereik te bepalen, bereidt u gazons voor van meerdere vermeende gastheren geïsoleerd uit omgevingsmonsters of uit stammen die zijn verkregen uit andere laboratoria of cultuurcollecties. Spot op gazons met een pipet 2 μL bacteriofaag (of virus) suspensie op het gazon. Spot op een apart gebied van dezelfde plaat hetzelfde volume Triton X-100 en nanopuur (18 MW) water als positieve en negatieve controles, respectievelijk16. Voer meerdere spot-on-lawn-tests uit met een bepaalde bacteriofaag (of virus) op meerdere gastheren om het gastheerbereik van de bacteriofaag16 te beoordelen. Plaque-fenotypes bieden inzicht in de replicatiestrategie van bacteriofaag (of virus). Plaques met scherpe randen en die tot aan de agar helder zijn, duiden op lytische replicatie, terwijl plaques met diffuse randen of een halo kunnen duiden op niet-lytische replicatie16,17.
      OPMERKING: Als alternatief geven seriële verdunningsplaquetesten met één plaat aan of er een lineair verband bestaat tussen de grootte van de plaque en de bacteriofagtitter. Gebruik een stift aan de achterkant van de plaat om de plaat op te delen in een raster of taartsecties. Voer vervolgens, met hetzelfde volume (d.w.z. 2 ml) maar met verdunningen van bacteriofaaguspensuspensie (bijv. 1:1, 1:4, 1:16, 1:64), de spot-on-lawn-test uit op een enkele gastheerplaat.
    2. Gastheerresistentietesten: Om te bepalen of een reeks bacteriofagen een infectie op een bepaalde gastheer kan veroorzaken, bereidt u een gastheergazon voor op een bord zoals hierboven beschreven. Gebruik een stift aan de achterkant van de plaat om de plaat te verdelen in een raster of taartsecties. Spot vervolgens 2 ml van elke bacteriofaag (of virus) suspensie in een deel van het rooster (of taart), met Triton X-100 en nanopuur water als controles. Als alle bacteriofaagsuspensies (of virussuspensies) met gelijke titers worden toegevoegd, beoordeel dan de relatieve virulentie tussen bacteriofaagstammen (of virussen) op de gastheer kwalitatief (d.w.z. grotere plaque = virulenter virus).
  2. Kwantificering van virulentie, veerkracht en groei in vloeibare cultuurinfectietesten
    OPMERKING: De eerste kwalitatieve resultaten vormen een basis voor het richten op specifieke bacteriofaag-gastheerparen en het uitvoeren van meer kwantitatieve analyses van de dynamiek van virus-gastheerinteracties. In vloeibare cultuur wordt een groeicurve van de geïnfecteerde gastheer gegenereerd en vergeleken met de groei van niet-geïnfecteerde (controle)gastheer.
    1. Voer een test uit op een infectie met één virus/één gastheer in vloeibare kweek, zoals hieronder beschreven.
      1. Breng parallelle vloeibare culturen (~6-12) tot stand van een micro-organisme (bijv. een cyanobacterie) waarvan is bewezen dat het vatbaar en tolerant is door middel van plaattesten met vaste media (stap 5.1) in: 1,0 l (320 ml cultuur), 500 ml (160 ml cultuur) of 250 ml (80 ml cultuur) - verbijsterde kweekkolven, zoals eerder beschreven17. Op een vooraf bepaald tijdstip (meestal 0,5 of 1 gastheerverdubbelingstijd), inoculeer een subset van parallelle culturen met een equivalente celdichtheid (bijv. OD730 nm = 0,08) in drievoud met bacteriofagensuspensuspensie met behulp van het juiste volume dat nodig is om een vooraf geselecteerde multipliciteit van infectie (MOI) te verkrijgen met beschikbare werkvoorraadtiter.
      2. Laat andere parallelle culturen (ook in drievoud) niet-geïnoculeerd (d.w.z. niet-geïnfecteerd) als controles. Optioneel kunt u een derde set parallelle culturen inoculeren met een andere bacteriofaag (of virus) stam voor vergelijkingen tussen geselecteerde bacteriofaag-gastheerparen. Laat culturen 3-10 dagen groeien in een fotobioreactor bij 25 °C met een lichtintensiteit ingesteld op 20-40 mmol fotonen/m2/s.
      3. Genereer gastheergroeicurves door OD730nm-metingen te doen met regelmatige tussenpozen (bijv. 8 uur) van met bacteriofagie geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde (controle) culturen (Figuur 7A). Gebruik TEM-verificatie van niet-geïnfecteerde controleculturen (Figuur 7C) en productieve infectie in gastheercelculturen (Figuur 7D). Cytopathische effecten29,30 zijn gemakkelijk waarneembaar in de meeste geïnfecteerde cellen, terwijl niet-geïnfecteerde cellen geen tekenen van morfologische transformatie of stress vertonen.
    2. Basislijnanalyses voor vloeibare kweekinfectietests: Uit single-virus/single-host (SVSH) vloeibare cultuurinfectietests kunnen verschillende basislijnstatistieken worden afgeleid, zoals: maximale specifieke groeisnelheid (μmax)31, relatieve bacteriofaag (of virus) virulentie14 en relatieve veerkracht van de gastheer15 - voor een meer kwantitatieve beschrijving van de dynamiek van bacteriofaag of gastheer of virusgastheer (Figuur 7B). Standaard rapporteerbare statistieken zijn onder meer groeisnelheid (vaak gerapporteerd als maximale specifieke groeisnelheid, of μmax) en relatieve virulentie (VR)14 in vergelijking met een niet-geïnfecteerde gastheercontrole en/of een afzonderlijke bacteriofaag op dezelfde gastheer. Andere maatstaven, zoals de draagkracht van het systeem (N-asymptoot) en de relatieve veerkracht van de gastheer (RR)15, kunnen ook worden gerapporteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het gebruik van een draagbare elektrische generator op benzine, een wateroverdrachtspomp en instortbestendige slangen dient als een effectieve manier om watermonsters te extraheren uit de oceaan, meren, bevroren meren en andere aquatische omgevingen (bijv. lagunes) op geselecteerde diepten (Figuur 1, bovenste drie rijen). Alternatieve apparatuur is vereist voor zuur water met een hoge temperatuur van geothermische warmwaterbronnen, zwembaden en modderpotten,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De virosfeer is uitgestrekt en divers, waardoor verschillende experimentele benaderingen nodig zijn voor het bestuderen van verschillende virussystemen. Dit omvat verschillende strategieën voor het isoleren van virussen en hun gastheren uit verschillende omgevingen en verschillende verwerkingsmethoden om ervoor te zorgen dat zuivere culturen van gastheren en hun virussen kunnen worden geproduceerd uit onbewerkte monsters. Deze zuivere culturen kunnen worden gebruikt in SVSH-infectieteste...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de Amerikaanse National Science Foundation (NSF) OISE grant no. 1856091 (PI-Ceballos) en NSF DBI grant no. 2119968 (PI-Ceballos). De auteurs erkennen de bijdragen van Dr. Chinnapong Wangnai en Dr. Chakrit Tachaapaikoon van King Mongkut's University of Technology Thonburi (Thailand), die respectievelijk videografie en veldondersteuning leverden voor milieubemonstering. De auteurs danken ook Dr. Jorge Armando Leiva Sanabria van de Universiteit van Costa Rica - Guanacaste voor zijn hulp bij het verkrijgen van bemonsteringsvergunningen van nationale parken in Costa Rica en het assisteren bij het verzamelen van monsters uit de geothermische zwembaden. De auteurs danken ook de heer Enrique Marroquin, Jr. (University of California Merced) en mevrouw Alexia Maceda (University of Maine, Orono, ME, VS), die hielpen bij het bemonsteren voor respectievelijk de kust van Zuid-Californië en meren in het noorden van Minnesota. De auteurs bedanken en erkennen de technische ondersteuning van mevrouw Socheata Hour, die infectieparameters heeft berekend voor de φSBL14-SWII-dataset.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 hp roestvrijstalen transferpomp Utilitech, Charlotte, NC, USAN/A
1.5 ml buizenwww.eppendorf.com30123611
10K NMWL Centricon Plus 70 spin-concentrator www.sigmaaldrich.comUFC701008
250 mL Erlenmeyer kolven met barrière www.sigmaaldrich.comCLS4450250
3800-Watt Inverter Generator WEN Products, West Dundee, IL, USAWEN 56380i
3K NMWL Amicon 15 mL www.sigmaaldrich.comUFC800308
500 mL Erlenmeyer kolven met barrière www.sigmaaldrich.comCLS4450500
5-gallon waterkannen www.homedepot.comN/A
80ft lang, 0.5” diameter, nylon https://facomex.mx/producto/combo/N/A
Een 26 ft. diepe V-console Sailfish 2660 met twee Yamaha 150 pk buitenboordmotoren https://yamahaoutboards.com/N/A
Ammoniumacetaat (CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
Boorzuur (H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
Calciumchloride dihydraat (CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
Centrifuge 5920 Rwww.eppendorf.com5948000107
Citroenzuur (C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
Kobalt(II)nitraat hexahydraat [Co(NO3)2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
Instortingsbestendige rubberen flexibele slang swanhose.comCELTF58050
Koper(II)sulfaat pentahydraat (CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
Corning 50 mL centrifugebuizen www.sigmaaldrich.comCLS430291
Dipotassiumfosfaat (K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
Dinatriumethyleen-diaminetetra-acetaatzuur (Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolume en Spectrofotometer en Florometerwww.denovix.comN/A
Maskertape www.homedepot.comN/A
Eppendorf buizenwww.sigmaaldrich.comEP022364120
Ethanolwww.sigmaaldrich.com64175
Ethyleen-diaminetetra-acetaatzuur (EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
Ferric ammoniumcitraat (C6H8O7·xFe3+·yNH3)www.sigmaaldrich.com1185575
Flex-plus blauw PVC-slang www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - Stapelbare Incubator Shakerwww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 Benchtop Electron Microscope_Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)delongamerica.comN/A
Magnesiumsulfaat heptahydraat (MgSO4.7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
Mangaan(II)chloride tetrahydraat (MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
Mushroom Anchor zwarte vinylcoating/30 lbswww.homedepot.comN/A
Petrischalen, polystyreenwww.sigmaaldrich.comP5481
Polyethersulfone (PES) membraanfiltercup met 0.22 mmwww.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
Polyethersulfone (PES) membraanfiltercup met 0.45 mmwww.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
Kaliumethylxanthogenaat (C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
Natriumcarbonaat (Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
Natriumdodecylsulfaat [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
Natriummolybdaat dihydraat (Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
Natriumnitraat (NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonic acid (TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
Triton X-100 www.sigmaaldrich.comT8787
Trizma hydrochloride (Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
Vacuum/drukpomp Cole-Parmer; Vernon Hills, IL, USAEW-79204-00
Vinylslang www.homedepot.comN/A
Zinksulfaat heptahydraat (ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

Referenties

  1. Zhang, D., You, F., He, Y., Te, S. H., Gin, K. Y. H. Isolation and characterization of the first freshwater cyanophage infecting Pseudanabaena. J Virol. 94 (17), 10-1128 (2020).
  2. Dong, Z. Isolation, Characterization and Ecological Dynamics of Tropical Freshwater Cyanophages. , National University of Singapore. Doctoral dissertation (2022).
  3. Sime-Ngando, T. Environmental bacteriophages: viruses of microbes in aquatic ecosystems. Front Microbiol. 5, 355(2014).
  4. Sigee, D. C. Freshwater microbiology: biodiversity and dynamic interactions of microorganisms in the aquatic environment. , John Wiley & Sons. (2005).
  5. Jacquet, S., Miki, T., Noble, R., Peduzzi, P., Wilhelm, S. Viruses in aquatic ecosystems: important advancements of the last 20 years and prospects for the future in the field of microbial oceanography and limnology. Adv Oceanography Limnol. 1 (1), 97-141 (2010).
  6. Tucker, S., Pollard, P. Identification of cyanophage Ma-LBP and infection of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa from an Australian subtropical lake by the virus. Appl Environ Microbiol. 71 (2), 629-635 (2005).
  7. Bhardwaj, A., et al. Cyanobacteria: a key player in nutrient cycling. Cyanobacteria. , 579-596 (2024).
  8. Douterelo, I., et al. Methodological approaches for studying the microbial ecology of drinking water distribution systems. Water Res. 65, 134-156 (2014).
  9. Brandt, J. P., Flannigan, M. D., Maynard, D. G., Thompson, I. D., Volney, W. J. A. An introduction to Canada's boreal zone: ecosystem processes, health, sustainability, and environmental issues. Environ Rev. 21 (4), 207-226 (2013).
  10. Ramanan, R., Kim, B. H., Cho, D. H., Oh, H. M., Kim, H. S. Algae-bacteria interactions: evolution, ecology and emerging applications. Biotechnol Adv. 34 (1), 14-29 (2016).
  11. Atkinson, C. L., Capps, K. A., Rugenski, A. T., Vanni, M. J. Consumer-driven nutrient dynamics in freshwater ecosystems: From individuals to ecosystems. Biol Rev. 92 (4), 2003-2023 (2017).
  12. Mojica, K. D., Brussaard, C. P. Factors affecting virus dynamics and microbial host-virus interactions in marine environments. FEMS Microbiol Ecol. 89 (3), 495-515 (2014).
  13. Graham, E. B., et al. Microbes as engines of ecosystem function: when does community structure enhance predictions of ecosystem processes. Front Microbiol. 7, 214(2016).
  14. Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: when µ max fails and AUC alone just is not enough. J General Virol. 102 (1), 001515(2021).
  15. Hour, S., Pierce, A. J., Heng, S. Y., Plymale, R., Ceballos, R. M. Quantifying Resilience in Single-Host/Single-Virus Infections. Appl Microbiol. 5 (1), 18(2025).
  16. Ceballos, R. M., et al. Differential virus host-ranges of the Fuselloviridae of hyperthermophilic Archaea: implications for evolution in extreme environments. Front Microbiol. 3, 295(2012).
  17. Ceballos, R. M., Drummond, C. G., Stacy, C. L., Padilla-Crespo, E., Stedman, K. M. Host-dependent differences in replication strategy of the Sulfolobus spindle-shaped virus strain SSV9 (aka, SSVK1): infection profiles in hosts of the family Sulfolobaceae. Front Microbiol. 11, 1218(2020).
  18. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
  19. Kliphuis, A. M., Janssen, M., van den End, E. J., Martens, D. E., Wijffels, R. H. Light respiration in Chlorella sorokiniana. J Appl Phycol. 23, 935-947 (2011).
  20. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. J Vis Exp. (111), e54001(2016).
  21. Noroozi, M., Amozegar, M. A., Rahimi, R., Shahzadeh Fazeli, S. A., Bakhshi Khaniki, G. The isolation and preliminary characterization of native cyanobacterial and microalgal strains from lagoons contaminated with petroleum oil in Khark Island. Biol J Microorg. 5 (20), 33-41 (2017).
  22. Nübel, U., Garcia-Pichel, F., Muyzer, G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (8), 3327-3332 (1997).
  23. Tragin, M., Lopes dos Santos, A., Christen, R., Vaulot, D. Diversity and ecology of green microalgae in marine systems: an overview based on 18S rRNA gene sequences. Perspect. Phycol. 3 (3), 141-154 (2016).
  24. Uchida, H., et al. A coupled assay system for the lysis of cyanobacteria. Japanese J Water Treatment Biol. 34 (1), 67-75 (1998).
  25. Drummond, C. Characterization of Sulfolobus. Spindle-shaped Virus replication. , Portland State University. (2010).
  26. Flores, E., Wolk, C. P. Production, by filamentous, nitrogen-fixing cyanobacteria, of a bacteriocin and of other antibiotics that kill related strains. Arch Microbiol. 145, 215-219 (1986).
  27. Wick, C., McCubbin, P. Characterization of purified MS2 bacteriophage by the physical counting methodology used in the integrated virus detection system (IVDS). Toxicol Methods. 9 (4), 245-252 (1999).
  28. Marei, E. M., Elbaz, R., Hammad, A. Induction of temperate cyanophages using heavy metal-copper. Int J Microbiol Res Rev. 5 (5), 472(2013).
  29. Bratchkova, A., Kroumov, A. D. Microalgae as producers of biologically active compounds with antibacterial, antiviral, antifungal, antialgal, antiprotozoal, antiparasitic and anticancer activity. Acta Microbiol Bulgarica. 36 (3), 79-89 (2020).
  30. Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: a metric for quantitative analysis of phage virulence. Phage. 1 (1), 27-36 (2020).
  31. Omata, T., Murata, N. Isolation and characterization of three types of membranes from the cyanobacterium (blue-green alga) Synechocystis PCC 6714. Arch Microbiol. 139, 113-116 (1984).
  32. Wilson, W. H., Joint, I. R., Carr, N. G., Mann, N. H. Isolation and molecular characterization of five marine cyanophages propagated on Synechococcus sp. strain WH7803. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3736-3743 (1993).
  33. Grasso, C. R., et al. A review of cyanophage-host relationships: Highlighting cyanophages as a potential cyanobacteria control strategy. Toxins. 14 (6), 385(2022).
  34. Srivastava, A., Gupta, N., Mishra, A. K. Cyanophages: interacting mechanism and evolutionary significance. Cyanobacteria. , 255-282 (2024).
  35. Cai, L., et al. Abundant and cosmopolitan lineage of cyanopodoviruses lacking a DNA polymerase gene. ISME J. 17 (2), 252-262 (2023).
  36. Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86 (4), 295-335 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Cyanobacterievirussenvirus gastheer dynamiekisolatie van bacteriofagentransmissie elektronenmicroscopieplaque assaybepaling van het gastheerbereikhigh throughput sequencingfylogenetische analyse
Milieubemonstering van fotosynthetische microben en hun virussen: van veld tot laboratorium
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.