Visualisatie van retinale organoïden voor de hele berg met cellulaire resolutie

Samenvatting

Dit protocol combineert optische klaring en immunolabeling voor confocale beeldvorming van het hele netvlies van de hele montuur. Het behoudt de 3D-structuur, waardoor gedetailleerde visualisatie van belangrijke neuronale paden mogelijk is, waardoor de studie van retinale rijping, ruimtelijke organisatie en de mogelijke toepassingen ervan in ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskunde worden verbeterd.

Samenvatting

Retinale organoïden afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen zijn ingewikkelde 3D-structuren die het menselijk netvlies nabootsen en een krachtig platform bieden voor het bestuderen van de ontwikkeling van het netvlies, ziektemechanismen en mogelijke therapeutische strategieën. Bovendien worden ze, omdat ze afkomstig zijn van patiënten, steeds populairder omdat ze veelbelovend zijn als hulpmiddel voor gepersonaliseerde geneeskunde. In tegenstelling tot conventionele 2D-celculturen, behouden retinale organoïden de oorspronkelijke 3D-architectuur van het netvlies, waardoor een meer realistische weergave mogelijk is en meer fysiologisch relevante studies mogelijk zijn. Hun structurele complexiteit, hoge cellulaire dichtheid en diverse samenstelling vormen echter aanzienlijke uitdagingen voor karakterisering.

Om deze uitdagingen aan te gaan en ons begrip van de rijping van retinale organoïden te vergroten met behoud van de 3D-context, hebben we optische clearingmethoden gecombineerd met immunolabeling om de volledige structuur van organoïden op de hele berg te visualiseren met confocale microscopie. Hiervoor hebben we een clearingmethode gebruikt die compatibel is met objectieven met een lage en hoge numerieke apertuur, waardoor beeldvorming op volledig volume mogelijk is en bepaalde interessegebieden met cellulaire resolutie worden vastgelegd. Met behulp van deze benadering hebben we de morfologie en distributie in 3D geïdentificeerd van de drie belangrijkste neuronpaden die verantwoordelijk zijn voor de visuele informatieoverdracht: kegel- en staaffotoreceptoren, bipolaire en ganglioncellen. Onze bevindingen werpen meer licht op de visualisatietechnieken om de ruimtelijke organisatie van netvliescellen in de organoïde aan te pakken.

Inleiding

Retinale organoïden

Retinale organoïden zijn complexe 3D-structuren die het menselijk netvlies nabootsen en een waardevol platform bieden voor het bestuderen van de ontwikkeling van het netvlies, ziektemechanismen en mogelijke therapeutische strategieën¹. Ze behouden de natuurlijke 3D-architectuur van het netvlies, vertonen transcriptomische getrouwheid en functionele competentie, reproduceren fototransductie en synaptische connectiviteit². Bovendien bootsen ze de in vivo ^{ontwikkeling 3,4} nauw na, wat een meer realistische weergave mogelijk maakt in vergelijking met platte celculturen. In eerdere studies hebben Isla-Magrané et al. een tweestapsprotocol opgesteld om multioculaire organoïden te verkrijgen die zijn afgeleid van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) om cellulaire kenmerken van het menselijk oog in ontwikkeling te modelleren ^5,6. Vanwege de schaarste aan foetaal weefsel is het onderzoek naar de ontwikkeling van het menselijk oog beperkt tot anatomische studies.

De retinale organoïden die met dit protocol werden verkregen, vertoonden een goede gelaagdheid en bevatten alle belangrijke subtypes van retinale cellen, zoals fotoreceptoren, bipolaire cellen, ganglioncellen, amacriene en horizontale cellen en macroglia, samen met belangrijke morfologische kenmerken en correcte ruimtelijke organisatie en verbindingen. Organoïdemodellen, hoewel een mogelijke oplossing, vertonen een aanzienlijke variabiliteit, waardoor het moeilijk is om consistente resultaten te bereiken. Daarom is er een dringende behoefte om een verscheidenheid aan geavanceerde technologieën toe te passen in betrouwbaardere menselijke modellen. Tot op heden zijn deze organoïden alleen bestudeerd met behulp van histologische secties, omdat hun complexe cellulaire samenstelling, dichtheid en grootte de lichtpenetratie belemmeren, wat resulteert in slechte optische beeldvormingsprestaties in diepere lagen, waardoor uitgebreide analyse wordt beperkt.

Beeldvorming op de hele berg

Traditionele histologische technieken, waarbij gefixeerde weefsels worden doorgesneden en gekleurd, kunnen gedetailleerde informatie verschaffen over specifieke regio's, maar slagen er niet in om de algehele architectuur en ruimtelijke relaties binnen de hele organoïde vast te leggen. Om deze beperking te overwinnen, komt beeldvorming op de hele berg naar voren als een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van retinale organoïden. Whole-mount beeldvorming maakt visualisatie van de gehele organoïde in zijn intacte 3D-vorm mogelijk, waardoor de ruimtelijke verdeling van celtypen en extracellulaire matrixcomponenten behouden blijft. Deze benadering is vooral nuttig voor het onderzoeken van de cellulaire samenstelling binnen en tussen organoïden, en biedt een vollediger begrip van hun ontwikkelingsprocessen en functionele organisatie. Vanwege hun cellulaire dichtheid en verdichting zijn retinale organoïden echter ondoorzichtig (Figuur 1, niet opgehelderd). De inherente ondoorzichtigheid van monsters veroorzaakt lichtverstrooiing, wat een gedetailleerde visualisatie van interne structuren met behulp van microscopie belemmert. Hier komen optische clearingtechnieken naar voren als een krachtig hulpmiddel.

Optische clearingtechnieken

Optische klaring verwijst naar fysisch-chemische behandelingen die dikke biologische monsters transparant maken door de brekingsindex (RI) gradiënten van het weefsel te homogeniseren zodat ze overeenkomen met die van het klaringsmiddel en lichtabsorberende stoffen te verwijderen⁷. Deze methoden verminderen de lichtverstrooiing drastisch en verhogen de transparantie. Deze transformatie stelt ons in staat om door de hele retinale organoïde te kijken, waardoor een uitgebreide analyse van de ingewikkelde cellulaire organisatie en morfologie mogelijk is door middel van beeldvormingstechnieken voor de hele reeks. In de praktijk wordt dit bereikt door het monster te impregneren met een stof met een hoog RI-gehalte en lipiden en pigmenten te verwijderen.

Er zijn verschillende clearingmethoden beschikbaar, die in verschillende aspecten verschillen (bijv. mate van transparantie, compatibiliteit met microscopische technieken, monsters en fluorescerende moleculen, haalbaarheid, duur), maar geen enkele onderscheidt zich als het beste gemeenschappelijke protocol⁸. Ze worden ingedeeld in vier hoofdgroepen: (1) eenvoudige onderdompeling, (2) hydrofoob of op basis van organische oplosmiddelen, (3) op basis van hyperhydratatie en (4) weefseltransformatie of hydrogelinbedding, zoals mooi samengevat door Avilov et al⁷. Alle methoden bevatten een stap voor de RI-matching, meestal door het monster in een oplossing te dompelen die overeenkomt met de gemiddelde RI van het weefsel. Bij hydrofobe methoden worden lipiden en water verwijderd door het monster onder te dompelen in een toenemende concentratie organische oplosmiddelen (zoals methanol of propanol).

Het gepresenteerde protocol is een geoptimaliseerde methode die optische klaring integreert met immunolabeling om 3D-visualisatie van retinale organoïden met confocale microscopie te vergemakkelijken, waardoor beeldvorming op volledig volume mogelijk is met behoud van structurele integriteit. Deze aanpak maakt het mogelijk om de belangrijkste retinale celtypen binnen de organoïde te identificeren, waardoor onderzoekers een krachtig hulpmiddel krijgen om de rijping en ruimtelijke organisatie van retinale organoïden te onderzoeken in een fysiologisch relevante context.

Protocol

1. Bereiding van op maat gemaakte fluorescerende secundaire antilichamen

OPMERKING: Deze benadering dient als alternatief voor het gebruik van in de handel verkrijgbare fluorescerende antilichamen (zie de discussie voor de voordelen van het bereiden van fluorescerende secundaire antilichamen). Bovendien kan dit protocol worden gebruikt voor het conjugeren van fluoroforen aan primaire antilichamen in het geval dat directe immunofluorescentie moet worden uitgevoerd en het fluorescerende primaire antilichaam niet in de handel verkrijgbaar is. Het beheersen van de verhouding tussen fluorofoor en antilichamen door de hoeveelheid fluorofoor in de labelingsreactie aan te passen, produceert helderdere geconjugeerde antilichamen. Op maat gemaakte secundaire antilichamen zijn echter minder stabiel en de concentratie van het resulterende conjugaat is 10x lager dan die van de in de handel verkrijgbare fluorescerende antilichamen. Dit protocol is een bewerking van het werk beschreven door Bálint et al⁹.

1. Los 1 mg fluorofoor op in watervrije DMSO en aliquot in buisjes voor een uiteindelijke 0,02 mg fluorofoor per buisje. Verwijder alle DMSO met behulp van een vacuümconcentrator, die 1 uur en 30 minuten draait. Bewaar aliquots bij -20 ºC beschermd tegen licht. Voor Alexa Fluor 405 is ultrapure H₂O het geschikte oplosmiddel voor het maken van aliquots.
2. Los voor het uitvoeren van de labelreactie één aliquot van de fluorofoor op in 1-10 μL DMSO (of ultrazuivere H₂O voor Alexa Fluor 405).
   OPMERKING: De exacte hoeveelheid DMSO wordt bepaald door middel van eerdere controleconjugatietests. Deze tests worden uitgevoerd wanneer een nieuwe batch van een fluorofoor moet worden gebruikt (of wanneer een eerdere fluorofoorbatch opraakt), of wanneer een nieuwe fluorofoor voor het eerst in de conjugatie wordt gebruikt. De controleconjugatietest omvat het uitvoeren van labelingsreacties met variërende hoeveelheden fluorofoor om de optimale verhouding tussen fluorofoor en antilichamen in het conjugaat te bepalen. In ons geval ligt de optimale verhouding meestal tussen 3 μL en 5 μL.
3. Incubeer 50 μL secundair IgG (of primair), 6 μL 1 M NaHCO₃ en 1-5 μL fluorofoor gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur (RT) op een schommelplatform, beschermd tegen licht.
4. Terwijl de reactie vordert, bereidt u de uitsluitingskolommen voor zuiveringsgrootte voor door de deksels te verwijderen en de buffer door te laten. Breng de kolom in evenwicht (één voor elke labelreactie) door 3 x 2-3 ml PBS door de kolom te laten lopen. Als de laatste evenwichtsstap is voltooid voordat de incubatie eindigt, plaats dan de deksels terug om te voorkomen dat ze opdrogen en wacht tot de etiketteringsreactie is voltooid.
   OPMERKING: Uitsluitingskolommen voor zuiveringsgrootte werken door zwaartekracht. Zorg ervoor dat de kolom op geen enkel moment opdroogt, anders werkt de zuiveringsreactie niet goed.
5. Wanneer de reactie is voltooid (stap 1.3), voegt u 140 μL PBS toe aan de labelreactie om het volume ongeveer 200 μL te maken en vortex het. Voeg deze oplossing toe aan het midden van de kolom, laat het monster de kolom binnenkomen en nadat de laatste druppel is geëlueerd, duwt u door 550 μL PBS toe te voegen. Wanneer de vloeistof stopt met vallen, elueert u door 300 μL PBS toe te voegen en verzamelt u deze in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
6. Bereken de antilichaamconcentratie en etiketteringsratio's door de extinctie van het monster bij 280 nm en de absorptie van de gebruikte fluoroforen te meten. Pas de wet van Beer-Lambert toe om de concentratie (in molariteit) als volgt te bepalen:
   
   Waarbij A staat voor de extinctie, ε voor de molaire extinctiecoëfficiënt, en CF₂₈₀ is een maat voor de extinctie die de specifieke fluorofoor heeft bij 280 nm die als correctiefactor dient. Dan is de concentratie van het antilichaam:
   
   En de etiketteringsverhouding is:
   
7. Bewaar de gelabelde antilichamen maximaal 6 maanden bij 4 ºC, beschermd tegen licht.

2. Immunofluorescentie etikettering

1. Fixeer de organoïden met 4% paraformaldehyde (PFA) bij RT gedurende 45 min.
   OPMERKING: OPTIONEEL: Incubeer de organoïden met een antigeen-ophaaloplossing (stappen 2.2 en 2.3) om de immunoreactiviteit van de antigenen te verbeteren.
2. Bereid 40 ml antigeenoplossing door 0,117 mg natriumcitraat tribasisch dihydraat te mengen in ultrazuivere H₂O en aan te passen aan pH 9.
3. Incubeer de organoïden met de antigeenoplossing onder licht schudden (30 rpm) bij 60 °C gedurende 1 uur.
4. Permeabiliseer de organoïden met PBST (PBS met 1% Triton X-100) met licht schudden bij RT gedurende 4 uur.
5. Blokkeer de organoïden met blokkeeroplossing (2% runderserumalbumine (BSA) met 0,1% Triton X-100) bij RT gedurende een nacht (of langer dan 1 dag).
   OPMERKING: Primaire en secundaire antilichaamconcentraties zijn afhankelijk van het specifieke antilichaam. Voor immunofluorescentie van whole-mount samples gebruiken we een hogere concentratie in vergelijking met gesegmenteerde samples. We incuberen het primaire antilichaam bij 10 μg/ml, wat in de meeste gevallen overeenkomt met 1:100 uit de voorraad (tabel 1). We incuberen onze op maat gemaakte secundaire antilichamen bij 20-50 μg/ml.
6. Incubeer de organoïden met de primaire antilichamen verdund in wasoplossing (0,1% BSA met 0,1% Triton X-100) bij 4 °C gedurende 2 dagen met licht schudden.
7. Was de organoïden 3 x 15 minuten in een wasoplossing met mild schudden bij RT.
8. Incubeer de organoïden met de secundaire antilichamen verdund in een wasoplossing bij 4 °C gedurende 2 dagen met licht schudden.
9. Was de organoïden 3 x 15 minuten in een wasoplossing met mild schudden bij RT.
   OPMERKING: Na immunolabeling kunnen fluorescerende kleurstoffen naar keuze worden geïncubeerd. Normaal gesproken gebruiken we fluorescerende kernmarkers, zoals DAPI (1:1.000) en DRAQ5 (1:500), of falloidine (1:100) voor het visualiseren van het actinefilamentnetwerk.
10. Incubeer de organoïden met de fluorescerende kleurstoffen verdund in een wasoplossing bij RT gedurende 1 uur met licht schudden.
11. Was de organoïden 3 x 15 minuten in een wasoplossing met mild schudden bij RT.

3. Optisch klaren met FluoClear BABB

OPMERKING: 1-Propanol kan plastic containers in gevaar brengen, vooral bij langdurige blootstelling. Gebruik voor de zekerheid glazen containers.

1. Stap uitdroging
   1. Bereid 1-propanoloplossingen in ultrazuivere H₂O met de gegeven percentages (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) en pas vervolgens aan op pH 9,5 met trimethylamine.
      LET OP: Triethylamine is giftig bij inademing. Werk onder een zuurkast. Oplossingen kunnen worden hergebruikt als ze op de juiste manier worden bewaard (goed afgesloten verpakking). Pas de pH aan voor gebruik.
   2. Incubeer de monsters met de toenemende gradiënt van 1-propanoloplossingen (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) gedurende elk 2 uur bij 30 °C met licht schudden.
   3. Incubeer de monsters met 100% 1-propanol een nacht bij 30 °C en schud licht.
2. Stap opruimen
   LET OP: BABB is een krachtig oplosmiddelmengsel dat bekend staat om zijn vermogen om veel kunststoffen op te lossen of aanzienlijk te beschadigen. Gebruik voor de zekerheid glazen containers met compatibele deksels en werk in een zuurkast.
   1. Bereid de BABB voor door benzylalcohol (BA) en benzylbenzoaat (BB) in een verhouding van 1:2 te mengen.
   2. Dompel de samples 's nachts onder in BABB bij RT.
   3. Vernieuw de BABB voor de beeldvorming.
      OPMERKING: Voor organoïden met een diameter van ~ 1 mm induceert BABB een zuiverend effect dat binnen tientallen minuten zichtbaar is. Afhankelijk van de grootte en de aard van het monster kan de mate van klaring verschillen en/of een langere belichtingstijd aan de klaringsoplossing vereisen. We raden aan om voor en na de BABB-onderdompeling afbeeldingen te maken om het clearingprotocol te verbeteren.
   4. Bewaar BABB-geklaarde monsters met BABB-oplossing voor de lange termijn bij 4 °C. Bescherm tegen licht om de fluorescentie te behouden.

4. Beeldacquisitie op de hele montage

1. Plaats de organoïde met behulp van een glaspipet in een petrischaaltje met glazen bodem met een druppel BABB. Zorg ervoor dat het monster contact maakt met het oppervlak van het dekglas.
   LET OP: Zorg ervoor dat de druppel BABB met het monster niet in contact komt met de plastic randen van de schaal, anders smelt het plastic, waardoor het monster en de kwaliteit van de beeldvorming in gevaar komen.
2. Met behulp van een omgekeerde confocale laserscanmicroscoop die is uitgerust met objectieven met lage en hoge vergroting, kunt u Z-stack-beelden verkrijgen om het volledige 3D-inzicht van het monster met cellulaire details te verkrijgen.
   OPMERKING: Voor dit onderzoek werden een 10x numeriek apertuur (NA) 0,4 luchtobjectief en een 63x NA 1,4 objectief gebruikt, met een stapgrootte van respectievelijk 3,5 μm en 1 μm.

5. Beeldverwerking

1. Kalibreer de stapgrootte van de Z-stack-acquisitie opnieuw, rekening houdend met de brekingsindex (RI) die niet overeenstemt tussen de klaringsoplossing en de immersiemedia.
   1. Bereken de opnieuw gekalibreerde stapgrootte als volgt:
      
      Voor een monster ingebed in BABB, afgebeeld met een luchtobjectief met een stapgrootte van 3,5 μm, ziet het er als volgt uit:
      
   2. Wijzig met ImageJ de voxeldiepte (klik op Afbeelding | Eigenschappen...) voor de opnieuw berekende stapgrootte.
2. Maak beeldprojecties van de Z-stack.
   1. Inspecteer met behulp van ImageJ de Z-stack grondig (klik op Afbeelding | Stapels | Orthogonale aanzichten). XY-, XZ- en YZ-weergaven van de retinale organoïde verschijnen.
   2. Sla de gewenste interessegebieden op (klik op Bestand | Opslaan als...).
3. Maak een animatie van de 3D-render van de Z-stack met behulp van verwerkingssoftware (zie de Materiaaltabel).
   1. Selecteer de kanalen die u wilt visualiseren door de selectievakjes in te schakelen.
   2. Pas de Z-vlakken aan om het interieur van het monster te visualiseren (schakel Clipping in het selectievakje in).
   3. Neem de animatie op met de filmeditor (schakel Filmeditor in het selectievakje in). Slepen en neerzetten en direct in- en uitzoomen met de muis. Klik op Toevoegen om een andere clip voor de animatie toe te voegen. Als u de Z-vlakken aanpast, schakelt u de optie Knipvlakken in (klik op Instellingen... | vink het vakje Vliegtuigen knippen aan).

Resultaten

Figuur 1: Vergelijking van drie clearingmethoden. Links: Brightfield-beelden van (A) niet-geclearde en (B-D) geclearde samples. Rechts: Z-stack met xz en yz orthogonale aanzichten van 90 DIV retinale organoïden gekleurd met de nucleaire marker DRAQ5 (geel) verkregen met een confocale laserscanmicroscoop uitgerust met een 10x luchtobjectief (RI = 1,00). (A) Niet-geklaarde retinale organoïde (N = 3). PFA-gefixeerde retinale organoïden zijn niet transparant genoeg voor 3D-visualisatie. (B) Fructose/glycerol-geklaarde organoïde (N = 3). (C) ECi-geclearde organoïde (N = 3). (D) FluoClear BABB-geclearde organoïde (N = 3). Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: BF = brightfield; CLSM = confocale laserscanmicroscoop; RI = brekingsindex; PFA = paraformaldehyde; ECi = ethylkaneel; BABB = benzylalcohol/benzylbenzoaat; DIV = dagen in vitro. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vergelijking van optische klaringsmethoden voor immunofluorescentiestudies in neuroretinale organoïden

Hier presenteren we de resultaten van drie clearingmethoden om de werkzaamheid van FluoClear BABB voor het transparant maken van retinale organoïden aan te tonen. In figuur 1 zien we retinale organoïden die zijn geklaard met fructose/glycerol (figuur 1B), ECi (figuur 1C) en FluoClear BABB (figuur 1D). De geteste klaringsmethoden zijn gekozen omdat is bewezen dat ze allemaal^10,11 compatibel zijn met immunofluorescentiekleuring en fluorescentie van endogene eiwitten behouden (bijv. GFP aanwezig in GCaMP's).

Fructose/Glycerol¹² is een niet-toxisch, eenvoudig protocol voor het opruimen van onderdompeling dat geen uitdroging vereist, waardoor de verwerkingstijd aanzienlijk wordt verkort in vergelijking met andere methoden. Er is gemeld dat het efficiënt is voor het transparantiseren van organoïden die zijn afgeleid van verschillende weefsels: luchtwegen, nieren, lever en borstkanker bij de mens¹².

ECi (Ethyl Cinnamate)¹¹ is een door de FDA goedgekeurd voedselaroma en additief voor cosmetica^13,14, wordt als onschadelijk beschouwd en heeft bewezen een uitstekend klaringsreagens te zijn voor weefsels van zoogdieren. Het staat bekend om zijn snelle klaringsvermogen en minimale weefselvervorming. Het is geclassificeerd als een hydrofobe klaringsmethode, maar in vergelijking met oplosmiddelen op basis van BABB is het niet giftig en behoudt het de fluorescentie van fluorescerende eiwitten langer (tot 14 dagen). Zoals gebruikelijk in de meeste clearingprotocollen, vereist ECi een voorafgaande uitdrogingsstap. Voor optimale resultaten wordt deze stap bereikt door het monster te dompelen in oplossingen met geleidelijk toenemende alcoholconcentraties. Omdat ECi niet schadelijk is, kan het monster, zodra het is gewist, veilig worden gemanipuleerd en in plastic containers worden bewaard. De dehydratatiestappen worden echter uitgevoerd met behulp van 1-propanol, een organisch oplosmiddel dat onder een zuurkast moet worden gemanipuleerd en in glazen containers moet worden bewaard.

FluoClear BABB¹⁰ is een variantvorm van een hydrofoob protocol op basis van benzylalcohol/benzylbenzoaat (BABB) als oplossing voor het matchen van de brekingsindex. Het is bekend dat het zeer giftig en bijtend is, dus het moet met zorg worden behandeld. FluoClear BABB is beschreven als een verbeterde versie die GFP en RFP beter behoudt dan eerdere versies en het gebruik van 1-propanol of tert-butanol als dehydratatiemiddel mogelijk maakt.

Om de prestaties van de drie clearingmethoden te beoordelen, hebben we Z-vlakken in beeld gebracht met een confocale microscoop uitgerust met een 10x NA0.4 luchtobjectief, dat een groot gezichtsveld (FoV) van 2,5 x 2,5 x 2,56 mm biedt om het hele volume van de retinale organoïde vast te leggen. We gebruikten retinale organoïden in een tussenstadium van rijping (90 dagen in vitro (DIV)) die alle retinale neuronen (ganglioncellen, bipolaire cellen en fotoreceptoren) bevatten, waardoor de cellulaire dichtheid en verdichting wordt bereikt en dus ondoorzichtig is. Zoals uitgelegd in de inleiding, wordt de optische klaring bereikt wanneer RI wordt afgestemd op het hele object dat moet worden afgebeeld. De immersiemedia die voor beeldvorming worden gebruikt, zullen dus een drastische invloed hebben op de bereikte transparantie. Tabel 2 geeft een gedetailleerd overzicht van de RI van de dompelmedia en de geteste klaringsoplossingen.

	Oplossing	Brekingsindex
Dompel media	Lucht	1
	Water	1.33
	Glycerol	1.45
	Olie	1.51
Oplossingen voor clearing	Fructose/glycerol	1.468
	Μγος	1.558
	FluoClear BABB	1.56

Tabel 2: Brekingsindex (RI) van de immersiemedia die het meest worden gebruikt voor lichtmicroscopie en de optische clearingmethodologieën die zijn getest voor het klaren van retinale organoïden. Afkorting: RI = brekingsindex.

Bij het vergelijken van de resulterende confocale beelden (Figuur 1, rechterpaneel), resulteerde fructose/glycerolbehandeling in de minste verbetering van de transparantie, waardoor de visualisatie van de retinale lagen werd beperkt en visualisatie van de organoïde kern werd voorkomen. ECi bereikte een betere transparantie, waardoor de visualisatie van de retinale lagen mogelijk was, maar nog steeds beperkte visualisatie van de retinale organoïde kern vanwege lichtverstrooiing die de fluorescentiedetectie vanuit de binnenste delen van het monster belemmerde. FluoClear BABB zorgde voor de grootste verbetering in transparantie, waardoor een duidelijke visualisatie van zowel de kern als de cortex van de retinale organoïde mogelijk was met een hogere resolutie en een vergelijkbare fluorescentie-intensiteit.

Het is vermeldenswaard dat zowel ECi- als FluoClear BABB-protocollen een opmerkelijke krimp van het monster veroorzaakten, zoals geïllustreerd door de bijbehorende helderveldbeelden van elke geklaarde retinale organoïde (Figuur 1, linkerpaneel). Krimp van het monster is te wijten aan de vorige dehydratatiestappen die water verwijderen, en dat is de reden waarom het fructose/glycerol-protocol het monster niet krimpt. Deze krimp biedt echter een unieke kans voor diepere exploratie. Hoewel het de totale grootte van de organoïde comprimeert en mogelijk interne afstanden onderschat, verhoogt het ook de compactheid. Deze isotrope compactheid, relatief uniform in alle richtingen, stelt ons in staat om gebruik te maken van objecten met een hoge vergroting met een superieur oplossend vermogen (vanwege hun grotere NA) die anders alleen de buitenste cellaag in beeld zouden brengen vanwege hun kortere werkafstanden (WD). Zo biedt een 10x NA 0.4 luchtobjectief een WD van 2,53 mm, terwijl een 63x NA 1,4 olieobjectief met een aanzienlijk betere resolutie een WD heeft van slechts 0,14 mm. Door gebruik te maken van BABB-geclearde, compactere organoïden, kunnen we deze beperking effectief overwinnen en een beeldvorming met hoge resolutie bereiken van diepere structuren, zoals de ganglioncellaag in het inwendige van de organoïde (Figuur 2).

Figuur 2: 3D-reconstructies van een retinale organoïde (200 DIV) gecleard met FluoClear BABB in beeld gebracht met een laserscanning-confocale microscoop. De microscoop was uitgerust met een (A) 10x NA 0,4 luchtobjectief en (B) een 63x NA 1,5 olieobjectief. De opheldering en de beeldvorming maken het mogelijk om de hele organoïde te visualiseren en tegelijkertijd met fijne details enkele interessegebieden in beeld te brengen. DRAQ5 (kernen), opsine B+GR (kegeltjes) en TUJ1 (neuronen). Afkortingen: DIV = dagen in vitro; BABB = benzylalcohol/benzylbenzoaat; NA = numerieke apertuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Concluderend was onze keuze voor clearing FluoClear BABB, omdat het een superieure visualisatie van de gehele retinale organoïde bood met een hoge resolutie en signaal-ruisverhouding. Belangrijk is BABB-geïnduceerde krimp, waardoor de organoïde isotroop wordt verdicht. Deze compactheid stelde ons in staat om doelen met een hoge vergroting te benutten voor gedetailleerde verkenning van diepere structuren. Ten slotte zorgde de compatibiliteit van BABB met olie-immersieobjectieven voor minimale lichtverstrooiing en hoogwaardige beeldvorming bij vergrotingen.

Identificatie en spatiotemporele verdeling van retinale cellen binnen de organoïden tijdens de rijping

Volgens de hier beschreven methodologie en gebruikmakend van beeldvorming op organoïden die immuungelabeld zijn met de specifieke antilichamen die in tabel 1 worden beschreven, hebben we bestudeerd hoe het neuronetvlies wordt gevormd uit organoïden op verschillende rijpingspunten, van vroege ontwikkelingsstadia (40 DIV) tot meer volwassen stadia (tot 250 DIV), met een goed gedefinieerde 3D-structuur. Deze benadering stelde ons in staat om de vorming en organisatie van verschillende retinale componenten die in deze sectie worden beschreven, te visualiseren.

Antistof	Specificiteit	Doelstellingen	Locatie op het netvlies	[ ]definitief (verdunning)	Gastheer	#RRDI
Anti-GFP	GVK	GVK	GCaMP6s-positieve cellen	10 μg/ml (1:1.000)	Ch	AB_300798
Hoofdstuk 10	Ventromediale hypothalamus homeobox 2 (Vsx2)	Transcriptie factor	Neuroblasten en bipolaire cellen	10 μg/ml (1:2)	Mevrouw	AB_10842442
Opsin B	Opsin blauw	Buitenste segment van blauwe kegels	Blauwe kegels	10 μg/ml (1:100)	Rb	AB_177457
Opsin RG	Opsin groen en rood	Buitenste segment van groene en rode kegels	Groene en rode kegels	10 μg/ml (1:100)	Ch	AB_11213279
OPNIEUW	Herstellen	Calciumbindend eiwit	Fotoreceptoren	10 μg/ml (1:100)	Rb	AB_2253622
RHO (RET-P1)	Rhodopsine	Buitenste segment van staven	Staven	63 μg/ml (1:100)	Mevrouw	AB_260838
TUJ1	Neuronspecifieke klasse III bèta-tubuline	Beta-III tubuline isovorm	Neuronen	50 μg/ml (1:200)	Mevrouw	AB_2315514

Tabel 1: Primaire antilichamen getest in retinale organoïden uit verschillende stadia van rijping. Afkortingen: Kip = Ch; Muis = mevrouw; Konijn = Rb.

De immunolabeling met verschillende markers maakte het mogelijk om de cellen te identificeren die zich conformeerden aan deze gelaagde structuur. TUJ1 is een neuronspecifieke klasse III bèta-tubuline (tabel 1), meestal gebruikt in gesegmenteerde monsters om retinale ganglioncellen (RGC's)¹⁵ te labelen vanwege zijn overvloed. TUJ1 is aanwezig in alle retinale neuronen¹⁶ en vanaf vroege stadia van neurale differentiatie¹⁷. TUJ1-expressie werd gevonden in alle rijpingsstadia in de cortex van de organoïde, waardoor de organisatie van retinale cellen in lagen kon worden opgevolgd. In figuur 3 kunnen we zien dat TUJ1 in een vroeg stadium van ontwikkeling (40 DIV) gelijkmatig is verdeeld in een enkele, dunne en uniforme laag. Vanaf 90 DIV wordt het apicale gebied van de organoïde dichter en compacter, omdat het bevolkt is met veel meer cellen die zich ophopen in het apicale gebied. Bij 170 DIV kreeg de retinale organoïde een 3D-gestratificeerde retinale structuur met een discrete apicale laag. Bij 200 DIV kunnen we zien dat er andere cellichamen zijn die zich uitstrekken over lange projecties, die veel minder talrijk zijn, dieper in de organoïde worden gevonden. Ten slotte is bij 250 DIV de structuur in drie nucleaire lagen duidelijk, wat overeenkomt met: (1) de buitenste nucleaire laag (ONL) gevormd door volwassen fotoreceptoren, (2) de binnenste nucleaire laag (INL) die voornamelijk wordt bevolkt door bipolaire cellen en (3) de ganglioncellaag (GCL) gevormd door RGC's, zoals aangegeven in figuur 3 (rechtsonder).

Figuur 3: Neuronorganisatie bij rijping van retinale organoïden in een laaggelaagde structuur. Z-stack projecties van confocale beelden van FluoClear BABB-geclearde retinale organoïden gekleurd met TUJ1. Bij 40 DIV worden geen gelaagde structuren gevormd. Vanaf 170 DIV stratificeert het neuronetvlies zich in lagen. De retinale nucleaire lagen zijn aangegeven: ONL, INL en GCL (gele pijlpunten). Schaalbalken = 25 μm (links) en 10 μm (rechts). Afkortingen: BABB = benzylalcohol/benzylbenzoaat; DIV = dagen in vitro; ONL = buitenste nucleaire laag, INL = binnenste nucleaire laag; GCL = ganglioncellaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Met deze methodologie zouden we ook de assemblage van bundels axonen kunnen rapporteren. Zoals te zien is in de vergrote gebieden (Figuur 4), zagen we bundels vezels die zich uitstrekten van de binnenkern van de organoïde naar de periferie, en uitsteken in gebieden die ver uit elkaar liggen (tot 1 mm). Interessant is dat de vorming van deze vezels plaatsvond in verschillende stadia van rijping. Naarmate de organoïde groeit, worden de vezels dikker, worden ze complexer en verzamelen ze meer celprojecties (Figuur 4 [250 DIV] en aanvullende video S1). RGC's zijn de eerste cellen die differentiëren tijdens de ontwikkeling van het netvlies en kunnen dus hun projecties vanaf zeer vroege stadia van ontwikkeling rangschikken. RGC's kunnen neurietextensie initiëren nog voordat ze hun definitieve positie in de organoïde hebben vastgesteld. Onze bevindingen komen overeen met eerdere rapporten¹⁸ die de vorming van een oogzenuwachtige structuur aantonen in co-culturen van retinale en hersenorganoïden.

Figuur 4: Assemblage van neuronale projecties in verschillende stadia van rijping. De vezels strekken zich uit van de binnenste vlakken van de retinale organoïde naar de periferie. De vorming van deze vezels vond plaats in verschillende stadia van rijping, van 40 DIV tot het oudste bestudeerde rijpingspunt (250 DIV). Schaalbalken = 25 μm (bovenste rij) en 100 μm (onderste rij). Afkortingen: DIV = dagen in vitro. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Op de apicale plaats van retinale organoïden rijpen sommige fotoreceptoren tot staafjes, die rodopsine bevatten in de buitenste segmenten om monochromatisch zicht te detecteren bij weinig licht, terwijl andere uitgroeien tot kegeltjes, die blauwe, groene en rode opsins tot expressie brengen en verantwoordelijk zijn voor kleur en gezichtsscherpte bij fel licht. Figuur 5 (boven) illustreert de populatie van kegelfotoreceptoren in de retinale organoïde die blauwe en/of groene/rode opsins tot expressie brachten (OPSIN B en GR, Tabel 1). Deze cellen vertonen een langwerpige morfologie met de verschillende opsins verdeeld over het hele cellichaam, met uitzondering van de kern. Met name de buitenste punt van deze cellen lijkt helderder en lijkt mogelijk op het buitenste segment van de fotoreceptor die de schijven bevat. Om zowel blauwe als groen/rode kegeltjes te visualiseren met behulp van een enkel kanaal voor fluorescentiedetectie, werden secundaire antilichamen tegen blauw-opsine (OPSIN B, konijn) en groen/rood opsin (OPSIN GR, kip) gelabeld met dezelfde fluorofoor, waardoor het kanaalgebruik werd geoptimaliseerd en het beeldvormingsproces werd gestroomlijnd terwijl spectrale overlap werd vermeden. Een subset van fotoreceptorcellen in figuur 5 (onder) bracht rodopsine tot expressie (RHO, tabel 1 en aanvullende video S2), wat ondubbelzinnig hun identiteit als staafjes aangeeft. Deze staafcellen delen de eerder beschreven langwerpige morfologie, waarbij de kern centraal is gepositioneerd en het opsinerijke cellichaam naar de periferie van de organoïde is gericht.

Figuur 5: Retinale organoïden uit latere stadia van ontwikkeling. Boven: volwassen kegels, onder: staafjes. Z-projectie van confocale beelden van FluoClear BABB-geclearde retinale organoïden gekleurd met TUJ1 (neuronen), DRAQ5 (kernen), opsine-B+GR (kegeltjes) en RHO (staafjes). Schematische tekeningen worden ter referentie getoond. Schaalbalken = 100 μm (links) en 10 μm (rechts). Afkortingen: DIV = dagen in vitro; BABB = benzylalcohol/benzylbenzoaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De bipolaire cellen en hun spatiotemporele verdeling werden geïdentificeerd door de Chx10-expressie (ook bekend als Vsx2) te volgen over 250 DIV rijping (Figuur 6). Chx10 (Tabel 1) is een transcriptiefactor die cruciaal is voor de proliferatie van voorlopercellen en de bepaling van bipolaire cellen in het zich ontwikkelende netvlies^19,20. Als een homeobox-gen wordt het in vroege stadia van ontwikkeling tot expressie gebracht in neuroblasten en in het rijpe netvlies wordt het uitsluitend aangetroffen in bipolaire cellen. Figuur 6 toont de verdeling van Chx10-positieve cellen binnen de zich ontwikkelende organoïde. Aanvankelijk worden talrijke Chx10-positieve cellen waargenomen die zich uitstrekken van de periferie van het neuroretinum naar het centrum. Naarmate de organoïde rijpt, worden deze cellen minder overvloedig en verhuizen ze naar de INL, waar bipolaire cellen zich bevinden.

Figuur 6: Chx10 expressie over 250 DIV rijping. Z-projectie confocale beelden van een FluoClear BABB-geclearde retinale organoïde gekleurd met DRAQ5 (kernen) en Chx10 (neuroblasten en rijpe bipolaire cellen). Schaal balk = 100 μm. Afkortingen: DIV = dagen in vitro; BABB = benzylalcohol/benzylbenzoaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ten slotte tonen we aan dat de endogene GFP van GCaMP-calciummarkers behouden blijft na klaring met deze methodologie. In Figuur 7 kunnen we het neuronetvlies waarnemen van 70 DIV-retinale organoïden die zijn geïnfecteerd met Ad5-CMV-GCaMP6's en immunogelabeld met anti-GFP (Tabel 1) om de fluorescentie na langdurige fixatie te verbeteren.

Figuur 7: Endogeen GCaMP geconserveerd in de FluoClear BABB-clearingmethode. Een retinale organoïde van 70 DIV geïnfecteerd met Ad5-CMV-GCaMP6's immuungelabeld met anti-GFP (cellen die GCaMP tot expressie brengen), Chx10 (neuroblasten en bipolaire cellen in een vroeg stadium) en DRAQ5 (kernen). Schaalbalken = 100 μm (links) en 25 μm (rechts). Afkortingen: BABB = benzylalcohol/benzylbenzoaat; DIV = dagen in vitro. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Video S1: 3D-reconstructie van een retinale organoïde met een assemblage van neuronale projecties. Z-projectie van confocale beelden van FluoClear BABB-geclearde retinale organoïden bij 250 DIV gekleurd met TUJ1 (neuronen) weergegeven in paars en DRAQ5 (kernen) in geel. Afkortingen: BABB = benzylalcohol/benzylbenzoaat; DIV = dagen in vitro. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende Video S2: 3D-reconstructie van de staafjes uitgelijnd in het oppervlak van een retinale organoïde in een laat stadium van ontwikkeling (200 DIV). Z-projectie van confocale beelden van FluoClear BABB-geclearde retinale organoïden bij 200 DIV gekleurd met RECOV (fotoreceptoren) weergegeven in groen en RHO (staafjes) in paars. Afkortingen: DIV = dagen in vitro; BABB = benzylalcohol/benzylbenzoaat. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

Het hier beschreven protocol vergemakkelijkt de studie van de spatiotemporele verdeling van de cellen die de retinale organoïde vormen in verschillende stadia van rijping, met behoud van de natuurlijke 3D-architectuur, een cruciaal aspect voor het begrijpen van deze modellen in de context van toekomstige gepersonaliseerde geneeskunde. Het biedt een gedetailleerd beeld van de retinale architectuur op het niveau van verschillende lagen en individuele celtypen, waardoor visualisatie van subcellulaire structuren mogelijk is met behoud van de globale 3D-context.

Het alternatief voor beeldvorming op de hele assemblage is het nabewerken van het monster voor het uitvoeren van beeldvorming op conventionele secties (paraffineerd of gecryopreserveerd). Hoewel secties waardevolle informatie opleveren over de lokalisatie van eiwitten en structuren, zijn deze gegevens beperkt tot een enkel vlak, waardoor het begrip van ruimtelijke cellulaire verbindingen wordt beperkt. Als gevolg hiervan kunnen kenmerken zoals het aandeel kegels en staven of de vorming van axonale bundels in specifieke regio's niet nauwkeurig worden weergegeven, wat de interpretatie in drie dimensies bemoeilijkt. Retinale organoïden zijn zeer heterogeen, waarbij verschillende regio's mogelijk verschillende celtypen bevatten en/of verschillende gradaties van complexiteit en differentiatie vertonen. Whole-mount beeldvorming lost dit probleem op, omdat het het mogelijk maakt om heterogeniteitsgradiënten wereldwijd te analyseren zonder te vertrouwen op de selectie van een subset van secties die mogelijk niet het geheel van de steekproef vertegenwoordigen.

Light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM)21,22,23 zou kunnen worden gebruikt als alternatief voor confocale microscopie met laserscanning. Bij LSFM wordt het preparaat verlicht met een dunne laag licht van enkele microns dik en wordt alle fluorescentie die door het verlichte optische gedeelte wordt gegenereerd, gedetecteerd met behulp van een camera. LSFM is een op widefield gebaseerde detectietechniek die een zeer efficiënte strategie vertegenwoordigt voor snelle visualisatie van grote volumes (monsters op centimeterschaal) met minimale effecten op fotobleken en fototoxiciteit. Organoïden kunnen echter aanzienlijke sferische aberratie vertonen omdat licht dat door de gebogen oppervlakken gaat, anders wordt gebroken, afhankelijk van de invalshoek. In deze experimenten veroorzaakte deze vervorming een verlies van focus, wat leidde tot vervaging en de resolutie van diepere structuren in gevaar bracht. Voor het in beeld brengen van onze retinale organoïden (ongeveer 1 mm in diameter) bleek confocale lasermicroscopie de meest effectieve aanpak te zijn.

Dit protocol is afgestemd op onze experimentele vereisten. Het kan worden gebruikt als een startgids voor onderzoekers die zich wagen aan beeldvorming van optisch geklaarde retinale organoïden en moet worden aangepast als die verschillen. In dit gedeelte worden de kritieke stappen, wijzigingen en beperkingen van de methodologie in detail beschreven.

Een cruciale stap is de beslissing over het clearingprotocol. Er moet met veel criteria rekening worden gehouden. Overweeg eerst de typologie van de steekproef. Het opruimen van botten is niet hetzelfde als het opruimen van hersenweefsel, net zoals het opruimen van retinale organoïden verschilt van het opruimen van maagorganoïden, omdat elk een eigen aanpak vereist. Om geclearde organoïden van een ander type te visualiseren, is het essentieel om de literatuur door te nemen om protocollen te identificeren die specifiek zijn geoptimaliseerd voor de steekproef van belang. Fructose/glycerol is een snelle en niet-toxische klaringsmethode waarvan is bewezen dat deze nuttig is voor het opruimen van organoïden die zijn afgeleid van verschillende weefsels (organoïden van menselijke luchtwegen, darm-, nier-, lever- en borsttumoren en borstklierorganoïden van muizen)¹² , maar was niet geschikt voor het transparant maken van menselijke retinale organoïden. Voor zover wij weten, rapporteert geen enkele studie de toepassing van fructose/glycerol op neuraal weefsel/organoïde. Daarom concluderen we dat deze opruimmethode niet geschikt is voor het klaren van neurale weefsels. Verder onderzoek is gerechtvaardigd om de onderliggende redenen voor deze onverenigbaarheid op te helderen.

Een andere kritische factor waarmee rekening moet worden gehouden, is de vereiste FoV, omdat deze een directe invloed heeft op de beeldvormingsstrategie en de keuze van optische componenten. Grote FoV's worden doorgaans bereikt met objectieven met een lage vergroting, die vaak zijn ontworpen voor gebruik zonder immersiemedia (bijv. lucht, RI = 1,00). Deze objectieven ervaren een grotere RI-mismatch bij het afbeelden van BABB-gewiste samples (RI = 1,56), wat leidt tot verschuivingen in dieptefocus die tijdens de nabewerking moeten worden gecorrigeerd. Daarentegen vertonen olie-immersieobjectieven (RI = 1,51) minder RI-mismatch met klaringsoplossingen zoals BABB (RI = 1,56) en hoeven ze daarom niet opnieuw te worden gekalibreerd.

Eenvoudige onderdompelingsmethoden bereiken meestal geen hoge transparantie en zijn niet geschikt voor het verkrijgen van hoogwaardige afbeeldingen van volledige samples. Protocollen voor het opruimen van weefsel beïnvloeden de effectieve resolutie via zwelling of krimp van de monsters. Afhankelijk van het doel van het experiment kan zwelling of krimp gunstig zijn. Protocollen die het monster uitbreiden, kunnen de resolutie van fijne details in hetzelfde optische systeem verbeteren die voorheen niet in staat waren om dezelfde details weer te geven. Krimp kan gewenst zijn om grote monsters te visualiseren die anders niet in de monsterkamer zouden passen of om zich aan te passen aan de objectieve werkafstanden. Omdat krimp het monster echter comprimeert en interne afstanden kan vervormen, is deze techniek niet geschikt voor dimensionale beoordeling of nauwkeurige meting van intercellulaire afstanden.

Een andere belangrijke factor waarmee rekening moet worden gehouden, is de compatibiliteit met fluorescerende eiwitten. Meestal doven protocollen op basis van organische oplosmiddelen fluorescerende eiwitten uit omdat ze hoge temperaturen vereisen of degraderen de fluorescerende eiwitten tijdens inbedding met RI-matching-oplossingen. Gelukkig zijn de meeste methoden compatibel met immunolabelingtechnieken. De compatibiliteit van elk epitoop moet echter experimenteel worden bevestigd.

Bovendien kan de penetratie van grote IgG-moleculen door weefsel worden belemmerd, waardoor de kleuringsefficiëntie afneemt en de visualisatie van de beoogde structuur tot het monsteroppervlak wordt beperkt. Het kleuren van hele gemonteerde exemplaren met antilichamen kan enkele dagen (of zelfs weken) duren, afhankelijk van de grootte en de aard van het monster, waardoor de duur van het protocol aanzienlijk wordt verlengd.

Ten slotte is compatibiliteit met het optische instrument verplicht. De meeste methoden op basis van organische oplosmiddelen (behalve ECi) zijn zeer corrosief en chemisch niet compatibel met commerciële monsterkamers en onderdompelingsobjectieven. Bovendien hebben sommige clearingoplossingen een RI die niet overeenkomt met het bereik dat vereist is voor de beschikbare objectieven (meestal water).

Er zijn enkele stappen in het protocol die speciale aandacht behoeven. FluoClear BABB, als hydrofobe opruimingsmethode, vereist een voorafgaande uitdrogingsstap. De pH speelt een belangrijke rol bij het behoud van de fluorescentie van endogene eiwitten zoals GFP. Dan is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de pH van de alcoholoplossingen goed is afgesteld. Uitdroging is de sleutel tot volledige opruiming. Optimale resultaten worden bereikt door de monsters te incuberen met een toenemende gradiënt van alcoholoplossingen.

De grootte van het monster speelt een belangrijke rol om antilichamen in staat te stellen hun specifieke doelen te bereiken. Antilichamen kunnen er niet in slagen homogeen door te dringen en aan de buitenkant van uw monster worden vastgehouden. Als dit gebeurt, overweeg dan om over te schakelen op een ander type wasmiddel (Tween-20 of Saponin), waardoor de concentratie en incubatietijd van het wasmiddel en de antilichamen worden verhoogd. Als deze aanpassingen onvoldoende zijn, kunnen alternatieve strategieën de permeabilisatie van antilichamen verbeteren. Voor immunolabeling van grote exemplaren (centimeterschaal) hebben onderzoekers ontdekt dat het SDS een diepere penetratie van antilichamen kan vergemakkelijken²⁴. SDS induceert een gedeeltelijk verlies van de tertiaire structuur van antilichamen, waardoor het eiwit effectief wordt gelineariseerd en dieper in het weefsel kan doordringen. Vervolgens herstelt het uitwassen van het SDS de antigeenbindende eigenschappen van de antilichamen, waardoor een meer uniforme kleuring van dikkere weefsels mogelijk wordt en de vaak waargenomen gradiënt van sterkere etikettering op het oppervlak van het monster wordt verminderd.

Het bereiden van uw eigen fluorescerende secundaire antilichamen biedt verschillende voordelen, omdat het meer flexibiliteit biedt bij het ontwerpen van immunolabeling, waardoor de specifieke combinatie van fluorofoor en secundair antilichaam kan worden geselecteerd, waardoor het aantal kleuren dat in hetzelfde monster kan worden gebruikt, toeneemt. Bovendien kan de verhouding tussen fluorofoor en antilichamen worden afgestemd, zodat ze over het algemeen helderder zijn. Er moet echter met enkele aspecten rekening worden gehouden. Op maat gemaakte secundaire antilichamen zijn over het algemeen minder stabiel dan de in de handel verkrijgbare antilichamen en moeten vers worden gebruikt. De meeste behouden hun ligandaffiniteit gedurende 3-6 maanden bij 4 °C, maar de stabiliteit moet experimenteel worden bepaald, omdat sommige combinaties sneller kunnen verslechteren. Bovendien kunnen sommige antilichaam-fluorofoorparen de affiniteit van het antilichaam voor zijn epitoop veranderen, wat resulteert in gedeeltelijke of volledige niet-specifieke etikettering. Om de betrouwbaarheid te garanderen, is het raadzaam om op maat gemaakte secundaire antilichamen eerst te testen met behulp van controles, zoals cellen in kweek, voordat deze op experimentele monsters worden toegepast.

Dit geoptimaliseerde protocol integreert optische klaring met immunolabeling om confocale beeldvorming van hele netvliesorganoïden te vergemakkelijken. Het behoudt de structurele integriteit en maakt de identificatie van belangrijke retinale celtypen in de organoïde mogelijk. Het protocol biedt onderzoekers dus een krachtig hulpmiddel om de rijping en ruimtelijke organisatie van retinale organoïden te onderzoeken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10x NA0.40 DRY objective	Leica	HC PL APO CS2	-
63x NA1.40 OIL objective	Leica	HC PL APO CS2	-
anti-GFP antibody	Abcam	ab13970	-
Benzyl alcohol (BA)	Sigma Aldrich	13162	-
Benzyl benzoate (BB)	Sigma Aldrich	W213802	-
bottom-glass petri dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	-
Bovine Serum Albumine (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	-
Chx10 antibody	Sta Cruz Biotech	sc-365519	-
Cytiva Illustra Nap-5 gel filtration columns, Sephadex G-25	Sigma Aldrich	17-0853-02	-
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	-
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	-
DRAQ5	Thermofisher	62251	-
Dye (carboxylic acid, succinimidyl ester)	Invitrogen or Abberior	-	-
ImageJ/Fiji	NIH	v1.50i	-
Inverted confocal laser-scanning microscope	Leica microsystems	TCS SP8 STED 3X-FALCON	-
LAS X 3D processing software	Leica microsystems	-	-
mQ H2O	-	-	Ultrapuur water van het Synergy waterzuiveringssysteem
NaHCO3	Acros Organics	424270010	-
Non-labelled secondary IgG	Jackson Immunoresearch	-	-
Opsin blue antibody	Millipore	AB5407	-
Opsin RG antibody	Millipore	AB5745	-
Paraformaldehyde (PFA) 4%	Thermo scientific	J199943-K2	-
PBS Solution	Gibco	18912-014	-
Phalloidin labelling probes	Thermofisher	-	-
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010023	-
RECOV antibody	Millipore	AB5585-I	-
RHO (RET-P1) antibody	Sigma Aldrich	O4886	-
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532	-
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	-
TUJ1 antibody	Covance	MMS-435P	-